JP2018532798A - 耳の疾患および障害の処置におけるジベンゾアゼピン化合物およびその使用 - Google Patents

耳の疾患および障害の処置におけるジベンゾアゼピン化合物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩ、鼓室内投与に好適な前記結晶性化合物の１つを含む医薬組成物、ならびに結晶性化合物および医薬組成物を使用して耳の障害を処置するための方法を提供する。出願人らは、耳の疾患および内耳の障害の処置（防止、発生率および／または重症度を低減させること、進行および逆転を減速または停止させることを含む）という課題にとりわけ適している、選択された置換ジベンゾアゼピン誘導体を同定した。

Description

背景
分野
本開示は、耳の疾患および内耳の障害の処置における、ある特定の置換ジベンゾアゼピン誘導体およびその医薬組成物の使用を対象とする。本開示はさらに、医薬組成物ならびに耳の疾患および障害を処置する方法を対象とする。
説明
聴力損失は、米国の人口の１０パーセント超を苦しめている。末梢聴覚系への損傷が、そのような聴力欠損の大部分に関与している。特に、有毛細胞の破壊、および有毛細胞から脳へ聴覚信号を伝達するらせん神経節における一次求心性ニューロンの破壊は、聴力機能障害の主要原因として暗に示されてきた。
聴力機能障害を引き起こす作用因子は、大きな騒音、加齢、感染症および耳毒性化学物質を含む。最後のものには、ある特定の治療薬、食品または薬における夾雑物、ならびに環境および産業汚染物質がある。聴覚に対して有害作用を有することが分かっている治療剤は、アミノグリコシド系抗生物質（ストレプトマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカシン等）、シスプラチンおよびカルボプラチン等の白金含有抗新生物剤、エリスロマイシン等のある特定のマクロライド系抗生物質、バンコマイシン、キニーネおよびその類似体、サリチレートおよびその類似体等の糖ペプチド系抗生物質、ならびにフロセミドおよびエタクリン酸等のループ利尿薬を含む。シスプラチンおよびアミノグリコシド系抗生物質等の耳毒素は、蝸牛有毛細胞内に蓄積し、蓄積に起因するこれらの細胞への細胞損傷は、化学的に誘発される聴力損失の主な理由であると考えられている。前庭系および聴覚系は、有毛細胞の末梢神経支配および脳幹核への中心投影を含む多くの特徴を共有する。前庭機能は、上記した通りの耳毒素に対して同様に感受性である。
聴覚細胞およびらせん神経節ニューロンに対するこれらの薬物の毒性作用は、多くの場合、それらの治療有用性における制限要因である。例えば、アミノグリコシド系抗生物質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および抗酸性細菌に対して有効な、広域スペクトル抗微生物剤である。これらは、多くの場合、相乗効果を提供するベータラクタムと組み合わせて、グラム陰性細菌によって引き起こされる感染症を処置するために主に使用される。アミノグリコシド系抗生物質を使用することの利点は、他の抗生物質と比べたクロストリジウム・ディフィシル下痢症の低い発生率、およびアレルギー反応の低いリスクを含む。しかしながら、アミノグリコシドは、とりわけより高用量で、重篤な耳毒性を呈することが公知である。例えば、１グラムのストレプトマイシンを６０から１２０日間にわたって毎日与えられた患者の２５％は、何らかの前庭機能障害を示し、これに対し、１日当たり２グラムでは、その発生率は７５％に増加し、一部の患者は永久的な損傷を被る（米国特許第５，０５９，５９１号を参照）。
アスピリン等のサリチレートは、それらの抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用および抗血栓作用のために長い間使用されてきた。残念なことに、サリチレートは、耳毒性副作用を有し、多くの場合、耳鳴り（tinnitus）（「耳鳴り（ringing in the ears）」）および一時的な聴力損失につながり、高用量で長期にわたって使用した場合、聴力機能障害は持続性かつ不可逆性になり得る（J. A. Brien、１９９３年、Drug Safety ９巻：１４３〜１４８頁）。
ループ利尿薬（エタクリン酸、フロセミドおよびブメタニド等）は、耳毒性を引き起こすことが公知である。いくつかのあまり一般的に使用されないループ利尿薬も、耳毒性を引き起こすことが実験的に示されており、この群は、トルセミド、アゾセミド、オゾリノン、インダクリノンおよびピレタニドを含む。ループ利尿薬に関連する聴力損失は、常にではないが高頻度で、可逆性である。
耳毒性は、精巣がん、卵巣がん、膀胱がん、および頭頸部がんを含む多様なヒトがんに対して有効であることが証明されている、広く使用される抗新生物剤であるシスプラチンの、重篤な用量制限副作用である。シスプラチンの毒性副作用（末梢神経障害、骨髄抑制、胃腸毒性、腎臓毒性および耳毒性）は、周知である。マンニトール、高張食塩水、および高流体（high fluid）の日常投与は、シスプラチン誘発腎臓毒性を大きく改善したが、主な用量制限要因として耳毒性を今日残している。故に、ますます多数のがん患者が化学療法のモデム（modem）レジメンを耐え抜いているが、彼らは高頻度でシスプラチン誘発聴力機能障害を患っている。
シスプラチンは、聴覚系および前庭系の両方を損傷する。シスプラチンの主な耳毒性作用は、蝸牛において起こるようである。解剖学的変化は、血管条およびコルチ器官の両方において出現する。主な組織学的所見は、用量関連有毛細胞変性および支持細胞への損傷を含み、高用量では、膜性迷路の全壊が起こり得る。コルチ器官において、外および内有毛細胞の損失があり、基底回転における外有毛細胞損失、ならびに支持細胞およびライスナー膜における変化の傾向がある。クチクラ板の軟化および外有毛細胞の先端部におけるリソソーム体の数の増加も報告されている。
騒音性聴力損失（ＮＩＨＬ）は、あまり強烈でない騒音レベルへの長年にわたる曝露で徐々に起こる慢性聴力機能障害疾患プロセスを記載するものであり、ここで、損傷は、内耳、具体的には、蝸牛へのものである。この種類の聴力損失は、概して、重なった偶発的衝撃またはインパルス騒音を伴う高強度の連続的な騒音への慢性曝露によって引き起こされる。耳に短期間にわたって提示される強烈な音およびより長期間にわたって提示されるあまり強烈でない音の両方が、内耳への等しい損傷を生じさせる。慢性ＮＩＨＬの大部分は、職業的曝露または産業曝露によるものである。しかしながら、社会的難聴（socioacusis）と呼ばれるＮＩＨＬの非職業的形態は、ほんの数例を挙げれば、発砲、大音量の音楽（コンサートまたはヘッドホンを介する）、オートバイ、スノーモービルまたはトラクター等のオープンビークル、および電動工具に起因し得る。聴力損傷は、多くの場合、左右対称である、すなわち、両耳が冒されるが、頻繁なターゲット射撃による聴力損失等、非対称の聴力損失に終わる場合がある。
発破等のインパルス騒音への曝露の際、患者は、重大な鼓膜および中耳の損傷を被り得る。概してより低い強度レベルで起こる慢性曝露において、中耳および鼓膜の損傷は起こりそうにない。騒音曝露において、主なおよび初期の損傷は、概して蝸牛のものであり、聴覚系の二次神経変性は経時的に起こる。騒音性聴力損失は、K. Campbell、「Essential Audiology for Physicians」（１９９８年）、San Diego: Singular Publishing Group,Inc.によって総説されている。
加齢性聴力損失、または老人性難聴は、高齢者における一般的な神経変性障害である。米国における６５から７４歳の間のおよそ３人に１人が聴力損失を有し、７５歳超の人々のほぼ半分が難聴を有する（国立聴覚・伝達障害研究所からのデータ）。加齢のプロセスは、蝸牛における受容体有毛細胞（ＨＣ）およびらせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）にとって危険な、騒音曝露および多岐にわたる耳毒性傷害等の多くの他の要因と相互作用する。多くの場合において、蝸牛における細胞死に対する加齢自体の作用と他の危険な要因の作用との間を識別することは困難である。ＨＣおよびＳＧＮの損失に起因する永久的な聴力損失は不可逆性であり、これは、細胞が最終的に発達し（terminally developed）、有糸分裂によって置き換えることができないからである。
中耳炎は、最も一般的にはウイルス感染または細菌感染に関連する、中耳の炎症である。人口の比較的高いパーセンテージ、特に小児が冒される。小児において、この疾患は、最も多くの場合、エウスタキオ管および中耳において漏出液分泌応答をトリガーする上気道の苦痛に関連する。細菌およびウイルスは、鼻咽頭からエウスタキオ管を介して通常は空気で満たされた中耳へ移動し、エウスタキオ管をブロックさせ得、中耳の換気および排液を妨げる。次いで、流体が鼓膜（eardrum）の後ろに蓄積して、疼痛および炎症を引き起こす。
中耳炎は、小児の間での聴力損失の最も一般的な原因である。中耳炎は抗生物質で容易に処置され、普通は重篤ではないが、頻繁かつ／または未処置の中耳炎は、小児の聴力を永久的に損傷し得る。中耳に残っている流体は、繰り返し起こる急性中耳炎の発作を引き起こし得、状態が慢性になれば、急性感染症の頻繁な再発をもたらし得る。中耳炎のより重度の形態において、化膿性滲出液、毒素および内因性の抗微生物酵素は、中耳内に蓄積し、これが、感覚神経構造および伝音構造への治癒不可能な損傷を引き起こし得る。そのような感染症によって引き起こされる、鼓膜（eardrum）、耳の骨、または聴覚神経への損傷は、潜在的に永久的な聴力損失をもたらし得る。聴力損失は、中耳腔内の損傷性物質が正円窓膜を通る拡散を介して内耳に接近することから、内耳蝸牛有毛細胞の機能障害、損傷または破壊に起因することもある。
Izumikawa, M.ら、「Auditory Hair Cell Replacement and Hearing Improvement by Atoh1 Gene Therapy in Deaf Mammals」、Nat. Med. １１巻（３号）、２７１〜２７６頁（２００５年）は、アデノベクターを介する蝸牛へのＡｔｏｈ１遺伝子の投与が、モルモット（guina pigs）における聴力閾値を向上させたことを開示している。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害剤、および特に、選択的ガンマセクレターゼ阻害剤は、Ａｔｏｈ１の発現に対するそれらのプラスの効果を通して有毛細胞分化を刺激すると理解されている（Zhengら、「Hes1 is a Negative Regulator of Inner Ear Hair Cell Differentiation」、Development、２０００年、１２７巻（２１号）：４５５１〜６０頁；Zineら、「Hes1 and Hes5 Activities Are Required for the Normal Development of the Hair Cells in the Mammalian Inner Ear」、J Neurosci.、２００１年、２１巻（１３号）：４７１２〜２０頁；Yamamotoら、「Inhibition of Notch/RBP-J Signaling Induces Hair Cell Formation in Neonate Mouse Cochleas」、J Mol Med、２００６年、８４巻（１号）：３７〜４５頁）。
Mizutari, K.ら、「Notch Inhibition Induces Cochlear Hair Cell Regeneration and Recovery of Hearing after Acoustic Trauma」、Neuron ７７巻、５８〜６９頁（２０１３年）は、騒音性聴力損失を持つ幼若マウスにおけるＬＹ４１１５７５の研究について記載した。
米国特許第５，０５９，５９１号明細書
