CN109071450A - 二苯并氮杂卓化合物及其治疗耳部疾病和病症的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了结晶化合物I和结晶化合物II，适于鼓室内施用的包含所述结晶化合物之一的药物组合物，以及使用所述结晶化合物和所述药物组合物治疗耳部病症的方法。

Description

二苯并氮杂卓化合物及其治疗耳部疾病和病症的用途
背景
领域
本公开内容涉及某些取代的二苯并氮杂卓衍生物及其药物组合物治疗内耳的耳部疾病和病症的用途。本公开内容进一步涉及治疗耳部疾病和病症的药物组合物和方法。
描述
听力损失使美国超过百分之十的人口遭受痛苦。外周听觉系统的损伤是大多数此类听力缺陷的原因。特别地，毛细胞的破坏和螺旋神经节中的初级传入神经元(其将听觉信号从毛细胞转导至脑)的破坏已经涉及听力损伤的主要原因。
引起听力损伤的因素包括大的噪音、衰老、感染和耳毒性化学物质。其中，最后一个是某些治疗药物、食品或药品中的污染物、以及环境和工业污染物。已经发现对听力具有副作用的治疗剂包括氨基糖苷抗生素(例如链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素和阿米卡星)、诸如顺铂和卡铂的含铂的抗肿瘤剂、诸如红霉素的某些大环内脂抗生素，诸如万古霉素的糖肽抗生素、奎宁及其类似物、水杨酸酯及其类似物以及诸如呋塞米和依他尼酸的髓袢利尿剂。诸如顺铂和氨基糖苷抗生素的耳毒剂(Ototoxin)在耳蜗的毛细胞中积累，并且由该积累导致对这些细胞的细胞损害被认为是化学诱导的听力损失的主要原因。前庭和听觉系统共享许多特性，包括毛细胞的外周神经元支配和到达脑干核团的中心投影。前庭功能同样地对耳毒剂是敏感的，如以上所述。
这些药物对听觉细胞和螺旋神经节神经元的毒性作用在其治疗有效性中通常是限制因素。例如，氨基糖苷抗生素是有效抵抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗酸细菌的广谱抗菌剂。其主要用于治疗由革兰氏阴性细菌引起的感染，通常与提供协同作用的β内酰胺相组合。使用氨基糖苷抗生素的优点包括艰难梭菌(clostridium difficile)腹泻的发生率低(相对于其他抗生素)和变态反应的风险性低。然而，已知氨基糖苷表现出严重的耳毒性，尤其是在较高剂量时。例如，每日给予一克链霉素持续60天至120天的患者中的25％表现出一些前庭损伤，而每天两克时，发病率增加至75％，并且一些患者遭受永久损害(参见第5,059,591号美国专利)。
诸如阿司匹林的水杨酸酯由于其抗炎症、止痛、退热和抗血栓作用而已经长期使用。不幸地，水杨酸酯具有耳毒性副作用，通常导致耳鸣(“耳中嗡嗡作响”)和暂时的听力损失，并且如果高剂量使用长久的时间，则听力损伤可以变为持久性且不可逆的(J.A.Brien,1993,Drug Safety 9:143-148)。
已知髓袢利尿剂(例如依他尼酸、呋塞米和布美他尼)引起耳毒性。多种不常使用的髓袢利尿剂也已经通过实验示出引起耳毒性；这种群组包括托拉塞米、阿佐塞米、奥唑林酮、茚达立酮和吡咯他尼。与髓袢利尿剂有关的听力损失经常是(但不总是)不可逆的。
耳毒性对于顺铂是严重的剂量限制性副作用，所述顺铂为广泛使用的抗肿瘤剂，其已经证明对包括睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌和头颈癌在内的各种人类癌症是有效的。顺铂的毒性副作用(外周神经病、骨髓抑制、肠胃毒性、肾毒性和耳毒性)是众所周知的。甘露醇、高渗盐水的常规施用和高流体施用已经很大程度上减轻了顺铂诱导的肾毒性，留下耳毒性作为当今主要的剂量限制性因素。因此，尽管越来越多的癌症患者幸免于化学治疗的调整方案，但他们经常遭受顺铂诱导的听力损伤。
顺铂损害听觉和前庭系统。顺铂的主要耳毒性作用似乎发生在耳蜗。解剖学变化发生在血管纹和柯蒂(Corti)器官中。主要的组织学发现包括剂量相关性毛细胞变性和对支持细胞的损害，并且在高剂量时，可以发生膜迷路的完全萎陷。在柯蒂器官中，存在外毛细胞和内毛细胞的损失，并且倾向于底转的外毛细胞损失以及支持细胞和赖斯纳氏(Reissner)膜的改变。还已经报道了在外毛细胞的顶端部分中角皮层软化和溶酶体数目增加。
噪音诱导的听力损失(NIHL)描述了慢性听力损害疾病过程，其在暴露于较低强度的噪音水平的多年内逐渐发生，其中损伤针对内耳、特别是耳蜗。这种类型的听力损失通常由长期暴露于具有叠加的阵发性影响的高强度持续噪音或脉冲噪音所引起。短时间出现在耳中的强声和长时间出现的强度较弱的声音将对内耳产生相同损害。大多数慢性NIHL是由于职业或工业暴露造成的。然而，非职业形式的NIHL(称为社会性听力减退)可以由炮火声、大声的音乐(经由音乐会或耳机)、敞式车辆(例如摩托车、雪地汽车或拖拉机)以及电动工具造成，在此仅举几例。尽管听力损伤通常是对称的，即，两只耳朵都受到影响，但是也存在导致不对称的听力损失的情况，例如由于经常靶标射击造成的听力损失。
在暴露于诸如爆炸冲击波的脉冲噪音时，患者可能遭受显著的鼓膜损害和中耳损害。在通常发生在较低强度水平的长期暴露时，不太可能发生中耳损害和鼓膜损害。在噪音暴露时，主要且初始的损害通常在耳蜗，并且随时间发生听觉系统的二次神经变性。K.Campbell在“Essential Audiology for Physicians”(1998),San Diego:SingularPublishing Group,Inc.中综述了噪音诱导的听力损失。
年龄相关性听力损失或老年性耳聋在老年人中是常见的神经变性病症。在美国，65岁至74岁之间的约三分之一的人患有听力损失，75岁以上的人中有近乎一半患有听力困难(数据来自National Institution on Deafness and other CommunicationDisorder)。衰老过程与许多其他因素相互作用，例如噪音暴露和多方面的耳毒性损害，这对于耳蜗中的受体毛细胞(HC)和螺旋神经节神经元(SGN)是有害的。在许多情况下，难以区分自身衰老的作用与其他有害因素对耳蜗中细胞死亡的作用。由HC和SGN的损失引起的永久性听力损失是不可逆的，因为细胞是末端发育的并且无法通过有丝分裂进行替代。
中耳炎是中耳的炎症，最常见与病毒感染或细菌感染有关。相对高比例的人群、特别是儿童受到影响。在儿童中，疾病最常见与上呼吸道病害有关，其在耳咽管和中耳中引起渗出物分泌反应。细菌和病毒经由耳咽管从鼻咽部迁移至正常充气的中耳，并且可以引起耳咽管被阻塞，妨碍中耳的通风和排泄。然后流体积累在耳膜后，引起疼痛和炎症。
