JP2019000083A - 試料作製方法、試料作製キット、観察方法および観察装置 - Google Patents

試料作製方法、試料作製キット、観察方法および観察装置 Download PDF

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Abstract

【課題】顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像が可能な試料を容易に作製するとともに、試料の作製の自動化を容易にする。
【解決手段】ゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液Ｍの液滴に少なくとも１つの細胞凝集塊Ｇを内包させて、媒質溶液Ｍの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤを形成するステップと、媒質溶液Ｍのゲル化または固体化を促進させる促進因子をハンギングドロップＤに作用させて、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化させるステップとを含む試料作製方法を提供する。
【選択図】図２

Description

本発明は、試料作製方法、試料作製キット、観察方法および観察装置
に関するものである。
近年、細胞凝集塊のような３次元培養細胞の顕微鏡画像データを得、画像解析技術を用いてスクリーニングを行い、薬効を評価する方法が注目されている。細胞凝集塊の作製方法としては、例えば、シャーレの蓋の内面に培養液とともに細胞を液滴として分注し、この液滴を反転させてハンギングドロップを形成させ、ハンギングドロップの曲面に沿う方向に、重力の分力による助けを借りてハンギングドロップ内部で細胞凝集を引き起こさせる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法は、ハンギングドロップの正確なアレイ配列がなされないので、細胞凝集塊の作製の自動化に適さないのは明らかである。
特許文献１のこの点を改善し、自動化に適するハンギングドロップを形成可能なマルチウエルプレートの構造が知られている（例えば、特許文献２参照。）。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、分注器から排出される液を受ける窪み部と、ハンギングドロップが形成されて保持されるハンギングドロップ形成区画と、これらに通じる導管との組がアレイ状に配列されて構成されている。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、特許文献１に記載の方法のように液滴を反転させる必要が無く、細胞や培養液等の分注をアレイ配列フォーマットに従ってマルチウエルプレートの上方から行うだけでハンギングドロップを形成可能としたことで、ハンギングドロップでの細胞凝集塊の作製の自動化を容易にしている。しかしながら、特許文献２は、顕微鏡での高精細の観察方法については特許文献１と同様になんら言及していない。
特許文献２の技術を更に発展させ、顕微鏡による高精細な観察や撮像を容易に行えるようにした技術が知られている（例えば、特許文献３参照。）。特許文献３に記載の技術は、作製したハンギングドロップ内の細胞凝集塊をハンギングドロップとともに、底面が平面なマルチウエルプレートのウエルに落下させ、このウエルの底面を介して倒立型顕微鏡で観察や撮像を行う。このウエルには工夫が施されており、ウエルの横断面が下方に向かって徐々に狭められ、ウエルの底面の面積が細胞凝集塊よりもやや大きな形状を有するようにすることで、底面に落下した細胞凝集塊のＸＹ位置（鉛直方向に交差する方向の位置）をほぼ定めることができるようになっている。これにより、細胞凝集塊を観察光軸上に合わせ易くしている。
独国特許発明第１０３６２００２号明細書 特許第５４９０８０３号公報 国際公開第２０１７／００１８８０号
しかしながら、細胞凝集塊の大きさは常に同じであるわけではなく、細胞凝集塊がウエルの底面よりも小さければ、細胞凝集塊のＸＹ位置は底面のどこかに位置するが、誤差を伴ってしまう。また、細胞凝集塊の大きさがウエルの底面よりも大きければ、細胞凝集塊は底面に着地しない。また、特許文献３に記載の技術は、ハンギングドロップを落下させるために、液を加えるステップが必要になる。これは、マルチウエルプレートの全ウエルに対して行わねばならず、時間がかかり、スループットを低下させる原因となる。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像が可能な試料を容易に作製することができるとともに、自動化が容易な試料作製方法および試料作製キットと、この試料作製方法および試料作製キットにより作製した試料としての細胞凝集塊の観察に適した観察方法および観察装置を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、ゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液の液滴に少なくとも１つの細胞凝集塊を内包させて、前記媒質溶液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するステップと、前記媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進因子を前記ハンギングドロップに作用させて、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させるステップとを含む試料作製方法である。
本発明の第１態様によれば、媒質溶液の液滴が細胞凝集塊を内包してハンギングドロップを形成し、このハンギングドロップが促進因子によりゲル化または固体化することで、略透明なハンギングドロップ内で細胞凝集塊の位置が固定された試料が作製される。
したがって、ハンギングドロップ内の細胞凝集塊から発せられる光をハンギングドロップの外部で検出して、細胞凝集塊を高精細に観察することができる。また、媒質溶液の液滴に細胞凝集塊を内包させてハンギングドロップを形成するとともに、ハンギングドロップに促進因子を作用させるだけの簡易な作業なので、試料の作製を自動化することができる。これにより、顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像が可能な試料を容易に作製することができるとともに、試料の作製の自動化も容易にすることができる。
本発明の第２態様は、培養液の液滴に少なくとも１つの細胞を内包させて、前記培養液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するステップと、前記ハンギングドロップ内で、前記細胞が所望の細胞凝集塊を形成するまで培養するステップと、ゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液を前記ハンギングドロップに加えるステップと、前記媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進因子を前記ハンギングドロップに作用させて、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させるステップとを含む試料作製方法である。
本発明の第２態様によれば、培養液の液滴により構成されるハンギングドロップ内で細胞を培養して細胞凝集塊を形成することで、培養した細胞凝集塊を移し替える必要がなく、スループットを向上して、安価にスクリーニングを行うことができる。
本発明の第３態様は、培養液およびゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液の液滴に少なくとも１つの細胞を内包させ、前記培養液および前記媒質溶液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するステップと、前記ハンギングドロップ内で、前記細胞が所望の細胞凝集塊を形成するまで培養するステップと、前記媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進因子を前記ハンギングドロップに作用させて、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させるステップとを含む試料作製方法である。
本発明の第３態様によれば、媒質溶液を培養液ともに注入してハンギングドロップを形成することで、ハンギングドロップ形成後に媒質溶液を加えるステップを省くことができる。これにより、作業を簡略化することができる。
上記第２態様においては、前記細胞を培養後、前記ハンギングドロップに前記媒質溶液を加える前に、前記ハンギングドロップから前記培養液を吸引するステップを含むこととしてもよい。
このように構成することで、培養液に媒質溶液のゲル化または固体化を阻害する成分が含まれている場合に、ハンギングドロップを確実にゲル化または固体化することができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させる前に、前記媒質溶液のゲル化または固体化の促進を阻害してゲル化または固体化を遅延させる阻害溶液を前記媒質溶液に加えるステップを含むこととしてもよい。
このように構成することで、ハンギングドロップを時間をかけてゲル化または固体化することができる。したがって、ハンギングドロップを構成する媒質溶液の比重が細胞凝集塊の比重よりも小さければ、重力によって、細胞凝集塊がハンギングドロップの最下点近傍に位置した状態でハンギングドロップをゲル化または固体化させ、ハンギングドロップ内での細胞凝集塊の鉛直方向の位置を略一定にすることができる。また、細胞凝集塊は最終的にハンギングドロップの界面に沿って落下することになるので、水平方向に対しての位置も略一定にすることができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップに前記促進因子を作用させる前に、前記細胞凝集塊を透明にする透明化溶液を前記ハンギングドロップに加えるステップを含むこととしてもよい。