J. A. Brien、１９９３年、Drug Safety ９巻：１４３〜１４８頁 K. Campbell、「Essential Audiology for Physicians」（１９９８年）、San Diego: Singular Publishing Group, Inc. Izumikawa, M.ら、「Auditory Hair Cell Replacement and Hearing Improvement by Atoh1 Gene Therapy in Deaf Mammals」、Nat. Med. １１巻（３号）、２７１〜２７６頁（２００５年） Zhengら、「Hes1 is a Negative Regulator of Inner Ear Hair Cell Differentiation」、Development、２０００年、１２７巻（２１号）：４５５１〜６０頁 Zineら、「Hes1 and Hes5 Activities Are Required for the Normal Development of the Hair Cells in the Mammalian Inner Ear」、J Neurosci.、２００１年、２１巻（１３号）：４７１２〜２０頁 Yamamotoら、「Inhibition of Notch/RBP-J Signaling Induces Hair Cell Formation in Neonate Mouse Cochleas」、J Mol Med、２００６年、８４巻（１号）：３７〜４５頁 Mizutari, K.ら、「Notch Inhibition Induces Cochlear Hair Cell Regeneration and Recovery of Hearing after Acoustic Trauma」、Neuron ７７巻、５８〜６９頁（２０１３年）
出願人らは、耳の疾患および内耳の障害の処置（防止、発生率および／または重症度を低減させること、進行および逆転を減速または停止させることを含む）という課題にとりわけ適している、選択された置換ジベンゾアゼピン誘導体を同定した。
概要
本開示は、式：

を有する化合物Ｉおよび式：

を有する化合物ＩＩから選択される化合物の結晶性形態を提供する。
一部の実施形態では、本結晶性化合物Ｉは、８．２、１３．８、１４．０、１８．４および２０．９±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物Ｉは、４．６、８．２、９．２、１３．８、１４．０、１８．２、１８．４、２０．９、２３．８および２７．７±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物Ｉは、３．０、４．６、８．２、９．２、１０．４、１３．８、１４．０、１６．４、１８．２、１８．４、１８．８、１９．１、２０．９、２１．５、２２．２、２２．７、２３．０、２３．８、２４．３、２４．７、２５．２、２６．５、２６．６、２７．１、２７．７、２８．１、２８．３、２８．６、２９．０、３０．０、３１．２、３１．５、３１．８、３２．１、３２．４、３５．１、３５．６、３５．８、３６．４、３６．７、３８．４、３８．８、３９．８、４０．５および４０．８±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物Ｉは、約２３８．５℃において示差走査熱量測定の吸熱開始を有するものとしてさらに特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物Ｉは、約２４９．３℃において示差走査熱量測定の吸熱ピークを有するものとしてさらに特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物ＩＩは、８．４、１５．２、１６．０、２０．６および２２．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物ＩＩは、６．５、８．４、１５．２、１６．０、１９．９、２０．６、２２．６、２４．５、２５．１および３０．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物ＩＩは、６．５、８．４、１０．１、１３．１、１４．６、１５．０、１５．２、１６．０、１７．６、１８．０、１８．４、１９．６、１９．９、２０．１、２０．６、２０．９、２１．２、２２．２、２２．６、２３．３、２３．５、２３．８、２４．５、２４．９、２５．１、２５．８、２６．１、２６．７、２６．８、２７．５、２７．８、２９．６、３０．６、３１．２、３２．３、３２．９、３３．２、３３．９、３４．４、３５．４、３６．３、３６．７、３７．３、３７．７、３８．０、３８．９、４０．０、４０．２、４０．８および４１．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本結晶性化合物ＩＩは、約１７３℃において示差走査熱量測定の吸熱開始を有するものとしてさらに特徴付けられる。
一部の実施形態では、化合物ＩＩの結晶性形態は、約１７５℃において示差走査熱量測定の吸熱ピークを有するものとしてさらに特徴付けられる。
一部の実施形態では、本開示は、
（１）上記に提供する実施形態の結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される活性剤と、
（２）（Ａ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７；または
（Ｂ）（ｉ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）公称粘度４０〜６０ｃＰもしくはグレード８０〜１２０ｃＰを有するおよそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルメチルセルロース；または
（Ｃ）（ｉ）およそ１０重量％（ｗ／ｗ）〜２０重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）およそ０．１重量％（ｗ／ｗ）〜０．３重量％（ｗ／ｗ）のＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ；または
（Ｄ）（ｉ）およそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から８重量％（ｗ／ｗ）のヒアルロン酸；または
（Ｅ）（ｉ）およそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒアルロン酸、および
（ｉｉ）およそ５体積％から２０体積％のポリエチレングリコール４００
を含む薬学的に許容される水溶液と
を含み、
該活性剤が、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから約２０％ｗ／ｖで存在する、鼓室内投与のための水性医薬組成物を提供する。
水性医薬組成物の一部の実施形態では、前記水溶液が、
（Ａ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７；または
（Ｂ）（ｉ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）公称粘度４０〜６０ｃＰもしくはグレード８０〜１２０ｃＰを有するおよそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルメチルセルロース；または
（Ｃ）（ｉ）およそ１０重量％（ｗ／ｗ）〜２０重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）およそ０．１重量％（ｗ／ｗ）〜０．３重量％（ｗ／ｗ）のＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ
を含む。
水性医薬組成物の一部の実施形態では、前記水溶液が、およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含む。
水性医薬組成物の一部の実施形態では、前記水溶液のｐＨが、約７．０から８．０の間である。
水性医薬組成物の一部の実施形態では、前記水溶液が、緩衝剤をさらに含む。
水性医薬組成物の一部の実施形態では、前記水溶液が、（ｉ）リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムまたはそれらの組合せ；および（ｉｉ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから選択される緩衝剤をさらに含む。
水性医薬組成物の一部の実施形態では、前記活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する。
水性医薬組成物の一部の実施形態では、前記水溶液が、およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含む。
一部の実施形態では、前記水性医薬組成物は、（１）上記に記載した結晶性化合物Ｉと、（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが約７．０から８．０の間である薬学的に許容される水溶液とを含み、該結晶性化合物Ｉが、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖで存在する。一部の実施形態では、前記水溶液が、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含む。一部の実施形態では、結晶性化合物Ｉは、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する。一部の実施形態では、前記水溶液は、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含み、結晶性化合物Ｉは、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する。
一部の実施形態では、前記水性医薬組成物は、（１）上記で記載した結晶性化合物ＩＩと、（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが約７．０から８．０の間である薬学的に許容される水溶液とを含み、該結晶性化合物ＩＩが、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖで存在する。一部の実施形態では、前記水溶液が、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含む。一部の実施形態では、結晶性化合物ＩＩは、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する。一部の実施形態では、前記水溶液は、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含み、結晶性化合物ＩＩは、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する。
一部の実施形態では、本開示は、耳の障害の処置のための方法であって、本明細書中に開示される結晶性化合物から選択される治療有効量の活性剤の、それを必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与を含む、方法を提供する。
耳の障害の処置の方法の一部の実施形態では、前記耳の障害が、聴力損失である。
一部の実施形態では、耳の障害を処置する方法であって、本明細書に記載の水性医薬組成物の、そのような処置を必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、前記耳の障害が、聴力損失である。一部の実施形態では、前記水性医薬組成物が、週に１回から３か月毎に１回の間の頻度で投与され得る。
一部の実施形態では、聴力損失を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への、（１）本明細書に記載の結晶性化合物から選択される活性剤と、（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが、およそ７．０から８．０の間である水溶液とを含み、該活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、水性医薬組成物の鼓室内投与を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、前記活性剤が、本明細書に記載の結晶性化合物Ｉである。一部の実施形態では、前記活性剤が、本明細書に記載の結晶性化合物ＩＩである。
本開示の一部の実施形態は、耳の障害の処置のための医薬の調製における、本明細書で開示されている結晶性化合物から選択される活性剤またはそれを含む組成物の使用を対象とする。一部の実施形態では、医薬は、患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与のために製剤化される。使用の一部の実施形態では、耳の障害は、聴力損失であり得る。