在儿童中，中耳炎是听力损失的最常见原因。尽管中耳炎容易用抗生素进行治疗并且通常不严重，但是频繁的和/或未治疗的中耳炎可以永久性地损害儿童听力。保留在中耳中的流体可以引起急性中耳炎的重复发作，并且如果病况变成慢性的，其可以引起急性感染的频繁复发。在中耳炎的更严重形式中，脓性渗出物、毒素和内源性抗微生物酶积累在中耳中，这可以对感觉神经和声音传导结构引起不可修复的损害。由此类感染引起的对耳膜、耳骨或听觉神经的损害可以潜在地导致永久性听力损失。听力损失还可以由内耳耳蜗毛细胞的损伤、损害或破坏造成，因为中耳空间中的损害物质经由扩散通过圆窗膜进入内耳。
Izumikawa,M.等人，“Auditory Hair Cell Replacement and HearingImprovement by Atoh1 Gene Therapy in Deaf Mammals”,Nat.Med.11(3),271-276(2005)公开了Atoh1基因经由腺病毒载体施用于耳蜗改善了豚鼠中的听力阈值。Notch信号转导途径抑制剂，特别是选择性γ分泌酶抑制剂被理解为通过其对Atoh1表达的阳性作用刺激毛细胞分化。(Zheng等人，“Hes1is a Negative Regulator of Inner Ear Hair CellDifferentiation”,Development,2000,127(21):4551-60；Zine等人，“Hes1andHes5Activities Are Required for the Normal Development of the Hair Cells inthe Mammalian Inner Ear”,J Neurosci.,2001,21(13):4712-20；Yamamoto等人，“Inhibition of Notch/RBP-J Signaling Induces Hair Cell Formation in NeonateMouse Cochleas”,J Mol Med,2006,84(1):37-45)。
Mizutari,K.等人，“Notch Inhibition Induces Cochlear Hair CellRegeneration and Recovery of Hearing after Acoustic Trauma”,Neuron 77,58-69(2013)描述了对具有噪音诱导的听力损失的幼鼠中的LY411575的研究。
申请人已经鉴定出选择的取代二苯并氮杂卓衍生物，其尤其适于治疗(包括预防、降低发病率和/或严重程度、使进程减慢或停止，以及逆转)内耳的耳部疾病和病症。
概述
本公开内容提供了化合物的结晶形式，所述化合物选自具有下式的化合物I：
以及具有下式的化合物II：
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物I的特征在于X-射线粉末衍射图谱在8.2°、13.8°、14.0°、18.4°和20.9°±0.15°2θ处有峰。
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物I的特征在于X-射线粉末衍射图谱在4.6°、8.2°、9.2°、13.8°、14.0°、18.2°、18.4°、20.9°、23.8°和27.7°±0.15°2θ处有峰。
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物I的特征在于X-射线粉末衍射图谱在3.0°、4.6°、8.2°、9.2°、10.4°、13.8°、14.0°、16.4°、18.2°、18.4°、18.8°、19.1°、20.9°、21.5°、22.2°、22.7°、23.0°、23.8°、24.3°、24.7°、25.2°、26.5°、26.6°、27.1°、27.7°、28.1°、28.3°、28.6°、29.0°、30.0°、31.2°、31.5°、31.8°、32.1°、32.4°、35.1°、35.6°、35.8°、36.4°、36.7°、38.4°、38.8°、39.8°、40.5°和40.8°±0.15°2θ处有峰。
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物I的特征还在于具有在约238.5℃处的差示扫描量热吸热开始。
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物I的特征还在于具有在约249.3℃处的差示扫描量热吸热峰。
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物II的特征在于X-射线粉末衍射图谱在8.4°、15.2°、16.0°、20.6°和22.6°±0.15°2θ处有峰。
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物II的特征在于X-射线粉末衍射图谱在6.5°、8.4°、15.2°、16.0°、19.9°、20.6°、22.6°、24.5°、25.1°和30.6°±0.15°2θ处有峰。
在一些实施方案中，本发明的结晶化合物II的特征在于X-射线粉末衍射图谱在6.5°、8.4°、10.1°、13.1°、14.6°、15.0°、15.2°、16.0°、17.6°、18.0°、18.4°、19.6°、19.9°、20.1°、20.6°、20.9°、21.2°、22.2°、22.6°、23.3°、23.5°、23.8°、24.5°、24.9°、25.1°、25.8°、26.1°、26.7°、26.8°、27.5°、27.8°、29.6°、30.6°、31.2°、32.3°、32.9°、33.2°、33.9°、34.4°、35.4°、36.3°、36.7°、37.3°、37.7°、38.0°、38.9°、40.0°、40.2°、40.8°和41.6°±0.15°2θ处有峰。
在一些实施方案中，化合物II的结晶形式的特征还在于具有在约173℃处的差示扫描量热吸热开始。
在一些实施方案中，化合物II的结晶形式的特征还在于具有在约175℃处的差示扫描量热吸热峰。
在一些实施方案中，本公开内容提供用于鼓室内施用的水性药物组合物，包含：
(1)活性剂，其选自以上所提供的实施方案的结晶化合物I和结晶化合物II，以及
(2)药物可接受的水溶液，其包含：
(A)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407；或者(B)(i)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407；以及
(ii)约0.5重量％(w/w)至4重量％(w/w)的羟丙基甲基纤维素，其具有40cP-60cP或等级为80cP-120cP的标称粘度；或者