このように構成することで、細胞凝集塊が大きい場合であっても、観察のための照明光を細胞凝集塊の内部まで到達し易くすることができる。これにより、細胞凝集塊の大きさに関わらず、細胞凝集塊の内部構造を容易に観察することができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップが、前記細胞凝集塊よりも小さい比重を有する溶液により構成されることとしてもよい。
このように構成することで、重力によって、細胞凝集塊をハンギングドロップの界面に沿って移動させて最下点近傍に配置することができる。
上記態様においては、前記促進因子が温度であってもよい。
このように構成することで、媒質溶液の温度を管理するだけの簡易な作業で、ハンギングドロップをゲル化または固体化させることができる。
この場合、前記媒質溶液がアガロースであってもよい。
上記態様においては、前記促進因子が光であってもよい。
このように構成することで、媒質溶液に特定の光を照射するだけの簡易な作業で、ハンギングドロップをゲル化または固体化させることができる。
この場合、前記媒質溶液が紫外線硬化型の液状樹脂であってもよい。
上記態様においては、前記媒質溶液を前記促進因子としての促進溶液と接触させることにより、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させることとしてもよい。
このように構成することで、媒質溶液を促進溶液と接触させるだけの簡易な作業で、ハンギングドロップをゲル化または固体化させることができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップが、前記促進溶液に浸漬されてゲル化または固体化されることとしてもよい。
このように構成することで、ハンギングドロップに促進溶液を注入する必要がなく、複数のハンギングドロップを１度に促進溶液に接触させてゲル化または固体化させることができる。
上記態様においては、前記媒質溶液がアルギン酸ナトリウム溶液であり、前記促進溶液が、カルシウムイオンが溶解されてなるカルシウム溶液であってもよい。
上記態様においては、前記媒質溶液がエポキシ系の液状樹脂であり、前記促進溶液が、ポリアミン類が溶解されてなるポリアミン溶液であってもよい。
上記態様においては、溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を前記細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備えるハンギングドロップ形成器具を用いて、前記ハンギングドロップを形成することとしてもよい。
このように構成することで、ハンギングドロップ形成器具の窪み部に注入された溶液が導管を介してハンギングドロップ形成区画に移動することにより、溶液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップが形成される。したがって、窪み部に溶液を注入するだけの簡易な方法で、ハンギングドロップを形成することができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップ形成器具の前記窪み部を介して前記溶液を分注することとしてもよい。
上記態様においては、前記ハンギングドロップ形成器具が、アレイ構造を有するマルチウエルプレートであってもよい。
このように構成することで、ウエルの数に相当する複数のハンギングドロップを１度に形成することができる。
本発明の第４態様は、溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備えるハンギングドロップ形成器具と、前記窪み部に細胞と共に注入されるゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液と、該媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進溶液とを備える試料作製キットである。
本発明の第４態様によれば、ハンギングドロップ形成器具の窪み部に媒質溶液を注入すると、媒質溶液が導管を介してハンギングドロップ形成区画に移動することにより、媒質溶液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップが形成される。そして、細胞凝集塊を内包させたこのハンギングドロップに促進溶液を作用させることで、ハンギングドロップをゲル化または固体化させて、略透明なハンギングドロップ内で細胞凝集塊の位置が固定された試料を作製することができる。したがって、顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像が可能な試料を容易に作製することができるとともに、試料の作製の自動化も容易にすることができる。
本発明の第５態様は、細胞凝集塊を内包させた液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを支持し、該ハンギングドロップ内の前記細胞凝集塊からの観察光を検出する観察方法である。
本発明の第５態様によれば、ハンギングドロップに細胞凝集塊が内包された状態で、細胞凝集塊を観察することができる。したがって、ハンギングドロップをウエルに落下させる手間を省き、複数の細胞凝集塊を短時間で観察することができる。
上記態様においては、光を透過可能な透明部を有する媒質容器内に貯留された、前記ハンギングドロップを構成する溶液の屈折率と同等の屈折率を有する液浸媒質内に、前記細胞凝集塊を内包しゲル化または固体化された前記ハンギングドロップを浸漬させ、前記細胞凝集塊からの前記観察光を前記透明部を介して検出することとしてもよい。
このように構成することで、細胞凝集塊からの観察光がハンギングドロップと液浸媒質との間で屈折することなく媒質容器の透明部を介して放射される。したがって、媒質容器の外部において細胞凝集塊からの観察光を検出して、細胞凝集塊を高精細に観察することができる。
上記態様においては、前記細胞凝集塊に照明光を照射することにより、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出することとしてもよい。
このように構成することで、細胞凝集塊から所望の観察光を発生させて観察することができる。
上記態様においては、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出する検出光学系の検出光軸に交差する方向から前記媒質容器の前記透明部を介して前記細胞凝集塊に前記照明光を照射することとしてもよい。
このように構成することで、照明光の入射平面に検出光学系の焦点面を一致させることにより、検出光学系の焦点面に沿う広い範囲において発生する観察光を検出することができる。
上記態様においては、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出する検出光学系の検出光軸に交差する方向から前記媒質容器の前記透明部を介して前記細胞凝集塊に照明光を照射し、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を前記検出光学系により検出することとしてもよい。
上記態様においては、前記細胞凝集塊が、前記媒質容器の底面から間隔をあけて配置されることとしてもよい。
細胞凝集塊が媒質容器の底面に接していると、媒質容器の透明部の屈折率が液浸媒質の屈折率と等しくないと細胞凝集塊のこの底面に接する部分を好適に照明することができない。このように構成することで、媒質容器の透明部の屈折率に関わらず、細胞凝集塊の全体を観察することができる。
上記態様においては、前記細胞凝集塊が、前記媒質容器の底面から間隔をあけて配置され、前記細胞凝集塊に照明光を照射することにより、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出することとしてもよい。
上記態様においては、溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を前記細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備えるハンギングドロップ形成器具を用いて、前記ハンギングドロップを支持することとしてもよい。
このように構成することで、窪み部に溶液を注入するだけの簡易な方法でハンギングドロップを形成して支持することができ、細胞凝集塊の観察を容易にすることができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップ形成器具の前記窪み部を介して前記溶液を分注することとしてもよい。
上記態様においては、前記細胞凝集塊を内包させた前記ハンギングドロップを複数支持して観察に供することとしてもよい。
本発明の第６態様は、液滴が細胞凝集塊を内包して吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するハンギングドロップ形成器具と、該ハンギングドロップ形成器具により形成された前記ハンギングドロップ内に内包されている前記細胞凝集塊から発せられる観察光を検出する検出光学系と、前記ハンギングドロップ形成器具により支持された前記ハンギングドロップと前記検出光学系の検出位置との相対的な位置を変更する駆動装置とを備える観察装置である。
