JP2018535197A - タグ付きコンビナトリアルライブラリ化合物のLogDを推定する方法 - Google Patents
タグ付きコンビナトリアルライブラリ化合物のLogDを推定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018535197A JP2018535197A JP2018517731A JP2018517731A JP2018535197A JP 2018535197 A JP2018535197 A JP 2018535197A JP 2018517731 A JP2018517731 A JP 2018517731A JP 2018517731 A JP2018517731 A JP 2018517731A JP 2018535197 A JP2018535197 A JP 2018535197A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- matrix
- logd
- adsorbed
- ligand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物のLogDを推定する方法が本明細書に開示される。これらの方法は、一般に、化合物をマトリックスと接触させるステップ、化合物とマトリックスの相互作用を測定するステップ、及び化合物とマトリックスの相互作用を化合物のLogDと関連付けるステップを含む。また、認識要素と作動可能に連結したリガンド及びリガンドを認識要素に連結させるリンカーを含む新規の化合物も本明細書に開示される。
Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)に従い、2015年10月9日に提出された米国仮特許出願第62239824号明細書(その全体を参照により本明細書に組み込む)からの優先権を主張する。
認識要素(recognition element)と作動可能に連結したリガンドを含む化合物のLogDを推定する方法が本明細書に開示される。これらの方法は、一般に、化合物をマトリックスと接触させるステップ、化合物とマトリックスの相互作用を測定するステップ、及び化合物とマトリックスの相互作用を化合物のLogDと相関させるステップを含む。また、認識要素と作動可能に連結したリガンド及びリガンドを認識要素に連結させるリンカーを含む新規の化合物も本明細書に開示される。
コンビナトリアルライブラリは、30年以上前に最初に開発され、現在では、多種多様な生物学的標的(例えば、受容体、酵素、核酸など)に対する新規の、高い親和性リガンドを同定するのに常用されていることから、薬物の発見において重要性が増している。タグ付きコンビナトリアルライブラリ、特に、DNAと作動可能に結合したリガンドが受ける合成ステップを記録するためのタグとしてDNAを使用するライブラリが、特に、近年では注目されている。DNAシークエンシング、PCR技術及びリガンドアッセイ開発の進歩によって、DNAと作動可能に連結したリガンドの複雑な混合物から、生物学的標的に結合するDNAと作動可能に連結したリガンドを同定し、選択する方法が提供されている(Harbury,et al.,米国特許第7,479,472号明細書;Liu et al.,米国特許第7,070,928号明細書;Liu et al.,米国特許第7,223,545号明細書;Liu et al.,米国特許第7,442,160号明細書;Liu et al.,米国特許第7,491,160号明細書;Liu et al.,米国特許第7,557,068号明細書;Liu et al.,米国特許第7,771,935号明細書;Liu et al.,米国特許第7,807,408号明細書;Liu et al.,米国特許第7,998,904号明細書;Liu et al.,米国特許第8,017,323号明細書;Liu et al.,米国特許第8,183,178号明細書;Pedersen et al.,米国特許第7,277,713号明細書;Pedersen et al.,米国特許第7,413,854号明細書;Gouliev et al.,米国特許第7,704,925号明細書;Franch et al.,米国特許第7,915,201号明細書;Gouliev et al.,米国特許第8,722,583号明細書;Freskgard et al.,米国特許出願公開第2006/0269920号明細書;Freskgard et al.,米国特許出願公開第2012/0028812号明細書;Hansen et al.,米国特許第7,928,211号明細書;Hansen et al.,米国特許第8,202,823号明細書;Hansen et al.,米国特許出願公開第2013/0005581号明細書;Hansen et al.,米国特許出願公開第2013/0288929号明細書;Neri et al.,米国特許第8,642,514号明細書;Neri et al.,米国特許第8,673,824号明細書;Neri et al.,米国特許出願公開第2014/01288290号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,972,992号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,935,658号明細書;Morgan et al.,米国特許出願公開第2011/0136697号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,972,994号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,989,395号明細書;Morgan et al.,米国特許第8,410,028号明細書;Morgan et al.,米国特許第8,598,089号明細書;Morgan et al.,米国特許出願第14/085,271号明細書;Wagner et al.,米国特許出願公開第2012/0053901号明細書;Keefe et al.,米国特許出願公開第2014/0315762号明細書;Dower et al.,米国特許第6,140,493号明細書;Lerner et al.,米国特許第6,060,596号明細書;Dower et al.,米国特許第5,789,162号明細書;Lerner et al.,米国特許第5,723,598号明細書;Dower et al.,米国特許第5,708,153号明細書;Dower et al.,米国特許第5,639,603号明細書;Lerner et al.,米国特許第5,573,905号明細書)。
しかしながら、リガンドがタグ部分と作動可能に連結されるほとんどのコンビナトリアルライブラリは、単一の活性、すなわち、特定の生物学的標的に対する結合親和性について検定される。多くの場合、例えば、バイオアベイラビリティ、生理条件下での安定性、毒性及び/又は親油性(吸収及び分布にとって重要である)もまた、好適な薬物候補を同定する上で非常に重要である。
生体膜全体に受動的に拡散する特性は、親油性と大きく相関し、これは、経口投与されるほとんどの薬物、及び生物学的標的が細胞内である全ての薬物にとって不可欠である。従って、親油性は、薬物候補の最も重要な特性の1つである。例えば、5を超えるオクタノール−水係数(LogD)を有する化合物は、一般に、さらなる開発には候補として望ましくない。計算論的アプローチに基づいてこのパラメータを正確に推定する能力は非常に限られており、このパラメータを実験的に測定することは、薬物開発に依然として不可欠である。
親油性は、個々の有機化合物について定期的に測定することができるが、タグ付きコンビナトリアルケミストリー法により提供されるものなどの類似したリガンドの複雑な混合物中で認識要素と作動可能に連結したリガンドの親油性を推定する方法は、まだ開発されていない。従って、必要とされるのは、リガンドが認識要素と作動可能に連結されているコンビナトリアルライブラリの化合物の親油性を推定する方法である。このような方法は、コンビナトリアルライブラリから得られる、薬物候補としてのさらなる最適化に適した特性を備える化合物を同定する上で大いに役立ち、従って、薬物開発の効率を高めるであろう。
これらの、及びその他のニーズを満たす化合物及び方法が本明細書において提供される。第1の態様では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む1つの化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物を脂質マトリックスと接触させるステップ、脂質マトリックスに吸着されていない化合物から脂質マトリックスに吸着された化合物を分離するステップ、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量を測定するステップを含み、ここで、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量の測定が、化合物のLogDの推定をもたらす。
第2の態様では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物を脂質マトリックスと接触させるステップ、脂質マトリックスに吸着されていない化合物から脂質マトリックスに吸着された化合物を分離するステップ、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量を測定するステップを含み、ここで、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量の測定が、化合物のLogDの推定をもたらす。
第3の態様では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む1つの化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をゲルマトリックスと接触させるステップ、電圧勾配をゲルマトリックスに適用するステップ、及びゲルマトリックス上の化合物のRfを測定するステップを含み、ここで、ゲルマトリックス上の化合物のRfが、化合物のLogDの推定をもたらす。
第4の態様では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をゲルマトリックスと接触させるステップ、電圧勾配をゲルマトリックスに適用するステップ、並びにゲルマトリックス上の化合物のRfを測定するステップを含み、ここで、ゲルマトリックス上の化合物のRfが、化合物のLogDの推定をもたらす。
第5の態様では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む1つの化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をクロマトグラフィーマトリックスと接触させるステップ、並びにクロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間を測定するステップを含み、ここで、クロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間測定値が、化合物のLogDの推定をもたらす。
第6の態様では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をクロマトグラフィーマトリックスと接触させるステップ、並びにクロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間を測定するステップを含み、ここで、クロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間測定値が、化合物のLogDの推定をもたらす。
第7の態様では、3’末端で可変の第1リガンドと作動可能に連結した1つのオリゴヌクレオチドで、隣接した5’末端にある定常第2リガンドと作動可能に連結した相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたものを含む二本鎖DNA分子が提供され、ここで、第2リガンドのLogDは、6より大きい。
第8の態様では、二本鎖DNA分子の2つまたはそれ以上の第1リガンドのLogDを推定する方法において、上記の分子が使用される。この方法は、二本鎖DNA分子を脂質マトリックスと接触させるステップ、脂質マトリックスに吸着されていない二本鎖DNA分子から、脂質マトリックスに吸着された二本鎖DNA分子を分離するステップ、並びに脂質マトリックスに吸着された二本鎖DNA分子の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない二本鎖DNAの量を測定するステップを含み、ここで、脂質マトリックスに吸着された二本鎖DNAの量及び/又は脂質マトリックスによって吸着されていない二本鎖の量の測定が、二本鎖DNA分子の第1リガンドのLogDの推定をもたらす
。
。
第9の態様では、式(I):
RE−(X1)−(C1X2)n−(C2X3)o−La (I)
(式中、REは、認識要素であり、Laは、リガンドであり、C1及びC2は、個々に結合要素であり、n及びoは、個々に0又は1であり;X1、X2及びX3は、官能基である)の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
RE−(X1)−(C1X2)n−(C2X3)o−La (I)
(式中、REは、認識要素であり、Laは、リガンドであり、C1及びC2は、個々に結合要素であり、n及びoは、個々に0又は1であり;X1、X2及びX3は、官能基である)の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
さらに別の態様では、式(II):
REc−(X4)−(C3X5)k−(C4X6)l−Lb (II)
(式中、REcは、認識要素であり、Lbは、類似した若しくは同一の疎水性を有するリガンドであり、C3及びC4は、個々にリンカーであり、X4、X5及びX6は、官能基であり、k及びlは、個々に0又は1である)
の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
REc−(X4)−(C3X5)k−(C4X6)l−Lb (II)
(式中、REcは、認識要素であり、Lbは、類似した若しくは同一の疎水性を有するリガンドであり、C3及びC4は、個々にリンカーであり、X4、X5及びX6は、官能基であり、k及びlは、個々に0又は1である)
の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
第11の態様では、式(II)の化合物とハイブリダイズした式(I)の化合物を含む化合物が提供される。ここで、式中、RE及びREcは、個々に、オリゴヌクレオチド、一本鎖RNA又は一本鎖DNAであり、C1、C2、n、o、X1、X2、X3、La、Lb、C3、C4、k、l、X4、X5及びX6は、上に定義した通りである。
定義
他に定義がされない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。1つの用語に複数の定義が存在する場合には、他に明示されない限り、このセクションでの定義が優先する。
他に定義がされない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。1つの用語に複数の定義が存在する場合には、他に明示されない限り、このセクションでの定義が優先する。
本明細書で、並びに添付のクレームで使用されるとき、文脈上明らかに他の解釈を要する場合を除き、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「1つのタグ」に対しては、複数のそうしたタグへの言及を含み、「その化合物」に対しては、1つ又は複数の化合物、並びに当業者には周知の同等物への示唆を含むことになる。
さらに、クレームが、あらゆる任意選択の要素を排除するために記載され得ることも指摘される。従って、この記載事項は、クレーム要素の列挙に関して、「単独に」、「のみ」などの排他的用語の使用、又は「消極的」限定の使用のための先行詞の役割を果たすことが意図される。
本明細書で使用されるとき、別に明示されない限り、「約」及び「およそ」という用語は、数値又は数値の範囲を含む特性に関して使用される場合、数値又は数値の範囲が、特定の特性を依然として記述しながら、当業者には妥当とみなされる範囲まで逸脱し得ることを示す。具体的には、「約」及び「およそ」という用語は、本発明に関して使用される場合、数値又は数値の範囲が、特定の確固たる形態を依然として記述しながら、列挙される数値又は数値の範囲の5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%だけ変化し得ることを示す。
「アルキル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、親アルカン、アルケン若しくはアルキンの単一炭素原子からの1個の水素原子の除去によって得られる飽和若しくは不飽和、分岐、直鎖若しくは環状の1価炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルキル基として、限定されないが、以下:メチル;エタニル、エテニル、エチニルなどのエチル;プロパン−1−イル、プロパン−2−イル、シクロプロパン−1−イル、プロプ−1−エン−1−イル、プロプ−1−エン−2−イル、プロプ−2−エン−1−イル(アリル)、シクロプロプ−1−エン−1−イル;シクロプロプ−2−エン−1−イル、プロプ−1−イン−1−イル、プロプ−2−イン−1−イルなどのプロピル;ブタン−1−イル、ブタン−2−イル、2−メチル−プロパン−1−イル、2−メチル−プロパン−2−イル、シクロブタン−1−イル、ブト−1−エン−1−イル、ブト−1−エン−2−イル、2−メチル−プロプ−1−エン−1−イル、ブト−2−エン−1−イル、ブト−2−エン−2−イル、ブタ−1,3−ジエン−1−イル、ブタ−1,3−ジエン−2−イル、シクロブト−1−エン−1−イル、シクロブト−1−エン−3−イル、シクロブタ−1,3−ジエン−1−イル、ブト−1−イン−1−イル、ブト−1−イン−3−イル、ブト−3−イン−1−イルなどのブチルなどが挙げられる。「アルキル」という用語は、任意の飽和度若しくはレベルを有する基、すなわち、炭素−炭素単結合だけを有する基、1つ又は複数の炭素−炭素二重結合を有する基、1つ又は複数の炭素−炭素三重結合を有する基、並びに単、二重及び三重の炭素−炭素結合の混合を有する基を包含することが特に意図される。特定のレベルの飽和度が意図される場合、「アルカニル」、「アルケニル」、及び「アルキニル」という表現が使用される。一部の実施形態では、アルキル基は、1〜20個の炭素原子を含む(C1〜C20アルキル)。他の実施形態では、アルキル基は、1〜10個の炭素原子を含む(C1〜C10アルキル)。さらに別の実施形態では、アルキル基は、アルキル基は、1〜6個の炭素原子を含む(C1〜C6アルキル)。
「アルカニル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、親アルカンの単一炭素原子からの1個の水素原子の除去によって得られる飽和分岐、直鎖若しくは環状アルキルラジカルを指す。典型的なアルカニル基として、限定されないが、以下:メタニル;エタニル;プロパン−1−イル、プロパン−2−イル(イソプロピル)、シクロプロパン−1−イルなどのプロパニル;ブタン−1−イル、ブタン−2−イル(sec−ブチル)、2−メチル−プロパン−1−イル(イソブチル)、2−メチル−プロパン−2−イル(t−ブチル)、シクロブタン−1−イルなどのブタニルなどが挙げられる。
「アルケニル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、親アルケンの単一炭素原子からの1個の水素原子の除去によって得られる、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和分岐、直鎖若しくは環状アルキルラジカルを指す。この基は、二重結合を中心とするシス又はトランス立体配座のいずれであってもよい。典型的なアルケニル基として、限定されないが、以下:エテニル;プロプ−1−エン−1−イル、プロプ−1−エン−2−イル、プロプ−2−エン−1−イル(アリル)、プロプ−2−エン−2−イル、シクロプロプ−1−エン−1−イル;シクロプロプ−2−エン−1−イルなどのプロペニル;ブト−1−エン−1−イル、ブト−1−エン−2−イル、2−メチル−プロプ−1−エン−1−イル、ブト−2−エン−1−イル、ブト−2−エン−1−イル、ブト−2−エン−2−イル、ブタ−1,3−ジエン−1−イル、ブタ−1,3−ジエン−2−イル、シクロブト−1−エン−1−イル、シクロブト−1−エン−3−イル、シクロブタ−1,3−ジエン−1−イルなどのブテニルなどが挙げられる。
「アルキニル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、親アルキンの単一炭素原子からの1個の水素原子の除去によって得られる、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和分岐、直鎖若しくは環状アルキルラジカルを指す。典型的なアルキニル基として、限定されないが、以下:エチニル;プロプ−1−イン−1−イル、プロプ−2−イン−1−イルなどのプロピニル;ブト−1−イン−1−イル、ブト−1−イン−3−イル、ブト−3−イン−1−イルなどのブチニルが挙げられる。