(C)(i)约10重量％(w/w)至20重量％(w/w)的泊洛沙姆407；以及
(ii)约0.1重量％(w/w)至0.3重量％(w/w)的974P；或者
(D)(i)约0.5重量％(w/w)至8重量％(w/w)的透明质酸；或者
(E)(i)约0.5重量％(w/w)至4重量％(w/w)的透明质酸，以及
(ii)约5体积％至20体积％的聚乙二醇400；
其中所述活性剂以所述水溶液的约0.01％w/v至约20％w/v存在。在水性药物组合物的一些实施方案中，水溶液包含：
(A)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407；或者
(B)(i)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407以及
(ii)约0.5重量％(w/w)至4重量％(w/w)的羟丙基甲基纤维素，其具有40cP-60cP或等级为80cP-120cP的标称粘度；或者
(C)(i)约10重量％(w/w)至20重量％(w/w)的泊洛沙姆407；以及
(ii)约0.1重量％(w/w)至0.3重量％(w/w)的974P。
在水性药物组合物的一些实施方案中，所述水溶液包含约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407。
在水性药物组合物的一些实施方案中，所述水溶液的pH为约7.0至8.0。
在水性药物组合物的一些实施方案中，所述水溶液还包含缓冲剂。
在水性药物组合物的一些实施方案中，所述水溶液还包含缓冲剂，所述缓冲剂选自(i)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或其组合；以及(ii)三(羟基甲基)氨基甲烷。
在水性药物组合物的一些实施方案中，所述活性剂以约0.1％w/v至5％w/v存在。
在水性药物组合物的一些实施方案中，所述水溶液包含约15重量％(w/w)至18重量％(w/w)的泊洛沙姆407。
在一些实施方案中，所述水性药物组合物包含：(1)以上所述的结晶化合物I，以及(2)包含约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407的药物可接受的水溶液，其中pH为约7.0至8.0；并且其中所述结晶化合物I以所述水溶液的约0.01％w/v至20％w/v存在。在一些实施方案中，所述水溶液包含约15重量％至18重量％的泊洛沙姆407。在一些实施方案中，结晶化合物I以约0.1％w/v至5％w/v存在。在一些实施方案中，所述水溶液包含约15重量％至18重量％的泊洛沙姆407，并且结晶化合物I以约0.1％w/v至5％w/v存在。
在一些实施方案中，所述水性药物组合物包含：(1)以上所述的结晶化合物II，以及(2)包含约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407的药物可接受的水溶液，其中pH为约7.0至8.0；并且其中所述结晶化合物II以所述水溶液的约0.01％w/v至20％w/v存在。在一些实施方案中，所述水溶液包含约15重量％至18重量％的泊洛沙姆407。在一些实施方案中，结晶化合物II以约0.1％w/v至5％w/v存在。在一些实施方案中，所述水溶液包含约15重量％至18重量％的泊洛沙姆407，并且结晶化合物II以约0.1％w/v至5％w/v存在。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗耳部病症的方法，其包括向有需要的患者鼓室内施用治疗有效量的选自本文所公开的结晶化合物的活性剂至所述患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。
在治疗耳部病症的方法的一些实施方案中，所述耳部病症可以是听力损失。
在一些实施方案中，提供了治疗耳部病症的方法，包括向需要此类治疗的患者鼓室内施用本文所述的水性药物组合物至所述患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。在一些实施方案中，所述耳部病症可以是听力损失。在一些实施方案中，所述水性药物组合物可以按每周一次至每3个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，提供了治疗听力损失的方法，包括向需要此类治疗的患者鼓室内施用水性药物组合物至所述患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域，所述水性药物组合物包含(1)活性剂，其选自本文所述的结晶化合物；以及(2)水溶液，其包含约15重量％(w/w)至18重量％(w/w)的泊洛沙姆407，其中pH为约7.0至8.0；并且其中所述活性剂以约0.1％w/v至5％w/v存在。在一些实施方案中，所述活性剂为以上所述的结晶化合物I。在一些实施方案中，所述活性剂为以上所述的结晶化合物II。
本公开内容的一些实施方案涉及选自本文所公开的结晶化合物的活性剂或包含该活性剂的组合物在制备用于治疗耳部病症的药剂中的用途。在一些实施方案中，将药剂配制用于鼓室内施用至患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。在所述用途的一些实施方案中，所述耳部病症可以是听力损失。
本公开内容的一些实施方案涉及选自本文所公开的结晶化合物的活性剂或包含该活性剂的组合物在制备本文所述的用于治疗耳部病症的水性药物组合物中的用途。在一些实施方案中，将水性药物组合物配制用于鼓室内施用至患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。在一些实施方案中，所述耳部病症可以是听力损失。
本公开内容的一些实施方案涉及选自本文所公开的结晶化合物的活性剂或包含该活性剂的组合物在制备在治疗听力损失中的水性药物组合物中的用途，所述水性药物组合物包含(1)活性剂，其选自本文所述的结晶化合物；以及(2)水溶液，其包含约15重量％(w/w)至18重量％(w/w)的泊洛沙姆407，其中pH为约7.0至8.0；并且其中所述活性剂以约0.1％w/v至5％w/v存在。在一些实施方案中，将水性药物组合物配制用于鼓室内施用至患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。在一些实施方案中，所述活性剂为以上所述的结晶化合物I。在一些实施方案中，所述活性剂为以上所述的结晶化合物II。
附图简述
图1描述了结晶化合物I的X-射线粉末衍射图谱。
图2描述了结晶化合物I的差示扫描量热(DSC)曲线。
图3描述了结晶化合物II的X-射线粉末衍射图谱。
图4描述了结晶化合物II的差示扫描量热(DSC)曲线。