本開示の一部の実施形態は、耳の障害の処置において使用するための本明細書で記載されている水性医薬組成物の調製における、本明細書で開示されている結晶性化合物から選択される活性剤またはそれを含む組成物の使用を対象とする。一部の実施形態（embodiements）では、水性医薬組成物は、患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与のために製剤化される。一部の実施形態では、耳の障害は、聴力損失であり得る。
本開示の一部の実施形態は、聴力損失の処置における、（１）本明細書で記載されている結晶性化合物から選択される活性剤と；（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが、およそ７．０から８．０の間である水溶液とを含み、前記活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、水性医薬組成物の調製における、本明細書で開示されている結晶性化合物から選択される活性剤またはそれを含む組成物の使用を対象とする。一部の実施形態では、水性医薬（pharmacecutical）組成物は、患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与のために製剤化される。一部の実施形態では、活性剤は、本明細書で記載されている結晶性化合物Ｉである。一部の実施形態では、活性剤は、本明細書で記載されている結晶性化合物ＩＩである。
図１は、結晶性化合物ＩのＸ線粉末回折ディフラクトグラムを描写する。
図２は、結晶性化合物Ｉについての示差走査熱量測定（ＤＳＣ）曲線を描写する。
図３は、結晶性化合物ＩＩのＸ線粉末回折ディフラクトグラムを描写する。
図４は、結晶性化合物ＩＩについての示差走査熱量測定（ＤＳＣ）曲線を描写する。
図５Ａは、非晶質形態および結晶性形態の化合物Ｉを含む水性医薬組成物について、外リンパにおけるモルモットＰＫを描写する。
図５Ｂは、非晶質形態および結晶性形態の化合物Ｉを含む水性医薬組成物について、蝸牛におけるモルモットＰＫを描写する。
図６Ａは、非晶質形態および結晶性形態の化合物ＩＩを含む水性医薬組成物について、外リンパにおけるモルモットＰＫを描写する。
図６Ｂは、非晶質形態および結晶性（cystalline）形態の化合物ＩＩを含む水性医薬組成物について、蝸牛におけるモルモットＰＫを描写する。
参照による組み込み
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
詳細な説明
用語「化合物Ｉ」は、構造式：

を有する、化合物（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）−カルバミン酸（Ｓ）−１−（（Ｓ）−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イルカルバモイル）エチルエステルを指す。
用語「化合物ＩＩ」は、構造式：

を有する、化合物（２Ｒ）−２−フルオロ−２−メチル−Ｎ−［（Ｓ）−５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル］−Ｎ’−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）マロンアミドを指す。
化合物Ｉおよび化合物ＩＩの結晶性形態は、対応する非晶質材料をメタノールまたはエタノール等のアルコールに溶解し、その後、形成された固体を収集することによって取得され得る。銅Ｋ−アルファ（４０ｋＶ、４０ｍＡ）放射線を利用するＢｒｕｋｅｒ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）ＡＸＳ Ｃ２ ＧＡＤＤＳ回折計またはＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳ Ｄ８アドバンスを使用するＸ線粉末回折を使用して、結晶性化合物Ｉおよび化合物ＩＩを特徴付けた。ＤＳＣデータは、３４位置のオートサンプラーを装備したＭｅｔｔｌｅｒ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）ＤＳＣ ８２３Ｅで収集した。認定インジウムを使用して、機器をエネルギーおよび温度について較正した。典型的には、ピンホール付きアルミニウムパン中の、０．５〜３ｍｇの各試料を、１０℃／分で、２５℃から３００℃まで加熱した。５０ｍｌ／分での窒素パージを、試料全体にわたって維持した。
結晶性化合物Ｉは、図３において実質的に示される通り、Ｃｕ Ｋ−α Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンによって特徴付けられ得る。代替として、結晶性化合物Ｉは、約８．２、１３．８、１４．０、１８．４、２０．９±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって；または約４．６、８．２、９．２、１３．８、１４．０、１８．２、１８．４、２０．９、２３．８、２７．７±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって；または約３．０、４．６、８．２、９．２、１０．４、１３．８、１４．０、１６．４、１８．２、１８．４、１８．８、１９．１、２０．９、２１．５、２２．２、２２．７、２３．０、２３．８、２４．３、２４．７、２５．２、２６．５、２６．６、２７．１、２７．７、２８．１、２８．３、２８．６、２９．０、３０．０、３１．２、３１．５、３１．８、３２．１、３２．４、３５．１、３５．６、３５．８、３６．４、３６．７、３８．４、３８．８、３９．８、４０．５、４０．８±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって、特徴付けられ得る。代替として、結晶性化合物Ｉは、下記の実施例の項において記載されている通りに特徴付けられ得る。
結晶性化合物ＩＩは、図４において実質的に示される通り、Ｃｕ Ｋ−α Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンによって特徴付けられ得る。代替として、結晶性化合物ＩＩは、約８．４、１５．２、１６．０、２０．６、２２．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって；または約６．５、８．４、１５．２、１６．０、１９．９、２０．６、２２．６、２４．５、２５．１、３０．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって；または約６．５、８．４、１０．１、１３．１、１４．６、１５．０、１５．２、１６．０、１７．６、１８．０、１８．４、１９．６、１９．９、２０．１、２０．６、２０．９、２１．２、２２．２、２２．６、２３．３、２３．５、２３．８、２４．５、２４．９、２５．１、２５．８、２６．１、２６．７、２６．８、２７．５、２７．８、２９．６、３０．６、３１．２、３２．３、３２．９、３３．２、３３．９、３４．４、３５．４、３６．３、３６．７、３７．３、３７．７、３８．０、３８．９、４０．０、４０．２、４０．８、４１．６±０．２においてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって、特徴付けられ得る。代替として、結晶性化合物ＩＩは、下記の実施例の項において記載されている通りに特徴付けられ得る。
結晶性化合物Ｉおよび化合物ＩＩは、本明細書で記載されている、鼓室内投与のための水性医薬組成物の調製において有用である。結晶性化合物Ｉおよび化合物ＩＩならびにそれらを含有する水性医薬組成物は、耳の疾患および障害の処置に有用である。
医薬組成物
一態様では、本開示は、結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される活性剤と、薬学的に許容される水溶液とを含む、鼓室内投与のための水性医薬組成物を対象とする。活性剤は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害剤であり、特に、選択的ガンマセクレターゼ阻害剤である。
一部の実施形態では、活性剤は、本明細書で記載され特徴付けられている通りの結晶性化合物Ｉから選択される。一部の実施形態では、活性剤は、本明細書で記載され特徴付けられている通りの結晶性化合物ＩＩである。
一部の実施形態では、結晶性活性剤は、より均一な粒径を提供するため、または粒径を制御するため、または粒径を低減させるために、さらに加工される。例えば、初期結晶性材料を、例えば、破砕、粉砕、ミリング（ボールミリングおよびジェットミリング等）等の機械的衝撃手段に供して、所望の粒径分布を有する粒子を提供することができる。
一部の実施形態では、鼓室内投与のための水性医薬組成物は、中耳における活性剤の持続放出を提供するものを含む。持続放出製剤は、典型的には、ポリマーを含み、言及され得る本開示に好適なポリマーは、ゼラチン、ヒアルロン酸／ヒアルロネート、キトサン、およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマーを含むがこれらに限定されない［例えば、Liuら、Acta Pharmaceutica Sinica B、２０１３年、１３巻（２号）：８６〜９６頁、およびSwanら、Adv. Drug Deliv. Rev.、２００８年、６０巻（１５号）：１５８３〜１５９９頁を参照］。
一部の実施形態では、本発明の水性医薬組成物を、周囲温度で、より高粘度を有するゲルをｉｎ ｓｉｔｕで形成するより低粘度の液体として、中耳に送達することができる。そのような組成物の利点は、（１）投与のときに液体を取り扱うことの利便性、および（２）ｉｎ ｓｉｔｕでゲル化されたら、沈着部位における薬物の長時間の放出を含む。放出時間を増加させることは、長時間の治療有効性および潜在的な薬物用量の低減をもたらす。そのような組成物は、有利なことに、周囲温度で液体であり、ほぼ哺乳類の体温でゲルであるという特性を有する熱可逆性ゲルを含む。
医薬への応用に好適な熱可逆性ゲルは、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）またはＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧのトリブロックコポリマーを含むポリマーを使用して調製され得る。キトサン−グリセロールホスフェート溶液は、可逆性熱硬化性ゲルを形成することができる。糖ベースのホスフェートの添加は、キトサンを熱可逆性ゲル薬物送達系に転換する。熱可逆性ゲルの共通の群は、ポロキサマーとして一般的に公知であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマー等のポリオキシアルキレンベースのポリマーである。水溶液中のポロキサマーは、本開示に有利である熱可逆性特性を呈する。故に、ポロキサマーの水溶液は、温度上昇とともに、液体状態からゲル状態へ転移することができる。液体−ゲル転移温度は、ポロキサマーの濃度を変動させることおよび粘度調節剤等の他の添加剤の添加によって調整され得、故に、室温またはそれ未満では液体状態であり、体温ではゲル状態に転移する、ポロキサマーの溶液が調製され得る。本発明の組成物の一実施形態では、熱可逆性ゲルは、ポロキサマー４０７（例えば、ＢＡＳＦ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪによって市販されている、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）である。