「アルキルジイル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、親アルカン、アルケン若しくはアルキンの2つの異なる炭素原子の各々からの1個の水素原子の除去によって、又は親アルカン、アルケン若しくはアルキンの単一炭素原子からの2個の水素原子の除去によって得られる飽和若しくは不飽和、分岐、直鎖若しくは環状の2価炭化水素基を指す。2つの1価ラジカル中心又は2価ラジカル中心の各原子価は、同じ又は異なる原子との結合を形成することができる。典型的なアルキルジイル基として、限定されないが、以下:メタンジイル;エタン−1,1−ジイル、エタン−1,2−ジイル、エテン−1,1−ジイル、エテン−1,2−ジイルなどのエチルジイル;プロパン−1,1−ジイル、プロパン−1,2−ジイル、プロパン−2,2−ジイル、プロパン−1,3−ジイル、シクロプロパン−1,1−ジイル、シクロプロパン−1,2−ジイル、プロプ−1−エン−1,1−ジイル、プロプ−1−エン−1,2−ジイル、プロプ−2−エン−1,2−ジイル、プロプ−1−エン−1,3−ジイル、シクロプロプ−1−エン−1,2−ジイル、シクロプロプ−2−エン−1,2−ジイル、シクロプロプ−2−エン−1,1−ジイル、プロプ−1−イン−1,3−ジイルなどのプロピルジイル;ブタン−1,1−ジイル、ブタン−1,2−ジイル、ブタン−1,3−ジイル、ブタン−1,4−ジイル、ブタン−2,2−ジイル、2−メチル−プロパン−1,1−ジイル、2−メチル−プロパン−1,2−ジイル、シクロブタン−1,1−ジイル;シクロブタン−1,2−ジイル、シクロブタン−1,3−ジイル、ブト−1−エン−1,1−ジイル、ブト−1−エン−1,2−ジイル、ブト−1−エン−1,3−ジイル、ブト−1−エン−1,4−ジイル、2−メチル−プロプ−1−エン−1,1−ジイル、2−メタニリデン−プロパン−1,1−ジイル、ブタ−1,3−ジエン−1,1−ジイル、ブタ−1,3−ジエン−1,2−ジイル、ブタ−1,3−ジエン−1,3−ジイル、ブタ−1,3−ジエン−1,4−ジイル、シクロブト−1−エン−1,2−ジイル、シクロブト−1−エン−1,3−ジイル、シクロブト−2−エン−1,2−ジイル、シクロブタ−1,3−ジエン−1,2−ジイル、シクロブタ−1,3−ジエン−1,3−ジイル、ブト−1−イン−1,3−ジイル、ブト−1−イン−1,4−ジイル、ブタ−1,3−ジイン−1,4−ジイルなどのブチルジイルなどが挙げられる。特定の飽和レベルが意図される場合、アルカニルジイル、アルケニルジイル及び/又はアルキニルジイルという名称が使用される。一部の実施形態では、アルキルジイル基は、(C1〜C20)アルキルジイルである。他の実施形態では、アルキルジイル基は、(C1〜C10)アルキルジイルである。さらに別の実施形態では、アルキルジイル基は、(C1〜C6)アルキルジイルである。一部の実施形態では、ラジカル中心が末端炭素、例えば、メタンジイル(メタノ);エタン−1,2−ジイル(エタノ);プロパン−1,3−ジイル(プロパノ);ブタン−1,4−ジイル(ブタノ)にある飽和非環状アルカニルジイル基など(以下に定義されるアルキレノとも呼ばれる)が好ましい。
「アルキレノ」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、直鎖親アルカン、アルケン若しくはアルキンの2個の末端炭素原子の各々からの1個の水素原子の除去によって得られる、2つの末端1価ラジカル中心を有する直鎖アルキルジイル基を指す。典型的なアルキレノ基として、限定されないが、以下:メタノ;エタノ、エテノ、エチノなどのエチレノ;プロパノ、プロプ[1]エノ、プロパ[1,2]ジエノ、プロプ[1]イノなどのプロピレノ;ブタノ、ブト[1]エノ、ブト[2]エノ、ブタ[1,3]ジエノ、ブト[1]イノ、ブト[2]イノ、ブト[1,3]ジイノなどのブチレノなどが挙げられる。特定の飽和レベルが意図される場合、アルカノ、アルケノ及び/又はアルキノという名称が使用される。一部の実施形態では、アルキレノ基は、(C1〜C20)アルキレノである。他の実施形態では、アルキレノ基は、(C1〜C10)アルキレノである。さらに別の実施形態では、アルキレノ基は、(C1〜C6)アルキレノである。一部の実施形態では、直鎖飽和アルカノ基、例えば、メタノ、エタノ、プロパノ、ブタノなどが好ましい。
本明細書で使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子、又は免疫グロブリン遺伝子の断片、例えば、1つ又は複数の相補性決定領域(CDR)を含む断片によって実質的若しくは部分的にコードされる1つ又は複数のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、典型的に、例えば、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、典型的に、例えば、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、これらが、次に免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEをそれぞれ規定する。典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含む。本来、各四量体は、同じ2対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、1つの「軽」鎖(約25kD)及び1つの「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端は、主として抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域と定義されている。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼでの消化によって生成される、十分に特性決定されたいくつかの断片として存在する。このように、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、F(ab)’2(抗原結合断片)及びFc(結晶性断片、若しくは補体結合断片)を生成する。F(ab)’2は、Fabの二量体であり、それ自体が、ジスルフィド結合によってVH−CH1に連結した軽鎖である。F(ab)’2は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、これにより、F(ab’)2二量体をFab’単量体に変換する。Fab’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を含むFabである。抗体分子のFc部分は、大部分が免疫グロブリン重鎖の定常領域と一致し、抗体のエフェクター機能を担う(抗体断片のさらに詳細な説明については、Fundamental Immunology,4th edition.W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1998)を参照されたい)。インタクトな抗体の消化に関して、様々な抗体断片が定義されているが、当業者であれば、そうしたFab’又はFc断片が、化学的に、又は組換えDNA法、ペプチドディスプレイなどの使用によるいずれかで、新たに合成され得ることは理解されよう。従って、本明細書で使用されるとき、抗体という用語は、抗体全体を修飾することで生成されたもの、又は組換えDNA法を用いて新たに合成されたいずれの抗体断片も包含する。抗体はまた、単アーム複合モノクローナル抗体、可変重鎖と可変軽鎖が共に連結されて(直接又はペプチドリンカーを介して)連続したポリペプチドを形成する一本鎖Fv(sFv)抗体をはじめとする一本鎖抗体、並びに二重特異性抗体(diabodies)、三重特異性抗体(tribodies)、及び四重特異性抗体(tetrabodies)も包含する(Pack et al.(1995)J Mol Biol 246:28;Biotechnol 11:1271;及びBiochemistry 31:1579)。抗体は、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、Fab断片、Fab発現ライブラリにより生成される断片などである。
「アリール」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、本明細書に定義する通り、親芳香環系の単一炭素原子からの1個の水素原子の除去によって得られる1価芳香族炭化水素基を指す。典型的なアリール基として、限定されないが、以下:アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、as−インダセン、s−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−2,4−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどから得られる基が挙げられる。一部の実施形態では、アリール基は、6〜20個の炭素原子を含む(C6〜C20アリール)。他の実施形態では、アリール基は、6〜15個の炭素原子を含む(C6〜C15アリール)。さらに別の実施形態では、アリール基は、6〜15個の炭素原子を含む(C6〜C10アリール)。
「アリールアルキル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、本明細書に定義する通り、炭素原子(典型的には、末端若しくはsp3炭素原子)に結合した水素原子の1つが、アリール基で置換された非環状アルキル基を指す。典型的なアリールアルキル基として、限定されないが、以下:ベンジル、2−フェニルエタン−1−イル、2−フェニルエテン−1−イル、ナフチルメチル、2−ナフチルエタン−1−イル、2−ナフチルエテン−1−イル、ナフトベンジル、2−ナフトフェニルエタン−1−イルなどが挙げられる。具体的なアルキル部分が意図される場合、アリールアルカニル、アリールアルケニル及び/又はアリールアルキニルという名称が使用される。一部の実施形態では、アリールアルキル基は、(C6〜C30)アリールアルキルであり、例えば、アリールアルキル基のアルカニル、アルケニル又はアルキニル部分は、(C1〜C10)アルキルであり、アリール部分は、(C6〜C20)アリールである。他の実施形態では、アリールアルキル基は、(C6〜C20)アリールアルキルであり、例えば、アリールアルキル基のアルカニル、アルケニル又はアルキニル部分は、(C1〜C8)アルキルであり、アリール部分は、(C6〜C12)アリールである。さらに別の実施形態では、アリールアルキル基は、(C6〜C15)アリールアルキルであり、例えば、アリールアルキル基のアルカニル、アルケニル又はアルキニル部分は、(C1〜C5)アルキルであり、アリール部分は、(C6〜C10)アリールである。
「アリールジイル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、親芳香環系の2個の異なる炭素原子の各々からの1個の水素原子の除去によって、又は親芳香環系の単一炭素原子からの2個の水素原子の除去によって得られる2価炭化水素ラジカルを指す。2つの1価ラジカル中心又は2価中心の各原子価は、同じ又は異なる原子との結合を形成することができる。典型的なアリールジイル基として、限定されないが、以下:アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、as−インダセン、s−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−2,4−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどから得られる基が挙げられる。一部の実施形態では、アリールジイル基は、5〜20個の炭素原子を含む。別の実施形態では、アリールジイル基は、5〜12個の炭素原子を含む。
「アリールアルキルジイル」は、炭素原子(典型的には、末端若しくはsp3炭素原子)に結合した水素原子の1つが、アリール基で置換された非環状アルキルジラジカルを指す。
「cLogD」は、本明細書で使用されるとき、Chem Axon Physiochemical LogD/logPプログラムを用いた、LogDの計算値を指す。2つの相は平衡状態にないことに留意されたい。
cLogPは、本明細書で使用されるとき、Chem Axon Physiochemical LogD/logPプログラムを用いた、水及び親油相(通常、オクタノール)間での化合物の計算分配係数を指す。2つの相は平衡状態にないことに留意されたい。
「クロマトグラフィーマトリックス」は、本明細書で使用されるとき、例えば、逆相、シリカ、イオン交換又は「混合モード」支持体などの従来のクロマトグラフィー樹脂を指す。クロマトグラフィーマトリックスはまた、固定化タンパク質(例えば、血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質又は例えば、リン脂質(Pedgeon et al.,Anal.Chem.176(1989))などの固定化人工膜(多くが、Regis Technologies,Inc.,Morton Grove,ILから入手可能である)を含む樹脂も含み得る。
「ChromLogD」は、本明細書で使用されるとき、クロマトグラフィーにより決定したLogDを指す。未知化合物のchromLogDは、未知化合物と既知eLogDの2つの化合物の保持時間に基づく補間法により計算するが、この方法は、未知化合物を括弧演算するものであり、そのための保持時間は、同じHPLC法(理想的には、未知化合物との同時注入として)を用いて測定される。
「ChromssLogD」は、本明細書で使用されるとき、クロマトグラフィーによる化合物のeLogDの代用物(surrogate)の決定を指し、ここで、化合物は、典型的に、TEGリンカーとのアミド結合によって、一本鎖核酸断片と共有結合している。保持時間は、化合物が一本鎖核酸に結合していない場合に化合物のeLogDの代用物としての役目を果たす。未知化合物のchromssLogD値は、既知chromLogDの2つの化合物の保持時間に基づく補間法により計算するが、この方法は、未知化合物を括弧演算するものであり、そのための保持時間は、同じHPLC法(理想的には、未知化合物との同時注入として)及び同一又は機能的に類似のリンカーを用いて測定される。一部の実施形態では、核酸は、20塩基対DNAオリゴヌクレオチドであり、eLogDの代用物は、chromss20LogDである。
「ChromdsLogD」は、本明細書で使用されるとき、chromssLogDに類似するeLogDの代用物の決定を指し、主な違いは、複合体が、二本鎖DNA断片に共有結合されることである。一部の実施形態では、核酸は、220塩基対DNAオリゴヌクレオチドであり、これは、Harbury,et al.,米国特許第7,479,472号明細書で使用される典型的ライブラリ遺伝子と設計が類似しているため、eLogDの代用物は、chromds220LogDである。
「コードテンプレート」は、本明細書で使用されるとき、各々複数のハイブリダイゼーション配列(すなわち、コドン)と官能基又は連結実体とを含む核酸配列を意味する。「ハイブリダイゼーション配列」は、約3〜100以下、3〜50以下、及び約5〜約30の核酸サブユニットを含むオリゴヌクレオチドを指す。このようなコードテンプレートは、連結されたハイブリダイゼーション配列に基づくコンビナトリアルライブラリの合成を指令することができる。コードテンプレートは、官能基又は任意選択で連結実体と作動可能に連結される。コードテンプレートは、捕捉テンプレートにより固定化されて、DPCC内でコンビナトリアルライブラリの合成を指令し得る。一部の実施形態では、コードテンプレートは、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、20核酸サブユニットである。他の実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、定常スペーサ配列によって隔てられる。定常スペーサ配列は、約3〜100以下、3〜50以下、及び約5〜約30の核酸サブユニットを含むオリゴヌクレオチドを指す。」は、約3〜100以下、3〜50以下、及び約5〜約30の核酸サブユニットを含むオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、定常スペーサ配列は、20核酸サブユニットである。
「コンビナトリアルライブラリ」は、本明細書で使用されるとき、典型的には、異なるサブユニット配列を特徴とする多数の、典型的には103〜1015またはそれ以上の異なる化合物、又は異なる側鎖官能基の組合せを含む分子のライブラリを指す。一部の実施形態では、コンビナトリアルライブラリは、102個より多くの分子を含む。
「化合物」は、本明細書に開示される構造式により包含される化合物を指し、これらの式において、その構造が本明細書に開示されるあらゆる具体的化合物を含む。化合物は、その化学構造及び/又は化学名のいずれかにより同定され得る。化学構造と化学名が矛盾する場合には、化学構造が化合物のアイデンティティを決定する。本明細書に記載される化合物は、1つ又は複数のキラル中心及び/又は二重結合を含み得ることから、二重結合異性体(すなわち、幾何異性体)、鏡像異性体又はジアステレオマーなどの立体異性体として存在し得る。従って、本明細書に描かれる化学構造は、立体異性体として純粋な形態(例えば、幾何異性体として純粋、鏡像異性体として純粋若しくはジアステレオマーとして純粋)並びに鏡像異性体及び立体異性体混合物をはじめとする、例示化合物の考えられる鏡像異性体及び立体異性体を全て包含する。鏡像異性体及び立体異性体混合物は、当業者には周知の分離技術又はキラル合成技術を用いて、それらの成分鏡像異性体又は立体異性体に分離することができる。化合物はまた、エノール形態、ケト形態及びその混合物を含む、いくつかの互変異性体でも存在し得る。従って、本明細書に描かれる化学構造は、例示化合物の考えられる全ての互変異性体を包含する。さらに、記載される化合物は、同位体標識された化合物も含み、その場合、1個又は複数個の原子は、天然に通常見出される原子質量とは異なる原子質量を有する。本明細書に記載の化合物に組み込まれ得る同位体の例として、限定されないが、2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35Sなどが挙げられる。一般に、本明細書に記載の化合物を含む元素のいずれの同位体は全て、これらの化合物に見出し得ることは理解すべきである。化合物は、非溶媒和又は非水和形態、並びに水和形態及びN−オキシドを含む溶媒和形態で存在し得る。一般に、化合物は、水和、溶媒和又はN−オキシドであってよい。いくつかの化合物は、様々な結晶又は非晶形態で存在し得る。一般に、全ての物理的形態は、本明細書に考慮される使用について同等であり、本発明の範囲内であることが意図される。さらに、化合物の部分的構造が例示されるとき、括弧は、部分的構造と残りの分子との結合点を示すことも理解すべきである。
「eLogD」は、本明細書で使用されるとき、水性バッファー/オクタノール混合物中でのフラスコ振盪法によるLogDの決定を指す。
「デプシペプチド」は、本明細書で使用されるとき、1つ又は複数のアミド結合が、エステル結合によって置換された本明細書のペプチドを指す。
「ゲルマトリックス」は、本明細書で使用されるとき、クリオゲル、アガロース、スーパーアガロース又はポリアクリルアミドゲルなどの多種多様なゲルを含み、これらを指す。典型的には、ゲルマトリックスは、例えば、小胞、リポソーム、ミセル、親油性化合物、親油性ポリマー、人工膜又はそれらの組合せなどの脂質相を含む。
「ヘテロアルキル、ヘテロアルカニル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルカニル、ヘテロアルキルジイル及びヘテロアルキレノ」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、アルキル、アルカニル、アルケニル、アルキニル、アルキルジイル及びアルキレノ基(並びに任意選択で任意の結合水素原子)を指し、各々、互いに個々に、同じ又は異なるヘテロ原子又はヘテロ原子基で置換される。炭素原子を置換することができる典型的なヘテロ原子又はヘテロ原子基として、限定されないが、−O−、−S−、−N−、−Si−、−NH−、−S(O)−、−S(O)2−、−S(O)NH−、−S(O)2NH−など及びそれらの組合せが挙げられる。ヘテロ原子又はヘテロ原子基は、アルキル、アルケニル又はアルキニル基の任意の内部位置に配置してよい。これらの基に含有させることができる典型的なヘテロ原子基として、限定されないが、−O−、−S−、−O−O−、−S−S−、−O−S−、−NR501R502−、=N−N=、−N=N−、−N=N−NR503R504−、−PR505−、−P(O)2−、−POR506−、−O−P(O)2−、−SO−、−SO2−、−SnR507R508−などが挙げられ、ここで、R501、R502、R503、R504、R505、R506、R507及びR508は、個々に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル又は置換ヘテロアリールアルキルである。
「ヘテロアリール」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、本明細書で定義される通り、親ヘテロ芳香環系の単一原子からの1個の水素原子の除去によって得られる1価ヘテロ芳香族ラジカルを指す。典型的なヘテロアリール基として、限定されないが、以下:アクリジン、β−カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソオキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなどが挙げられる。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、5〜20個の環原子を含む(5〜20員ヘテロアリール)。他の実施形態では、ヘテロアリール基は、5〜10個の環原子を含む(5〜10員ヘテロアリール)。典型的なヘテロアリール基として、フラン、チオフェン、ピロール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンズイミダゾール、インドール、ピリジン、ピラゾール、キノリン、イミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール及びピラジンから得られるものが挙げられる。