本発明の第６態様によれば、ハンギングドロップ形成器具により細胞凝集塊が内包されたハンギングドロップが支持された状態で、駆動装置によってハンギングドロップと検出光学系の検出位置との相対的な位置を調整することにより、ハンギングドロップ内の細胞凝集塊からの観察光を検出光学系により検出して、細胞凝集塊を観察することができる。したがって、ハンギングドロップを落下させるウエルを用いることなく、複数の試料を短時間かつ低コストで観察することができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップ形成器具が、溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を前記細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備える物であってもよい。
上記態様においては、前記ハンギングドロップを構成する前記液滴の屈折率と同等の屈折率を有する液浸媒質が貯留され、前記細胞凝集塊からの前記観察光を透過可能な媒質容器を備え、前記駆動装置が、前記細胞凝集塊を内包しゲル化または固体化された前記ハンギングドロップを前記液浸媒質に浸漬させるよう、前記ハンギングドロップ形成器具を移動させることとしてもよい。
このように構成することで、駆動装置によってハンギングドロップ形成器具を移動させて、媒質容器の液浸媒質にハンギングドロップを浸漬させることにより、ハンギングドロップに内包されている細胞凝集塊からの観察光を液浸媒質および媒質容器を介して検出光学系により検出することができる。したがって、駆動装置により、媒質容器内でハンギングドロップを検出光学系の検出光軸に沿う方向に移動させることで、検出光軸に交差する細胞凝集塊の断層像を取得することができる。
上記態様においては、前記媒質容器が、前記細胞凝集塊からの前記観察光を透過可能な観察光透過用透明部を有することとしてもよい。
このように構成することで、細胞凝集塊からの観察光を媒質容器の観察光透過用透明部を介して検出光学系によって検出することにより、細胞凝集塊を高精細に観察することができる。
上記態様においては、前記媒質容器が、前記検出光学系の対物レンズに支持されていることとしてもよい。
このように構成することで、媒質容器を別途支持する部材が不要となり、構成を簡略化することができる。
上記態様においては、前記対物レンズが、略鉛直上方に光軸を向けて配置される液浸対物レンズであり、前記媒質容器が、前記液浸対物レンズの先端部と、該先端部に軸方向の一端が取り付けられる筒状部材とにより構成されていることとしてもよい。
このように構成することで、液浸対物レンズの先端部を媒質容器の底部として用いて、媒質容器を安価に構成することができる。
上記態様においては、前記細胞凝集塊に照明光を照射する照明光学系を備え、前記媒質容器が、前記照明光学系からの前記照明光を透過する照明光透過用透明部を有することとしてもよい。
このように構成することで、照明光学系を媒質容器の外部に配置し、媒質容器の外部から照明光透過用透明部を介して細胞凝集塊に照明光を照射することができる。
上記態様においては、前記照明光学系が、前記検出光学系の検出光軸に交差する方向から、照明光軸に交差する方向に幅と厚さを有する前記照明光を射出することとしてもよい。
このように構成することで、細胞凝集塊における照明光の入射範囲に検出光学系の焦点面を一致させることにより、細胞凝集塊における焦点面に沿う広い範囲において発生した観察光を検出光学系によって１度に検出することができる。
上記態様においては、前記照明光学系の光軸と前記検出光学系の光軸とが互いに直交していることとしてもよい。
上記態様においては、前記照明光学系が、前記検出光学系の視野内で検出光軸に沿う方向に集光した平面状の前記照明光を前記細胞凝集塊に入射させることとしてもよい。
このように構成することで、細胞凝集塊における照明光の入射平面に検出光学系の焦点面を一致させることにより、検出光学系の焦点面に沿う広い範囲において発生した観察光を検出光学系によって１度に検出して、より高解像の画像を取得することができるライトシート顕微鏡を構成することができる。
上記態様においては、前記照明光学系が、光走査によって照明光軸に交差する方向に幅を有する前記照明光を形成することとしてもよい。
上記態様においては、前記検出光学系が、略結像位置に配置されるマイクロレンズと、該マイクロレンズの後方に配置されるカメラとを備えることとしてもよい。
このように構成することで、細胞凝集塊における照明光の入射範囲に検出光学系の焦点面を一致させることで、細胞凝集塊における焦点面に沿う広い範囲において発生した観察光がマイクロレンズによって投影されて、投影された像がカメラにより撮影される。したがって、視差が異なる複数の画像情報を１度に取得することができるライトフィールド顕微鏡を構成することができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップ形成器具が、複数の前記ハンギングドロップを支持可能なアレイ構造を有するマルチウエルプレートであり、前記駆動装置が、前記ハンギングドロップと前記検出光学系の検出位置との相対的な位置を変更して、前記検出光学系の検出光軸上に各前記細胞凝集塊を順次位置合わせすることとしてもよい。
このように構成することで、駆動装置により検出光学系の検出光軸上に位置合わせされる順に、複数の細胞凝集塊を観察していくことができる。
上記態様においては、前記液浸媒質が培養液を含み、前記ハンギングドロップを構成する前記液滴が、前記培養液の培養成分を透過可能な材質からなることとしてもよい。
このように構成することで、ハンギングドロップに内包される複数の細胞を生きたまま観察することができる。
上記態様においては、前記ハンギングドロップ形成器具が、複数の前記ハンギングドロップを支持可能なアレイ構造を有するマルチウエルプレートであり、前記液浸媒質が培養液を含み、前記ハンギングドロップを構成する前記液滴が、前記培養液の培養成分を透過可能な材質からなり、前記駆動装置が、前記ハンギングドロップと前記検出光学系の検出位置との相対的な位置を変更して、前記検出光学系の検出光軸上に各前記細胞凝集塊を順次位置合わせすることとしてもよい。
上記態様においては、タイムラプス観察を行うシーケンス制御を実行する制御部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、制御部により、ハンギングドロップに内包される複数の細胞の時系列変化を観察することができる。
本発明に係る試料作製方法および試料作製キットによれば、顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像を可能な試料を容易に作製することができるとともに、試料の作製の自動化を容易にすることができるという効果を奏する。また、本発明に係る観察方法および観察装置によれば、このような試料作製方法および試料作製キットにより作製された試料の細胞凝集塊を効率的に観察することができるという効果を奏する。
本発明の第１実施形態に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。 本発明の第１実施形態に係る試料作製方法で用いるハンギングドロップ形成器具の縦断面図である。 本発明の第１実施形態の変形例に係る試料作製方法で用いるハンギングドロップ形成器具の縦断面図である。 本発明の第１実施形態の変形例として、光を照射することによりハンギングドロップをゲル化または固体化させる例を示す縦断面図である。 本発明の第１実施形態の第１変形例に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。 本発明の第１実施形態の第１変形例に係る試料作製方法を説明するハンギングドロップ形成器具およびハンギングドロップの縦断面図である。 本発明の第１実施形態の第２変形例に係る試料作製方法を説明するハンギングドロップ形成器具およびハンギングドロップの縦断面図である。 本発明の第１実施形態の第３変形例に係る試料作製方法を説明するハンギングドロップ形成器具およびハンギングドロップの縦断面図である。 本発明の第１実施形態の第３変形例に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。 本発明の第２実施形態に係る観察装置の概略構成図である。 本発明の第３実施形態に係る観察装置の概略構成図である。 図１１の可変絞りを照明光軸に沿う方向に見た平面図である。 本発明の第４実施形態に係る観察装置の概略構成図である。 本発明の第４実施形態の第１変形例に係る観察装置の概略構成図である。 本発明の第４実施形態の第３変形例に係る観察装置の概略構成図である。
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る試料作製方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る試料作製方法は、図１のフローチャートおよび図２に示されるように、ゲル化または固体化時に透明な媒質溶液Ｍの液滴に少なくとも１つの細胞凝集塊Ｇを内包させて、媒質溶液Ｍの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤを形成するステップＳ１と、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化させるステップＳ２とを含んでいる。
この試料作製方法では、例えば、図２に示すようなハンギングドロップ形成器具１を用いて、ハンギングドロップＤを形成するようになっている。
ハンギングドロップ形成器具１は、溶液が注入される窪み部３と、窪み部３に注入された溶液の液滴を細胞凝集塊Ｇを内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画５と、これら窪み部３とハンギングドロップ形成区画５とを繋ぐ細い導管７とを備えている。