一部の実施形態では、鼓室内投与のための本発明の水性医薬組成物は、結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される活性剤と、ポロキサマー４０７を含む薬学的に許容される水溶液とを含む。ポロキサマーは、約１５重量％から約２５重量％までの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、ポロキサマー４０７の濃度は、約１５重量％から約１８重量％までである。一部の実施形態では、ポロキサマー４０７の濃度は、約１６重量％から約１７重量％までである。一部の実施形態では、ポロキサマーは、およそ１５重量％または１６重量％または１７重量％または１８重量％で存在する。一部の実施形態では、ポロキサマー４０７を含む本開示の医薬組成物は、公称粘度４０から１２０ｃＰを有するヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を、およそ０．５重量％から４重量％の量で、任意選択で含み得る。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される活性剤と、（ａ）およそ０．５重量％から８重量％のヒアルロン酸；または（ｂ）（ｉ）およそ０．５重量％から４重量％のヒアルロン酸、および（ｉｉ）およそ５体積％から２０体積％のポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含む薬学的に許容されるキャリアとを含む、鼓室内投与のための水性医薬組成物である。
鼓室内投与のための水性医薬組成物において、結晶性（cystalline）化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される活性剤の濃度は、概して、約０．０１％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖまでである。この範囲は、約０．０５ｗ／ｖから約１５ｗ／ｖ、約０．１ｗ／ｖから約１０ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖの部分範囲を含む。一部の実施形態では、活性剤の濃度は、約０．５％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖまでである。一部の実施形態では、活性剤の濃度は、約０．５％ｗ／ｖから約４％ｗ／ｖまでである。一部の実施形態では、活性剤の濃度は、約１％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖまでである。一部の実施形態では、活性剤の濃度は、約１％から約４％までである。一部の実施形態では、活性剤の濃度は、約０．５％ｗ／ｖ、１．０％ｗ／ｖ、１．５％ｗ／ｖ、２．０％ｗ／ｖ、２．５％ｗ／ｖ、３．０％ｗ／ｖ、３．５％ｗ／ｖ、４．０％ｗ／ｖ、４．５％ｗ／ｖまたは５％ｗ／ｖである。一部の実施形態では、活性剤の濃度は、約０．１％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ、０．３％ｗ／ｖ、０．４％ｗ／ｖ、０．５％ｗ／ｖ、０．６％ｗ／ｖ、０．７％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ、０．９％ｗ／ｖまたは１％ｗ／ｖである。
本明細書で開示されている組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される添加剤を含有していてよい。一部の実施形態では、組成物のｐＨは、約６から８、または約６から７、または約７から８の間である。一部の実施形態では、組成物は、リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウムまたはそれらの組合せ等のバッファを含んでよく、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）等のバッファであってよい。バッファの量は、約０．１重量％から約０．５重量％までであってよい。
一部の実施形態では、本開示の水性医薬組成物は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）等の粘度調節剤を含み得る。一部の実施形態では、鼓室内投与のための水性医薬組成物は、結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される活性剤と、ポロキサマー４０７およびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ等の粘度調節剤を含む薬学的に許容されるキャリアとを含む。一部の実施形態では、ポロキサマー４０７は、およそ１０重量％から２０重量％で存在し、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐは、約０．１重量％から約０．３重量％で存在する。一部の実施形態では、活性剤は、結晶性化合物Ｉまたは結晶性化合物ＩＩである。他の一般的な添加剤は、メチルパラベン等の保存剤、および等張性を提供するための塩化ナトリウムを含み得る。組成物は、ガンマセクレターゼ阻害を達成するために十分な期間にわたって、活性剤の持続放出を提供するように製剤化される。ガンマセクレターゼの持続的な阻害は、投与の頻度を、週に１回、隔週、月に１回、隔月、年に４回、半年に１回、年に１回等に最小化する。一部の実施形態では、投薬頻度は、２週間ごとに１回、または月に２回、または月に１回、または１か月おきに１回、または年に４回である。
結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される活性剤と、キャリアとを含む、本明細書で開示されている水性医薬組成物は、実施例において記載されているような従来の方法を使用して調製されてよく、シリンジ内等の単回用量使用用に、またはバイアル内等の複数回用量用に包装されてよい。代替として、活性剤成分および水溶液成分は、別個に、別個の区画内にまたは別個の容器内に包装されてよく、投与前に混合される。
本開示の化合物の局所内耳投与に好適な組成物の例証的な例を、下記の実施例の項において提供する。
処置方法
一態様では、本開示は、耳の障害の処置のための方法であって、結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩから選択される治療有効量の活性剤の、それを必要とする患者に対する、前記患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与を含む方法を対象とする。用語「耳の障害」は、概して、聴力損失および聴覚消失、ならびに目まい、平衡失調、空間識失調、吐き気およびかすみ目等の症状を通して現れ得る、前庭機能不全に関連する状態を含むがこれらに限定されない、蝸牛有毛細胞損失に起因する状態を指す。聴力損失または聴覚消失は、耳毒性化学物質、過度の騒音および加齢によるものであってよい。
本明細書において使用される場合、用語「処置」または「治療」または「処置すること」等は、処置されている状態を制御すること、軽減すること、逆転させること、またはその進行を減速させること；例えば、上記または他の要因によるさらなる聴力損失の低減または停止；および上記または他の要因による部分的または高度聴力損失後の聴力の回復を含む。処置は、聴力損失の防止（例えば、聴力損失の発病を遅延させることまたは発症するリスクを低減させること）、およびゲンタマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質またはシスプラチン等の白金化学療法剤等の耳毒性化学物質を受ける前、受けている最中または受けた後等の予防的使用も含む。
本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、処置されている疾患または障害において所望のまたは有益な効果を引き出すために十分な活性剤の量を指し、予防については、疾患または障害の発病を防止するまたは影響を低めるために十分な活性剤の量を指す。使用される量は、選択される活性剤、処置されている疾患または障害の重症度、投与ルート、および年齢等の患者の特徴によって決まる。
本開示において、活性剤は、中耳、内耳もしくは蝸牛、またはそれらの組合せの中への鼓室内注射によって、耳に投与される。鼓室内は、経鼓室とも称され、両方の用語は、本明細書において交換可能に使用される。鼓室内注射は、鼓膜を経由して治療剤を中耳に注射する技術であり、ここで、治療剤は、正円窓膜を超えて拡散し、内耳に到達し得る。これは、臨床実践において長年にわたって使用されており、医院において行うことができる比較的小さな介入である。反復注射のために、中耳換気管（middle ear ventilation tube）を鼓膜に挿入してよく、これを通して、鼓膜の後ろの中耳洞に薬剤を投与して、中耳および／または内へと投与することができる。一実施形態では、活性剤は、正円窓膜の付近のまたはその上の領域へと、鼓室内に投与される。
本発明の方法の一部の実施形態では、活性剤は、熱可逆性ゲルを含む水性医薬組成物で投与され、そのような組成物は、室温では液体（投与の容易さのため）であり、体温では、医薬組成物がエウスタキオ管を通って迅速に排出しないようなゲルになる。一部の実施形態では、本発明の方法は、本明細書で以下に記載する医薬組成物を利用する。
結晶性化合物Ｉまたは結晶性化合物ＩＩの局所内部投与のための用量は、約０．０６ｍｇから約１００ｍｇまでを含む。この範囲は、約０．１ｍｇから約９０ｍｇ、０．２５ｍｇから約８０ｍｇ、０．４ｍｇから７０ｍｇ、０．６ｍｇから６０ｍｇ、０．８０ｍｇから５０ｍｇ、１．０ｍｇから４０ｍｇ、２ｍｇから３０ｍｇ、３ｍｇから２０ｍｇの部分範囲を含む。用量は、水溶液を含む水性医薬組成物で投与されてよく、ここで、投与される水溶液の体積は、約１００μＬから約５００μＬの範囲の体積を含む。この体積の範囲は、約１００μＬから１５０μＬ、１００μＬから２００μＬ、１００μＬから２５０μＬ、１００μＬから３００μＬ、１００μＬから３５０μＬ、１００μＬから４００μＬ、１００μＬから４５０μＬおよび１００μＬから５００μＬの部分範囲を含む。この体積の範囲はまた、約２００μＬから２５０μＬ、２００μＬから３００μＬ、２００μＬから３５０μＬ、２００μＬから４００μＬ、２００μＬから４５０μＬおよび２００μＬから５００μＬの部分範囲を含む。この体積の範囲はまた、約３００μＬから３５０μＬ、３００μＬから４００μＬ、３００μＬから４５０μＬおよび３００μＬから５００μＬの部分範囲を含む。この体積の範囲は、約４００μＬから４５０μＬおよび４００μＬから５００μＬの部分範囲も含む。物理的制約により、水性医薬組成物に対する活性剤の割合は、２０重量％またはそれ未満であると企図される。
一態様では、本明細書で開示されている化合物は、ステロイド、例えばデキサメタゾン等の１つまたは複数の追加の作用物質と共投与されてよい。ある特定の実施形態では、追加の作用物質は、結晶性化合物Ｉまたは結晶性化合物ＩＩとは別個に投与されてよい（例えば、順次に、例えば、異なる重複スケジュールで）。他の実施形態では、これらの作用物質は、単一組成物中で化合物Ｉまたは化合物ＩＩと一緒に混合された、単一剤形の一部であってよい。また別の実施形態では、これらの作用物質は、結晶性化合物Ｉまたは結晶性化合物ＩＩが投与されるのとほぼ同時に投与される別個の用量として与えられ得る。本明細書で開示されている組成物が、結晶性化合物Ｉまたは結晶性化合物ＩＩおよび１つまたは複数の追加の治療剤または予防剤の組合せを含む場合、化合物および追加の作用物質の両方は、単独療法レジメンにおいて投与される投薬量の、約１％から１００％の間、より好ましくは、約５％から９５％の間の投薬量レベルで存在し得る。
生物学的機能
本開示の効用は、下記の方法または当該技術分野において公知である他の方法の１つまたは複数によって実証することができる。
Ａ．内耳細胞塊分化アッセイ
マウス有毛細胞分化を誘導する際の化合物活性を決定するために、Oshimaら、Auditory and Vestibular Res Methods、２００９年において記載されている通りに、内耳細胞塊をマウスコルチ器官から作製した。簡潔に述べると、新生児コルチ器官から感覚上皮を単離し、トリプシンで処理し、穏やかに解離した。次いで、解離細胞を、スフィア形成のために、１×Ｂ２７およびＮ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の低接着ウェルに移した。スフィア形成の３日後、スフィアを遠心分離によって単離し、フィブロネクチンコーティングプレートに移し、成長因子を欠く培地中で終夜接着させた。次いで、接着スフィアを、１０−５から１０−１０Ｍまでの範囲の濃度の試験化合物で、４日間にわたって処理した。次いで、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で採取し、Ｒｐｌ１９をハウスキーピング遺伝子として使用し、Ａｔｏｈ１およびＭｙｏ７ａに対する遺伝子特異的プライマーを使用して実施される定量的ＰＣＲを使用して分析した。その後、ΔΔＣｔ法を使用して値を分析した。当業者であれば、ΔΔＣｔ法がＰＣＲの技術分野において一般的に使用されていることを理解するであろう。