「ヘテロアリールアルキル」は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、炭素原子(典型的には、末端若しくはsp3炭素原子)に結合した水素原子の1つが、ヘテロアリール基で置換された非環状アルキル基を指す。具体的なアルキル部分が意図される場合、ヘテロアリールアルカニル、ヘテロアリールアルケニル及び/又はヘテロアリールアルキニルの名称が使用される。一部の実施形態では、ヘテロアリールアルキル基は、6〜21員ヘテロアリールアルキルであり、例えば、ヘテロアリールアルキルのアルカニル、アルケニル又はアルキニル部分は、(C1〜C6)アルキルであり、ヘテロアリール部分は、5〜15員ヘテロアリールである。他の実施形態では、ヘテロアリールアルキルは、6〜13員ヘテロアリールアルキルであり、例えば、アルカニル、アルケニル又はアルキニル部分は、(C1〜C3)アルキルであり、ヘテロアリール部分は、5〜10員ヘテロアリールである。
「ヘテロアリールジイル」は、親ヘテロ芳香環系の2つの異なる原子の各々からの1個の水素原子の除去によって、又は親ヘテロ芳香環系の単一原子からの2個の水素原子の除去によって得られる2価ヘテロ芳香族基を指す。2つの1価ラジカル中心又は単一の2価中心の各原子価は、同じ又は異なる原子との結合を形成することができる。典型的なヘテロアリールジイル基として、限定されないが、以下:アクリジン、アルシンドール、カルバゾール、 −カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソオキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなどから得られる2価基が挙げられる。一部の実施形態では、ヘテロアリールジイル基は、5〜20員ヘテロアリールジイルである。他の実施形態では、ヘテロアリールジイル基は、5〜10員ヘテロアリールジイルである。一部の実施形態では、チオフェン、ピロール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ピリジン、キノリン、イミダゾール、オキサゾール及びピラジンから得られるヘテロアリールジイル基が好ましい。
「ヘテロアリールアルキルジイル」は、炭素原子(典型的には、末端若しくはsp3炭素原子)に結合した水素原子の1つが、ヘテロアリール基で置換された非環状アルキルジラジカルを指す。
「水和物」は、付加物の形成をもたらす、本明細書に記載される化合物の結晶格子中への化学量論比での水の取り込みを指す。水和物の製造方法として、限定されないが、以下:水蒸気を含む空気中での貯蔵、水を含む剤形、又は例えば、結晶化(すなわち、水若しくは混合水性溶媒からの)、凍結乾燥、湿式造粒法、水性フィルムコーティング、又は噴霧乾燥などの常用的製剤ステップが挙げられる。水和物は、特定の状況下で、つまり水蒸気への曝露、又は水中での無水材料の懸濁時に結晶性溶媒和物から形成することもできる。また、水和物は、1より多い形態に結晶化が可能であってもよく、これにより水和物多型が得られる。例えば、(Guillory,K.,Chapter 5,pp.202−205 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids,(Brittain,H.ed.),Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,1999)。水和物を調製する前述の方法は、十分に当業者の技術の範囲内にあり、ごく一般的であり、当技術分野において標準的なものを超える実験は一切必要ない。水和物は、例えば、単結晶X線回析、X線粉末回析、偏光顕微鏡検査、熱顕微鏡検査、熱重量分析法、示差熱分析、示差走査熱量測定、赤外分光法、Raman分光法及びNMR分光法などの当業者にはよく知られている方法によって特性決定及び/又は分析することができる。(Brittain,H.,Chapter 6,pp.205−208 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids,(Brittain,H.ed.),Marcel Dekker,Inc.,New York,1999)。さらに、多くの会社が、水和物の調製及び/又は特性決定を含むサービスを日常的に提供しており、例えば、HOLODIAG,Pharmaparc II,Voie de l’Innovation,27 100 Val de Reuil,France(http://www.holodiag.com)などがある。
「脂質マトリックス」は、本明細書で使用されるとき、親油性小胞、人工膜、親油性若しくは両染性材料でコーティングされたビーズ、親油性化合物、親油性ポリマー、リポソーム若しくはミセルを指す。
「LogD(pH)」は、本明細書で使用されるとき、所与のpHでの水性バッファー及びオクタノール間の化合物の分配を指す。別に記載のない限り、pHは、7.4であると推定され、LogDと表記される。
「マトリックス」は、本明細書で使用されるとき、概して、少なくとも3種類のマトリックス:「クロマトグラフィー」、「ゲル」、又は「脂質」を指す。一部の実施形態では、マトリックスは、親油性液体と接触する親水性液体(例えば、オクタノール−水)であってもよい。
「核酸」は、本明細書で使用されるとき、以下に定義するオリゴヌクレオチド類似体、並びに二本鎖DNA及びRNA分子を指す。DNA及びRNA分子は、以下に定義する様々な類似体を含み得る。
「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」は、本明細書で使用されるとき、約3〜約300以下、典型的には約5〜約300の核酸サブユニットを含む核酸オリゴマーを指す。ライブラリ化合物の合成を指令するオリゴ(例えば、ハイブリダイゼーション配列)に関して、オリゴは、天然に存在するヌクレオチド残基、ヌクレオチド類似体残基、又は線状ポリマーにアセンブリングされると配列特異的なbase pairを形成することができる他のサブユニット(但し、このポリマーは、ポリメラーゼ及び1つ又は複数の三リン酸ヌクレオチド、例えば、通常のデオキシリボヌクレオチドの存在下で、鎖指向性重合のための好適な基質を提供することができるものとする)を含むか、又はそれらから構成され得る。「既知配列オリゴ」は、核酸配列がわかっているオリゴである。
「オリゴヌクレオチド類似体」は、本明細書で使用されるとき、修飾されて、それが由来するオリゴヌクレオチドの化学的、若しくは生物学的活性の一部又は全部が可能な核酸を指す。オリゴヌクレオチド類似体は、一部の事例では、別の骨格を有し得るオリゴヌクレオチド類似体も含まれるが、一般に、リン酸ジエステル結合を含む。リボース−リン酸骨格の修飾は、標識などの追加部分の付加を促進するか、又はそうした分子の安定性及び半減期を増大するために実施してもよい。さらに、天然に存在する核酸と類似体との混合物を製造することもできる。あるいは、様々な核酸類似体の混合物、及び天然に存在する核酸と類似体との混合物を製造することもできる。オリゴヌクレオチドは、明示されるように、一本鎖若しくは二本鎖であってもよいし、又は二本鎖配列若しくは一本鎖配列のいずれの部分を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA又はハイブリッドであってもよく、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ、並びにウラシル、ウリジン、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサニン(xathanine)ヒポキサニン(hypoxathanine)、イソシトシン、イソグアニンなどをはじめとする塩基の任意の組合せを含む。
「作動可能に連結される」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載の様々な操作を介して連結された状態を維持するように、互いに結合された少なくとも2つの化学構造を意味する。典型的には、リガンド又は官能基及びコードヌクレオチドは、適切なリンカーを介して共有結合される。リンカーは、少なくとも2価であり、オリゴヌクレオチドに対する結合部位と、リガンド又は官能基に対する結合部位とを有する。例えば、機能的部分がポリアミド化合物であるとき、ポリアミド化合物は、N末端、C末端で連結基に、又は官能基を介して側鎖の1つに結合することができる。リンカーは、少なくとも1個の原子によって、また一部の実施形態では、1より多い原子によって、リガンドとオリゴヌクレオチドを分離する上で十分である。ほとんどの実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドとは独立した様式で、リガンドを標的分子に結合させる上で十分に柔軟である。
「ペプチド」は、本明細書で使用されるとき、約2〜50アミノ酸残基、約2〜20アミノ酸残基、又は約2〜10アミノ酸残基のポリマーを指す。ペプチドは、例えば、糖ペプチド、ペグ化ペプチド、リポペプチド、有機若しくは無機リガンドとコンジュゲートしたペプチド、ペプチド結合イソスターを含むペプチド(例えば、ψ[CH2S]、ψ[CH2NH2]、ψ[NHCO]、ψ[COCH2]、ψ[(E)又は(Z)CH=CH]などが挙げられ、環状ペプチドも含まれる。一部の実施形態では、アミノ酸残基は、任意のL−α−アミノ酸、D−α−アミノ酸残基、それらのN−アルキル変異体又はそれらの組合せであってもよい。他の実施形態ではアミノ酸残基は、任意のL−α−アミノ酸、D−α−アミノ酸残基、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、それらのN−アルキル変異体又はそれらの組合せであってもよい。
「親芳香環系」は、コンジュゲートπ電子系を有する不飽和環又は多環系を指す。特に、「親芳香環系」の定義には、1つ又は複数の環が芳香族で、1つ又は複数の環が飽和若しくは不飽和である融合環系が含まれ、例えば、フルオレン、インダン、インデン、フェナレンなどがある。典型的な親芳香環系として、限定されないが、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、as−インダセン、s−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−2,4−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、ピレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどが挙げられる。
「ペプチド核酸」は、本明細書で使用されるとき、核酸の糖リン酸骨格が、擬ペプチド骨格により置換されているオリゴヌクレオチド類似体(例えば、N−(2−アミノエチル)−グリシン)(Nielsen et al.,米国特許第5,539,082号明細書;Nielsen et al.,米国特許第5,773,571号明細書;Burchardt et al.,米国特許第6,395,474号明細書)を指す。
「ペプトイド」は、本明細書で使用されるとき、ポリN−置換グリシンのポリマー(Simon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89(20)9367−9371)を指し、それらの環状変異体を含む。
「ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、典型的には50個を超えるアミノ酸残基を含むアミノ酸残基のポリマーを指し、それらの環状変異体を含む。ポリペプチドとしては、タンパク質(糖タンパク質、ペグ化タンパク質、リポタンパク質、有機若しくは無機リガンドとのポリペプチドコンジュゲートなどの修飾タンパク質を含む)受容体、受容体断片、酵素、構造タンパク質(例えば、コラーゲン)などが挙げられる。一部の実施形態では、アミノ酸残基は、任意のL−α−アミノ酸、D−α−アミノ酸残基、又はそれらの組合せであってもよい。他の実施形態ではアミノ酸残基は、任意のL−α−アミノ酸、D−α−アミノ酸残基、それらのN−アルキル変異体又はそれらの組合せであってもよい。
「認識要素」は、本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチド、一本鎖若しくは二本鎖RNA、一本鎖若しくは二本鎖DNA、DNA結合タンパク質、ロックド核酸、RNA結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、分子量50ダルトンを超える無機化合物、分子量約2000ダルトン〜約50ダルトンの有機化合物又はそれらの組合せを指す。
「塩」は、親化合物に期待される薬理活性を有する化合物の塩を指す。こうした塩として、以下:(1)塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸により形成される酸付加塩;又は酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3−(4−ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2−エタン−ジスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−クロロベンゼンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、4−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、4−メチルビシクロ[2.2.2]−オクト−2−エン−1−カルボン酸、グルコへプトン酸、3−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、tert−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸により形成される酸付加塩;あるいは(2)親化合物中に存在する酸性プロトンが、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、若しくはアルミニウムイオンなどの金属イオンで置換されるか;又はエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位結合するとき、形成される塩が挙げられる。一部の実施形態では、塩は、存在する酸性プロトンが無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウムなど)及び有機塩基(例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N−メチルグルカミンなど)と反応することができるとき、形成され得る。一部の実施形態では、塩は、薬学的に許容される。
「溶媒和物」は、本明細書に記載される化合物の結晶格子中への化学量論比での溶媒の取り込みを指し、付加物の形成をもたらす。溶媒和物の製造方法として、限定されないが、以下:溶媒を含む空気中での貯蔵、溶媒を含む剤形、又は例えば、結晶化(すなわち、溶媒若しくは混合溶媒からの)蒸気拡散などの常用的製剤ステップが挙げられる。また、溶媒和物は、溶媒への曝露、又は溶媒中での材料の懸濁といった特定の状況下で他の結晶性溶媒和物や水和物から形成することもできる。溶媒和物は、1より多い形態に結晶化が可能であってもよく、これにより溶媒和物多型が得られる。例えば、(Guillory,K.,Chapter 5,pp.205−208 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids,(Brittain,H.ed.),Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,1999)を参照されたい。溶媒和物を調製する前述の方法は、十分に当業者の技術の範囲内にあり、ごく一般的であり、当技術分野において標準的なものを超える実験は一切必要ない。溶媒和物は、例えば、単結晶X線回析、X線粉末回析、偏光顕微鏡検査、熱顕微鏡検査、熱重量分析法、示差熱分析、示差走査熱量測定、赤外分光法、Raman分光法、及びNMR分光法などの当業者にはよく知られている方法によって特性決定及び/又は分析することができる。(Brittain,H.,Chapter 6,pp.205−208 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids,(Brittain,H.ed.),Marcel Dekker,Inc.,New York,1999)。さらに、多くの民営会社が、溶媒和物の調製及び/又は特性決定を含むサービスを日常的に提供しており、例えば、HOLODIAG,Pharmaparc II,Voie de l’Innovation,27 100 Val de Reuil,France(http://www.holodiag.com)などがある。
「標準化合物」は、本明細書で使用されるとき、測定済LogDの化合物を指し、これは、クロマトグラフィーマトリックス中での保持時間測定値、又はいずれも遊離化合物として、ゲルマトリックス中での測定済Rf、若しくは脂質マトリックス中での既知吸光度も有し、さらに、標準的オリゴヌクレオチド(例えば、20核酸サブユニット若しくは220核酸サブユニットのオリゴヌクレオチド)にコンジュゲートされたときにも測定されている。標準化合物は、例えば、クロマトグラフィーマトリックスに対して、コンビナトリアルライブラリの化合物と同時注入する。次に、ライブラリの化合物の保持時間は、標準化合物の保持時間と比較され、ライブラリの化合物のLogDの推定をもたらす。
「置換された」は、記載される基又はラジカルを修飾するために使用される場合、記載される基又はラジカルの1個又は複数個の水素原子が、各々、互いに独立して、同じ又は異なる置換基で置換されることを意味する。記載される基又はラジカル中の飽和炭素原子を置換するのに有用な置換基として、限定されないが、−Ra、ハロ、−O−、=O、−ORb、−SRb、−S−、=S、−NRcRc、=NRb、=N−ORb、トリハロメチル、−CF3、−CN、−OCN、−SCN、−NO、−NO2、=N2、−N3、−S(O)2Rb、−S(O)2NRb、−S(O)2O−、−S(O)2ORb、−OS(O)2ORb、−OS(O)2O−、−OS(O)2ORb、−P(O)(O−)2、−P(O)(ORb)(O−)、−P(O)(ORb)(ORb)、−C(O)Rb、−C(S)Rb、−C(NRb)Rb、−C(O)O−、−C(O)ORb、−C(S)ORb、−C(O)NRcRc、−C(NRb)NRcRc、−OC(O)Rb、−OC(S)Rb、−OC(O)O−、−OC(O)ORb、−OC(S)ORb、−NRbC(O)Rb、−NRbC(S)Rb、−NRbC(O)O−、−NRbC(O)ORb、−NRbC(S)ORb、−NRbC(O)NRcRc、−NRbC(NRb)Rb及び−NRbC(NRb)NRcRcが挙げられ、ここで、Raは、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール及びヘテロアリールアルキルからなる群から選択され;各Rbは、個々に、水素又はRaであり;各Rbは、個々に、Rbであり、あるいは、2つのRcは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、4−、5−、6−若しくは7−員シクロヘテロアルキルを形成するが、これは、任意選択で、O、N及びSからなる群から選択される、1〜4個の同じ若しくは異なる別のヘテロ原子を含んでもよい。具体的な例として、−NRcRcは、−NH2、−NH−アルキル、N−ピロリジニル及びN−モルホリニルを含むことを意味する。
同様に、記載される基又はラジカル中の不飽和炭素原子を置換するのに有用な置換基として、限定されないが、−Ra、ハロ、−O−、−ORb、−SRb、−S−、−NRcRc、トリハロメチル、−CF3、−CN、−OCN、−SCN、−NO、−NO2、−N3、−S(O)2Rb、−S(O)2O−、−S(O)2ORb、−OS(O)2Rb、−OS(O)2O−、−OS(O)2ORb、−P(O)(O−)2、−P(O)(ORb)(O−)、−P(O)(ORb)(ORb)、−C(O)Rb、−C(S)Rb、−C(NRb)Rb、−C(O)O−、−C(O)ORb、−C(S)ORb、−C(O)NRcRc、−C(NRb)NRcRc、−OC(O)Rb、−OC(S)Rb、−OC(O)O−、−OC(O)ORb、−OC(S)ORb、−NRbC(O)Rb、−NRbC(S)Rb、−NRbC(O)O−、−NRbC(O)ORb、−NRbC(S)ORb、−NRbC(O)NRcRc、−NRbC(NRb)Rb及び−NRbC(NRb)NRcRcが挙げられ、ここで、Ra、Rb及びRcは、上に定義した通りである。