ハンギングドロップ形成器具１は、これら窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７の組が１つからなるものであってもよいし、この組がアレイ状に配列されて構成されるマルチウエルプレートであってもよい。図２は、アレイ構造を有するマルチウエルプレートからなるハンギングドロップ形成器具１の１組の窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７を示している。以下、窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７の組をハンギングドロップ形成部９という。
ハンギングドロップ形成部９は、鉛直方向に沿って上から窪み部３、導管７、ハンギングドロップ形成区画５の順に配列されて構成されている。以下、鉛直方向をＺ方向とし、Ｚ方向に交差し互いに直交する方向をＸ方向およびＹ方向とする。
窪み部３は、鉛直上方に向けて開口する開口部３ａを有し、開口部３ａから鉛直下方に向かってテーパ状に細くなって導管７に繋がる略円錐形状を有している。
導管７は、鉛直方向に沿って貫通する貫通孔７ａを有している。
ハンギングドロップ形成区画５は、導管７から鉛直下方に向かって次第に径方向外方に拡がる略円錐形状を有している。
媒質溶液Ｍとしては、例えば、アガロース溶液が用いられる。アガロース溶液は、例えば、３２℃〜４５℃程度に温度が下がるとゲル化する性質を有しており、ゲル化時に透明である。この媒質溶液Ｍは比重が１であり、細胞凝集塊Ｇの比重よりも小さい。
ハンギングドロップＤを形成するステップＳ１では、媒質溶液Ｍと共に細胞凝集塊Ｇをハンギングドロップ形成器具１の窪み部３に分注するようになっている。
ハンギングドロップＤをゲル化または固体化するステップＳ２では、ハンギングドロップＤに促進因子として温度を作用させるようになっている。
このように構成された試料作製方法の作用について説明する。
本実施形態に係る試料作製方法により試料を作製するには、まず、予め作製しておいた少なくとも１つの細胞凝集塊Ｇをアガロース溶液からなる媒質溶液Ｍと共に、分注器１１を用いてハンギングドロップ形成器具１の窪み部３に分注する。
窪み部３に分注された媒質溶液Ｍと細胞凝集塊Ｇは、重力によって導管７の貫通孔７ａを介してハンギングドロップ形成区画５に移動する。そして、細胞凝集塊Ｇを内包した媒質溶液Ｍの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤが形成される（ステップ１）。
ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液Ｍは細胞凝集塊Ｇよりも比重が小さいので、細胞凝集塊Ｇは、重力によりハンギングドロップＤの界面に沿って移動してハンギングドロップＤの最下点近傍に落ち着く。したがって、窪み部３に分注する媒質溶液Ｍの量を決めておくことにより、細胞凝集塊ＧのＸ，Ｙ方向の位置だけでなくＺ方向の位置も一定にすることができる。また、ハンギングドロップ形成器具１を用いることで、ハンギングドロップＤを形成するために媒質溶液Ｍの液滴を反転させる必要もない。
次に、ハンギングドロップ形成器具１に支持されているハンギングドロップＤの温度を下げてハンギングドロップＤをゲル化させる（ステップ２）。これにより、略透明なハンギングドロップＤ内で細胞凝集塊Ｇの位置が固定された試料が作製される。
なお、室温をハンギングドロップＤのゲル化温度よりも低く設定しておき、分注時に媒質溶液Ｍをゲル化温度よりも高くしておくことで、ハンギングドロップＤを自然にゲル化させることとしてもよい。
以上説明したように、本実施形態に係る試料作製方法によれば、媒質溶液Ｍの液滴に細胞凝集塊Ｇを内包させてハンギングドロップＤを形成させ、このハンギングドロップＤを支持した状態でゲル化させることで、略透明なハンギングドロップＤ内で細胞凝集塊Ｇの位置が固定された試料を作製することができる。
そして、ハンギングドロップＤ内の細胞凝集塊Ｇから発せられる光をハンギングドロップＤの外部で検出して、細胞凝集塊Ｇを高精細に観察することができる。また、媒質溶液Ｍの液滴に細胞凝集塊Ｇを内包させてハンギングドロップＤを形成するとともに、ハンギングドロップＤに促進因子を作用させるだけの簡易な作業なので、試料の作製を自動化することができる。これにより、顕微鏡による細胞凝集塊Ｇの高精細な観察および撮像が可能な試料を容易に作製することができるとともに、試料の作製の自動化も容易にすることができる。
また、ハンギングドロップ形成器具１として、ハンギングドロップ形成部９がアレイ配列されたマルチウエルプレートを採用した場合は、自動分注が容易であり、スクリーニングを目的とした大量の細胞凝集塊Ｇの撮像を高スループットで行うことができる。
ここで、ハンギングドロップＤのゲル化または固体化には、ハンギングドロップＤ内で細胞凝集塊Ｇの位置が最終的に落ち着くまでの時間が必要である。そこで、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化させる前に、媒質溶液Ｍのゲル化または固体化の促進を阻害してゲル化または固体化を遅延させる阻害溶液（図示略）を媒質溶液Ｍに加えるステップを含むこととしてもよい。
阻害溶液を加えることで、ハンギングドロップＤを時間をかけてゲル化または固体化することができる。したがって、重力によって、細胞凝集塊ＧがハンギングドロップＤの最下点近傍に位置した状態でハンギングドロップＤをゲル化または固体化させ、ハンギングドロップＤ内での細胞凝集塊ＧのＺ方向とＸ，Ｙ方向の位置を略一定にすることができる。
媒質溶液Ｍとしてアガロース溶液を用いる場合は、阻害溶液として、例えば、縮合リン酸塩を溶解したものを用いることができる。
また、本実施形態においては、ハンギングドロップ形成器具１を例示して説明したが、ハンギングドロップ形成器具は、観察や撮像のために細胞凝集塊ＧをハンギングドロップＤ内に固定、好ましくはハンギングドロップＤの特定の空間位置に固定できればよく、これに限定されるものではない。
ハンギングドロップ形成器具として、例えば、図３に示すような、ロッド１３を採用することとしてもよい。この場合、分注器１１を用いてロッド端面１３ａに媒質溶液Ｍを分注し、ロッド１３を反転させてハンギングドロップＤを形成することとすればよい。このようにすることで、ハンギングドロップ形成器具の構造をシンプルにして安価に構成できるという利点がある。
本変形例においては、大きなハンギングドロップＤを形成できるように、ロッド端面１３ａに撥水処理を施すことが好ましい。ロッド１３は、複数のロッド端面１３ａがアレイ状に配列されて構成されるマルチウエルプレートであってもよい。
また、本実施形態においては、例えば、媒質溶液Ｍとして紫外線硬化型の液状樹脂を採用し、促進因子として光を作用させることとしてもよい。この場合、図４に示すように、紫外線硬化型の液状樹脂からなる媒質溶液Ｍの液滴によりハンギングドロップＤを形成し、このハンギングドロップＤに紫外線（光）を照射することにより、ハンギングドロップＤを固体化させることとすればよい。
このようにすることで、媒質溶液Ｍに特定の光を照射するだけの簡易な作業なので、ハンギングドロップＤの固体化のタイミングを自由に設定することができる。また、１度に複数のハンギングドロップＤに紫外線を照射して固体化させることができ、高いスループットのスクリーニングを行えるという利点がある。また、ハンギングドロップＤを完全に固体化させることができ、保管を容易にすることができるという利点もある。
また、本実施形態においては、例えば、媒質溶液Ｍとしてアルギン酸ナトリウム溶液を採用するとともに、促進因子としてカルシウムイオンを用いて、化学的な反応により、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化させることとしてもよい。
本実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、例えば、ハンギングドロップＤの内部で細胞を培養して細胞凝集塊Ｇを作製することとしてもよい。すなわち、本変形例に係る試料作製方法は、図５のフローチャートおよび図６に示すように、培養液Ｃの液滴に少なくとも１つの細胞Ｓを内包させて、培養液Ｃの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤを形成するステップＳ１−１と、ハンギングドロップＤ内で、細胞Ｓが所望の細胞凝集塊Ｇを形成するまで培養するステップＳ１−２と、ゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液ＭをハンギングドロップＤに加えるステップＳ１−４と、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化させるステップＳ２とを含むこととしてもよい。さらに、細胞Ｓを培養後、ハンギングドロップＤに媒質溶液Ｍを加える前に、ハンギングドロップＤから培養液Ｃを吸引するステップＳ１−３を含むこととしてもよい。
この場合、ステップＳ１−１では、分注器１１を用いて少なくとも１つの細胞Ｓを培養液Ｃとともにハンギングドロップ形成器具１の窪み部３に分注することとすればよい。
ステップＳ１−２では、細胞Ｓが培養されるまで、ハンギングドロップ形成器具１によりハンギングドロップＤを支持した状態に維持することとすればよい。
ステップＳ１−３では、分注器１１により、窪み部３を介して培養液Ｃを吸引し、ハンギングドロップＤを維持可能な量を残して培養液Ｃの一部を抜き取ることとすればよい。
ステップＳ１−４では、媒質溶液Ｍとして、例えば、アルギン酸系の溶液を採用し、分注器１１を用いてハンギングドロップＤにアルギン酸ナトリウム溶液を加えることとすればよい。アルギン酸ナトリウム溶液はゲル化時に透明である。
ステップＳ２では、ハンギングドロップＤに促進因子として促進溶液Ｈを作用させることとすればよい。促進溶液Ｈとしては、例えば、カルシウムイオン（促進因子）を溶解してなるカルシウム溶液を採用し、媒質溶液Ｍとしてのアルギン酸ナトリウム溶液を加えたハンギングドロップＤに、さらにカルシウム溶液を添加してハンギングドロップＤをゲル化させることとすればよい。