Ｂ．マウスコルチ器官外植片アッセイ
（ａ）Ｎｏｔｃｈ阻害。新生児マウス外植片を使用して、Ｎｏｔｃｈ経路の阻害を解明し、ｅｘ ｖｉｖｏ系において有毛細胞を発生させる化合物の能力を試験した。簡潔に述べると、コルチ器官を生後３日目のマウスから切断し、ポリ−Ｌ−リシンおよびフィブロネクチンでコーティングした４ウェルチャンバー上に蒔いた。１０％ウシ胎児血清、Ｂ２７サプリメントを含有し、試験化合物を加えたおよび加えていないＤＭＥＭ培地中に、外植片を直接蒔いた。Ｎｏｔｃｈ阻害を解明するために、化合物添加２４時間後に、ＲＮｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを抽出し、Ｈｅｓ５に対して特異的な遺伝子プライマーを使用して、定量的ＰＣＲを実施した。Ｒｐｌ１９をハウスキーピング遺伝子として使用し、ΔΔＣｔ法を使用して値を分析した。
（ｂ）有毛細胞誘導。有毛細胞誘導研究のために、外植片を作製し、化合物で上記の通りに処理したが、外植片は、化合物の存在下または非存在下、毎日培地を補充して３〜５日間にわたって処理した。次いで、外植片をパラホルムアルデヒドで固定し、ＭＹＯ７Ａ、ＳＯＸ２に対する抗体で免疫染色し、Ａｌｅｘａ６４７−ファロイジンおよびヘキストで対比染色した。ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用するＮｉｋｏｎ Ｎ２共焦点システムで画像を撮影した。次いで、ＭＹＯ７Ａ／ファロイジン陽性有毛細胞を定量し、ビヒクル処置群に対して比較した。
Ｃ．ヒト神経幹細胞アッセイ
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、胚性幹細胞から、公開されているプロトコール（Yuanら、２０１１年３月２日、PLoS ONE、６巻（３号）：ｅ１７５４０頁）を使用して得た。細胞を選別し、第３継代で特徴付け、増殖させた。次いで、細胞を、第５継代で凍結させた。細胞を、ＮＳＣ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２（１×）、Ｂ２７（１×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１×）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を加えたもの）中で維持した。１日目に、ポリ−オルニチン（ornithin）およびラミニンで予めコーティングした９６ウェルプレート内に、細胞を、１００μｌの培地中、６０，０００細胞／ウェルで蒔いた。２日目に、消費した培地を除去し、１８０μｌの新鮮な培地を細胞に添加した。同日（２日目）の後に、細胞を、試験化合物を含有する２０μｌのＮＳＣ培地で処理した（７点ＣＲＣ）。３日目に、消費した培地を除去し、１４０μｌのＲＬＴ／ｂＭＥを細胞に添加した。トータルＲＮＡ抽出＋ＤＮＡｓｅプロトコールを使用するＱｉａＣｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡを抽出した。次いで、ｉＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ｉＴａｑサイバーグリーン（ＢｉｏＲａｄ）を使用するリアルタイムＰＣＲ分析のためにｃＤＮＡを使用した。ＣＦＸ９６またはＣＦＸ３８４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、Ａｔｏｈ１、Ｈｅｓ５、Ｈｅｓ１、ミオシン７ａ遺伝子の発現を評価した。ＨＰＲＴ１を参照遺伝子として使用した。分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ（登録商標）およびＣＢＩＳ（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。
上記の手順に従って、各化合物についてＥＣ５０を決定した。
Ｄ．有毛細胞様細胞へのヒト胚性幹細胞分化
このプロトコールは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を耳の前駆細胞に分化させ、さらに前駆細胞を有毛細胞様細胞に分化させるように設計された。ｈＥＳＣを、２０％のノックアウト血清、１×非必須アミノ酸、１×ｌ−グルタミン、１×β−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）および８〜１０ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを補充したノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、マイトマイシンＣ処理したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上に維持した。コラゲナーゼを使用して、ｈＥＳＣを新たなＭＥＦ上に、分化を始める準備が整うまで継代し、この場合、８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補充したＭＥＦ馴化培地中のマトリゲルコーティングプレート上に、３〜５日間にわたって継代した。
ヒトＥＳ細胞は、公開されているプロトコール（Ronaghi Mら、Stem Cells Dev. ２０１４年、１２７５〜８４頁）を使用して分化させた。プロトコールの最初の６日間に、胚様体（ＥＢ）を発生させるためにＡｇｇｒｅＷｅｌｌプレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）を使用したことを除いて。３４〜３９日目に、潜在的なＡｔｏｈ１または有毛細胞誘導物質による処理を細胞に施した。３９日目に、細胞を、以下に記載する通りにタンパク質のために溶解させ、画像化のために固定し、またはＲＮＡのために抽出した。
（ａ）ミオシン７ａのウエスタンブロット分析：ＲＩＰＡ緩衝液を使用して、２つの実験的に同様のウェルからタンパク質を同時に抽出した。確立されたプロトコールを使用してタンパク質濃度を決定し、分化したタンパク質試料、同じ継代のｈＥＳＣの試料、マーカー、およびミオシン７ａを発現する陽性対照細胞試料（Ｙ７９細胞）を用いてウエスタンブロットを行った。膜を、ミオシン７ａ抗体およびローディング対照としてのα−アクチン抗体とともに、インキュベートした。ブロットが画像化されたら、Ｌｉｃｏｒシステムを使用して、比較分析のためにミオシン７ａバンドおよびα−アクチンバンドを定量した。
（ｂ）免疫細胞化学検査：ウェルをＤＰＢＳで短時間すすぎ、次いで、４％パラホルムアルデヒドで１０分間にわたって固定し、続いて、ＤＰＢＳ中１００ｍＭのグリシンとともに１０分間インキュベートした。ウェルをＤＰＢＳで３回洗浄し、０．２％トリトンＸ−１００で１０分間にわたって透過処理し、次いで、０．１％ＢＳＡおよび０．２％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液で１時間にわたってブロッキングした。ミオシン７ａおよびＳｏｘ２のための一次抗体を添加し、終夜４℃に保った。翌日、ウェルをＤＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体を添加し、暗所、室温で２時間にわたってインキュベートした。ウェルを２回洗浄し、細胞を、４８８−ファロイジンにより、暗所、室温で１０分間にわたって染色した。ウェルをＤＰＢＳで２回洗浄し、ヘキスト染色をウェルに添加し、暗所、室温で１０分間にわたってインキュベートした。ウェルを最後に３回洗浄し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）ＩｎＣｅｌｌ２２００自動画像化システムを使用して画像化した。
（ｃ）ＰＣＲ：ＲＮＡを抽出し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）製のＲＮＡ単離キットを使用して、単離した（ＤＮＡｓｅ処理を含む）。ＲＮＡ濃度を、ナノドロップを使用して決定した。ｃＤＮＡを、ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）においてｉＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して作製した。ミオシン７ａ、Ａｔｏｈ１、Ｈｅｓ５、Ａｘｉｎ２およびＧＡＰＤＨ等の標的遺伝子の分量を、ＣＦＸ−９６またはＣＦＸ−３８４リアルタイムＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ）においてｉＴａｑ ＰＣＲキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して決定した。すべてのプライマーは、ＯｒｉＧｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）製であった。
Ｅ．モルモットＰＫ
雄ハートレイモルモット（３００〜３５０ｇ）に、ケタミンおよびキシラジンで麻酔をかけた。３０マイクロリットルの本発明の実施形態の水性医薬組成物を、経鼓室的に送達して、薬物を正円窓膜に沈着させた。送達は片側のみであった。動物を、麻酔から回復するまで、暖かいチャンバー内に、投薬された耳側を上にしたままに保って側臥位で入れた。
投与後の種々の時点で、動物をＣＯ２吸入によって安楽死させた。血液およびＣＳＦを収集し、−８０℃で貯蔵した。動物を断頭し、側頭骨を除去し、胞（bulla）を開いて耳嚢を露出させた。マイクロキャピラリー管を使用して、尖部から同側および対側の外リンパを収集した。同側の蝸牛を耳嚢から除去し、−８０℃で貯蔵した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、収集したすべての組織を試験化合物濃度について次の通りに分析した。分析標準は、公知濃度の試験化合物ストック溶液を、血漿または人工ＣＳＦ等のマトリックスにスパイクすることによって調製した。固定量の収集した組織およびスパイクした標準を、内部標準としてのブスピロンを含有するアセトニトリルで沈殿させた。沈殿した試料を、４０００ｇにて、４℃で１０分間にわたって遠心分離した。上清を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣおよびＣＴＣ ＰＡＬオートサンプラー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を装備したＡＢ Ｓｃｉｅｘ４０００ Ｑｔｒａｐ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使用して設定した。
Ｆ．機能的薬力学
（ａ）正円窓膜への試験化合物の外科的送達。ナイーブマウスまたは騒音を受けたもしくは薬理学的に損傷を受けた耳を持つマウスに対して、外科手術を実施した。動物にイソフルランで麻酔をかけ、耳介の下方の尾側端部に８ｍｍの耳介後方の切開を行った。皮膚を引き込み（retracted）、顔面神経および筋肉が一緒になっているところから脂肪組織を鈍的剥離した。筋肉を引き込んで、鼓室胞内の骨が薄い領域を露わにした。３０ｇの針を使用して、耳胞（otic bulla）の露出された薄い部分に穴を開けた。３２ｇの鈍針を備えたハミルトンシリンジを、耳胞の開口部に挿入した。薬物製剤を注射によって送達し、針を除去した。組織接着剤を用いて創傷閉鎖を行った。
（ｂ）機能的ＰＤ。薬物送達後の種々の時点、典型的には２４時間後において、マウスをＣＯ２曝露によって安楽死させ、側頭骨を除去して氷冷ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に入れた。耳嚢を側頭骨から慎重に切断し、ＴｒｉＺｏｌ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含有する清浄な管に入れ、液体窒素中で直ちにフラッシュ凍結し、ＲＮＡ単離まで−８０℃で貯蔵した。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮＡ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅキットを製造業者の指示に従って使用して、ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを作製し、ＢｉｏＲａｄ ｉＴａｑを使用して特異的プライマーに対してＰＣＲを実施した。