图5A描述了包含无定形形式和结晶形式的化合物I的水性药物组合物在外淋巴液中的豚鼠PK。
图5B描述了包含无定形形式和结晶形式的化合物I的水性药物组合物在耳蜗中的豚鼠PK。
图6A描述了包含无定形形式和结晶形式的化合物II的水性药物组合物在外淋巴液中的豚鼠PK。
图6B描述了包含无定形形式和结晶形式的化合物II的水性药物组合物在耳蜗中的豚鼠PK。
援引并入
在本说明书中提及的所有公开物和专利申请均通过援引并入本文，其程度与每个单独的公开物或专利申请被具体且单独地指明通过援引并入一样。
详述
术语“化合物I”是指化合物(2,2,3,3,3-五氟丙基)-氨基甲酸(S)-1-((S)-6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基氨基甲酰基)乙酯，其具有结构式：
术语“化合物II”是指化合物(2R)-2-氟-2-甲基-N-[(S)-5-甲基-6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基]-N'-(2,2,3,3,3-五氟丙基)丙二酰胺，其具有结构式：
可以通过将相应的无定形材料溶于诸如甲醇或乙醇的醇中，并且随后收集形成的固体，从而获得化合物I和化合物II的结晶形式。使用利用铜K-α(40kV,40mA)辐射的Bruker(Billerica,Massachusetts)AXS C2GADDS衍射仪或Bruker AXS D8Advance，使用X-射线粉末衍射表征结晶化合物I和化合物II。在配备有34个位置自动取样器的Mettler(Columbus,Ohio)DSC 823E上收集DSC数据。使用经校正的铟来校准仪器的能量和温度。通常将0.5mg至3mg的各样品在销孔铝板中以10℃/min从25℃加热至300℃。在样品上维持50ml/min的氮气吹扫。
结晶化合物I的特征可以在于基本上如图3所示的Cu K-αX-射线粉末衍射(XRPD)图谱。或者，结晶化合物I的特征可以在于X-射线粉末衍射图谱在约8.2°、13.8°、14.0°、18.4°、20.9°±0.15°2θ处有峰；或特征在于X-射线粉末衍射图谱在约4.6°、8.2°、9.2°、13.8°、14.0°、18.2°、18.4°、20.9°、23.8°、27.7°±0.15°2θ处有峰；或特征在于X-射线粉末衍射图谱在约3.0°、4.6°、8.2°、9.2°、10.4°、13.8°、14.0°、16.4°、18.2°、18.4°、18.8°、19.1°、20.9°、21.5°、22.2°、22.7°、23.0°、23.8°、24.3°、24.7°、25.2°、26.5°、26.6°、27.1°、27.7°、28.1°、28.3°、28.6°、29.0°、30.0°、31.2°、31.5°、31.8°、32.1°、32.4°、35.1°、35.6°、35.8°、36.4°、36.7°、38.4°、38.8°、39.8°、40.5°、40.8°±0.15°2θ处有峰。或者，结晶化合物I可以如以下实施例部分描述的那样进行表征。
结晶化合物II的特征在于基本上如图4所示的Cu K-αX-射线粉末衍射(XRPD)图谱。或者，结晶化合物II的特征可以在于X-射线粉末衍射图谱在约8.4°、15.2°、16.0°、20.6°、22.6°±0.15°2θ处有峰；或特征在于X-射线粉末衍射图谱在约6.5°、8.4°、15.2°、16.0°、19.9°、20.6°、22.6°、24.5°、25.1°、30.6°±0.15°2θ处有峰；或特征在于X-射线粉末衍射图谱在约6.5°、8.4°、10.1°、13.1°、14.6°、15.0°、15.2°、16.0°、17.6°、18.0°、18.4°、19.6°、19.9°、20.1°、20.6°、20.9°、21.2°、22.2°、22.6°、23.3°、23.5°、23.8°、24.5°、24.9°、25.1°、25.8°、26.1°、26.7°、26.8°、27.5°、27.8°、29.6°、30.6°、31.2°、32.3°、32.9°、33.2°、33.9°、34.4°、35.4°、36.3°、36.7°、37.3°、37.7°、38.0°、38.9°、40.0°、40.2°、40.8°、41.6°±0.2°2θ处有峰。或者，结晶化合物II可以如以下实施例部分描述的那样进行表征。
结晶化合物I和化合物II可用于制备用于如本文所述的鼓室内施用的水性药物组合物。结晶化合物I和化合物II以及含有它们的水性药物组合物可用于治疗耳部疾病和病症。
药物组合物
在一个方面，本公开内容涉及用于鼓室内施用的水性药物组合物，其包含选自结晶化合物I和结晶化合物II的活性剂以及药物可接受的水溶液。活性剂是Notch信号传导途径抑制剂，特别是选择性γ分泌酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述活性剂选自如本文所述和表征的结晶化合物I。在一些实施方案中，所述活性剂为如本所述和表征的结晶化合物II。
在一些实施方案中，将结晶活性剂进一步处理，以提供更均匀的粒径或控制粒径或减小粒径。例如，初始结晶材料可以经历机械冲击方式，例如粉碎、研磨、碾磨(例如球磨碾磨和喷射碾磨)等，以提供具有期望的粒径分布的颗粒。
在一些实施方案中，用于鼓室内施用的水性药物组合物包括在中耳提供活性剂的持续释放。持续释放制剂通常包含聚合物；可能提及的适用于本公开内容的聚合物包括但不限于明胶、透明质酸/透明质酸盐、壳聚糖和聚氧乙烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物[参见，例如Liu等人，Acta Pharmaceutica Sinica B,2013,13(2):86-96，以及Swan等人，Adv.DrugDeliv.Rev.,2008,60(15):1583-1599]。
在一些实施方案中，可以将本发明的水性药物组合物以在环境温度下较低粘度液体形式递送至中耳，所述水性药物组合物在原位形成具有较高粘度的凝胶。此类组合物的优点包括(1)在施用时处理液体的方便性，以及(2)一旦在原位凝胶化，药物在沉积部位延长时间的释放。增加释放时间导致延长时间的治疗有效性和可能降低的药物剂量。此类组合物有利地包含热可逆凝胶，其具有在环境温度下为液体并且在大致哺乳动物体温下为凝胶的性质。