本変形例によれば、培養液Ｃの液滴により構成されるハンギングドロップＤ内で細胞Ｓを培養して細胞凝集塊Ｇを形成することで、細胞凝集塊Ｇを移し替える必要がなく、スループットを向上して、安価にスクリーニングを行うことができる。
また、培養液Ｃは蛍光観察を行う場合に照明光により蛍光を発生し、観察の背景光をあげるため好ましくない。また、培養液ＣがハンギングドロップＤのゲル化または固体化に影響する成分を含んでいる可能性もある。したがって、ハンギングドロップＤから培養液Ｃを吸引して一部を抜き取ることで、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化し易くすることができる。
本変形例では、媒質溶液Ｍとしてアルギン酸系の溶液を使用することとしたが、この溶液に限定されることはない。例えば、媒質溶液Ｍとしてエポキシ系の液状樹脂を採用し、促進溶液Ｈとしてポリアミン類が溶解されてなるポリアミン溶液を採用することとしてもよい。また、２液を混合することによりハンギングドロップＤをゲル化または固体化させることに限定されるものではなく、例えば、３液以上の多液を混合させることによりハンギングドロップＤをゲル化または固体化させることとしてもよい。
第２変形例としては、例えば、図７に示すように、ハンギングドロップＤに促進因子を作用させてゲル化または固体化させる前に、細胞凝集塊Ｇを透明にする透明化溶液ＴをハンギングドロップＤに加えるステップを含むこととしてもよい。
例えば、直径が３００μを超えるような大きな細胞凝集塊Ｇを観察する場合は、観察のための照明光（励起光）が細胞凝集塊Ｇの内部に到達できず、細胞凝集塊Ｇの内部構造を観察することができないことがある。本変形例によれば、細胞凝集塊Ｇが大きい場合であっても、観察のための照明光を細胞凝集塊Ｇの内部まで到達し易くすることができる。これにより、細胞凝集塊Ｇの大きさに関わらず、細胞凝集塊Ｇの内部構造を容易に観察することができる。
本変形例においては、図７に示すように、細胞凝集塊Ｇが透明になったらハンギングドロップＤから透明化溶液Ｔの少なくとも一部を吸引して抜き取るステップをさらに含むこととしてもよい。このようにすることで、透明化溶液ＴがハンギングドロップＤのゲル化または固体化に影響する成分を含んでいる場合であっても、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化し易くすることができる。
第３変形例としては、図８に示すように、ハンギングドロップＤを促進溶液Ｈに浸漬（接触）させることによりゲル化または固体化させることとしてもよい。
この場合、例えば、促進溶液Ｈとしてカルシウム溶液を用いるとともに、光を透過可能な底部（透明部、観察光透過用透明部）１５ａおよび側壁部（透明部、照明光透過用透明部）１５ｂを有するキュベット等の媒質容器１５を採用し、媒質容器１５に促進溶液Ｈを貯留して、以下のようにすることとすればよい。
例えば、図９のフローチャートに示すように、培養液Ｃと共に媒質溶液Ｍとしてのアルギン酸ナトリウム溶液および少なくとも１つの細胞Ｓをハンギングドロップ形成器具１の窪み部３に分注してハンギングドロップＤを形成させる（ステップＳ１−１）。そして、所望の細胞凝集塊Ｇが形成されるまで、ハンギングドロップＤ内で細胞Ｓを培養する（ステップＳ１−２）。
所望の細胞凝集塊Ｇが形成されたら、媒質容器１５内に貯留されている促進溶液Ｈ内に、ハンギングドロップＤをゆっくり浸漬させてゲル化または固体化させる（ステップＳ２）。細胞凝集塊Ｇから鉛直下方に向かって発せられる光は、媒質容器１５の底部１５ａを介して顕微鏡観察することができる。図８において、符号２９は対物レンズを示している。
本変形例によれば、ハンギングドロップＤに促進溶液Ｈを分注する必要がなく、ハンギングドロップＤを降下させて促進溶液Ｈ内に浸漬させるだけでゲル化または固体化させることができる。したがって、ハンギングドロップ形成器具１として、アレイ構造を有するマルチウエルプレートを採用した場合は、複数のハンギングドロップＤを促進溶液Ｈに１度に浸漬させてゲル化または固体化させることができる。
また、媒質容器１５にハンギングドロップＤを浸漬させたままの状態でライトシート顕微鏡により細胞凝集塊Ｇを観察することができ、大量のスクリーニングを行うのに適している。
上記各変形例においては、ハンギングドロップ形成器具１と、媒質溶液Ｍと、促進溶液Ｈとを備える試料作製キット（図示略）を構成することができる。
このように構成された試料作製キットによれば、顕微鏡による細胞凝集塊Ｇの高精細な観察および撮像が可能な試料を容易に作製することができるとともに、試料の作製の自動化も容易にすることができる。
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る観察装置および観察方法について説明する。
以下、第１実施形態に係る試料作製方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態に係る観察装置２１は、図１０に示すように、倒立型顕微鏡を構成するようになっている。この観察装置２１は、ハンギングドロップ形成器具１と、媒質容器１５と、ハンギングドロップ形成器具１により形成されたゲル化または固体化された略透明なハンギングドロップＤ内に内包されている細胞凝集塊Ｇから発せられる観察光を検出する検出光学系２３と、ハンギングドロップ形成器具１により支持されたハンギングドロップＤと検出光学系２３の検出位置との相対的な位置を変更する駆動装置２５と、検出光学系２３および駆動装置２５の制御等を行う制御器（制御部）２７とを備えている。
ハンギングドロップ形成器具１は、窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７により構成されるハンギングドロップ形成部９がアレイ配列されたマルチウエルプレートにより構成されている。図１０に示す例では、ハンギングドロップ形成部９が、Ｘ方向に３個、Ｙ方向に４個配列されているものとする。
駆動装置２５は、例えば、電動ステージであり、ハンギングドロップ形成器具１をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動可能に支持している。
媒質容器１５は、検出光学系２３のＺ方向に沿って延びる検出光軸Ｐ上に配置されている。媒質容器１５には、ハンギングドロップＤを構成する溶液の屈折率と同等の屈折率を有する液浸媒質Ｗが貯留されている。
本実施形態においては、媒質容器１５は、ハンギングドロップ形成器具１をＹ方向に移動させることによって、Ｙ方向に配列された４個のハンギングドロップ形成部９により支持される各ハンギングドロップＤを検出光軸Ｐ上に択一的に配置可能な大きさを有している。これにより、駆動装置２５により、ハンギングドロップ形成器具１をＺ方向に移動させることなくＹ方向に移動させるだけで、４個のハンギングドロップＤを検出光軸Ｐ上に選択的に配置することができる。
液浸媒質Ｗは発光基質を含んでいる。本実施形態において用いられる細胞凝集塊Ｇは、観察対象部位に発光遺伝子が導入されており、液浸媒質Ｗに浸漬されることにより生物発光するようになっている。
検出光学系２３は、検出光軸Ｐ上に媒質容器１５の底部１５ａに対向して配置された対物レンズ２９と、対物レンズ２９により集光された光を反射する反射ミラー３１と、反射ミラー３１により反射された光を結像させる結像レンズ３３と、結像レンズ３３により結像された光を撮影するカメラ３５とを備えている。
制御器２７は、例えば、ＣＰＵ(Central Processing Unit）と、ＲＯＭ（Read Only Memory）およびＲＡＭ（Random Access Memory）等の主記憶部と、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）等の補助記憶部と、ユーザが指示を入力する入力部と、データを出力する出力部と、外部機器との間で種々のデータのやりとりを行う外部インタフェース等（いずれも図示略）を備えている。補助記憶部には各種プログラムが格納されており、ＣＰＵが補助記憶部からプログラムをＲＡＭ等の主記憶部に読み出して、そのプログラムを実行することにより、種々の処理が実現されるようになっている。
具体的には、制御器２７は、プログラムの実行により、駆動装置２５を駆動してハンギングドロップ形成器具１を移動させ、観察対象のハンギングドロップＤの細胞凝集塊Ｇを検出光軸Ｐ上に配置するようになっている。また、制御器２７は、カメラ３５を制御して、画像を生成するようになっている。
次に、本実施形態に係る観察方法は、細胞凝集塊Ｇを内包させた媒質溶液Ｍの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤを支持し、媒質容器１５の液浸媒質Ｗ内に観察対象のハンギングドロップＤを浸漬させて、ハンギングドロップＤ内の細胞凝集塊Ｇからの観察光を検出するようになっている。
このように構成された観察装置２１および観察方法の作用について説明する。
本実施形態に係る観察装置２１および観察方法により細胞凝集塊Ｇを観察するには、まず、ハンギングドロップ形成器具１により、各ハンギングドロップ形成部９において、細胞凝集塊Ｇが内包された媒質溶液Ｍの液滴が吊り下げられた状態からなるゲル化または固体化した略透明なハンギングドロップＤを支持する。
そして、制御器２７により駆動装置２５を駆動してハンギングドロップ形成器具１を移動させ、観察対象の細胞凝集塊Ｇが内包されたハンギングドロップＤを媒質容器１５の液浸媒質Ｗに浸漬させて、検出光軸Ｐ上に細胞凝集塊Ｇを配置する。
細胞凝集塊Ｇの観察部位には発光遺伝子が導入され、液浸媒質Ｗには発光基質が含まれているので、ハンギングドロップＤが液浸媒質Ｗに浸漬されることにより細胞凝集塊Ｇが生物発光する。細胞凝集塊Ｇの観察部位において発生した発光の内、鉛直下方に向けて放射された発光は、液浸媒質Ｗおよび媒質容器１５の透明な底部１５ａを介して対物レンズ２９により集光される。対物レンズ２９により集光された発光は、反射ミラー３１により反射された後、結像レンズ３３によりカメラ３５の撮像面上に結像される。これにより、カメラ３５において、細胞凝集塊Ｇの観察像が得られる。