Ｇ．有毛細胞誘導
マウスにおいては、本発明の薬物製剤を、上記のＦ項において記載されている通り、正円窓に外科的に送達した。モルモットにおいては、本発明の薬物製剤を、上記のＥ項において記載されている通り、正円窓窩に経鼓室注射を介して送達した。薬物送達の７から１４日後、動物をケタミンおよびキシラジンで安楽死させ、それらの全身を１０％中性緩衝ホルマリンで灌流し、側頭骨を除去し、ホルマリン中に貯蔵した。モルモットについては、蝸牛全組織標本を調製する場合、階内灌流（intrascalar perfusion）を実施して、ホルマリン中の蝸牛を完全に浸した。中央蝸牛軸（Midmodiolar）切片または蝸牛全組織標本を調製し、有毛細胞を同定するために染色した。
Ｈ．聴性脳幹反応（ＡＢＲ）
ナイーブマウスまたは騒音を受けたもしくは薬理学的聴覚消失いずれかの後の種々の時点におけるマウスに、ケタミン／キシラジン／アセプロマジンで麻酔をかけ、Ｔｕｃｋｅｒ Ｄａｖｉｓ（Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）ＲＺ６装置を使用して、両耳における聴性脳幹反応を決定した。マウスを、１０ｄＢ降順ステップにおいて９０〜１０ｄＢで、４、８、１６、２４および３２ｋＨｚのクリックまたは純音に曝露し、聴力閾値を決定した。
実施例３（ｃ）および３（ｄ）の製剤を使用して実施した上記実験の結果を、以下の表において提供する：
ナイーブまたは薬理学的聴覚消失後のモルモットに、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけた。Ｔｕｃｋｅｒ Ｄａｖｉｓ ＲＺ６装置を使用して、両側で聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を決定した。モルモットを、１０ｄＢ降順ステップにおいて９０〜１０ｄＢで、４、８、１６または２４ｋＨｚのクリックまたは純音に曝露し、聴力閾値を決定した。
（実施例１）
結晶性化合物Ｉの調製
化合物Ｉは、２００７年１月２３日に発行された、Flohrら、米国特許第７，１６６，５８７号において開示されており、その中で開示されている合成手順は、従った場合、化合物Ｉを非晶質材料として生成する。非晶質化合物Ｉ（２ｇ）をＭｅＯＨ（６０ｍＬ）に懸濁し、懸濁液を摂氏６５度に加熱して、透明溶液を得た。溶液を冷却し、１８時間にわたって周囲温度のままにした。その時間中に、結晶化が起こった。反応物を濾過し、固体を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体（１ｇ）を得、これは、結晶性であることが決定され、表１におけるＸ線粉末回折ピークおよび図１において表示されているパターンによって特徴付けられる。ＤＳＣ吸熱開始は、図２において示される通り、２３８．５℃で起こる。
（実施例２）
結晶性化合物ＩＩの調製
化合物ＩＩは、２００７年１月９日に発行された、Flohrら、米国特許第７，１６０，８７５号において開示されており、その中で開示されている合成手順は、従った場合、化合物ＩＩを非晶質材料として生成する。非晶質化合物ＩＩ（４３２ｍｇ）を２０ｍＬのバイアル内に秤量し、ＥｔＯＨ（２．１５ｍＬ、５体積）に溶解した。得られた透明溶液を３０分後に検査して、白色粉末が形成されたことを観察した。この懸濁液を、室温でおよそ１６時間にわたってかき混ぜ、固体を濾過によって単離し、４０℃／３ｍｂａｒで１６時間にわたって乾燥させて、粉末状白色固体（３１５ｍｇ、７３％収率）を得、これは、結晶性であることが決定され、表２におけるＸＲＰＤピークおよび図３において表示されているパターンによって特徴付けられる。ＤＳＣ吸熱開始は、図４において示される通り、１７３℃（融解）で始まる。
（実施例３（ａ）および３（ｂ））
製剤Ａ−１の調製
実施例３（ａ）− １２８ｍＬの滅菌濾過した水に、０．９ｇの塩化ナトリウム、０．５９ｇのリン酸二ナトリウムおよび０．１７ｇのリン酸一ナトリウムを添加した。溶液を周囲温度で撹拌し、２７．２ｇのポロキサマー４０７を添加し、終夜撹拌して、透明溶液を得た。２ｍＬの上記した溶液を、４０ｍｇの結晶性化合物Ｉに添加し、懸濁液を氷浴上で２０分間にわたって撹拌して、均一懸濁液を得た。
実施例３（ｂ）− ２％ｗ／ｖの結晶性化合物ＩＩを含有する均一懸濁液を、上記したのと同じ様式で調製した。
（実施例３（ｃ）および（ｄ））
製剤Ａ−２の実施例３（ｃ）及び（ｄ）
実施例３（ｃ）− １２９ｍＬの滅菌水に、０．９６ｇの塩化ナトリウム、０．５９ｇのリン酸二ナトリウムおよび０．１４ｇのリン酸一ナトリウムを添加した。溶液を周囲温度で撹拌し、２５．６ｇのポロキサマー４０７を添加し、終夜撹拌して、透明溶液を得た。溶液を滅菌濾過し、１ｍＬの上記した溶液を、２０ｍｇの結晶性化合物Ｉに添加し、懸濁液を６０分間にわたってボルテックスして、均一懸濁液を得た。
実施例３（ｄ）− ２％ｗ／ｖの結晶性化合物ＩＩを含有する均一懸濁液を、上記したのと同じ様式で調製した。
（実施例４）
製剤Ｂの調製
３ｍＬの滅菌濾過した０．１Ｍ ｐＨ７ ＴＲＩＳ緩衝液に、０．６ｇのポロキサマー４０７を添加し、これを、４℃で終夜撹拌して、透明な均一溶液を形成した。次いで、この溶液に、６０ｍｇの結晶性化合物Ｉおよび３ｍｇのメチルパラベンを添加した。得られた懸濁液を４℃で１６時間にわたって撹拌し、投薬まで４℃で貯蔵した。
（実施例５（ａ）、５（ｂ）、５（ｃ）および５（ｄ））
製剤Ｃの調製
実施例５（ａ）− １０ｍＬの滅菌濾過した０．１Ｍ ｐＨ７ ＴＲＩＳ緩衝液に、１．８ｇのポロキサマー４０７を添加し、これを、４℃で終夜撹拌して、透明な均一溶液を形成した。次いで、３ｍＬのこの溶液に、６０ｍｇの結晶性化合物Ｉを添加し、懸濁液を４℃で終夜撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成した。最後に、９０ｍｇのヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（４０〜６０ｃｐ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および３ｍｇのメチルパラベンを添加し、懸濁液を４℃で１６時間にわたって撹拌し、投薬まで４℃で貯蔵した。
実施例５（ｂ）− ２％の非晶質化合物Ｉを含有する均一懸濁液を、上記した手順に従って調製した。
実施例５（ｃ）− ２％の結晶性化合物ＩＩを含有する均一懸濁液を、上記した手順に従って調製した。
実施例５（ｄ）− ２％の非晶質化合物ＩＩを含有する均一懸濁液を、上記した手順に従って調製した。
（実施例６）
製剤Ｄの調製
３ｍＬの滅菌濾過した０．１Ｍ ｐＨ７ ＴＲＩＳ緩衝液に、０．５４ｇのポロキサマー４０７を添加し、これを、４℃で終夜撹拌して、透明な均一溶液を形成した。次いで、この溶液に、６０ｍｇの結晶性化合物Ｉを添加し、懸濁液を４℃で終夜撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成した。最後に、９０ｍｇのＨＰＭＣ（４０〜６０ｃｐ）、３ｍｇのメチルパラベンおよび６ｍｇのＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を添加し、懸濁液を４℃で１６時間にわたって撹拌し、投薬まで４℃で貯蔵した。
（実施例７）
製剤Ｅの調製
３ｍＬの滅菌濾過した０．１Ｍ ｐＨ７ ＴＲＩＳ緩衝液に、０．５４ｇのポロキサマー４０７を添加し、これを、４℃で終夜撹拌して、透明な均一溶液を形成した。次いで、この溶液に、６０ｍｇの結晶性化合物Ｉを添加し、懸濁液を４℃で終夜撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成し、投薬まで４℃で貯蔵した。
（実施例８）
製剤Ｆの調製
１０ｍＬの滅菌濾過リン酸緩衝食塩水に、１００ｍｇのヒアルロン酸を添加し、これを、周囲温度で終夜撹拌して、透明な均一溶液を形成した。６０ｍｇの結晶性化合物Ｉに、０．６ｍＬのＰＥＧ４００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌した。３ｍＬの上記したヒアルロン酸溶液を、化合物ＩおよびＰＥＧ４００懸濁液に添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成した。
（実施例９）
製剤Ｇの調製
１０ｍＬの滅菌濾過リン酸緩衝食塩水に、２００ｍｇのヒアルロン酸を添加し、これを、周囲温度で終夜撹拌して、透明な均一溶液を形成した。６０ｍｇの結晶性化合物Ｉに、０．１５ｍＬのＰＥＧ４００を添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌した。３ｍＬの上記したヒアルロン酸溶液を、化合物ＩおよびＰＥＧ４００懸濁液に添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成した。
（実施例１０（ａ）および１０（ｂ））
製剤Ｈの調製
実施例１０（ａ）− １０ｍＬの滅菌濾過リン酸緩衝食塩水に、１５０ｍｇのヒアルロン酸を添加し、これを、周囲温度で終夜撹拌して、透明な均一溶液を形成した。６０ｍｇの結晶性化合物Ｉに、０．３ｍＬのＰＥＧ４００を添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌した。３ｍＬの上記したヒアルロン酸溶液を、化合物ＩおよびＰＥＧ４００懸濁液に添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成した。
実施例１０（ｂ）− ２％の結晶性化合物ＩＩを含有する均一懸濁液を、上記した手順に従って調製した。
（実施例１１）
製剤Ｉの調製
５ｍＬの滅菌濾過リン酸緩衝食塩水に、５０ｍｇのオリゴペプチド（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）ペプチドヒドロゲル、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を添加し、これを、周囲温度で２時間にわたって撹拌して、透明な均一溶液を形成した。６０ｍｇの結晶性化合物Ｉに、０．３ｍＬのＰＥＧ４００を添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌した。３ｍＬの上記したオリゴペプチド溶液を、化合物ＩおよびＰＥＧ４００懸濁液に添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成した。
（実施例１２）
製剤Ｊの調製
５ｍＬの滅菌濾過リン酸緩衝食塩水に、５００ｍｇのＨＰＭＣ（４０〜６０ｃｐ）を添加し、これを、周囲温度で終夜にわたって撹拌して、透明な均一溶液を形成した。６０ｍｇの結晶性化合物Ｉに、０．３ｍＬのＰＥＧ４００を添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌した。３ｍＬの上記したＨＰＭＣ溶液を、化合物ＩおよびＰＥＧ４００懸濁液に添加した。懸濁液を周囲温度で撹拌して、均一に分散した懸濁液を形成した。
（実施例１３）
モルモットＰＫ
本明細書で記載されている液体組成物を、上記で提供されている生物学的機能の項のパートＥにおいて記載されている方法を使用して評価した。実施例５（ａ）〜５（ｄ）において記載されている通りに調製した液体組成物を、それぞれ１ｍＬのシリンジに吸い込んだ。充填された１ｍＬのシリンジを使用して、液体組成物を、２８ゲージの針を装着した１００μＬのハミルトンシリンジに５℃で再充填した（back-filled）。次いで、ハミルトンシリンジを室温に加温した。
雄ハートレイモルモット（３００〜３５０ｇ）に、ケタミンおよびキシラジンで麻酔をかけた。３０マイクロリットルの上記の液体組成物を経鼓室的に送達して、薬物を正円窓膜に沈着させた。送達は片側のみであった。動物を、麻酔から回復するまで、暖かいチャンバー内に、投薬された耳側を上にしたままに保って側臥位で入れた。
投与後の種々の時点で、動物をＣＯ２吸入によって安楽死させた。血液および脳脊髄液を収集し、−８０℃で貯蔵した。動物を断頭し、側頭骨を除去し、胞を開いて耳嚢を露出再た。マイクロキャピラリー管を使用して、尖部から同側および対側の外リンパを収集した。同側の蝸牛を耳嚢から除去し、−８０℃で貯蔵した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、収集したすべての組織を上記の生物学的機能の項のパートＥにおいて記載されている通りに分析した。