可以使用聚合物制备适用于药物应用的热可逆凝胶，所述聚合物包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)(PLA-PEG)或PEG-PLGA-PEG的三嵌段共聚物。壳聚糖-甘油磷酸酯溶液能够形成可逆的热固性凝胶。基于糖的磷酸酯的加入将壳聚糖转变成热可逆凝胶药物递送系统。热可逆凝胶的常见群组为基于聚氧化烯的聚合物，例如通常已知为泊洛沙姆的聚氧乙烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物。水溶液中的泊洛沙姆表现出有利于本公开内容的热可逆性质。因此，泊洛沙姆水溶液可以经由升高温度从液态转变为凝胶态。可以通过改变泊洛沙姆的浓度以及添加诸如粘度改性剂的其他赋形剂来调整液体-凝胶转变温度；因此可以制备在室温或低于室温下为液态并且在体温下转变为凝胶态的泊洛沙姆溶液。在本发明组合物的一个实施方案中，热可逆凝胶是泊洛沙姆407(例如，F127，由BASF,Florham Park,NJ售卖)。
在一些实施方案中，用于鼓室内施用的本发明的水性药物组合物包含选自结晶化合物I和结晶化合物II的活性剂以及包含泊洛沙姆407的药物可接受的水溶液。泊洛沙姆可以以约15重量％至约25重量％的浓度存在。在一些实施方案中，泊洛沙姆407的浓度为约15重量％至约18重量％。在一些实施方案中，泊洛沙姆407的浓度为约16重量％至约17重量％。在一些实施方案中，泊洛沙姆以约15重量％或16重量％或17重量％或18重量％存在。在一些实施方案中，包含泊洛沙姆407的本公开内容的药物组合物可以任选地包括标称粘度为40cP至120cP和量为约0.5重量％至4重量％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物为用于鼓室内施用的水性药物组合物，其包含选自结晶化合物I和结晶化合物II的活性剂以及药物可接受的载体，所述药物可接受的载体包含(a)约0.5重量％至8重量％的透明质酸；或者(b)(i)约0.5重量％至4重量％的透明质酸，以及(ii)约5体积％至20体积％的聚乙二醇400(PEG400)。
在用于鼓室内施用的水性药物组合物中，选自结晶化合物I和结晶化合物II的活性剂的浓度通常为约0.01％w/v至20％w/v。该范围包括约0.05w/v％至约15w/v％、约0.1w/v％至约10w/v％、约0.1％w/v至约5％w/v的子范围。在一些实施方案中，活性剂的浓度为约0.5％w/v至约5％w/v。在一些实施方案中，活性剂的浓度为约0.5％w/v至约4％w/v。在一些实施方案中，活性剂的浓度为约1％w/v至约5％w/v。在一些实施方案中，活性剂的浓度为约1％至约4％。在一些实施方案中，活性剂的浓度为约0.5％w/v、1.0％w/v、1.5％w/v、2.0％w/v、2.5％w/v、3.0％w/v、3.5％w/v、4.0％w/v、4.5％w/v或5％w/v。在一些实施方案中，活性剂的浓度为约0.1％w/v、0.2％w/v、0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v、0.6％w/v、0.7％w/v、0.8％w/v、0.9％w/v或1％w/v。
本文所公开的组合物可以含有任何常规的无毒的药物可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物的pH为约6至8、或约6至7、或约7至8。在一些实施方案中，组合物可以包含诸如磷酸二氢钠或磷酸氢二钠或其组合的缓冲剂，并且可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或诸如三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)的缓冲剂。缓冲剂的量可以为约0.1重量％至约0.5重量％。
在一些实施方案中，本公开内容的水性药物组合物可以包含诸如974P(Lubrizol Advanced Materials,Cleveland,OH)的粘度改性剂。在一些实施方案中，用于鼓室内施用的水性药物组合物包含选自结晶化合物I和结晶化合物II的活性剂、包括泊洛沙姆407的药物可接受的载体以及诸如974P的粘度改性剂。在一些实施方案中，泊洛沙姆407以约10重量％至20重量％存在，并且974P以约0.1重量％至约0.3重量％存在。在一些实施方案中，活性剂为结晶化合物I或结晶化合物II。其他常用的赋形剂可以包括诸如对羟基苯甲酸甲酯的防腐剂以及用于提供等渗性的氯化钠。配制组合物以使其提供活性剂的持续释放，持续足以实现γ分泌酶抑制的时间。γ分泌酶的持续抑制使施用频率最小化至每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每个季度一次、每半年一次、每年一次等。在一些实施方案中，给药频率为每两周一次、或每月两次、或每月一次、或每隔一个月一次或每个季度一次。
包含选自结晶化合物I和结晶化合物II的活性剂和载体的本文所公开的水性药物组合物可以使用常规方法(例如实施例中所述的)来制备，并且可以包装用于单一剂量使用(例如在注射器中)或包装用于多剂量(例如在小瓶中)。或者，可以将活性剂组分和水溶液组分在单独隔室或单独容器中单独包装，并且在施用前混合。
在以下实施例部分中提供了适用于本公开内容的化合物的局部内耳施用的组合物的示例性实例。
治疗方法
在一个方面，本公开内容涉及用于治疗耳部病症的方法，其包括向有需要的患者鼓室内施用治疗有效量的选自结晶化合物I和结晶化合物II的活性剂至所述患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。术语“耳部病症”通常涉及由耳蜗毛细胞损失引起的病况(包括但不限于听力损失和耳聋)，以及与前庭功能障碍有关的病况，其可以通过诸如头晕、失衡、眩晕、恶心和模糊视觉来呈现。听力损失或耳聋可以归因于耳毒性化学物质、过度噪音和衰老。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(therapy)”或“治疗(treating)”等包括控制、缓解、逆转或减缓所治疗的病况的进展；例如，降低或停止由于以上或其他因素造成的进一步听力损失；以及在由于以上或其他因素造成的部分或深度听力损失后的恢复听力。治疗还包括预防(例如，延迟发展的发作或减低发展的危险)听力损失，以及例如在接受诸如氨基糖苷抗生素(例如庆大霉素)或铂化学治疗剂(例如顺铂)的耳毒性化学物质之前、期间或之后的预防性使用。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指活性剂在治疗的疾病或病症中足以引起期望效果或有益效果的量；对于预防，其是指活性剂足以预防疾病或病症的发作或者减轻疾病或病症的效果的量。使用量取决于所选择的活性剂、治疗的疾病或病症的严重程度、施用途径和诸如年龄的患者特性。