制御器２７により駆動装置２５を駆動して、媒質容器１５内でハンギングドロップＤをＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させることで、細胞凝集塊Ｇの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。また、ハンギングドロップ形成器具１をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させて、検出光軸Ｐ上に配置するハンギングドロップＤを変更することにより、他のハンギングドロップＤに内包されている細胞凝集塊Ｇを観察することができる。
以上説明したように、本実施形態に係る観察装置２１および観察方法によれば、ハンギングドロップＤ内の細胞凝集塊Ｇからの発光を検出光学系２３により検出して、細胞凝集塊Ｇを観察することができる。したがって、ハンギングドロップＤを落下させるウエルを用いることなく、複数の試料を短時間かつ低コストで観察することができる。
本実施形態においては、媒質容器として、透明な底部１５ａおよび側壁部１５ｂを有する媒質容器１５を例示して説明したが、少なくとも底部における検出光軸Ｐ上に光を透過可能な観察光透過用透明部を有するものであればよい。
〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る観察装置および観察方法について説明する。
本実施形態に係る観察装置４１は、図１１に示すように、倒立型ライトシート顕微鏡を構成する点で第２実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る試料作製方法、第２実施形態に係る観察装置２１および観察方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
観察装置４１は、ハンギングドロップ形成器具１と、媒質容器１５と、駆動装置２５と、照明光学系４３と、検出光学系２３と、制御器２７とを備えている。
照明光学系４３は、レーザ光を発生するレーザ光源４５と、レーザ光源４５から発せられたレーザ光を導光する光ファイバ４７と、光ファイバ４７の射出端から射出されたレーザ光を平行光束に変換するコリメートレンズ４９と、コリメートレンズ４９により平行光束に変換されたレーザ光の光束径を変更可能な可変絞り５１と、可変絞り５１を通過したレーザ光を検出光軸Ｐに直交する平面に沿う平面状に集光するシリンドリカルレンズ５３と、シリンドリカルレンズ５３により集光されたレーザ光を反射して、検出光軸Ｐに直交する照明光軸Ｑに沿って媒質容器１５の透明な側壁部１５ｂを介してハンギングドロップＤにレーザ光を入射させる２つの反射ミラー５５，５７とを備えている。
可変絞り５１は、図１２に示すように、４枚の遮光羽５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄを有している。これら４枚の遮光羽５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄをコリメートレンズ４９の光軸に交差する方向に移動させることにより、レーザ光の光束径を変更することができるようになっている。可変絞り５１によりレーザ光の光束径を変更することで、シリンドリカルレンズ５３により平面状に集光するレーザ光の厚さと幅を変更することができる。
シリンドリカルレンズ５３は、照明光学系４３の照明光軸Ｑに直交する一方向にパワーを有している。このシリンドリカルレンズ５３は、略平行光束からなるレーザ光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有する平面状に集光して、検出光学系２３の検出光軸Ｐ上で焦点を結ばせるようになっている。
検出光学系２３は、対物レンズ２９を検出光軸Ｐに沿う方向に移動させる照準部５９を備えている。照準部５９は、対物レンズ２９を検出光軸Ｐに沿う方向に微動させることにより、対物レンズ２９の焦点位置を検出光軸Ｐに沿う方向に微調整することができるようになっている。
制御器２７は、プログラムの実行により、レーザ光源４５およびカメラ３５の制御、駆動装置２５の制御、画像生成の他に、可変絞り５１によるレーザ光の光束径の調整と、照準部５９による検出光学系２３の検出光軸Ｐに沿う方向の対物レンズ２９の位置の微調整とを制御するようになっている。
このように構成された観察装置４１および観察方法の作用について説明する。
本実施形態に係る観察装置４１および観察方法により細胞凝集塊Ｇを観察するには、まず、制御器２７により駆動装置２５を駆動してハンギングドロップ形成器具１を移動させ、観察対象の細胞凝集塊Ｇが内包されたゲル化または固体化された略透明なハンギングドロップＤを媒質容器１５内の液浸媒質Ｗに浸漬して、細胞凝集塊Ｇを照明光軸Ｑおよび検出光軸Ｐ上に配置し、レーザ光源４５からレーザ光を発生させる。
レーザ光源４５から発せられたレーザ光は、光ファイバ４７により導光されてコリメートレンズ４９により平行光束にされ、可変絞り５１により光束径が制限される。可変絞り５１を通過したレーザ光は、シリンドリカルレンズ５３により平面状に集光された後、反射ミラー５５，５７により反射されて、媒質容器１５の側壁部１５ｂを透過して媒質容器１５内に入射される。
媒質容器１５内に入射されたレーザ光は、液浸媒質Ｗを介して、検出光軸Ｐに直交する方向からハンギングドロップＤ内の細胞凝集塊Ｇに入射される。細胞凝集塊Ｇに平面状のレーザ光が入射することにより、レーザ光の入射平面に沿って細胞凝集塊Ｇ内の蛍光物質が励起されて蛍光（観察光）が発生する。
細胞凝集塊Ｇにおいて発生した蛍光の内、検出光軸Ｐに沿う方向に放射された蛍光は、ハンギングドロップＤから媒質溶液Ｍ、媒質容器１５の底部１５ａを介して対物レンズ２９により集光される。対物レンズ２９により集光された蛍光は、反射ミラー３１により反射されて結像レンズ３３によりカメラ３５の撮像面上に結像される。これにより、カメラ３５において、細胞凝集塊Ｇの検出光軸Ｐに直交する断層像が得られる。
この場合において、細胞凝集塊Ｇが媒質容器１５の底部１５ａから間隔をあけて配置されるようにすることが好ましい。細胞凝集塊Ｇが媒質容器１５の底部１５ａに接していると、底部１５ａの屈折率が液浸媒質Ｗの屈折率と等しくない場合は、細胞凝集塊Ｇにおける底部１５ａに接する部分を良好に観察することができない。細胞凝集塊Ｇが媒質容器１５の底部１５ａから間隔をあけて配置されるようにすることで、媒質容器１５の底部１５ａの屈折率に関わらず、細胞凝集塊Ｇの全体を良好に観察することができる。
制御器２７により駆動装置２５を駆動して、媒質容器１５内でハンギングドロップＤをＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させることで、細胞凝集塊Ｇの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。また、ハンギングドロップ形成器具１をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させて、検出光軸Ｐ上に配置するハンギングドロップＤを変更することにより、他のハンギングドロップＤに内包されている細胞凝集塊Ｇを観察することができる。
ここで、シリンドリカルレンズ５３の焦点位置と対物レンズ２９の光軸（検出光軸Ｐ）とを一致させるとともに、レーザ光の入射平面に対物レンズ２９の焦点面を一致させることにより、対物レンズ２９の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を対物レンズ２９により１度に集光してカメラ３５により撮影し、細胞凝集塊Ｇにおける観察部位の鮮明な蛍光画像を取得することができる。また、カメラ３５の撮像平面以外にレーザ光が照射されないので、蛍光の褪色を抑えて良好な３次元立体像を得ることができる。
また、ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液Ｍの屈折率と液浸媒質Ｗの屈折率との間に差がある場合において、細胞凝集塊ＧのＸＹＺスタック画像を撮像するために、細胞凝集塊ＧをＺ方向に移動させると、レーザ光の入射平面と対物レンズ２９の焦点面とにずれが生じることがある。この場合、制御器２７によって照準部５９を駆動して、対物レンズ２９の検出光軸Ｐに沿う方向の位置を微調整することにより、焦点位置のずれを解消することができる。
本実施形態においては、例えば、照明光学系４３が、レーザ光を照明光軸Ｑに交差する方向に走査する走査部材を備え、光走査によって照明光軸Ｑに交差する方向に幅を有するレーザ光を形成することとしてもよい。
〔第４実施形態〕
次に、本発明の第４実施形態に係る観察装置および観察方法について説明する。
本実施形態に係る観察装置６１は、図１３に示すように、倒立型ライトフィールド顕微鏡を構成する点で第３実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る試料作製方法、第２，第３実施形態に係る観察装置２１，４１および観察方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
観察装置６１は、ハンギングドロップ形成器具１と、媒質容器１５と、駆動装置２５と、照明光学系４３と、検出光学系２３と、制御器２７とを備えている。
照明光学系４３は、レーザ光源４５と、光ファイバ４７と、コリメートレンズ４９と、可変絞り５１と、２つの反射ミラー５５，５７とを備えている。
検出光学系２３は、対物レンズ２９と、反射ミラー３１と、結像レンズ３３と、複数のマイクロレンズ６３ａからなるマイクロレンズアレイ６３と、カメラ３５とを備えている。また、対物レンズ２９には照準部５９が備えられている。
結像レンズ３３は、反射ミラー３１からの蛍光をマイクロレンズアレイ６３上に結像させるように配置されている。