化合物Ｉおよび化合物ＩＩの濃度は、種々の時点で、結晶性形態または非晶質形態のいずれかの本発明の製剤の経鼓室注射後、外リンパ流体および蝸牛組織の両方においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して測定した。非晶質形態として投薬される場合、外リンパおよび蝸牛における化合物Ｉの濃度は、１日および７日におけるＡｔｏｈ１についてのヒトＮＳＣ ＥＣ５０を上回るものであった。結晶性形態として投薬される場合の化合物１の濃度は、１日目から２８日目までのＮＳＣ ＥＣ５０を上回るものであった。非晶質形態として投薬される場合、外リンパおよび蝸牛における化合物ＩＩの濃度は、１日および７日におけるＡｔｏｈ１についてのヒトＮＳＣ ＥＣ５０を上回るものであった。結晶性形態として投薬される場合の化合物ＩＩの濃度は、１日目から４２日目までのヒトＮＳＣ ＥＣ５０ Ａｔｏｈ１を上回るものであった。外リンパおよび／または蝸牛組織中の本発明の化合物の濃度は、対象化合物がヒトの有毛細胞再生および聴力回復において効果的であり得ることの指標である、Ａｔｏｈ１についてのヒトＮＳＣ ＥＣ５０を上回るものであった。驚くべきことに、ｐＫ結果は、結晶性化合物Ｉおよび結晶性化合物ＩＩを含有する製剤が、それぞれの非晶質形態を含有する製剤よりも長い、内耳への化合物Ｉおよび化合物ＩＩの曝露を提供することを示す。以下の表３は、結晶性化合物Ｉの水性製剤を使用する研究についての結果を収載し、一方、以下の表４は、結晶性化合物ＩＩの水性製剤についてのものを収載する。結晶性化合物Ｉの水性製剤についての結果を、図５Ａおよび図５Ｂにおいてグラフでも示し、一方、結晶性化合物ＩＩの水性製剤についての結果を、図６Ａおよび図６Ｂにおいてグラフで示す。

前述は、明瞭さおよび理解を目的に、例証および実施例としてある程度詳細に記載してきたが、本開示の趣旨から逸脱することなく、多数のおよび種々の修正が為され得ることが、当業者には理解される。したがって、本明細書で開示されている形態は例証に過ぎず、本開示の範囲を限定することを意図しておらず、むしろ、本発明の真の範囲および趣旨に付随するすべての修正および代替も網羅することを、明らかに理解すべきである。
本開示の一部の実施形態は、聴力損失の処置における、（１）本明細書で記載されている結晶性化合物から選択される活性剤と；（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが、およそ７．０から８．０の間である水溶液とを含み、前記活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、水性医薬組成物の調製における、本明細書で開示されている結晶性化合物から選択される活性剤またはそれを含む組成物の使用を対象とする。一部の実施形態では、水性医薬（pharmacecutical）組成物は、患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与のために製剤化される。一部の実施形態では、活性剤は、本明細書で記載されている結晶性化合物Ｉである。一部の実施形態では、活性剤は、本明細書で記載されている結晶性化合物ＩＩである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
式：

を有し、８．２、１３．８、１４．０、１８．４および２０．９±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性化合物Ｉ。
（項目２）
４．６、８．２、９．２、１３．８、１４．０、１８．２、１８．４、２０．９、２３．８および２７．７±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、項目１に記載の結晶性化合物Ｉ。
（項目３）
３．０、４．６、８．２、９．２、１０．４、１３．８、１４．０、１６．４、１８．２、１８．４、１８．８、１９．１、２０．９、２１．５、２２．２、２２．７、２３．０、２３．８、２４．３、２４．７、２５．２、２６．５、２６．６、２７．１、２７．７、２８．１、２８．３、２８．６、２９．０、３０．０、３１．２、３１．５、３１．８、３２．１、３２．４、３５．１、３５．６、３５．８、３６．４、３６．７、３８．４、３８．８、３９．８、４０．５および４０．８±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、項目１に記載の結晶性化合物Ｉ。
（項目４）
約２３８．５℃において示差走査熱量測定の吸熱開始を有するものとしてさらに特徴付けられる、項目１に記載の結晶性化合物Ｉ。
（項目５）
式：

を有し、８．４、１５．２、１６．０、２０．６および２２．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性化合物ＩＩ。
（項目６）
６．５、８．４、１５．２、１６．０、１９．９、２０．６、２２．６、２４．５、２５．１および３０．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、項目５に記載の結晶性化合物ＩＩ。
（項目７）
６．５、８．４、１０．１、１３．１、１４．６、１５．０、１５．２、１６．０、１７．６、１８．０、１８．４、１９．６、１９．９、２０．１、２０．６、２０．９、２１．２、２２．２、２２．６、２３．３、２３．５、２３．８、２４．５、２４．９、２５．１、２５．８、２６．１、２６．７、２６．８、２７．５、２７．８、２９．６、３０．６、３１．２、３２．３、３２．９、３３．２、３３．９、３４．４、３５．４、３６．３、３６．７、３７．３、３７．７、３８．０、３８．９、４０．０、４０．２、４０．８および４１．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、項目５に記載の結晶性化合物ＩＩ。
（項目８）
約１７３℃において示差走査熱量測定の吸熱開始を有するものとしてさらに特徴付けられる、項目５に記載の結晶性化合物ＩＩ。
（項目９）
（１）項目１から８のいずれかに記載の結晶性化合物から選択される活性剤と、
（２）（Ａ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７；または
（Ｂ）（ｉ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）公称粘度４０〜６０ｃＰもしくはグレード８０〜１２０ｃＰを有するおよそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルメチルセルロース；または
（Ｃ）（ｉ）およそ１０重量％（ｗ／ｗ）〜２０重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）およそ０．１重量％（ｗ／ｗ）〜０．３重量％（ｗ／ｗ）のＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ；または
（Ｄ）（ｉ）およそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から８重量％（ｗ／ｗ）のヒアルロン酸；または
（Ｅ）（ｉ）およそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒアルロン酸、および
（ｉｉ）およそ５体積％から２０体積％のポリエチレングリコール４００
を含む薬学的に許容される水溶液と
を含み、
該活性剤が、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから約２０％ｗ／ｖで存在する、鼓室内投与のための水性医薬組成物。
（項目１０）
前記水溶液が、
（Ａ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７；または
（Ｂ）（ｉ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）公称粘度４０〜６０ｃＰもしくはグレード８０〜１２０ｃＰを有するおよそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルメチルセルロース；または
（Ｃ）（ｉ）およそ１０重量％（ｗ／ｗ）〜２０重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
（ｉｉ）およそ０．１重量％（ｗ／ｗ）〜０．３重量％（ｗ／ｗ）のＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ
を含む、項目９に記載の水性医薬組成物。
（項目１１）
前記水溶液が、およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含む、項目９または１０に記載の水性医薬組成物。
（項目１２）
前記水溶液のｐＨが、約７．０から８．０の間である、項目９から１１のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
（項目１３）
前記水溶液が、緩衝剤をさらに含む、項目９から１２のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
（項目１４）
前記緩衝剤が、（ｉ）リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムまたはそれらの組合せ；および（ｉｉ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから選択される、項目１３に記載の水性医薬組成物。
（項目１５）
前記活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、項目９から１４のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
（項目１６）
前記水溶液が、およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含む、項目９から１４のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
（項目１７）
（１）項目１から４のいずれかに記載の結晶性化合物Ｉと、
（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが約７．０から８．０の間である薬学的に許容される水溶液と
を含み、
該結晶性化合物Ｉが、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖで存在する、項目９に記載の水性医薬組成物。
（項目１８）
前記水溶液が、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含む、項目１７に記載の水性医薬組成物。
（項目１９）
前記結晶性化合物Ｉが、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、項目１７または１８に記載の水性医薬組成物。
（項目２０）
（１）項目５から８のいずれかに記載の結晶性化合物ＩＩと、
（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが約７．０から８．０の間である薬学的に許容される水溶液と
を含み、
該結晶性化合物ＩＩが、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖで存在する、項目９に記載の水性医薬組成物。
（項目２１）
前記水溶液が、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含む、項目２０に記載の水性医薬組成物。
（項目２２）
前記結晶性化合物ＩＩが、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、項目２０から２１に記載の水性医薬組成物。
（項目２３）
耳の障害の処置のための方法であって、項目１から８のいずれかに記載の結晶性化合物から選択される治療有効量の活性剤の、それを必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与を含む、方法。
（項目２４）
前記耳の障害が、聴力損失である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
耳の障害を処置する方法であって、項目９から２２のいずれかに記載の水性医薬組成物の、そのような処置を必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与を含む、方法。