在本公开内容中，将活性剂通过鼓室内注入中耳、内耳或耳蜗或其组合施用于耳部。鼓室内的也被称为经鼓膜的，并且两个术语在本文可互换使用。鼓室内注射是将治疗剂通过鼓膜注入中耳的技术，其中治疗剂可以扩散通过圆窗膜以到达内耳。其已在临床实践中使用多年并且是可以在医师办公室中进行的相对小的干预。对于重复注射，可以将中耳通气管插入鼓膜，药物通过其可以被施用于鼓膜后的中耳空间而进入中耳和/或内耳。在一个实施方案中，将活性剂鼓室内施用于圆窗膜附近的区域或所述圆窗膜上。
在本发明方法的一些实施方案中，将活性剂在包含热可逆凝胶的水性药物组合物中施用；此类组合物在室温下是液体(为了容易施用)并且在体温下变成凝胶以使药物组合物不会通过耳咽管被快速排放。在一些实施方案中，本发明的方法利用下文所述的药物组合物。
结晶化合物I或结晶化合物II的局部内部施用的剂量包括约0.06mg至约100mg。该范围包括约0.1mg至约90mg、0.25mg至约80mg、0.4mg至70mg、0.6mg至60mg、0.80mg至50mg、1.0mg至40mg、2mg至30mg、3mg至20mg的子范围。所述剂量可以在包含水溶液的水性药物组合物中施用，其中待施用的水溶液的体积包括约100μL至约500μL的体积范围。该体积范围包括约100μL至150μL、100μL至200μL、100μL至250μL、100μL至300μL、100μL至350μL、100μL至400μL、100μL至450μL和100μL至500μL的子范围。该体积范围还包括约200μL至250μL、200μL至300μL、200μL至350μL、200μL至400μL、200μL至450μL和200μL至500μL的子范围。该体积范围还包括约300μL至350μL、300μL至400μL、300μL至450μL和300μL至500μL的子范围。该体积范围还包括约400μL至450μL和400μL至500μL的子范围。由于物理限制，活性剂与水性药物组合物的比例预期为20重量％或更低。
在一个方面，本文公开的化合物可以与一种或多种其他试剂共同施用，例如类固醇；例如，地塞米松。在某些实施方案中，其他试剂可以与结晶化合物I或结晶化合物II分开施用(例如，顺序地，例如按不同的交叠方案)。在其他实施方案中，这些试剂可以是单一剂型的一部分，即，与单一组合物中的化合物I或化合物II一起混合。在另一实施方案中，这些试剂可以以单独剂量给予，其在施用结晶化合物I或结晶化合物II的大致相同时间施用。当本文公开的组合物包括结晶化合物I或结晶化合物II和一种或多种其他治疗剂或预防剂的组合，所述化合物和其他试剂可以以单一治疗方案中施用剂量的约1％至100％，并且更优选约5％至95％的剂量水平存在。
生物功能
可以通过以下方法或本领域已知的其他方法中的一种或多种证明本公开内容的效用。
A.Otosphere分化测定
为了测定诱导小鼠毛细胞分化的化合物活性，由小鼠柯蒂器官产生otosphere，如在Oshima等人，Auditory and Vestibular Res Methods,2009中所述。简而言之，将来自新生柯蒂器官的感觉上皮细胞分离、用胰蛋白酶处理以及温和地分离。然后将分离的细胞转移至低附着性孔的包含1x B27和N2补充剂(Invitrogen Life Sciences,Carlsbad,CA)、EGF、IGF-1和bFGF的DMEM/F12培养基中，用于球体形成。在球体形成3天后，将球体通过离心分离并且转移至纤连蛋白涂覆的板，并且使其在缺少生长因子的培养基中粘附过夜。然后将粘附的球体用测试化合物以10-5M至10-10M的浓度处理4天。然后用RNeasy试剂盒(Hilden，德国)收获RNA，并且使用Rpl19作为管家基因，使用针对Atoh1和Myo7a的基因特异性引物进行的定量PCR来分析。将值使用ΔΔCt方法顺序地分析。普通技术人将理解，ΔΔCt方法通常用于PCR领域。
B.小鼠柯蒂器官的外植体测定
(a)Notch抑制。将新生小鼠外植体用于确定Notch途径的抑制并且测量在体外系统中产生毛细胞的化合物能力。简而言之，将柯蒂器官从出生后3天的小鼠中切下来并且接种在涂覆有聚-L-赖氨酸和纤连蛋白的4孔室上。将外植体直接接种在具有和不具有测试化合物的含有10％胎牛血清、B27补充剂的DMEM培养基内。为了确定Notch抑制，使用RNeasy试剂盒和利用特异性针对Hes5的基因引物进行的定量PCR在化合物添加后24小时提取RNA。将Rpl19用作管家基因并且使用ΔΔCt方法分析各个值。
(b)毛细胞诱导。为了毛细胞诱导研究，产生外植体并且用以上化合物处理；然而，在存在或不存在化合物时，将外植体用每天重新补充的培养基处理3天至5天。然后将外植体用多聚甲醛固定并且用针对MYO7A、SOX2的抗体进行免疫染色，以及用Alexa647-鬼笔环肽和Hoechst复染。使用NIS-Elements软件(Nikon,Melville,NY,USA)在Nikon N2共焦系统上获取图像。然后将MYO7A/鬼笔环肽阳性毛细胞进行定量化并且与媒介物处理的组进行比较。
C.人神经干细胞测定
使用已公开的方案(Yuan等人，March 2,2011,PLoS ONE,6(3):e17540)由胚胎干细胞得到神经干细胞(NSC)。将细胞在传代3次时进行分类和表征并且进行扩增。然后将细胞在传代5次时冷冻。将细胞维持在NSC培养基(DMEM/F12，N2(1x)，B27(1x)(Invitrogen)和Pen/Strep(1x)(Life Technologies)，并且具有20ng/ml bFGF(BD Bioscience/Corning))中。在第1天，将细胞接种在已经先前用聚-鸟氨酸和层粘连蛋白涂覆的96孔板中，在100μl培养基中有60,000个细胞/孔。在第2天，去除废培养基，并且将180μl新制培养基添加至细胞。在同一天(第2天)晚些时候，用含有测试化合物(7个点的CRC)的20μl NSC培养基处理细胞。在第3天，去除废培养基，并且将140μl的RLT/bME添加至细胞。使用总的RNA提取+DNAse方案，用QiaCube(Germantown,MD,USA)提取RNA。然后将RNA使用iScript(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)逆转录成cDNA。然后使用iTaq Sybergreen(BioRad)将cDNA用于实时PCR分析。使用CFX96或CFX384(Bio-Rad)评估Atoh1、Hes5、Hes1、Myosin7a基因的表达。将HPRT1用作参考基因。使用和CBIS(ChemInnovation Software,Inc.,San Diego,CA,USA)完成分析。
按照以上程序来确定各个化合物的EC50。
化合物 hNSC Atoh1 EC<sub>50</sub>(μM) hNSC HES1 IC<sub>50</sub>(μM) hNSC HES5 IC<sub>50</sub>(μM)