マイクロレンズアレイ６３は、対物レンズ２９の略焦点位置に配置されており、結像レンズ３３により結像された蛍光を複数のマイクロレンズ６３ａにより集光して、カメラ３５の撮像面に像を投影させるようになっている。
このように構成された観察装置６１および観察方法の作用について説明する。
本実施形態に係る観察装置６１および観察方法により細胞凝集塊Ｇを観察するには、まず、制御器２７により駆動装置２５を駆動してハンギングドロップ形成器具１を移動させ、観察対象の細胞凝集塊Ｇが内包されたゲル化または固体化された略透明なハンギングドロップＤを媒質容器１５内の液浸媒質Ｗに浸漬して、細胞凝集塊Ｇを照明光軸Ｑおよび検出光軸Ｐ上に配置し、レーザ光源４５からレーザ光を発生させる。
レーザ光源４５から発せられたレーザ光は、光ファイバ４７により導光されてコリメートレンズ４９により平行光束に変換され、可変絞り５１によりＹ方向およびＺ方向の両方に幅を有する平行光束で出射された後、反射ミラー５５，５７により反射されて、媒質容器１５の側壁部１５ｂを透過して媒質容器１５内に入射される。
媒質容器１５内に入射されたレーザ光は、液浸媒質Ｗを介して、検出光学系２３の検出光軸Ｐに直交する方向からハンギングドロップＤ内の細胞凝集塊Ｇに入射される。レーザ光が入射されることにより細胞凝集塊Ｇにおいて発生して検出光軸Ｐに沿う方向に放射された蛍光は、ハンギングドロップＤから媒質溶液Ｍ、媒質容器１５の底部１５ａを介して対物レンズ２９により集光される。
対物レンズ２９により集光された蛍光は、反射ミラー３１により反射されて結像レンズ３３によりマイクロレンズアレイ６３の各マイクロレンズ６３ａ上に結像され、カメラ３５の撮像面上に投影される。これにより、カメラ３５において、細胞凝集塊Ｇの撮像データが取得され、制御器２７に撮像データが送られて回復処理され、３次元データが構築される。
以上説明したように、本実施形態に係る観察装置６１および観察方法によれば、細胞凝集塊Ｇの視差が異なる複数の画像情報を１度に取得することができる。
ライトフィールド顕微鏡は、細胞凝集塊ＧのＺ方向の所定の深さデータを１度に取り込むことができるが、取り込み可能な深さがサンプルボリュームに対して不足する場合は、駆動装置２５によりハンギングドロップ形成器具１をＺ方向に移動させて画像データを取得することとすればよい。また、ハンギングドロップ形成器具１をＺ方向に移動させることにより対物レンズ２９の焦点ずれが発生する場合は、照準部５９によりこの焦点ズレを調整することとすればよい。
上記第２、第３、第４実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、例えば、図１４に示すように、複数の媒質容器１５がハンギングドロップ形成器具１の複数の各ハンギングドロップ形成部９に対応して配置された媒質容器マルチウエルプレート６５を採用することとしてもよい。図１４は、観察装置４１を例示している。
図１４に示す例では、媒質容器マルチウエルプレート６５は、ハンギングドロップ形成部９の配列に対応して、媒質容器１５がＸ方向に３個、Ｙ方向に４個配列されている。この媒質容器マルチウエルプレート６５には、ハンギングドロップ形成器具１が載置されており、各ハンギングドロップ形成部９において支持されるハンギングドロップＤが、対応する各媒質容器１５の液浸媒質Ｗに浸漬されるようになっている。この媒質容器マルチウエルプレート６５は、駆動装置２５により、ハンギングドロップ形成器具１と共にＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動可能に支持されている。
このようにすることで、駆動装置２５によりハンギングドロップ形成器具１と共に媒質容器マルチウエルプレート６５をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させることにより、所望の細胞凝集塊Ｇを検出光軸Ｐ上に配置して観察することができる。さらに、ハンギングドロップＤが常に液浸媒質Ｗに浸漬されているので、ゲル化または固体化されたハンギングドロップＤが乾燥するのを防止してスクリーニングすることができる。
本変形例においては、液浸媒質Ｗに培養液を含ませておくこととしてもよい。この場合、ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液Ｍが、培養液の培養成分を透過可能な材質からなるものであればよい。このようにすることで、ハンギングドロップＤを介して必要なガス交換や成分供給が可能となる。これにより、細胞凝集塊Ｇを培養しながらタイムラプス観察することができる。
第２変形例としては、制御器２７が、プログラムの実行により駆動装置２５を駆動してハンギングドロップ形成器具１を移動させ、ハンギングドロップＤと検出光学系２３の検出位置との相対的な位置を変更して、検出光学系２３の検出光軸Ｐ上に各細胞凝集塊Ｇを順次位置合わせすることとしてもよい。
このようにすることで、検出光学系２３の検出光軸Ｐ上に位置合わせされる順に、複数の細胞凝集塊Ｇを観察していくことができる。
また、制御器２７が、プログラムに基づいて、所定の時間間隔で細胞凝集塊Ｇを撮影するタイムラプス観察を行うシーケンス制御を実行することとしてもよい。
このようにすることで、ハンギングドロップＤに内包される細胞凝集塊Ｇの時系列変化を観察することができる。
また、第３変形例としては、例えば、図１５に示すように、対物レンズとして、略鉛直上方に光軸を向けて配置された液浸対物レンズ６７を採用することとしてもよい。また、液浸対物レンズ６７により媒質容器１５を支持することとしてもよい。具体的には、液浸対物レンズ６７の先端部６７ａと、先端部６７ａに軸方向の一端が取り付けられる筒状部材６９とにより媒質容器を構成することとしてもよい。
この場合、先端部６７ａと筒状部材６９との隙間にＯリング等のシールド部材７１を配置することとすればよい。また、筒状部材６９は、光を透過可能な材質により形成するか、照明光軸Ｑ上に光を透過可能な透明部（照明光透過用透明部）を有することとすればよい。
このようにすることで、液浸対物レンズ６７の先端部６７ａを媒質容器の底部として用いることにより、媒質容器を安価に構成することができる。
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
また、例えば、上記各実施形態においては、媒質容器１５が透明な底部１５ａおよび側壁部１５ｂを有することとしたが、底部および側壁部の全てが透明である必要はなく、媒質容器１５が、照明光学系４３からのレーザ光を透過可能な照明光透過用透明部および細胞凝集塊Ｇからの観察光を透過可能な観察光透過用透明部を有するものであればよい。
１ ハンギングドロップ形成器具
３ 窪み部
５ ハンギングドロップ形成区画
７ 導管
１３ ロッド（ハンギングドロップ形成器具）
１５ 媒質容器
１５ａ 底部（透明部、観察光透過用透明部）
１５ｂ 側壁部（透明部、照明光透過用透明部）
２１，４１，６１ 観察装置
２３ 検出光学系
２５ 駆動装置
２７ 制御器（制御部）
２９ 対物レンズ
３５ カメラ
４３ 照明光学系
６３ マイクロレンズアレイ
６３ａ マイクロレンズ
６７ 液浸対物レンズ
６７ａ 先端部
６９ 筒状部材
Ｃ 培養液
Ｄ ハンギングドロップ
Ｇ 細胞凝集塊
Ｈ 促進溶液
Ｍ 媒質溶液
Ｓ 細胞
Ｔ 透明化溶液
Ｗ 液浸媒質

Claims (45)

  1. ゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液の液滴に少なくとも１つの細胞凝集塊を内包させて、前記媒質溶液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するステップと、
    前記媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進因子を前記ハンギングドロップに作用させて、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させるステップとを含む試料作製方法。
  2. 培養液の液滴に少なくとも１つの細胞を内包させて、前記培養液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するステップと、
    前記ハンギングドロップ内で、前記細胞が所望の細胞凝集塊を形成するまで培養するステップと、
    ゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液を前記ハンギングドロップに加えるステップと、
    前記媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進因子を前記ハンギングドロップに作用させて、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させるステップとを含む試料作製方法。
  3. 培養液およびゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液の液滴に少なくとも１つの細胞を内包させ、前記培養液および前記媒質溶液の液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するステップと、
    前記ハンギングドロップ内で、前記細胞が所望の細胞凝集塊を形成するまで培養するステップと、
    前記媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進因子を前記ハンギングドロップに作用させて、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させるステップとを含む試料作製方法。
  4. 前記細胞を培養後、前記ハンギングドロップに前記媒質溶液を加える前に、前記ハンギングドロップから前記培養液を吸引するステップを含む請求項２に記載の試料作製方法。