ヘテロアルキル及びシクロヘテロアルキル基中の窒素原子を置換するのに有用な置換基として、限定されないが、−Ra、−O−、−ORb、−SRb、−S−、−NRcRc、トリハロメチル、−CF3、−CN、−NO、−NO2、−S(O)2Rb、−S(O)2O−、−S(O)2ORb、−OS(O)2Rb、−OS(O)2O−、−OS(O)2ORb、−P(O)(O−)2、−P(O)(ORb)(O−)、−P(O)(ORb)(ORb)、−C(O)Rb、−C(S)Rb、−C(NRb)Rb、−C(O)ORb、−C(S)ORb、−C(O)NRcRc、−C(NRb)NRcRc、−OC(O)Rb、−OC(S)Rb、−OC(O)ORb、−OC(S)ORb、−NRbC(O)Rb、−NRbC(S)Rb、−NRbC(O)ORb、−NRbC(S)ORb、−NRbC(O)NRcRc、−NRbC(NRb)Rb及び−NRbC(NRb)NRcRcが挙げられ、ここで、Ra、Rb及びRcは、上に定義した通りである。
他の記載される基又は原子を置換するのに有用な上記リストからの置換基は、当業者には明らかであろう。記載される基を置換するのに使用される置換基は、典型的には、上に明示した様々な基から選択される、1つ又は複数の同じ若しくは異なる基でさらに置換することができる。本明細書で考慮される置換基の組合せは、安定した化合物、又は化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。「安定した」という用語は、本明細書で使用されるとき、それらの生成、検出、特定の実施形態では、それらの回収、精製、並びに本明細書に開示される1つ又は複数の目的のための使用を可能にする条件に付されたとき、実質的に改変されない化合物を指す。一部の実施形態では、置換基は、上に明記した基に限定される。
本発明の実施形態について以下に詳細に述べる。本発明は、これらの実施形態と共に説明していくが、本発明を以下の実施形態に限定することは意図されないことを理解されたい。そうではなく、添付のクレームによって明確にされる本発明の主旨及び範囲内に含まれるものとして、代替物、改変物、及び同等物を包含することが意図される。
タグ付きコンビナトリアルライブラリ化合物のLogDを推定する方法
本明細書には、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物のLogDを推定する方法が開示される。一部の事例では、化合物は、コンビナトリアルライブラリの化合物であってよく、これらの方法は、コンビナトリアルライブラリのいくつかの化合物のLogDの推定値を同時に提供し得る。
本明細書には、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物のLogDを推定する方法が開示される。一部の事例では、化合物は、コンビナトリアルライブラリの化合物であってよく、これらの方法は、コンビナトリアルライブラリのいくつかの化合物のLogDの推定値を同時に提供し得る。
コンビナトリアルライブラリは、よく知られており、当技術分野で公知の方法により合成することができる(Harbury,et al.,米国特許第7,479,472号明細書;Liu et al.,米国特許第7,070,928号明細書;Liu et al.,米国特許第7,223,545号明細書;Liu et al.,米国特許第7,442,160号明細書;Liu et al.,米国特許第7,491,160号明細書;Liu et al.,米国特許第7,557,068号明細書;Liu et al.,米国特許第7,771,935号明細書;Liu et al.,米国特許第7,807,408号明細書;Liu et al.,米国特許第7,998,904号明細書;Liu et al.,米国特許第8,017,323号明細書;Liu et al.,米国特許第8,183,178号明細書;Pedersen et al.,米国特許第7,277,713号明細書;Pedersen et al.,米国特許第7,413,854号明細書;Gouliev et al.,米国特許第7,704,925号明細書;Franch et al.,米国特許第7,915,201号明細書;Gouliev et al.,米国特許第8,722,583号明細書;Freskgard et al.,米国特許出願公開第2006/0269920号明細書;Freskgard et al.,米国特許出願公開第2012/0028812号明細書;Hansen et al.,米国特許第7,928,211号明細書;Hansen et al.,米国特許第8,202,823号明細書;Hansen et al.,米国特許出願公開第2013/0005581号明細書;Hansen et al.,米国特許出願公開第2013/0288929号明細書;Neri et al.,米国特許第8,642,514号明細書;Neri et al.,米国特許第8,673,824号明細書;Neri et al.,米国特許出願公開第2014/01288290号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,972,992号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,935,658号明細書;Morgan et al.,米国特許出願公開第2011/0136697号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,972,994号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,989,395号明細書;Morgan et al.,米国特許第8,410,028号明細書;Morgan et al.,米国特許第8,598,089号明細書;Morgan et al.,米国特許出願第14/085,271号明細書;Wagner et al.,米国特許出願公開第2012/0053901号明細書;Keefe et al.,米国特許出願公開第2014/0315762号明細書;Dower et al.,米国特許第6,140,493号明細書;Lerner et al.,米国特許第6,060,596号明細書;Dower et al.,米国特許第5,789,162号明細書;Lerner et al.,米国特許第5,723,598号明細書;Dower et al.,米国特許第5,708,153号明細書;Dower et al.,米国特許第5,639,603号明細書;Lerner et al.,米国特許第5,573,905号明細書)。
理論による拘束は望まないが、リガンドの構造が、コンビナトリアルライブラリの化合物の相対LogDを決定し得る。認識要素(すなわち、タグ)は、典型的には異性体ポリマーであることから、類似の物理化学的特性を有する。従って、極性の異なるリガンドが、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物のLogDを制御し得る(Bouma et al.,米国特許第5,006,473号明細書、Pascoe et al.,Electrophoresis 2003,24,4227−4240;Pascoe et al.,Electrophoresis 2006,27,793−804)。コンビナトリアルライブラリ中の認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物のLogDは、修飾なしで、又は相補的部分若しくは修飾された相補的部分のいずれかと認識要素の結合後に、推定することができる(後掲)。
一部の実施形態では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む1つの化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物を脂質マトリックスと接触させるステップ、脂質マトリックスに吸着されていない化合物から脂質マトリックスに吸着された化合物を分離するステップ、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量を測定するステップを含み、ここで、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量の測定が、化合物のLogDの推定をもたらす。
別の実施形態では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物を脂質マトリックスと接触させるステップ、脂質マトリックスに吸着されていない化合物から脂質マトリックスに吸着された化合物を分離するステップ、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量を測定するステップを含み、ここで、脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量の測定が、化合物のLogDの推定をもたらす。
一部の実施形態では、接触ステップで賦形剤を含有させる。賦形剤は、例えば、ポリアミン若しくは塩などのカチオン若しくはポリカチオン、又はPEGなどの体積排除剤であってよい。ポリアミンは、限定されないが、プトレシン、カダベリン、スペルミジン又はスペルミンであってもよい。一部の実施形態では、塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム若しくはグアナジニウムカチオンと組み合わせたフッ化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、塩化物、硝酸塩、臭化物、塩化物、過塩素酸塩又はチオ硫酸塩である。他の実施形態では、塩は、硫酸アンモニウムである。
一部の実施形態では、約15℃〜約50℃の温度で、混合物をマトリックスと接触させる。
一部の実施形態では、マトリックスは、脂質膜材料でコーティングされたビーズ(例えば、Longhi et al.,Drug Metabolism and Disposition 39:312−321,2011)、合成小胞、リポソーム又はミセルである。一部の実施形態では、合成小胞は、ホスファチジルコリン、セラミド、ホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルセリンの混合物から形成される。他の実施形態では、合成小胞は、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、オクチル硫酸ナトリウム、臭化オクチルトリメチルアンモニウム、1−パルミトイル−2−オレイル−sn−グリセロ−30−ホスホコリン又はビス(2−エチルヘキシル)スルホコハク酸ナトリウムの混合物から形成される。また別の実施形態では、合成小胞は、ドデシル硫酸ナトリウム及び硫酸セチルトリメチルアンモニウムの混合物から形成される。さらに別の実施形態では、ミセルは、ドデシル硫酸ナトリウム及び臭化セチルトリメチルアンモニウムから形成される。さらに別の実施形態では、合成小胞は、炭水化物、荷電化合物又はタンパク質でコーティングされる。さらにまた別の実施形態では、マトリックスは、オクタノール/水混合物である。一般に、脂質マトリックスは、再生可能に合成され、実験条件に対して安定しており、且つ極性が異なる化合物を分離するのに十分なダイナミックレンジを有していなければならない。従って、適正な脂質マトリックスの選択は、十分に当業者の技術の範囲内である常用的実験を含み得る。
マトリックスに吸着される化合物は、マトリックスに吸着されていない化合物から、限定されないが、遠心分離、濾過、電気泳動又は磁気ビーズへの磁界の適用を含む方法によって分離することができる。一部の実施形態では、マトリックスに吸着された化合物の量及び/又はマトリックスに吸着されていない化合物の量は、吸光度、蛍光、放射線又は定量的質量分析法によって測定される。別の実施形態では、マトリックスに吸着された化合物の量及び/又はマトリックスに吸着されていない化合物の量は、DNAシークエンシング又はqPCRによって測定される。
一部の実施形態では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む1つの化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をゲルマトリックスと接触させるステップ、電圧勾配をゲルマトリックスに適用するステップ、並びにゲルマトリックス上の化合物のRfを測定するステップを含み、ここで、ゲルマトリックス上の化合物のRfが、化合物のLogDの推定をもたらす。
一部の実施形態では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をゲルマトリックスと接触させるステップ、電圧勾配をゲルマトリックスに適用するステップ、並びにゲルマトリックス上の化合物のRfを測定するステップを含み、ここで、ゲルマトリックス上の化合物のRfが、化合物のLogDの推定をもたらす。
一部の実施形態では、ゲルマトリックスは、脂質相を含む。他の実施形態では、脂質相は、合成小胞、リポソーム又はミセルである。また別の実施形態では、ゲルマトリックス上の化合物は、染色によって検出される。さらに別の実施形態では、ゲルマトリックス上の化合物は、分光学的手段(例えば、蛍光又は吸光度)によって検出される。
一部の実施形態では、化合物を含むゲルマトリックスの個別の領域を単離する。ゲルマトリックスの個別の単離された領域の各々から化合物を溶出して、単一のオリゴヌクレオチドでバーコード化されている単一の画分を取得し、これらの画分をプールし、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した後、次世代シークエンシングによって配列決定する。
他の実施形態では、ゲルマトリックスの個別の単離された領域の各々から化合物を溶出して、単一の画分を取得する。画分をポリメラーゼ連鎖反応により増幅した後、次世代シークエンシングによって配列決定する。
一部の実施形態では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む1つの化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をクロマトグラフィーマトリックスと接触させるステップ、及びクロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間を測定するステップを含み、ここで、クロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間測定値が、化合物のLogDの推定をもたらす。
一部の実施形態では、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法が提供される。この方法は、化合物をクロマトグラフィーマトリックスと接触させるステップ、及びクロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間を測定するステップを含み、ここで、クロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間測定値が、化合物のLogDの推定をもたらす。
適正なクロマトグラフィーマトリックスの選択は、当業者の技術の範囲内であり、試行錯誤であることが多い。リガンドと作動可能に連結した認識要素の識別による溶出は、クロマトグラフィーマトリックスの必須要件である。重要なもう一つの特徴は孔径である。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスの孔径は、約100Åである。別の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスの孔径は、約4000Åである。
一部の実施形態では、認識要素は、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドであり、リガンドは、ペプチド又は有機分子であり、クロマトグラフィーマトリックスは、逆相クロマトグラフィー支持体である。他の実施形態では、化合物の保持時間は、chromssxxLogDであり、ここで、xxは、DNAオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数である。一部の実施形態では、xxは、20である。また別の実施形態では、接触ステップに2種またはそれ以上の標準化合物が含まれ、ここで、標準化合物は、測定済chromssxxLogD及び測定済chromLogDのリガンドを含む。また別の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは、高圧液体クロマトグラフィーカラム中に充填される。さらに別の実施形態では、化合物を含む画分は、カラムの溶出によって収集される。さらにまた別の実施形態では、各画分をポリメラーゼ連鎖反応により増幅した後、次世代シークエンシングによって配列決定して、画分中の化合物の保持時間の推定値を得る。また別の実施形態では、化合物の保持時間を標準化合物の保持時間と比較して、化合物のchromssxxLogDの推定値を取得する。さらに別の実施形態では、単一のオリゴヌクレオチドバーコードを各画分中の化合物に結合させ、画分をプールし、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した後、次世代シークエンシングにより配列決定して、画分中の化合物の保持時間の推定値を得る。さらにまた別の実施形態では、化合物の保持時間は標準化合物の保持時間と比較され、化合物のchromssxxLogDの推定値をもたらす。
一部の実施形態では、認識要素は、二本鎖DNAオリゴヌクレオチドであり、リガンドは、ペプチド又は有機分子であり、クロマトグラフィーマトリックスは、逆相クロマトグラフィー支持体である。一部の実施形態では、化合物の保持時間は、chromdsxxLogDである。また別の実施形態では、xxは、220である。さらに別の実施形態では、2種またはそれ以上の標準化合物が接触ステップに含まれ、ここで、標準化合物は、測定済chromdsxxLogD及び測定済chromLogDのリガンドを含む。さらにまた別の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは、高圧液体クロマトグラフィーカラム中に充填される。また別の実施形態では、化合物を含む画分は、カラムの溶出によって収集される。さらに別の実施形態では、各画分をポリメラーゼ連鎖反応により増幅した後、次世代シークエンシングによって配列決定して、画分中の化合物の保持時間の推定値を得る。さらにまた別の実施形態では、化合物の保持時間は標準化合物の保持時間と比較され、化合物のchromdsxxLogDの推定値をもたらす。また別の実施形態では、単一のオリゴヌクレオチドバーコードを各画分中の化合物に結合させ、画分をプールし、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した後、次世代シークエンシングにより配列決定して、画分中の化合物の保持時間の推定値を得る。さらに別の実施形態では、化合物の保持時間は標準化合物の保持時間と比較され、化合物のchromdsxxLogDの推定値をもたらす。
当業者であれば、認識要素が、相補的部分(例えば、オリゴヌクレオチド、一本鎖DNA又はRNA)と結合することができる場合、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物の親油性又またはLogDは、限定されないが、下記のものを含むいくつかの異なる立体配置で推定され得ることを理解されよう。第1に、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物の親油性又はLogDは、一切の修飾なしで推定することができる。第2に、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物の親油性又はLogDは、相補的部分との結合後に、推定することができる。第3に、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物の親油性又はLogDは、修飾された相補的部分、例えば、1つの基が結合された相補的部分(一部の実施形態では、疎水性である)との結合後に、推定することができる。
一部の実施形態では、認識要素は、3’末端で第1リガンドと作動可能に連結したオリゴヌクレオチド、一本鎖DNA又は一本鎖RNAである。これらの実施形態の一部では、3’末端で第1リガンドに作動可能に連結したオリゴヌクレオチド、一本鎖DNA又は一本鎖RNAは、隣接する5’末端で第2リガンドと作動可能に連結した相補的オリゴヌクレオチド又は一本鎖DNAとハイブリダイズさせた後、化合物の混合物を脂質マトリックスと接触させる。
一部の実施形態では、認識要素は、5’末端で第1リガンドと作動可能に連結したオリゴヌクレオチド、一本鎖DNA又は一本鎖RNAである。これらの実施形態の一部では、5’末端で第1リガンドに作動可能に連結したオリゴヌクレオチド、一本鎖DNA又は一本鎖RNAは、隣接する3’末端で第2リガンドと作動可能に連結した相補的オリゴヌクレオチド又は一本鎖DNAとハイブリダイズさせた後、化合物の混合物をマトリックスと接触させる。一部の実施形態において、第1リガンドは3’末端にあってよく、第2リガンドは3’末端にあってよいことを理解すべきである。
ハイブリダイズした化合物(前掲)が、コンビナトリアルライブラリの一部である場合、第2リガンドは、ライブラリの全化合物について同一であってもよいが、必ずしも同一であるわけではない。一部の実施形態では、コンビナトリアルライブラリの第2リガンド(前掲)は、類似するオクタノール−水係数(LogD)を有する。他の実施形態では、第2リガンドは、1超、2超、3超、4超、5超又は6超のオクタノール−水係数(LogD)を有し得る。一部の実施形態では、コンビナトリアルライブラリの第2リガンド(前掲)は、同一である。これらの他の実施形態では、第2リガンドは、疎水性である。これらのまた別の実施形態では、第2リガンドは、5超又は6超のオクタノール−水係数(LogD)を有する。これらのさらに別の実施形態では、第2リガンドは、C6〜C30アルカニル、C18アルカニル、アリール、アリールアルキル、ステロール誘導体、ステロイド誘導体又はコレステロール誘導体である。