I 0.625 0.242 0.288
II 0.023 0.023
D.人胚胎干细胞分化成毛细胞样细胞
将本方案设计成使人胚胎干细胞(hESC)分化成耳部祖细胞，并且还使所述祖细胞分化成毛细胞样细胞。将hESC维持在补充有20％敲除血清、1x非必需氨基酸、1x l-谷氨酰胺、1xβ-巯基乙醇(bME)和8ng/ml至10ng/ml人bFGF的敲除DMEM/F12培养基中的丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。将hESC使用胶原酶在新MEF上传代，直至它们已经开始分化，在这种情况下，使它们在补充有8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中的基质胶涂覆板上传代3天至5天。
使用公开的方案(Ronaghi M等人，Stem Cells Dev.2014,1275-84)分化人ES细胞。除此以外，将AggreWells板(来自Stem Cell Technology,Vancouver,CA)用于在方案的第一个6天产生拟胚体(EB)。将用潜在的Atoh1或毛细胞诱导物的处理在第34天至39天施用于细胞。在第39天，将细胞裂解用于蛋白质、固定用于成像或提取用于RNA，如以下所述。
(a)肌球蛋白7a的蛋白质印迹分析：使用RIPA缓冲液同时从两种实验上类似的孔中提取蛋白质。使用建立的方案测定蛋白质浓度，并且用分化的蛋白质样品、同一代的hESC样品、标记物和表达肌球蛋白7a(Y79细胞)的阳性对照细胞样品完成蛋白质印迹。用肌球蛋白7a抗体以及作为上样对照的α-肌动蛋白抗体，孵育所述膜。一旦印迹成像，将Licor系统用于定量肌球蛋白7a和α-肌动蛋白以用于对比分析。
(b)免疫细胞化学：将孔用DPBS简单地清洗，然后用4％多聚甲醛固定10分钟，随后用含100mM甘氨酸的DPBS孵育10分钟。将孔用DPBS洗涤3次，用0.2％TritonX-100渗透化10分钟，然后用含有0.1％BSA和0.2％TritonX-100的缓冲液阻断一小时。添加肌球蛋白7a和Sox2的一级抗体并且在4℃保持过夜。第二天，将孔用DPBS洗涤3次，添加二级抗体并且在室温下于黑暗中孵育2小时。将孔洗涤2次，并且将细胞用488-鬼笔环肽在室温下于黑暗中染色10分钟。将孔用DPBS洗涤2次，以及将Hoechst染色剂添加至孔并且在室温下于黑暗中孵育10分钟。将孔最后洗涤3次并且使用GE Healthcare Life Sciences(Pittsburgh,PA,USA)InCell 2200自动化成像系统成像。
(c)PCR：使用来自的RNA分离试剂盒提取和分离RNA(包括DNAse处理)。使用Nano-Drop测定RNA浓度。使用CFX96(BioRad)上的iScript(Bio-Rad)制备cDNA。使用CFX-96上的iTaq PCR试剂盒(Bio-Rad)或CFX-384实时PCR(BioRad)测量诸如肌球蛋白7a、Atoh1、Hes5、Axin2和GAPDH的靶基因的数量。所有引物来自OriGene(Rockville,MD)或Integrated DNA Technologies(IDT,Coralville,IA)。
E.豚鼠PK
用氯胺酮和甲苯噻嗪使雄性Hartley豚鼠(300g-350g)麻醉。将三十微升本发明实施方案的水性药物组合物经鼓膜递送，以使药物沉积至圆窗膜。递送是单侧的。将动物以侧卧位置于温暖的室中，保持给药耳朵向上，直至它们从麻醉中恢复。
在施用后的各个时间点，通过CO2吸入使动物安乐死。收集血液和CSF并且储存在-80℃。将动物斩首，去除颞骨并且打开大泡以暴露耳囊。使用微毛细管从顶点收集同侧和对侧的外淋巴。从耳囊取出同侧耳蜗并且储存在-80℃。对于以下测试化合物浓度，使用LC/MS/MS分析所有收集的组织。通过将已知浓度的测试化合物储备溶液加入诸如血浆或人造CSF的基质中制备分析标准物。用含有丁螺环酮作为内部标准物的乙腈使固定量的所收集的组织和加入的标准物沉淀。将沉淀的样品以4000g在4℃离心10分钟。使用LC-MS/MS分析上清液。使用配备有Agilent 1200系列HPLC和CTC PAL自动进样器(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA)的AB Sciex 4000 Qtrap(AB Sciex,Framingham,MA)构建LC-MS/MS系统。
F.功能药效动力学
(a)将测试化合物通过手术递送至圆窗膜。在年幼小鼠或具有受噪音损害或在药理学上损害的耳朵的小鼠上进行手术。用异氟烷使动物麻醉，并且对耳郭的下尾部边缘产生8mm耳后切口。使皮肤缩回并且从面部神经和肌肉结合在一起之处钝性切下脂肪组织。使肌肉缩回以在骨骼薄的鼓泡中露出一区域。将30g的针用于在耳泡的暴露的薄部分中钻孔。将配备有32g钝针的Hamilton注射器插入耳泡的开口。通过注射递送药物制剂并且取出针。用组织胶进行伤口闭合。
(b)功能PD。在药物递送后的各个时间点(通常24小时)，将小鼠通过CO2暴露进行安乐死，并且将颞骨取出放入冰冷的(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)中。将耳囊从颞骨小心地切下，放入含有TriZol(Zymo Research,Irvine,CA,USA)的干净的管中，立即在液氮中急速冷冻并且储存在-80℃直至RNA分离。根据制造商的说明书使用RNA MiniElute试剂盒分离RNA。产生cDNA并且使用BioRad iTaq在特异性引物上进行PCR。
G.毛细胞诱导
在小鼠中，将本发明的药物制剂通过手术递送至圆窗，如以上部分F所述。在豚鼠中，将本发明的药物制剂经由经鼓膜注射递送至圆窗龛，如以上部分E所述。在药物递送后第7天至第14天，用氯胺酮和甲苯噻嗪使动物安乐死，用10％中性缓冲福尔马林灌注它们的整个身体，并且取出颞骨并储存在福尔马林中。对于豚鼠，当制备耳蜗全标本(wholemounts)时，进行intrascalar灌注以完全将耳蜗浸泡在福尔马林中。制备中蜗轴(Midmodiolar)部分或耳蜗全标本并且进行染色以鉴定毛细胞。
H.听性脑干反应(ABR)
将年幼小鼠或在噪音或药理学致聋后的各个时间的小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪进行麻醉，并且使用Tucker Davis(Alachua,FL)RZ6设备在两只耳朵中测定听性脑干反应。将小鼠暴露于滴答声或以10dB为递减阶梯的90dB-10dB中的4kHz、8kHz、16kHz、24kHz和32kHz纯音，并且测定听力阈值。