（項目２６）
前記耳の障害が、聴力損失である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記水性医薬組成物が、週に１回から３か月毎に１回の間の頻度で投与される、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
聴力損失を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への、（１）項目１から８のいずれかに記載の結晶性化合物から選択される活性剤と、（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが、約７．０から８．０の間である水溶液とを含み、該活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、水性医薬組成物の鼓室内投与を含む、方法。
（項目２９）
前記活性剤が、項目１から４のいずれかに記載の結晶性化合物Ｉである、項目２８に記載の聴力損失を処置する方法。
（項目３０）
前記活性剤が、項目５から８のいずれかに記載の結晶性化合物ＩＩである、項目２８に記載の聴力損失を処置する方法。

Claims (30)

  1. 式：

    を有し、８．２、１３．８、１４．０、１８．４および２０．９±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性化合物Ｉ。
  2. ４．６、８．２、９．２、１３．８、１４．０、１８．２、１８．４、２０．９、２３．８および２７．７±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、請求項１に記載の結晶性化合物Ｉ。
  3. ３．０、４．６、８．２、９．２、１０．４、１３．８、１４．０、１６．４、１８．２、１８．４、１８．８、１９．１、２０．９、２１．５、２２．２、２２．７、２３．０、２３．８、２４．３、２４．７、２５．２、２６．５、２６．６、２７．１、２７．７、２８．１、２８．３、２８．６、２９．０、３０．０、３１．２、３１．５、３１．８、３２．１、３２．４、３５．１、３５．６、３５．８、３６．４、３６．７、３８．４、３８．８、３９．８、４０．５および４０．８±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、請求項１に記載の結晶性化合物Ｉ。
  4. 約２３８．５℃において示差走査熱量測定の吸熱開始を有するものとしてさらに特徴付けられる、請求項１に記載の結晶性化合物Ｉ。
  5. 式：

    を有し、８．４、１５．２、１６．０、２０．６および２２．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性化合物ＩＩ。
  6. ６．５、８．４、１５．２、１６．０、１９．９、２０．６、２２．６、２４．５、２５．１および３０．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、請求項５に記載の結晶性化合物ＩＩ。
  7. ６．５、８．４、１０．１、１３．１、１４．６、１５．０、１５．２、１６．０、１７．６、１８．０、１８．４、１９．６、１９．９、２０．１、２０．６、２０．９、２１．２、２２．２、２２．６、２３．３、２３．５、２３．８、２４．５、２４．９、２５．１、２５．８、２６．１、２６．７、２６．８、２７．５、２７．８、２９．６、３０．６、３１．２、３２．３、３２．９、３３．２、３３．９、３４．４、３５．４、３６．３、３６．７、３７．３、３７．７、３８．０、３８．９、４０．０、４０．２、４０．８および４１．６±０．１５度２シータにおいてピークを持つＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、請求項５に記載の結晶性化合物ＩＩ。
  8. 約１７３℃において示差走査熱量測定の吸熱開始を有するものとしてさらに特徴付けられる、請求項５に記載の結晶性化合物ＩＩ。
  9. （１）請求項１から８のいずれかに記載の結晶性化合物から選択される活性剤と、
    （２）（Ａ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７；または
    （Ｂ）（ｉ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
    （ｉｉ）公称粘度４０〜６０ｃＰもしくはグレード８０〜１２０ｃＰを有するおよそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルメチルセルロース；または
    （Ｃ）（ｉ）およそ１０重量％（ｗ／ｗ）〜２０重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
    （ｉｉ）およそ０．１重量％（ｗ／ｗ）〜０．３重量％（ｗ／ｗ）のＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ；または
    （Ｄ）（ｉ）およそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から８重量％（ｗ／ｗ）のヒアルロン酸；または
    （Ｅ）（ｉ）およそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒアルロン酸、および
    （ｉｉ）およそ５体積％から２０体積％のポリエチレングリコール４００
    を含む薬学的に許容される水溶液と
    を含み、
    該活性剤が、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから約２０％ｗ／ｖで存在する、鼓室内投与のための水性医薬組成物。
  10. 前記水溶液が、
    （Ａ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７；または
    （Ｂ）（ｉ）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
    （ｉｉ）公称粘度４０〜６０ｃＰもしくはグレード８０〜１２０ｃＰを有するおよそ０．５重量％（ｗ／ｗ）から４重量％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルメチルセルロース；または
    （Ｃ）（ｉ）およそ１０重量％（ｗ／ｗ）〜２０重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７、および
    （ｉｉ）およそ０．１重量％（ｗ／ｗ）〜０．３重量％（ｗ／ｗ）のＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ
    を含む、請求項９に記載の水性医薬組成物。
  11. 前記水溶液が、およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含む、請求項９または１０に記載の水性医薬組成物。
  12. 前記水溶液のｐＨが、約７．０から８．０の間である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
  13. 前記水溶液が、緩衝剤をさらに含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
  14. 前記緩衝剤が、（ｉ）リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムまたはそれらの組合せ；および（ｉｉ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから選択される、請求項１３に記載の水性医薬組成物。
  15. 前記活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、請求項９から１４のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
  16. 前記水溶液が、およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含む、請求項９から１４のいずれか一項に記載の水性医薬組成物。
  17. （１）請求項１から４のいずれかに記載の結晶性化合物Ｉと、
    （２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが約７．０から８．０の間である薬学的に許容される水溶液と
    を含み、
    該結晶性化合物Ｉが、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖで存在する、請求項９に記載の水性医薬組成物。
  18. 前記水溶液が、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含む、請求項１７に記載の水性医薬組成物。
  19. 前記結晶性化合物Ｉが、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、請求項１７または１８に記載の水性医薬組成物。
  20. （１）請求項５から８のいずれかに記載の結晶性化合物ＩＩと、
    （２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から２５重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが約７．０から８．０の間である薬学的に許容される水溶液と
    を含み、
    該結晶性化合物ＩＩが、該水溶液のおよそ０．０１％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖで存在する、請求項９に記載の水性医薬組成物。
  21. 前記水溶液が、およそ１５重量％から１８重量％のポロキサマー４０７を含む、請求項２０に記載の水性医薬組成物。
  22. 前記結晶性化合物ＩＩが、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、請求項２０から２１に記載の水性医薬組成物。
  23. 耳の障害の処置のための方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の結晶性化合物から選択される治療有効量の活性剤の、それを必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与を含む、方法。
  24. 前記耳の障害が、聴力損失である、請求項２３に記載の方法。
  25. 耳の障害を処置する方法であって、請求項９から２２のいずれかに記載の水性医薬組成物の、そのような処置を必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への鼓室内投与を含む、方法。
  26. 前記耳の障害が、聴力損失である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記水性医薬組成物が、週に１回から３か月毎に１回の間の頻度で投与される、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 聴力損失を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に対する、該患者の耳内の正円窓膜にあるまたはその付近にある領域への、（１）請求項１から８のいずれかに記載の結晶性化合物から選択される活性剤と、（２）およそ１５重量％（ｗ／ｗ）から１８重量％（ｗ／ｗ）のポロキサマー４０７を含み、ｐＨが、約７．０から８．０の間である水溶液とを含み、該活性剤が、およそ０．１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖで存在する、水性医薬組成物の鼓室内投与を含む、方法。
  29. 前記活性剤が、請求項１から４のいずれかに記載の結晶性化合物Ｉである、請求項２８に記載の聴力損失を処置する方法。
  30. 前記活性剤が、請求項５から８のいずれかに記載の結晶性化合物ＩＩである、請求項２８に記載の聴力損失を処置する方法。
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