理論に拘束されることは望まないが、前述の疎水性3’定常第2リガンドは、膜画分中に二本鎖DNAの測定可能な分布を付与すると考えられ、これは、膜利用アッセイのダイナミックレンジの中央に位置し得る。5’可変第1リガンドへの近接は、膜画分について3’定常第2リガンドの親和性を乱し得ることから、原則として、5’可変第1リガンドの親油性の測定、並びに一部の実施形態では、5’可変第1リガンドのLogDの測定が可能になる。
一部の実施形態では、隣接する5’末端で定常第2リガンドと作動可能に連結した相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした、3’末端で可変第1リガンドと作動可能に連結した1つのオリゴヌクレオチドを含む二本鎖DNA分子であって、第2リガンドのLogDが6超である二本鎖DNA分子が提供される。
第8の態様では、二本鎖DNA分子の2つまたはそれ以上の第1リガンドのLogDを推定する方法に前述の分子を使用する。この方法は、二本鎖DNA分子を脂質マトリックスと接触させるステップ、脂質マトリックスに吸着されていない二本鎖DNA分子から脂質マトリックスに吸着された二本鎖DNA分子を分離するステップ、並びに脂質マトリックスに吸着された二本鎖DNA分子の量及び/又はマトリックスに吸着されていない二本鎖DNA分子の量を測定するステップを含み、ここで、マトリックスに吸着された二本鎖DNA分子の量及び/又はマトリックスに吸着されていない二本鎖DNA分子の量の測定が、二本鎖DNA分子の第1リガンドのLogDの推定をもたらす。
前述の方法のいずれかにおいて、一部の実施形態では、認識要素と作動可能に連結した少なくとも2つの標準化合物の使用は、標準化合物のLogD値間の補間法によって、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む未知化合物のLogDの推定値をもたらし得る。例えば、LogD値が3である標準化合物及びLogD値が4である別の標準化合物を使用すれば、LogDが3〜4の化合物の同定が可能になる。別の例では、既知LogD(当技術分野で既知の認識要素に結合されている場合)及び既知Rfの標準化合物を用いて、ゲルマトリックス上の化合物のRfを括弧演算し、これにより、化合物のLogDを推定することができる。また別の例では、既知LogDの標準化合物を用いて、クロマトグラフィーマトリックス上の化合物の保持時間を括弧演算し、これにより、化合物のLogDを推定することができる。
前述の方法のいずれかにおいて、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む化合物は、マトリックスと接触させる前に、標的との結合によりアフィニティ精製してもよく、標的は、例えば、受容体、酵素、タンパク質、細胞、膜調製物などの生物学的標的であってよい。一部の実施形態では、アフィニティ精製では、非結合化合物を除去することによって、化合物の混合物を濃縮し、これにより、標的に対する親和性が証明された化合物のみの親油性推定値が得られる。
当業者は、前述の方法が選択モード又はスクリーニングモードのいずれかで使用され得ることも理解されよう。選択モードの一例として、脂質相を含むゲルマトリックスに化合物のライブラリを適用し、電気泳動によって分離し、ゲルの所望の領域を単離した後、対応する化合物上の核酸タグをPCR増幅することができる。ゲルマトリックス上で可動性を有する配列のシークエンシング及び後の相関によって、ゲルの選択した領域内の化合物ライブラリの化合物にLogDを割り当てることができる。あるいは、化合物のライブラリは、脂質マトリックスと接触させてもよく、脂質マトリックスと結合した集団を分離し、PCRで増幅した後、脂質マトリックス上でのもう1ラウンドの翻訳及び選択のための投入物として使用することができる。また別の実施形態では、化合物のライブラリをクロマトグラフィーマトリックスと接触させ、画分を収集し、PCRで増幅した後、クロマトグラフィーマトリックス上でのもう1ラウンドの翻訳及び選択のための投入物として使用することもできる。このような方法を繰り返すことによって、所望のLogDを有する化合物を指数関数的に濃縮することができる。一部の実施形態では、PCR増幅した材料を例えばアフィニティ選択のための投入物として使用してもよい。
さらに、前述の方法は、認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む単一の化合物、並びにコンビナトリアルライブラリのメンバーである化合物(すなわち、複雑な混合物)のLogDを測定するために使用することもできる。
一部の実施形態では、各々単一のオリゴヌクレオチドに連結した複数の化合物が合成され、プールされる。次に、プールした化合物を前述した方法のいずれかを用い、LogDの差に基づいて分離することができる。収集した画分のシークエンシングによって、いずれか所与の画分内のいずれか所与のオリゴヌクレオチドの相対存在量が得られ、これにより、LogDを推定するための計算が可能になる。各化合物は単一のオリゴヌクレオチドに結合されるため、複数の化合物を並行して検定することができる。プールされた化合物は、本発明に記載される方法で分離の前に、例えば、固定化標的に対してアフィニティ精製してもよい。
前述の実施形態の一部では、当技術分野で公知の方法(前掲)により個別の容器中の非変異オリゴヌクレオチドに結合した化合物を合成することによって、化合物の混合物を調製する。非変異オリゴヌクレオチドは、前述の非変異オリゴヌクレオチドと同一のフランキングオリゴヌクレオチド領域の間に配置された単一のバーコード領域を含む単一のオリゴヌクレオチドでプライミングしてから、従来の方法により二本鎖材料に変換してもよい。次に、二本鎖材料をプールし、化合物のLogDの推定値を得るための前述した方法のいずれかに使用する。一部の実施形態では、二本鎖材料は、前述した方法のいずれかで使用する前に、生物学的標的に対してアフィニティ精製してもよい。
標準化合物を使用しないか、又は入手できない場合、LogDの推定なしで、コンビナトリアルライブラリ化合物の相対親油性を取得するために、前述した方法のいずれを用いてもよいことに留意すべきである。前述した方法の多くでは、標準化合物が接触ステップに含まれる。
前述した実施形態のいくつかでは、リガンドは、オリゴヌクレオチド、一本鎖RNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、二本鎖DNA、ペプチド、デプシペプチド、ペプトイド、又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。別の実施形態では、リガンドは、ペプチド、ペプトイド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。また別の実施形態では、リガンドは、ペプチド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。
リガンドは、リンカーによって認識要素に作動可能に連結されるが、リンカーは、一般に、リガンドと認識要素を連結する機能を果たす任意の分子又は物質である。リガンドと認識要素との距離は、約10Å、約25Å、約50Å又は約100Åより大きくてもよい。
リンカーは、様々な構造及び長さであってよい。リンカーは、疎水性又は親水性、長い又は短い、剛性、半剛性又は柔軟などのいずれであってもよい。連結基は、例えば、下記のものを含んでよい:−(CH2)n−鎖などのポリメチレン鎖、又は−(CH2CH2O)n鎖などのポリ(エチレングリコール)鎖(いずれの場合も、nは1〜約20の整数である)、5’−O−ジメトキシトリチル−1’、2’−ジデオキシリボース−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;9−O−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、1−[2−シアノエチル)−(N,N−イソプロピル)]−ホスホロアミダイト;3−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)プロピル−1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;及び18−O−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、1,−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、アミノ−カルボン酸リンカー(例えば、ペプチド(例えば、Z−Gly−Gly−Gly−Osu又はZ−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Osu)、PEG(例えば、Fmoc−アミノPEG2000−NHS若しくはアミノ−PEG(12−24)−NHS)、又はアルカン酸鎖(例えば、Boc−ε−アミノカプロン酸−Osu))、クリックケミストリーリンカー(例えば、ペプチド(例えば、アジドホマラニン−Gly−Gly−Gly−Osu若しくはプロパルギルグリシン−Gly−Gly−Gly−Osu)、PEG(例えば、アジド−PEG−NHS)、又はアルカン酸鎖(例えば、5−アジドペンタン酸、(S)−2−(アジドメチル)−1−Boc−ピロリジン、又は4−アジド−ブタン−1−酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル))、チオール反応性リンカー(例えば、PEG(例えば、SM(PEG)nNHS−PEG−マレイミド)、アルカン鎖(例えば、3−(ピリジン−2−イルジスルファニル)−プロピオン酸−Osu若しくはスルホスクシンイミジル6−(3’−[2−ピリジルジチオ]プロピオンアミド)ヘキサノエート)))、オリゴヌクレオチド合成のためのアミダイト(例えば、アミノ修飾塩基(例えば、6−(トリフルオロアセチルアミノ)−ヘキシル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト)、チオール修飾塩基(例えば、S−トリチル−6−メルカプトヘキシル−1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、又はクリックケミストリー修飾塩基(例えば、5−ヘキシン1−TTT(T)0〜7、6−ヘキシン1−TTT(T)0〜7、5−ヘキシン−1−イル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト、6−ヘキシン−1−イル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト、3−ジメトキシトリチルオキシ−2−(3−(3−プロパルギルオキシプロパンアミド)プロパンアミド)プロピル−1−O−スクシノイル、長鎖アルキルアミノCPG若しくは4−アジド−ブタン−1−酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル))。リンカーのさらに別の例は以下に記載する。
認識要素は、最も広義の用語では、オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖RNA、一本鎖DNA、二本鎖DNA、二本鎖RNA−DNAハイブリッド、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、ロックド核酸、抗体又はペプトイドであってもよい。一部の実施形態では、認識要素は、オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖RNA、二本鎖RNA−DNAハイブリッド、一本鎖DNA、二本鎖DNA又はペプチド核酸である。他の実施形態では、認識要素は、オリゴヌクレオチド、一本鎖DNA、一本鎖RNA又は二本鎖DNAである。
一部の実施形態では、前述した化合物は、コンビナトリアルライブラリの化合物であってもよく、この方法は、そうした特定のコンビナトリアルライブラリの1より多い化合物の親油性の推定値を同時にもたらし得る。コンビナトリアルライブラリは、限定されないが、前述したタグ付きコンビナトリアルライブラリを含む。
当業者には理解されるように、認識要素は、限定されないが、当技術分野で既に記載されている全てのタグ又は標識、及びこうしたタグを調製するために使用される全ての方法を含み得る。一部の実施形態では、認識要素の正確な化学構造は、本明細書に記載の方法で決定的に重要なものではない。従って、本明細書に記載される方法は、当技術分野でまだ知られていないものを含め、あらゆるタグ付きコンビナトリアルライブラリで使用することができる。
当業者には周知であるように、認識要素と作動可能に連結した化合物の同定は、認識要素の同定によって達成することができる。一般に、認識要素は、例えば、限定されないが、生物学的方法(例えば、アフィニティ結合、シークエンシングなど)及び化学的方法(例えば、NMR、質量分析法など)をはじめとする、当業者には周知の任意の方法によって同定することができる。一部の実施形態では、認識要素が核酸である場合、同定は、増幅、及び増幅された認識要素のシークエンシング、又は相補的配列との定量的ハイブリダイゼーションを含む。核酸の増幅、核酸の配列決定及び定量的ハイブリダイゼーションは、一般的であり、当技術分野において公知である。
また別の態様では、式(I):
RE−(X1)−(C1X2)n−(C2X3)o−La (I)
(式中:
REは、認識要素であり;
Laは、リガンドであり;
C1及びC2は、個々に連結要素であり;
n及びoは、個々に0又は1であり;
X1、X2及びX3は、官能基である)
の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
RE−(X1)−(C1X2)n−(C2X3)o−La (I)
(式中:
REは、認識要素であり;
Laは、リガンドであり;
C1及びC2は、個々に連結要素であり;
n及びoは、個々に0又は1であり;
X1、X2及びX3は、官能基である)
の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
一部の実施形態では、式(I)の化合物は、小分子コンビナトリアルライブラリの合成を指令するために使用されるコードテンプレートである(Harbury,et al.,米国特許第7,479,472号明細書)。コードテンプレートは、少なくとも1つ、典型的には2つまたはそれ以上の異なる連結されたハイブリダイゼーション配列、任意選択の定常スペーサ配列、及び結合した連結実体若しくは官能基(すなわち、化学反応部分)を含む核酸配列を有する化合物である(図1)。コードテンプレートは、ハイブリダイゼーション配列及び/又は定常スペーサ配列の数で限定されない。任意の所与のコードテンプレート中のハイブリダイゼーション配列は、一般に、いずれか他のコードテンプレート中の配列とは異なる。異なるコードテンプレートが、共通のコドンを有し得ることに留意すべきである。各コードテンプレートのハイブリダイゼーション配列は、連結実体若しくは官能基に結合したユニークなリガンドを合成するための連続的合成ステップの各々で使用される特定の化学的化合物を明らかにする。従って、各コードテンプレートのハイブリダイゼーション配列は、連結実体若しくは官能基への特定の化学単位の結合の順序も明らかにする。
他の実施形態では、式(I)の化合物は、以下:Morgan et al.,米国特許第7,972,992号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,935,658号明細書;Morgan et al.,米国特許出願公開第2011/0136697号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,972,994号明細書;Morgan et al.,米国特許第7,989,395号明細書;Morgan et al.,米国特許第8,410,028号明細書;Morgan et al.,米国特許第8,598,089号明細書;Morgan et al.,米国特許出願第14/085,271号明細書;Wagner et al.,米国特許出願公開第2012/0053901号明細書;及びKeefe et al.,米国特許出願公開第2014/0315762号明細書に記載される方法で使用されるものなどのタグ付けオリゴヌクレオチドである。
また別の実施形態では、式(I)の化合物は、以下:Pedersen et al.,米国特許第7,277,713号明細書;Pedersen et al.,米国特許第7,413,854号明細書;Gouliev et al.,米国特許第7,704,925号明細書;Franch et al.,米国特許第7,915,201号明細書;Gouliev et al.,米国特許第8,722,583号明細書;Freskgard et al.,米国特許出願公開第2006/0269920号明細書;Freskgard et al.,米国特許出願公開第2012/0028812号明細書;Hansen et al.,米国特許第7,928,211号明細書;Hansen et al.,米国特許第8,202,823号明細書;Hansen et al.,米国特許出願公開第2013/0005581号明細書;Hansen et al.,米国特許出願公開第2013/0288929号明細書;Neri et al.,米国特許第8,642,514号明細書;Neri et al.,米国特許第8,673,824号明細書;Neri et al.,米国特許出願公開第2014/01288290号明細書に記載されるオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、X1は、RE上の官能基に結合される。他の実施形態ではX2又はX3は、La上の官能基に結合される。前述した実施形態のいくつかでは、RE上の官能基は、OH、NH2又はNRXであり、ここで、Xは、アルキル基又はメチル基である。RE及びLaは、上に定義した通りである。
一部の実施形態では、X1は、−C(O)−、−CONR1−、−C(O)O−、−P(O)NR2−、−P(O)(OH)NR3−、−P(O)O−、−P(O)(OH)O−、−S(O)2NR4−、−OC(S)−、−OC(O)O−、−OC(S)O−、−OC(O)NR5−、−NR6C(O)O−、−NR7C(O)NR8−、−OP(O)NR9−、−OP(O)(OH)NR10−、−OP(O)O−、−OP(O)(OH)O−、−NR11−、−NR12P(O)O−、−NR13P(O)(OH)O−、−S−、−O−若しくは炭素−炭素結合であり;X2は、−C(O)−、−CONR21−、−C(O)O−、−P(O)NR22−、−P(O)(OH)NR23−、−P(O)O−、−P(O)(OH)O−、−S(O)2NR24−、−OC(S)−、−OC(O)O−、−OC(S)O−、−OC(O)NR25−、−NR26C(O)O−、−NR27C(O)NR28−、−OP(O)NR29−、−OP(O)(OH)NR30−、−OP(O)O−、−OP(O)(OH)O−、−NR31−、−NR32P(O)O−、−NR23P(O)(OH)O−、−S−、−O−若しくは炭素−炭素結合であり;X3は、−C(O)−、−CONR41−、−C(O)O−、−P(O)NR42−、−P(O)(OH)NR43−、−P(O)O−、−P(O)(OH)O−、−S(O)2NR44−、−OC(S)−、−OC(O)O−、−OC(S)O−、−OC(O)NR45−、−NR46C(O)O−、−NR47C(O)NR48−、−OP(O)NR49−、−OP(O)(OH)NR50−、−OP(O)O−、−OP(O)(OH)O−、−NR51−、−NR52P(O)O−、−NR53P(O)(OH)O−、−S−、−O−若しくは炭素−炭素結合であり;R1〜R13、R21〜R33及びR41〜R53は、個々に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル又は置換ヘテロアリールアルキルである。別の実施形態では、C1及びC2は、個々に、アルキルジイル、置換アルキルジイル、アリールジイル、置換アリールジイル、アリールアルキルジイル、置換アリールアルキルジイル、ヘテロアルキルジイル、置換ヘテロアルキルジイル、ヘテロアリールアルキルジイル又は置換ヘテロアリールアルキルジイルである。
一部の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチド、一本鎖若しくは二本鎖RNA又は一本鎖若しくは二本鎖DNAであり、Laは、ペプチド、ペプトイド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物であり、C1及びC2は、個々に、アルキルジイル、置換アルキルジイル、アリールジイル、置換アリールジイル、アリールアルキルジイル、置換アリールアルキルジイル、ヘテロアルキルジイル、置換ヘテロアルキルジイル、ヘテロアリールアルキルジイル又は置換ヘテロアリールアルキルジイルであり、X1は、−C(O)−、−CONR1−、−C(O)O−、−P(O)(OH)NR3−又は−P(O)(OH)O−であり;X2は、−C(O)−、−CONR21−、−C(O)O−、−P(O)(OH)NR23−又は−P(O)(OH)O−であり;X3は、−C(O)−、−CONR41−、−C(O)O−、−P(O)(OH)NR43−又は−P(O)(OH)O−である。他の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチドであり、X1は、−P(O)(OH)O−であり、C1は、−(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3であり、X2は、−NHC(O)−であり、oは、0であり、Laは、コレステロールである。また別の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチドであり、X1は、−P(O)(OH)O−であり、C1は、−(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3であり、X2は、−NHP(O)(OH)O−であり、Laは、−nC18H37である。