  5. 前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させる前に、前記媒質溶液のゲル化または固体化の促進を阻害してゲル化または固体化を遅延させる阻害溶液を前記媒質溶液に加えるステップを含む請求項１から請求項４のいずれかに記載の試料作製方法。
  6. 前記ハンギングドロップに前記促進因子を作用させる前に、前記細胞凝集塊を透明にする透明化溶液を前記ハンギングドロップに加えるステップを含む請求項１から請求項５のいずれかに記載の試料作製方法。
  7. 前記ハンギングドロップが、前記細胞凝集塊よりも小さい比重を有する溶液により構成される請求項１から請求項６のいずれかに記載の試料作製方法。
  8. 前記促進因子が温度である請求項１から請求項７のいずれかに記載の試料作製方法。
  9. 前記媒質溶液がアガロースである請求項８に記載の試料作製方法。
  10. 前記促進因子が光である請求項１から請求項７のいずれかに記載の試料作製方法。
  11. 前記媒質溶液が紫外線硬化型の液状樹脂である請求項１０に記載の試料作製方法。
  12. 前記媒質溶液を前記促進因子としての促進溶液と接触させることにより、前記ハンギングドロップをゲル化または固体化させる請求項１から請求項４のいずれかに記載の試料作製方法。
  13. 前記ハンギングドロップが、前記促進溶液に浸漬されてゲル化または固体化される請求項１２に記載の試料作製方法。
  14. 前記媒質溶液がアルギン酸ナトリウム溶液であり、
    前記促進溶液が、カルシウムイオンが溶解されてなるカルシウム溶液である請求項１２または請求項１３に記載の試料作製方法。
  15. 前記媒質溶液がエポキシ系の液状樹脂であり、
    前記促進溶液が、ポリアミン類が溶解されてなるポリアミン溶液である請求項１２または請求項１３に記載の試料作製方法。
  16. 溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を前記細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備えるハンギングドロップ形成器具を用いて、前記ハンギングドロップを形成する請求項１から請求項１５のいずれかに記載の試料作製方法。
  17. 前記ハンギングドロップ形成器具の前記窪み部を介して前記溶液を分注する請求項１６に記載の試料作製方法。
  18. 前記ハンギングドロップ形成器具が、アレイ構造を有するマルチウエルプレートである請求項１６または請求項１７に記載の試料作製方法。
  19. 溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備えるハンギングドロップ形成器具と、
    前記窪み部に細胞と共に注入されるゲル化または固体化時に略透明な媒質溶液と、
    該媒質溶液のゲル化または固体化を促進させる促進溶液とを備える試料作製キット。
  20. 細胞凝集塊を内包させた液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを支持し、
    該ハンギングドロップ内の前記細胞凝集塊からの観察光を検出する観察方法。
  21. 光を透過可能な透明部を有する媒質容器内に貯留された、前記ハンギングドロップを構成する溶液の屈折率と同等の屈折率を有する液浸媒質内に、前記細胞凝集塊を内包しゲル化または固体化された前記ハンギングドロップを浸漬させ、
    前記細胞凝集塊からの前記観察光を前記透明部を介して検出する請求項２０に記載の観察方法。
  22. 前記細胞凝集塊に照明光を照射することにより、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出する請求項２０または請求項２１に記載の観察方法。
  23. 前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出する検出光学系の検出光軸に交差する方向から前記媒質容器の前記透明部を介して前記細胞凝集塊に照明光を照射する請求項２１に記載の観察方法。
  24. 前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出する検出光学系の検出光軸に交差する方向から前記媒質容器の前記透明部を介して前記細胞凝集塊に照明光を照射し、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を前記検出光学系により検出する請求項２１に記載の観察方法。
  25. 前記細胞凝集塊が、前記媒質容器の底面から間隔をあけて配置される請求項２１、請求項２３および請求項２４のいずれかに記載の観察方法。
  26. 前記細胞凝集塊が、前記媒質容器の底面から間隔をあけて配置され、
    前記細胞凝集塊に照明光を照射することにより、前記細胞凝集塊から発せられる前記観察光を検出する請求項２１、請求項２３および請求項２４のいずれかに記載の観察方法。
  27. 溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を前記細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備えるハンギングドロップ形成器具を用いて、前記ハンギングドロップを支持する請求項２０から請求項２６のいずれかに記載の観察方法。
  28. 前記ハンギングドロップ形成器具の前記窪み部を介して前記溶液を分注する請求項２７に記載の観察方法。
  29. 前記細胞凝集塊を内包させた前記ハンギングドロップを複数支持して観察に供する請求項２０から請求項２８のいずれかに記載の観察方法。
  30. 液滴が細胞凝集塊を内包して吊り下げられた状態からなるハンギングドロップを形成するハンギングドロップ形成器具と、
    該ハンギングドロップ形成器具により形成された前記ハンギングドロップ内に内包されている前記細胞凝集塊から発せられる観察光を検出する検出光学系と、
    前記ハンギングドロップ形成器具により支持された前記ハンギングドロップと前記検出光学系の検出位置との相対的な位置を変更する駆動装置とを備える観察装置。
  31. 前記ハンギングドロップ形成器具が、溶液が注入される窪み部と、該窪み部に注入された前記溶液の液滴を前記細胞凝集塊を内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画と、これら窪み部とハンギングドロップ形成区画とを繋ぐ導管とを備える請求項３０に記載の観察装置。
  32. 前記ハンギングドロップを構成する前記液滴の屈折率と同等の屈折率を有する液浸媒質が貯留され、前記細胞凝集塊からの前記観察光を透過可能な媒質容器を備え、
    前記駆動装置が、前記細胞凝集塊を内包しゲル化または固体化された前記ハンギングドロップを前記液浸媒質に浸漬させるよう、前記ハンギングドロップ形成器具を移動させる請求項３０または請求項３１に記載の観察装置。
  33. 前記媒質容器が、前記細胞凝集塊からの前記観察光を透過可能な観察光透過用透明部を有する請求項３２に記載の観察装置。
  34. 前記媒質容器が、前記検出光学系の対物レンズに支持されている請求項３３に記載の観察装置。
  35. 前記対物レンズが、略鉛直上方に光軸を向けて配置される液浸対物レンズであり、
    前記媒質容器が、前記液浸対物レンズの先端部と、該先端部に軸方向の一端が取り付けられる筒状部材とにより構成されている請求項３４に記載の観察装置。
  36. 前記細胞凝集塊に照明光を照射する照明光学系を備え、
    前記媒質容器が、前記照明光学系からの前記照明光を透過する照明光透過用透明部を有する請求項３２から請求項３５のいずれかに記載の観察装置。
  37. 前記照明光学系が、前記検出光学系の検出光軸に交差する方向から、照明光軸に交差する方向に幅と厚さを有する前記照明光を射出する請求項３６に記載の観察装置。
  38. 前記照明光学系の光軸と前記検出光学系の光軸とが互いに直交している請求項３７に記載の観察装置。
  39. 前記照明光学系が、前記検出光学系の視野内で検出光軸に沿う方向に集光した平面状の前記照明光を前記細胞凝集塊に入射させる請求項３６から請求項３８のいずれかに記載の観察装置。
  40. 前記照明光学系が、光走査によって照明光軸に交差する方向に幅を有する前記照明光を形成する請求項３９に記載の観察装置。
  41. 前記検出光学系が、略結像位置に配置されるマイクロレンズと、該マイクロレンズの後方に配置されるカメラとを備える請求項３６から請求項３８および請求項４０のいずれかに記載の観察装置。
  42. 前記ハンギングドロップ形成器具が、複数の前記ハンギングドロップを支持可能なアレイ構造を有するマルチウエルプレートであり、
    前記駆動装置が、前記ハンギングドロップと前記検出光学系の検出位置との相対的な位置を変更して、前記検出光学系の検出光軸上に各前記細胞凝集塊を順次位置合わせする請求項３０から請求項４１のいずれかに記載の観察装置。
  43. 前記液浸媒質が培養液を含み、
    前記ハンギングドロップを構成する前記液滴が、前記培養液の培養成分を透過可能な材質からなる請求項３２から請求項４１のいずれかに記載の観察装置。
  44. 前記ハンギングドロップ形成器具が、複数の前記ハンギングドロップを支持可能なアレイ構造を有するマルチウエルプレートであり、
    前記液浸媒質が培養液を含み、
    前記ハンギングドロップを構成する前記液滴が、前記培養液の培養成分を透過可能な材質からなり、
    前記駆動装置が、前記ハンギングドロップと前記検出光学系の検出位置との相対的な位置を変更して、前記検出光学系の検出光軸上に各前記細胞凝集塊を順次位置合わせする請求項３２から請求項４１のいずれかに記載の観察装置。
  45. タイムラプス観察を行うシーケンス制御を実行する制御部を備える請求項４２または請求項４３に記載の観察装置。
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