一部の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチドであり、X1は、−P(O)(OH)O−であり、C1は、−((CH2)2O)2(CH2)3−であり、X2は、−NHC(O)−であり、C2は、n−C3H6、n−C7H14又はn−C11H22であり、X3は、−NHC(O)−である。他の実施形態では、Laは、ペプチド、ペプトイド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。また別の実施形態では、Laは、ステロール誘導体又はコレステロール誘導体である。さらに別の実施形態では、Laは、以下:
から得られる化合物である。
一部の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチドであり、X1は、−P(O)(OH)O−であり、C1は、−((CH2)2O)2(CH2)3−であり、X2は、−NHC(O)−、−((CH2)2O)3(CH2)2−であり、X3は、−NHC(O)−である。他の実施形態では、Laは、ペプチド、ペプトイド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。また別の実施形態では、Laは、ステロール誘導体又はコレステロール誘導体である。さらに別の実施形態では、Laは、以下:
から得られる化合物である。
一部の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチドであり、X1は、−P(O)(OH)O−であり、C1は、−((CH2)2O)2(CH2)3−であり、X2は、−NHC(O)−であり、C2は、ピペルジニル又は−(CH2)3−ピペルジニルであり、X3は、−C(O)−である。他の実施形態では、Laは、ペプチド、ペプトイド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。また別の実施形態では、Laは、以下:
から得られる化合物である。
一部の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチドであり、X1は、−P(O)(OH)O−であり、C1は、−C6H12、−C12H24−又はC18H36−であり、X2は、−NH−である。他の実施形態では、REは、オリゴヌクレオチドであり、X1は、−P(O)(OH)O−であり、C1は、−((CH2)2O)5CH2CH2−であり、X2は、−P(O)(OH)O−であり、L2は、−C12H24であり、X3は、−NH−である。また別の実施形態では、Laは、ペプチド、ペプトイド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。
前述した実施形態の多くでは、RE及びLaが異なる、一つより多くの、以上の式(I)の化合物を含む化合物のライブラリが提供される。一部の実施形態では、ライブラリの各化合物において、C1、C2、n、o、X1、X2及びX3は、同一である。
さらに別の態様では、式(II):
REc−(X4)−(C3X5)k−(C4X6)l−Lb (II)
(式中:
REcは、認識要素であり;
Lbは、類似若しくは同じ疎水性を有するリガンドであり;
C3及びC4は、個々にリンカーであり;
X4、X5及びX6は、官能基であり;
k及びlは、個々に0又は1である)
の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
REc−(X4)−(C3X5)k−(C4X6)l−Lb (II)
(式中:
REcは、認識要素であり;
Lbは、類似若しくは同じ疎水性を有するリガンドであり;
C3及びC4は、個々にリンカーであり;
X4、X5及びX6は、官能基であり;
k及びlは、個々に0又は1である)
の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物が提供される。
一部の実施形態では、X4は、RE上の官能基に結合される。他の実施形態では、X5又はX6は、Lb上の官能基に結合される。前述した実施形態のいくつかでは、REc上の官能基は、OH、NH2又はNRyであり、ここで、Yは、アルキル基又はメチル基である。RE及びLbは、上に定義した通りである。
一部の実施形態では、Lbは、ペプチド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物である。他の実施形態では、Lbは、4超、5超又は6超のlogPを有する疎水性化合物である。
一部の実施形態では、X4は、−C(O)−、−CONR61−、−C(O)O−、−P(O)NR62−、−P(O)(OH)NR63−、−P(O)O−、−P(O)(OH)O−、−S(O)2NR64−、−OC(S)−、−OC(O)O−、−OC(S)O−、−OC(O)NR65−、−NR66C(O)O−、−NR67C(O)NR68−、−OP(O)NR69−、−OP(O)(OH)NR70−、−OP(O)O−、−OP(O)(OH)O−、−NR71−、−NR72P(O)O−、−NR73P(O)(OH)O−、−S−、−O−若しくは炭素−炭素結合であり;X5は、−C(O)−、−CONR81−、−C(O)O−、−P(O)NR82−、−P(O)(OH)NR83−、−P(O)O−、−P(O)(OH)O−、−S(O)2NR84−、−OC(S)−、−OC(O)O−、−OC(S)O−、−OC(O)NR85−、−NR86C(O)O−、−NR87C(O)NR88−、−OP(O)NR89−、−OP(O)(OH)NR90−、−OP(O)O−、−OP(O)(OH)O−、−NR91−、−NR92P(O)O−、−NR93P(O)(OH)O−、−S−、−O−若しくは炭素−炭素結合であり;X5は、−C(O)−、−CONR91−、−C(O)O−、−P(O)NR92−、−P(O)(OH)NR93−、−P(O)O−、−P(O)(OH)O−、−S(O)2NR94−、−OC(S)−、−OC(O)O−、−OC(S)O−、−OC(O)NR95−、−NR96C(O)O−、−NR97C(O)NR98−、−OP(O)NR99−、−OP(O)(OH)NR100−、−OP(O)O−、−OP(O)(OH)O−、−NR101−、−NR102P(O)O−、−NR103P(O)(OH)O−、−S−、−O−若しくは炭素−炭素結合であり;R71〜R73、R81〜R83及びR91〜R103は、個々に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル又は置換ヘテロアリールアルキルである。他の実施形態では、C1及びC2は、個々に、アルキルジイル、置換アルキルジイル、アリールジイル、置換アリールジイル、アリールアルキルジイル、置換アリールアルキルジイル、ヘテロアルキルジイル、置換ヘテロアルキルジイル、ヘテロアリールアルキルジイル又は置換ヘテロアリールアルキルジイルである。
一部の実施形態では、REcは、オリゴヌクレオチド、一本鎖RNA又は一本鎖DNAであり、Lbは、ペプチド又は分子量2000ダルトン未満の有機化合物であり、C1及びC2は、個々に、アルキルジイル、置換アルキルジイル、アリールジイル、置換アリールジイル、アリールアルキルジイル、置換アリールアルキルジイル、ヘテロアルキルジイル、置換ヘテロアルキルジイル、ヘテロアリールアルキルジイル又は置換ヘテロアリールアルキルジイルであり、X4は、−C(O)−、−CONR1−、−C(O)O−、−P(O)(OH)NR3−又は−P(O)(OH)O−であり;X5は、−C(O)−、−CONR21−、−C(O)O−、−P(O)(OH)NR23−又は−P(O)(OH)O−であり、X6は、−C(O)−、−CONR41−、−C(O)O−、−P(O)(OH)NR43−又は−P(O)(OH)O−である。一部の実施形態では、Lbは、C6〜C30アルカニル、C18アルカニル、アリール、アリールアルキル、ステロール誘導体、ステロイド誘導体又はコレステロール誘導体である。
前述した実施形態の多くでは、REcが異なり、且つLbが類似の疎水性である、1より多い式(II)の化合物を含む化合物のライブラリが提供される。一部の実施形態では、ライブラリの各化合物において、C3、C4、k、l、X4、X5及びX6は、同一である。
また別の態様では、RE及びREcが個々に、オリゴヌクレオチド、一本鎖RNA又は一本鎖DNAであり、C1、C2、n、o、X1、X2、X3、La、Lb、C3、C4、k、l、X4、X5及びX6が上に定義した通りである、式(II)の化合物とハイブリダイズした式(I)の化合物を含む化合物が提供される。一部の実施形態では、式(II)の化合物とハイブリダイズした1より多い式(I)の化合物を含む化合物のライブラリが提供される。他の実施形態では、RE、REc及びLaが異なり、且つLbが類似の疎水性である、化合物が提供される。他の実施形態では、ライブラリの各化合物において、Lbは類似の疎水性であり、C1、C2、n、o、X1、X2、X3、C3、C4、k、l、X4、X5及びX6は同一である。また別の実施形態では、ライブラリの各化合物において、Lb、C1、C2、n、o、X1、X2、X3、C3、C4、k、l、X4、X5及びX6は同一である。
具体的な化合物を以下の表1に表示する。認識要素は、オリゴマーの5’末端に対するリガンド又はリンカーとの連結を有するDNAオリゴヌクレオチドである。
Xは、5’GCTCGTCGCATTCGGCACGC−3’(配列番号1)であり、Yは、ATGGTATXAAGCTTGCCAXAAPPT(配列番号2)であり、X=ピロロdC、Wは、
であり、Zは、
である。
下記の実施例は、あくまで例示の目的のために記載されるものであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。
実施例1:Fmoc−12−Ado修飾オリゴマーの調製
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液を40uLずつ、384−ウェルフィルタプレート内の5つのウェルの各々に添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。300uLの10mM酢酸に溶解させた100nモルのZappT(原材料)をDEAE−セファロース(5ウェル×ウェル当たり20nモルのオリゴ)にロードして、10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、それ以上の洗浄物は全て100uLであった。
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液を40uLずつ、384−ウェルフィルタプレート内の5つのウェルの各々に添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。300uLの10mM酢酸に溶解させた100nモルのZappT(原材料)をDEAE−セファロース(5ウェル×ウェル当たり20nモルのオリゴ)にロードして、10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、それ以上の洗浄物は全て100uLであった。
「ZappT」の配列は、5’−ZATGGTATXAAGCTTGCCAXA−3’(配列番号5)(Z=「TEGアミン」、X=ピロロdC)である。「TEGアミン」は、1級アミン、それに続いてオリゴヌクレオチドの5’末端に連結した3つのポリエチレングリコール部分を組み込むカスタム5’修飾である。「ピロロdC」は、DNA構造及び動力学の理想的なプローブである蛍光デオキシチジン類似体である(http://www.glenresearch.com/Catalog/structural.php#p64を参照)。「TEGアミン」及び「ピロロdC」の構造の詳細については、図7を参照されたい。
水、100mM N−メチルモルホリンの水溶液、水、50%水/MeOH、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFで樹脂を洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。その間、139uLのDMF中の12.1mgのFmoc−12−アミノドデカン酸(Fmoc−12−Ado−OH)の懸濁液(十分に溶解性ではない)を調製した。278uLのN−メチルモルホリン溶液(909uLのメタノール中10uL)を添加したが、溶液は依然として溶解性ではなかった。混合物を超音波処理したが、やはり溶解しなかった。懸濁液(187.5uL)を等分し、62.5uLの新しく調製したDMTMM(4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム)溶液(157uLのDMF中5.2mg)で処理した。次に、得られた懸濁液40uLを各ウェルに添加してから、これらを室温で1時間インキュベートした。
樹脂を濾過し、50%MeOH/DMF、70%MeOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水、水(5分静置させる)、50%MeOH/水、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFですすいだ後、遠沈した。
別の187.5uLのFmoc−12−Ado−OH懸濁液を62.5uLの新しく調製したDMTMM溶液(191uLのDMF中6.3mg)で処理した。次に、得られた懸濁液40uLを各ウェルに添加し、これらを室温で1時間インキュベートした。樹脂を濾過し、50%MeOH/DMF、70%MEOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水及び水ですすいだ。
各ウェルからのオリゴマーを3×33uLの1.5M NaCl/10mM 酢酸アンモニウム水溶液で溶出し、濾過の前に各溶媒を添加してから2分間静置した。Phenomenex Luna C−18カラム(溶媒A:10mM酢酸アンモニウム水溶液;溶媒B:アセトニトリル)でのRP−HPLCにより粗オリゴマーを精製した。所望の画分をSpeedvacにより乾燥させた。
実施例2:Fmoc−12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸修飾オリゴマーの合成
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液を40uLずつ、384−ウェルフィルタプレート内の5つのウェルの各々に添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。300uLの10mM酢酸に溶解させた100nモルのZappT(原材料)をDEAE−セファロース(5ウェル×ウェル当たり20nモルのオリゴ)にロードして、10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、それ以上の洗浄物は全て100uLであった。
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液を40uLずつ、384−ウェルフィルタプレート内の5つのウェルの各々に添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。300uLの10mM酢酸に溶解させた100nモルのZappT(原材料)をDEAE−セファロース(5ウェル×ウェル当たり20nモルのオリゴ)にロードして、10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、それ以上の洗浄物は全て100uLであった。
水、100mM N−メチルモルホリンの水溶液、水、50%水/MeOH、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFで樹脂を洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。その間、127uLのDMF中の11.2mgのFmoc−12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸の溶液を調製した。62.5uLのこの溶液を等分し、125uLのN−メチルモルホリン溶液(909uLのメタノール中10uLのN−メチルモルホリン)、続いて62.5uLの新しく調製したDMTMM溶液(157uLのDMF中5.2mg)で処理した。得られた溶液40uLを各ウェルに添加してから、これらを室温で1時間インキュベートした。
樹脂を濾過し、50%MeOH/DMF、70%MeOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水、水(5分静置)、50%MeOH/水、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFですすいだ後、遠沈した。
別の62.5uLのFmoc−12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸溶液を125uLのN−メチルモルホリン溶液、続いて62.5uLの新しく調製したDMTMM溶液(191uLのDMF中6.3mg)で処理した。次に、得られた溶液の40uLを各ウェルに添加してから、これらを室温で1時間インキュベートした。樹脂を濾過し、50%MeOH/DMF、70%MeOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水及び水ですすいだ。
3×33uLの1.5M NaCl/10mM 酢酸アンモニウム水溶液で各ウェルからオリゴマーを溶出し、各溶媒を添加してから2分間静置した後、濾過した。Phenomenex Luna C−18カラム(溶媒A:10mM酢酸アンモニウム水溶液;溶媒B:アセトニトリル)でのRP−HPLCにより粗オリゴマーを精製した。所望の画分をSpeedvacにより乾燥させた。得られた化合物を、主として図8に示すように、HPLCにより分析し、主要ピークに対応する面積の百分率(%)により定量して、純度が>90%であることが判明した。主要ピークでの化合物の質量測定値は、Fmoc−12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸修飾オリゴマーについて予測されるものの実験誤差の範囲内であった。
実施例3:4−(1−Fmoc−ピペリジン−4−イル)ブタン酸修飾オリゴマーの合成
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液を40uLずつ、384−ウェルフィルタプレート内の5つのウェルの各々に添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。300uLの10mM酢酸に溶解した100nモルのZappT(原材料)をDEAE−セファロース(5ウェル×20nモルオリゴ/ウェル)にロードして、10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、それ以上の洗浄物は全て100uLであった。
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液を40uLずつ、384−ウェルフィルタプレート内の5つのウェルの各々に添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。300uLの10mM酢酸に溶解した100nモルのZappT(原材料)をDEAE−セファロース(5ウェル×20nモルオリゴ/ウェル)にロードして、10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、それ以上の洗浄物は全て100uLであった。
水、100mM N−メチルモルホリンの水溶液、水、50%水/MeOH、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFで樹脂を洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。その間、159uLのDMF中の12.6mgの4−(1−Fmoc−ピペリジン−4−イル)ブタン酸を調製した。62.5uLのこの溶液を等分し、125uLのN−メチルモルホリン溶液(909uLのメタノール中10uLのN−メチルモルホリン)、続いて62.5uLの新しく調製したDMTMM溶液(136uLのDMF中4.5mg)で処理した。次に、得られた懸濁液の40uLを各ウェルに添加してから、これらを室温で1時間インキュベートした。
樹脂を濾過し、50%MeOH/DMF、70%MeOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水、水(5分静置させる)、50%MeOH/水、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFですすいだ後、遠心分離した。
別の62.5uLの4−(1−Fmoc−ピペリジン−4イル)ブタン酸溶液を125uLのN−メチルモルホリン溶液、続いて62.5uLの新しく調製したDMTMM溶液(191uLのDMF中6.3mg)で処理した。次に、得られた溶液の40uLを各ウェルに添加してから、これらを室温で1時間インキュベートした。樹脂を濾過し、50%MeOH/DMF、70%MEOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水及び水ですすいだ。
3×33uLの1.5M NaCl/10mM 酢酸アンモニウム水溶液で各ウェルからオリゴマーを溶出し、各溶媒を添加してから2分間静置した後、濾過した。Phenomenex Luna C−18カラム(溶媒A:10mM酢酸アンモニウム水溶液;溶媒B:アセトニトリル)でのRP−HPLCにより粗オリゴマーを精製した。所望の画分をSpeedvacにより乾燥させた。
実施例4:酢酸又は胆汁酸を伸長オリゴマーに連結する一般的な手順
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液40uLを384−ウェルフィルタプレート内の1ウェルに添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。実施例1、2又は3に記載の通りに調製した、精製済Fmoc−アミノ酸修飾オリゴマーを300uLの10mM酢酸に溶解させ、ウェル当たり60uLをDEAE−セファロースにロードした。懸濁液を10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、以上の洗浄物は全て100uLであった。
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液40uLを384−ウェルフィルタプレート内の1ウェルに添加した。60uLの10mM酢酸で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。実施例1、2又は3に記載の通りに調製した、精製済Fmoc−アミノ酸修飾オリゴマーを300uLの10mM酢酸に溶解させ、ウェル当たり60uLをDEAE−セファロースにロードした。懸濁液を10分間静置した後、濾過した。別に記載のない限り、以上の洗浄物は全て100uLであった。
水、50%MeOH/水、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMF、30%MeOH/DMF及びDMFで樹脂を洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。60uLの20%ピペリジンのDMF溶液をウェルに添加し、室温で10分間静置した。
樹脂を濾過した後、DMF、30%MEOH/DMF、50%MeOH/DMF、70%MeOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水、水、50%MeOH/水、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFで洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。
その間、オリゴマーに結合させるカルボン酸の200mM DMF溶液を調製した。12.5uLのこの溶液を等分し、25uLのN−メチルモルホリン溶液(909uLのメタノール中10uLのN−メチルモルホリン)、続いて12.5uLの新しく調製したDMTMM溶液(DMF中100mM)で処理した。得られた溶液の40uLをウェルに添加してから、これらを室温で1時間インキュベートした。
樹脂を濾過し、50%MeOH/DMF、70%MeOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水、水(5分静置)、50%MeOH/水、MeOH、70%MeOH/DMF、50%MeOH/DMFですすいだ後、遠沈した。
別の12.5uLのカルボン酸溶液を25uLのN−メチルモルホリン溶液で処理し、これに、12.5uLの新しく調製したDMTMM溶液(DMF中100mM)を添加した。得られた混合物の40uLをウェルに添加し、これを室温で1時間インキュベートしてから、濾過し、50%MeOH/DMF、70%MeOH/DMF、MeOH、50%MeOH/水及び水ですすいだ。
オリゴマーを3×33uLの1.5M NaCl/10mM 酢酸アンモニウム水溶液で溶出し、各溶媒を添加してから2分間静置した後、濾過した。得られたオリゴマーをHPLC及びNanodrop(濃度について)により分析した。
例示的なコンジュゲートから得られた分析データを図8に示す。コール酸とZappTのコンジュゲートを調製し、主として実施例4に記載のように精製した。トレースは、コール酸コンジュゲートの溶出プロファイルを示す。分単位の時間をX軸に示す。溶媒B(%)をY軸に示す(右側;軸は0から100%まで延びる)。溶媒Aは、10mM酢酸アンモニウム水溶液であった。溶媒Bはアセトニトリルであった。
実施例5:化合物1の調製
DNA自動合成装置でホスホロアミダイトを使用する標準的な方法によって、下記の配列Xa−ステアリル:(5’ZGCTCGTCGCATTCGGCACGC−3’)(配列番号5)を含む化合物1を合成した。Glen Researchから市販されているステアリルホスホロアミダイト(カタログ番号10−179−02)を使用することにより、Z基をオリゴマーに添加した。これは、主として図8に記載されるように特性決定され、>90%純粋であると評価された。
DNA自動合成装置でホスホロアミダイトを使用する標準的な方法によって、下記の配列Xa−ステアリル:(5’ZGCTCGTCGCATTCGGCACGC−3’)(配列番号5)を含む化合物1を合成した。Glen Researchから市販されているステアリルホスホロアミダイト(カタログ番号10−179−02)を使用することにより、Z基をオリゴマーに添加した。これは、主として図8に記載されるように特性決定され、>90%純粋であると評価された。
実施例6:化合物2の調製
DNA自動合成装置でホスホロアミダイトを使用する標準的な方法によって、下記の配列Xa−コレストリル:(5’Z’GCTCGTCGCATTCGGCACGC−3’)(配列番号6)を含む化合物2を合成した。Glen Researchから市販されているコレストリルホスホロアミダイト(カタログ番号10−1976−02)を使用することにより、Z’基をオリゴマーに添加した。これは、主として図8に記載されるように特性決定され、>90%純粋であると評価された。
DNA自動合成装置でホスホロアミダイトを使用する標準的な方法によって、下記の配列Xa−コレストリル:(5’Z’GCTCGTCGCATTCGGCACGC−3’)(配列番号6)を含む化合物2を合成した。Glen Researchから市販されているコレストリルホスホロアミダイト(カタログ番号10−1976−02)を使用することにより、Z’基をオリゴマーに添加した。これは、主として図8に記載されるように特性決定され、>90%純粋であると評価された。
実施例7:認識要素と作動可能に連結した化合物の親油性の推定のためのゲル法
小胞を含まない低融点アガロースゲル(標準1×TBE、1.5%アガロース)を従来の方法(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,T.Maniatis,E.F.Fritsch & J.Sambrook(1982))により調製した。
小胞を含まない低融点アガロースゲル(標準1×TBE、1.5%アガロース)を従来の方法(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,T.Maniatis,E.F.Fritsch & J.Sambrook(1982))により調製した。
小胞は、主としてPascoe et al.,Electrophoresis 2003,24:4227−4240に記載されるように調製する。簡潔にいうと、0.45gmのCTAB/SOS(CTAB=臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、Sigmaカタログ#9151;SOS=オクチル硫酸ナトリウム。Sigmaカタログ#O4003)を3:7の比で1×TBE[Trisma−ホウ酸塩−EDTA電気泳動バッファー、Maniatis et al.,p.454]に溶解し、確実に溶解するために、水浴中で50℃に加熱した。溶液を室温まで一晩冷却した後、0.2ミクロンフィルタで濾過する。このようにして調製した小胞は、室温で数日間安定していることが報告されている。
低融点アガロース(0.75gm)を25mLの1×TBEに溶解し、個別の小胞のチューブと一緒に、50℃の水浴中でインキュベートする。平衡に到達した後、チューブを予熱したフラスコ中に混合し、穏やかに旋回してから、スタンダード水平ミニゲル装置中に注ぎ込み、小胞アガロースゲルを得る((標準1×TBE、1.5%アガロース、0.9%)。
ゲルが凝固した後、サンプルをロードし、100ボルトで泳動させ、臭化エチジウムで染色した後、標準的方法によって撮影する(Molecular Cloning;Maniatis et al.;Cold Spring Harbor press,1982)。
図1及び2を参照すると、ゲルは、DNA分子(すなわち、それぞれ化合物1及び2)の5’末端へのコレステロール(Chol)又はC18(n−C18H37)いずれかの付加が、0.9%CTAB/SOS小胞を含有するアガロースゲル中のコンジュゲートの可動性を、これらの小胞がないコントロールゲルと比較して大幅に遅らせることができることを示す。FAMは、5’−6−FAM(フルオレセイン)である。6−FAM部分は、フルオレセインの単一異性体誘導体から成り、オリゴヌクレオチドについて最も一般的に使用される蛍光染料結合物質であり、ほとんどの蛍光検出装置と適合性である。これは、プロトン化され、pH7未満では蛍光は弱く;典型的には、7.5〜8.5のpH範囲で使用される。FAMは、オリゴの5’又は3’末端に結合する(https:/www.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Product/1108)。
理論に拘束されることは望まないが、可動性が小分子に左右され、且つ付随するDNA分子のDNA配列から独立している程度まで、logK、すなわち、埋め込まれた小胞中への分配係数の代用物を得ることができ、これは、他の脂質膜への拡散の代用物として機能し得る。従って、原則として、この方法を用いて、このタイプのゲル系に異なるリガンドを有する複数のDNA分子を分離することができる。次に、単離されたゲル切片の配列から、そこに含まれるDNAコンジュゲート種の可動性を推定することができる。
実施例8:認識要素と作動可能に連結したステロイドの親油性の推定のためのマトリックス方法
コンジュゲート(図3、化合物3は酢酸塩、化合物2はコレステロール、化合物4はコール酸、化合物5はケノデオキシコール酸、化合物6はリトコール酸、化合物7はコラン酸である)、(図4、化合物8は酢酸塩、化合物9はコール酸、化合物10はケノデオキシコール酸、化合物11はリトコール酸である)、(図5、化合物13は酢酸塩、化合物14はコール酸、化合物15はケノデオキシコール酸、化合物16はリトコール酸、化合物17はコラン酸である)を適切な濃度でPBS中に溶解させた。TRANSILビーズは、ADME Cell,Inc.Alameda,CAから取得した。キット中のTRANSILビーズのバイアルを25℃で解凍し、提供されるプロトコルに従ってPBS中で平衡化させた。オリゴコンジュゲートの最終濃度が約200ピコモル/300マイクロリットルとなるように、コンジュゲートをTRANSILビーズに添加した。プレートシェーカ上のビーズを1000rpmで12分間攪拌してから、750gで10分間回転させて、ビーズをペレット化し、TRANSILビーズを一切取らないように注意しながら、110マイクロリットルの上清を採取した。図3の分析方法に従い、上清をHPLC−MSにより分析した。コンジュゲートの既知保持時間のピークの積分により、目的のオリゴコンジュゲートを定量した。TRANSILビーズを含まない2つの参照チューブは、「ビーズなしコントロール」とした。ビーズなしチューブをリファレンスとして用いて、溶液中に残った各TRANSILチューブ内の各コンジュゲートの面積百分率を各サンプルについて計算した。このデータを用いて、図4、5及び6を作成した。データに示されるように、コンジュゲートの測定可能な画分はそれぞれTRANSILビーズに分配され、ビーズに分配されるものについて、予想した通り、ビーズに分配される画分はビーズ濃度と共に増加する。
コンジュゲート(図3、化合物3は酢酸塩、化合物2はコレステロール、化合物4はコール酸、化合物5はケノデオキシコール酸、化合物6はリトコール酸、化合物7はコラン酸である)、(図4、化合物8は酢酸塩、化合物9はコール酸、化合物10はケノデオキシコール酸、化合物11はリトコール酸である)、(図5、化合物13は酢酸塩、化合物14はコール酸、化合物15はケノデオキシコール酸、化合物16はリトコール酸、化合物17はコラン酸である)を適切な濃度でPBS中に溶解させた。TRANSILビーズは、ADME Cell,Inc.Alameda,CAから取得した。キット中のTRANSILビーズのバイアルを25℃で解凍し、提供されるプロトコルに従ってPBS中で平衡化させた。オリゴコンジュゲートの最終濃度が約200ピコモル/300マイクロリットルとなるように、コンジュゲートをTRANSILビーズに添加した。プレートシェーカ上のビーズを1000rpmで12分間攪拌してから、750gで10分間回転させて、ビーズをペレット化し、TRANSILビーズを一切取らないように注意しながら、110マイクロリットルの上清を採取した。図3の分析方法に従い、上清をHPLC−MSにより分析した。コンジュゲートの既知保持時間のピークの積分により、目的のオリゴコンジュゲートを定量した。TRANSILビーズを含まない2つの参照チューブは、「ビーズなしコントロール」とした。ビーズなしチューブをリファレンスとして用いて、溶液中に残った各TRANSILチューブ内の各コンジュゲートの面積百分率を各サンプルについて計算した。このデータを用いて、図4、5及び6を作成した。データに示されるように、コンジュゲートの測定可能な画分はそれぞれTRANSILビーズに分配され、ビーズに分配されるものについて、予想した通り、ビーズに分配される画分はビーズ濃度と共に増加する。
実施例9:20塩基対オリゴヌクレオチドと作動可能に連結したステロイドの親油性の推定のためのクロマトグラフィー法
Luna C18カラム及びアセトニトリル/酢酸アンモニウム勾配を用いる逆相HPLCカラムで、化合物3〜7を分析した。溶媒Aは、10mM酢酸アンモニウムであり、溶媒Bは、アセトニトリルであった。今度は図9を参照して、X軸は分単位であり、Y軸は、溶媒B(%)である。図3に示すように、これらのツール化合物をHPLCにより分離した。従って、LogDの順位は、カラムでの保持時間の順位から推定できる。理論に拘束されることは望まないが、適切な標準化合物の含有によって、LogDの絶対値の有用な代用物が提供され得る。chromLogD及びChrom20LogDが、上の実験の延長によって決定され得ることにも留意すべきである。
Luna C18カラム及びアセトニトリル/酢酸アンモニウム勾配を用いる逆相HPLCカラムで、化合物3〜7を分析した。溶媒Aは、10mM酢酸アンモニウムであり、溶媒Bは、アセトニトリルであった。今度は図9を参照して、X軸は分単位であり、Y軸は、溶媒B(%)である。図3に示すように、これらのツール化合物をHPLCにより分離した。従って、LogDの順位は、カラムでの保持時間の順位から推定できる。理論に拘束されることは望まないが、適切な標準化合物の含有によって、LogDの絶対値の有用な代用物が提供され得る。chromLogD及びChrom20LogDが、上の実験の延長によって決定され得ることにも留意すべきである。
実施例10:リガンドと作動可能に連結した20核酸サブユニットのオリゴヌクレオチドの、リガンドと作動可能に連結した220核酸サブユニットのオリゴヌクレオチドへの変換のための一般的方法
アルキル又はステロイドリガンドと作動可能に連結したHPLC精製済20塩基対の一本鎖オリゴマーを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって二本鎖220塩基対遺伝子に転換した。アルキル又はステロイドリガンドと作動可能に連結したオリゴマーと、20塩基対のリバースオリゴマー(1uM)を、2×Fusion Flash High−Fidelity PCR Master Mix(ThermoFisher F548S)と共に10ngの二本鎖220塩基対遺伝子テンプレートを含む100uL反応物中のPCRプライマーとして使用した。98℃10秒後、98℃1秒、55℃5秒、72℃10秒を10サイクル、続いて98℃10秒のプロトコルをさらに1回、続いて98℃1秒、50℃5秒、72℃10秒を15サイクルのサーモサイクルを実施した。220塩基対のPCR産物をゲル電気泳動によって確認し、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)で精製した後、nanodrop A260測定値からDNA濃度を定量した。
アルキル又はステロイドリガンドと作動可能に連結したHPLC精製済20塩基対の一本鎖オリゴマーを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって二本鎖220塩基対遺伝子に転換した。アルキル又はステロイドリガンドと作動可能に連結したオリゴマーと、20塩基対のリバースオリゴマー(1uM)を、2×Fusion Flash High−Fidelity PCR Master Mix(ThermoFisher F548S)と共に10ngの二本鎖220塩基対遺伝子テンプレートを含む100uL反応物中のPCRプライマーとして使用した。98℃10秒後、98℃1秒、55℃5秒、72℃10秒を10サイクル、続いて98℃10秒のプロトコルをさらに1回、続いて98℃1秒、50℃5秒、72℃10秒を15サイクルのサーモサイクルを実施した。220塩基対のPCR産物をゲル電気泳動によって確認し、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)で精製した後、nanodrop A260測定値からDNA濃度を定量した。
実施例11:認識要素と作動可能に連結したステロイドの親油性の推定のためのクロマトグラフィー法
類似した20塩基対オリゴマーから実施例10に記載されるように調製された化合物18〜24を、Agilent AdvanceBio Oligonucleotideカラム及びアセトニトリル/酢酸アンモニウム勾配を用いる逆相HPLCカラムで分析した。溶媒Aは、10mM酢酸アンモニウムであり、溶媒Bは、アセトニトリルであった。図9に示すように、ステロイドはHPLCにより分離され、酢酸塩は、空隙容積中に溶出した。従って、LogDの順位は、C18カラム上の保持時間の順位から推定することができる。アセトアミド(−0.2)、コール酸アミド(1.7)、ケノデオキシコール酸アミド(2.9)、リトコール酸アミド(4.2)、コール酸アミド(5.6)及び酢酸コレステロール(8.7)のcLogPに対して保持時間をプロットすると、図10に示されるように、線状相関が得られた。理論に拘束されることは望まないが、適切な標準化合物の含有によって、LogDの絶対値の有用な代用物が提供され得る。chromLogD及びChrom20LogDが、上の実験の延長によって決定され得ることにも留意すべきである。
類似した20塩基対オリゴマーから実施例10に記載されるように調製された化合物18〜24を、Agilent AdvanceBio Oligonucleotideカラム及びアセトニトリル/酢酸アンモニウム勾配を用いる逆相HPLCカラムで分析した。溶媒Aは、10mM酢酸アンモニウムであり、溶媒Bは、アセトニトリルであった。図9に示すように、ステロイドはHPLCにより分離され、酢酸塩は、空隙容積中に溶出した。従って、LogDの順位は、C18カラム上の保持時間の順位から推定することができる。アセトアミド(−0.2)、コール酸アミド(1.7)、ケノデオキシコール酸アミド(2.9)、リトコール酸アミド(4.2)、コール酸アミド(5.6)及び酢酸コレステロール(8.7)のcLogPに対して保持時間をプロットすると、図10に示されるように、線状相関が得られた。理論に拘束されることは望まないが、適切な標準化合物の含有によって、LogDの絶対値の有用な代用物が提供され得る。chromLogD及びChrom20LogDが、上の実験の延長によって決定され得ることにも留意すべきである。
実施例12:線状ペプチドのcLogD及びeLogDの決定
標準的な方法を用いて、9つの線状ペプチド(N末端アセチル化及びC末端アミド)の1セットを合成し、従来の方法を用いて、cLogD及びeLogD値を決定した。FFFFのeLogDは、オクタノール−水界面に可視凝集体が形成したため、決定することができなかった。
標準的な方法を用いて、9つの線状ペプチド(N末端アセチル化及びC末端アミド)の1セットを合成し、従来の方法を用いて、cLogD及びeLogD値を決定した。FFFFのeLogDは、オクタノール−水界面に可視凝集体が形成したため、決定することができなかった。
実施例13:線状ペプチドのchromLogDの決定
実施例12に挙げたペプチドのchromLogDの決定を、40mM酢酸アンモニウムの勾配、pH7.4及びアセトニトリル及びWater’s Shield RP18カラムを用いて、25℃で実施した。保持時間(分)をeLogDに対してプロットすると、R2=0.80の相関係数が得られた(図11)。
実施例12に挙げたペプチドのchromLogDの決定を、40mM酢酸アンモニウムの勾配、pH7.4及びアセトニトリル及びWater’s Shield RP18カラムを用いて、25℃で実施した。保持時間(分)をeLogDに対してプロットすると、R2=0.80の相関係数が得られた(図11)。
実施例14:ペプチドを伸長オリゴマーに連結する一般的な手順
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液40uLを384−ウェルフィルタプレート内の1ウェルに添加した。0.02%Tween−20を含む90uLの10mM酢酸水溶液で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。Trilinkにより調製された精製済アミノ−TEG修飾オリゴマー(アミノ−トリエチレングリコール−5’−GCTCGTCGCATTCGGCACGC−3’)(配列番号7)(uL当たり7.905nモルオリゴまで水に予め溶解した)5uLを、0.02%Tween−20を含む785uLの10mM酢酸水溶液に溶解し、ウェル当たり60uLをDEAE−セファロースにロードした(計12ウェル)。次に、遠心分離機中で懸濁液をスピン乾燥させ、フィルタプレートを通過させてディープウェルプレート中に入れた。ディープウェルプレートの内容物を吸引して樹脂上部に戻した後、再度遠心分離機中でスピン乾燥させた。このステップをもう1回繰り返した。
DEAE−セファロースの50%水性懸濁液40uLを384−ウェルフィルタプレート内の1ウェルに添加した。0.02%Tween−20を含む90uLの10mM酢酸水溶液で樹脂を3回洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。Trilinkにより調製された精製済アミノ−TEG修飾オリゴマー(アミノ−トリエチレングリコール−5’−GCTCGTCGCATTCGGCACGC−3’)(配列番号7)(uL当たり7.905nモルオリゴまで水に予め溶解した)5uLを、0.02%Tween−20を含む785uLの10mM酢酸水溶液に溶解し、ウェル当たり60uLをDEAE−セファロースにロードした(計12ウェル)。次に、遠心分離機中で懸濁液をスピン乾燥させ、フィルタプレートを通過させてディープウェルプレート中に入れた。ディープウェルプレートの内容物を吸引して樹脂上部に戻した後、再度遠心分離機中でスピン乾燥させた。このステップをもう1回繰り返した。
樹脂を水(90uL)、50%ジメチルアセトアミド(DMA)/水(90uL)、及びDMF(3×90uL)で洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。50uLの20%トリエチルアミンのDMA溶液をウェルに添加し、室温で7分間静置させた。
樹脂を濾過してから、DMA(3×90uL)、50%MeOH/DMA(3×90uL)で洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。
その間、オリゴマーに結合させるペプチド−カルボン酸の各々のDMA中の200mM溶液を調製した。この溶液を5uLずつ新しい384ディープウェルプレートの個別のウェルに各々分注した後、15uLの新しく調製したDMTMM溶液(1:1MeOH/DMA中33.5mM)を各ウェル内で混合した。個別に得られた溶液の各々20uLを、オリゴマーを含む個別の各フィルタプレートウェルに添加してから、これらを室温で30分間インキュベートした。
次に、樹脂を遠心分離機でスピン乾燥させてから、50%MeOH/DMA(90uL)で洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。
さらに、この200mMペプチド−カルボン酸溶液を5uLずつ個別のウェルに各々分注した後、15uLの新しく調製したDMTMM溶液(1:1MeOH/DMA中33.5mM)を各ウェル内で混合した。個別に得られた溶液の各々20uLを、オリゴマーを含む個別のフィルタプレートウェルに各々添加し、室温で30分間インキュベートし、濾過した後、得られた樹脂を、DMA(3×90uL)、50%MeOH/DMA(90uL)、及び水(3×90uL)ですすいだ後、遠心分離機でスピン乾燥させた。
各ウェルに、50uLの100mM水酸化ナトリウム水溶液を添加し、これを室温で10分間静置した。プレートを濾過し、水(3×90uL)で洗浄した後、遠心分離機でスピン乾燥させた。
新しい、清潔な384ディープウェルレシーバプレートを用い、33uLの1.5M酢酸トリエチルアンモニウムの5%IPA/水溶液により、オリゴマーをウェルから溶出し、4分間静置した後、遠心分離機でスピン乾燥した。この工程を2回繰り返し、計90uLを樹脂から溶出した(3×33uL)。
実施例15:20塩基対オリゴヌクレオチドと作動可能に連結したペプチドの親油性の推定のためのクロマトグラフィー法
実施例14に記載の20塩基対オリゴマーに連結した実施例12のペプチドのchromLogDを決定するために、40mM酢酸アンモニウムの勾配、pH7.4及びアセトニトリル並びにWater’s Shield RP18カラムを用いて、25℃で実施した。保持時間(分)をeLogDに対してプロットすると、cLogDを使用したペプチドFFFFおよびFFF以外の、20bpオリゴマーに連結したペプチドについてR2=0.79の相関係数が得られた(図12)。遊離ペプチドの対応するプロットも比較のために示す。
実施例14に記載の20塩基対オリゴマーに連結した実施例12のペプチドのchromLogDを決定するために、40mM酢酸アンモニウムの勾配、pH7.4及びアセトニトリル並びにWater’s Shield RP18カラムを用いて、25℃で実施した。保持時間(分)をeLogDに対してプロットすると、cLogDを使用したペプチドFFFFおよびFFF以外の、20bpオリゴマーに連結したペプチドについてR2=0.79の相関係数が得られた(図12)。遊離ペプチドの対応するプロットも比較のために示す。
Claims (20)
- 認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法であって:
前記化合物を脂質マトリックスと接触させるステップ;
前記脂質マトリックスに吸着されていない化合物から該脂質マトリックスに吸着された化合物を分離するステップ;並びに
該脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は該脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量を測定するステップ;ここで、該脂質マトリックスに吸着された前記化合物の量及び/又は該脂質マトリックスによって吸着されていない該化合物の量の測定が、該化合物のLogDの推定値をもたらす;
を包含する、化合物のLogDを推定する方法。 - 前記接触ステップに賦形剤を含むことをさらに包含し、ここで、前記賦形剤が、カチオン、ポリカチオン、又は体積排除剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記脂質マトリックスが、脂質膜材料でコーティングされたビーズである、請求項1に記載の方法。
- 前記脂質マトリックスに吸着された化合物が、該脂質マトリックスに吸着されていない化合物から遠心分離又は濾過により分離される、請求項3に記載の方法。
- 前記脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は該脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量が、吸光度、蛍光、DNAシークエンシング又はqPCRによって測定される、請求項3に記載の方法。
- 吸着が測定された、及び/又は吸着がなかった、かつ測定済みのLogDを有する2つまたはそれ以上の標準化合物が前記接触ステップに包含される、請求項1に記載の方法。
- 前記脂質マトリックスに吸着された化合物の量及び/又は該脂質マトリックスに吸着されていない化合物の量と、該脂質マトリックスに吸着された前記標準化合物の量及び/又は該脂質マトリックスに吸着されていない該標準化合物の量との比較が、前記化合物のLogDの推定値をもたらす、請求項6に記載の方法。
- 認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法であって:
前記化合物をゲルマトリックスと接触させるステップ;
電圧勾配を前記ゲルマトリックスに適用するステップ;並びに
該ゲルマトリックス上の該化合物のRfを測定するステップ;ここで、該ゲルマトリックス上の該化合物のRfが、該化合物のLogDの推定値をもたらす;
を包含する、化合物のLogDを推定する方法。 - 前記ゲルマトリックスが、アガロース及び小胞を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記ゲルマトリックスでの可動性が測定済みであって、かつ測定済のLogDを有する、2つまたはそれ以上の標準化合物が、前記接触ステップに含まれる、請求項9に記載の方法。
- 前記ゲルマトリックスにおける前記化合物のRfと前記標準化合物のRfの比較が、該化合物のLogDの推定値をもたらす、請求項10に記載の方法。
- 化合物を含む前記ゲルマトリックスの個別の領域を単離するステップ、をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 前記ゲルマトリックスにおける個別の領域の各々から前記化合物を溶出して、各々が単一のオリゴヌクレオチドでバーコード化された単一の画分を取得し、これをプールし、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した後、次世代シークエンシングによって配列決定する、請求項12に記載の方法。
- 前記ゲルマトリックスにおける前記化合物の可動性と該ゲルマトリックスにおける前記標準化合物の可動性との比較が、該化合物のLogDの推定値をもたらす、請求項13に記載の方法。
- 認識要素と作動可能に連結したリガンドを含む2つまたはそれ以上の化合物のLogDを推定する方法であって:
前記化合物をクロマトグラフィーマトリックスと接触させるステップ;及び
前記クロマトグラフィーマトリックス上の該化合物の保持時間を測定するステップを含む;ここで、該クロマトグラフィーマトリックス上の該化合物の保持時間測定値が、該化合物のLogDの推定値をもたらす;
を包含する、化合物のLogDを推定する方法。 - 前記認識要素が、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドであり、前記リガンドが、ペプチド又は有機分子であり、前記クロマトグラフィーマトリックスが、逆相クロマトグラフィー支持体である、請求項15に記載の方法。
- 前記認識要素が、二本鎖DNAであり、前記リガンドが、ペプチド又は有機分子であり、前記クロマトグラフィーマトリックスが、逆相クロマトグラフィー支持体である、請求項15に記載の方法。
- 式(I):
RE−(X1)−(C1X2)n−(C2X3)o−La (I)
式中、
REは、認識要素であり;
Laは、リガンドであり;
C1及びC2は、個々に連結要素であり;
n及びoは、個々に0又は1であり;
X1、X2及びX3は、官能基である、
の化合物又はその塩、水和物、若しくは溶媒和物。 - 3’末端で可変第1リガンドと作動可能に連結した1つのオリゴヌクレオチドと、それとハイブリダイズした、隣接する5’末端で定常第2リガンドと作動可能に連結した相補的オリゴヌクレオチド、を含む二本鎖DNA分子であって、前記第2リガンドのLogDが6を超える二本鎖DNA分子。
- 請求項19に記載の二本鎖DNA分子の2つまたはそれ以上の第1リガンドのLogDを推定する方法であって:
前記二本鎖DNA分子を脂質マトリックスと接触させるステップ;
該脂質マトリックスに吸着されていない二本鎖DNA分子から、該脂質マトリックスに吸着された二本鎖DNA分子を分離するステップ;並びに
該脂質マトリックスによって吸着された二本鎖DNA分子の量及び/又は該マトリックスによって吸着されていない二本鎖DNA分子の量を測定するステップ;ここで、該マトリックスによって吸着された前記二本鎖DNA分子の量及び/又は該マトリックスによって吸着されていない該二本鎖DNA分子の量の測定が、該二本鎖DNA分子の第1リガンドのLogDの推定値をもたらす;
を包含する、二本鎖DNA分子の第1リガンドのLogDを推定する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562239824P | 2015-10-09 | 2015-10-09 | |
US62/239,824 | 2015-10-09 | ||
PCT/US2016/056318 WO2017062973A2 (en) | 2015-10-09 | 2016-10-10 | Methods of estimating logd of tagged combinatorial library compounds |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018535197A true JP2018535197A (ja) | 2018-11-29 |
Family
ID=58488704
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018517731A Pending JP2018535197A (ja) | 2015-10-09 | 2016-10-10 | タグ付きコンビナトリアルライブラリ化合物のLogDを推定する方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20170153257A1 (ja) |
EP (1) | EP3359640A4 (ja) |
JP (1) | JP2018535197A (ja) |
WO (1) | WO2017062973A2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017218293A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Richard Edward Watts | Oligonucleotide directed and recorded combinatorial synthesis of encoded probe molecules |
EP3619340A4 (en) | 2017-05-02 | 2021-01-20 | Haystack Sciences Corporation | MOLECULES FOR THE VERIFICATION OF OLIGONUCLEOTIDE DIRECTED COMBINATIONAL SYNTHESIS AND METHOD OF MANUFACTURING AND USING THEREOF |
CN112955239B (zh) * | 2018-07-27 | 2022-11-29 | 沃特世科技公司 | 用于极性分子分析的液相色谱/质谱方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10302421A1 (de) * | 2003-01-21 | 2004-07-29 | Ribopharma Ag | Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit |
EP1935434A1 (en) * | 2006-12-19 | 2008-06-25 | Novosom AG | Construction and use of transfection enhancer elements |
AU2008340355B2 (en) * | 2007-12-04 | 2015-01-22 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Targeting lipids |
CA2882268A1 (en) * | 2014-02-17 | 2015-08-17 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning / Mcgill University | Polynucleotide-poly(diol) conjugates, process of preparation and uses thereof |
-
2016
- 2016-10-10 JP JP2018517731A patent/JP2018535197A/ja active Pending
- 2016-10-10 EP EP16854552.3A patent/EP3359640A4/en not_active Withdrawn
- 2016-10-10 WO PCT/US2016/056318 patent/WO2017062973A2/en active Application Filing
- 2016-10-10 US US15/289,946 patent/US20170153257A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170153257A1 (en) | 2017-06-01 |
WO2017062973A2 (en) | 2017-04-13 |
EP3359640A2 (en) | 2018-08-15 |
WO2017062973A3 (en) | 2017-05-26 |
EP3359640A4 (en) | 2019-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2020114811A (ja) | (ヘテロ)アリール1,3−双極子化合物と(ヘテロ)シクロアルキンとの環化付加のためのプロセス | |
JP6554180B6 (ja) | Dnaコード化化合物ライブラリーの固相合成方法 | |
US7910726B2 (en) | Amidite for synthesizing modified nucleic acid and method for synthesizing modified nucleic acid | |
JP2018535197A (ja) | タグ付きコンビナトリアルライブラリ化合物のLogDを推定する方法 | |
JP2023520940A (ja) | 標的プロテアーゼ分解(ted)プラットフォーム | |
CN102007091A (zh) | 用于直接亲核步骤的纯化策略 | |
Pícha et al. | Optimized syntheses of Fmoc azido amino acids for the preparation of azidopeptides | |
Billing et al. | Cyclic peptides containing a δ-sugar amino acid—synthesis and evaluation as artificial receptors | |
EP2344529A1 (fr) | Nouveaux composes octapeptidiques derives de la somatostatine et leur utilisation therapeutique | |
Caspi et al. | Process development of ABT-450–A first generation NS3/4A protease inhibitor for HCV | |
WO2001085733A1 (fr) | Agents de couplage pour brins d'adn et composes correspondants | |
Longin et al. | An orthogonally protected CycloTriVeratrylene (CTV) as a highly pre-organized molecular scaffold for subsequent ligation of different cyclic peptides towards protein mimics | |
Alleti et al. | A solanesol-derived scaffold for multimerization of bioactive peptides | |
WO2011118394A1 (ja) | 環状化合物、環状化合物の製造方法および生体分子の修飾法 | |
Haridas et al. | Synthetic minimalistic tryptophan zippers as a chiroptical switch | |
WO2017154997A1 (ja) | インドール構造選択的架橋剤およびそれを用いた複合体 | |
JP6977058B2 (ja) | ピクテ・スペングラー反応を介して得られたタグ付けヌクレオシドを用いたシーケンシング反応のための方法 | |
Wang et al. | Diversity‐Oriented Syntheses by Combining CuAAC and Stereoselective INCIC Reactions with Peptides | |
CN113680386B (zh) | 氮杂环卡宾-方酰胺双功能催化剂及其制备方法 | |
CN104844535A (zh) | 用于制备稠合杂环离子通道调节剂的方法 | |
AU2016347483A1 (en) | Method | |
Sayago et al. | Practical access to the proline analogs (S, S, S)‐and (R, R, R)‐2‐methyloctahydroindole‐2‐carboxylic acids by HPLC enantioseparation | |
JPH0859692A (ja) | 治療および診断用の核酸結合性オリゴマー | |
WO2019168164A1 (ja) | タンパク質及び/又はペプチド修飾用分子 | |
JP2000510839A (ja) | 触媒イミダゾール(例えばヒスチジン)機能を有する触媒を使用した安定化変遷複合体を用いたアシル移行 |