使用实施例3(c)和实施例3(d)的制剂进行的以上实验的结果提供在以下表中：
用氯胺酮/甲苯噻嗪使年幼或药理学致聋后的豚鼠麻醉。使用Tucker Davis RZ6设备双边地测定听性脑干反应(ABR)。将豚鼠暴露于滴答声或以10dB为递减阶梯的90dB-10dB中的4kHz、8kHz、16kHz或24kHz纯音，并且测定听力阈值。
实施例
实施例1.结晶化合物I的制备
在Flohr等人2007年1月23日公布的第7,166,587号美国专利中公开了化合物I，并且当按照其中公开的合成程序时，产生无定形材料形式的化合物I。将无定形化合物I(2g)悬浮于MeOH(60mL)中，并且将悬浮液加热至65℃以产生透明溶液。使所述溶液冷却并且在环境温度下保持18小时。在此期间，发生结晶化。将反应物过滤并且收集固体，在真空下干燥以产生白色固体(1g)，其确定为晶体并且特征在于表1中的X-射线粉末衍射峰和图1中所示的图谱。DSC吸热开始出现在238.5℃，如图2所示。
表1-结晶化合物I的XRPD峰位置
实施例2.结晶化合物II的制备
在Flohr等人2007年1月9日公布的第7,160,875号美国专利中公开了化合物II，并且当按照其中公开的合成程序时，产生无定形材料形式的化合物II。将无定形化合物II(432mg)称重放入20mL小瓶中并且溶于EtOH(2.15mL,5体积)。在30分钟后检查所得的透明溶液，并且观察到已经形成白色粉末。将该悬浮液在室温下搅拌约16小时，通过过滤分离固体并且在40℃/3mbar下干燥16小时，以产生粉末状白色固体(315mg，73％收率)，其确定为晶体并且特征在于表2中的XRPD峰和图3所示的图谱。DSC吸热开始出现在173℃(熔化)，如图4所示。
表2-结晶化合物II的XRPD峰位置
实施例3(a)和实施例3(b)制剂A-1的制备
实施例3(a)-向128mL无菌过滤水添加0.9g氯化钠、0.59g磷酸氢二钠和0.17g磷酸二氢钠。将溶液在环境温度下搅拌，添加27.2g泊洛沙姆407并且搅拌过夜以产生透明溶液。将2mL以上所述的溶液添加至40mg结晶化合物I，并且将悬浮液在冰浴上搅拌20分钟，以产生均匀的悬浮液。
实施例3(b)-以与上述相同的方式制备含有2％w/v结晶化合物II的均匀悬浮液。
实施例3(c)和实施例3(d)制剂A-2的制备
实施例3(c)-向129mL无菌水添加0.96g氯化钠、0.59g磷酸氢二钠和0.14g磷酸二氢钠。将溶液在环境温度下搅拌，添加25.6g泊洛沙姆407并且搅拌过夜以产生透明溶液。将溶液无菌过滤，并且将1mL以上所述的溶液添加至20mg结晶化合物I，以及将悬浮液旋涡60分钟，以产生均匀的悬浮液。
实施例3(d)-以与上述相同的方式制备含有2％w/v结晶化合物II的均匀悬浮液。
实施例4.制剂B的制备
向3mL无菌过滤的0.1M pH7 TRIS缓冲液添加0.6g泊洛沙姆407，并且将其在4℃搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。然后向该溶液添加60mg结晶化合物I和3mg对羟基苯甲酸甲酯。将所得的悬浮液在4℃搅拌16小时并且在4℃储存直至给药。
实施例5(a)、5(b)、5(c)和5(d).制剂C的制备
实施例5(a)-向10mL无菌过滤的0.1M pH7 TRIS缓冲液添加1.8g泊洛沙姆407，并且将其在4℃搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。然后向3mL该溶液添加60mg结晶化合物I，并且将悬浮液在4℃搅拌过夜以形成均匀分布的悬浮液。最终，添加90mg羟丙基甲基纤维素(HPMC)(40cp-60cp)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和3mg对羟基苯甲酸甲酯，将悬浮液在4℃搅拌16小时并且在4℃储存直至给药。
实施例5(b)-按照以上所述的程序制备含有2％无定形化合物I的均匀悬浮液。
实施例5(c)-按照以上所述的程序制备含有2％结晶化合物II的均匀悬浮液。
实施例5(d)-按照以上所述的程序制备含有2％无定形化合物II的均匀悬浮液。
实施例6.制剂D的制备
向3mL无菌过滤的0.1M pH7TRIS缓冲液添加0.54g泊洛沙姆407，并且将其在4℃搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。然后向该溶液添加60mg结晶化合物I，将悬浮液在4℃搅拌过夜以形成均匀分布的悬浮液。最终，添加90mg HPMC(40cp-60cp)、3mg对羟基苯甲酸甲酯和6mg974P(Lubrizol Advanced Materials,Cleveland,OH)，将悬浮液在4℃搅拌16小时并且在4℃储存直至给药。
实施例7.制剂E的制备
向3mL无菌过滤的0.1M pH7 TRIS缓冲液添加0.54g泊洛沙姆407，并且将其在4℃搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。然后向该溶液添加60mg结晶化合物I，将悬浮液在4℃搅拌过夜以形成均匀分布的悬浮液并且在4℃储存直至给药。
实施例8.制剂F的制备
向10mL无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水添加100mg透明质酸，并且将其在环境温度下搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。向60mg结晶化合物I添加0.6mL PEG400(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。将悬浮液在环境温度下搅拌。将3mL以上所述的透明质酸溶液添加至化合物I和PEG400悬浮液。将悬浮液在环境温度下搅拌以形成均匀分布的悬浮液。
实施例9.制剂G的制备
向10mL无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水添加200mg透明质酸，并且将其在环境温度下搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。向60mg结晶化合物I添加0.15mL PEG400。将悬浮液在环境温度下搅拌。将3mL以上所述的透明质酸溶液添加至化合物I和PEG400悬浮液。将悬浮液在环境温度下搅拌以形成均匀分布的悬浮液。
实施例10(a)和实施例10(b).制剂H的制备
实施例10(a)-向10mL无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水添加150mg透明质酸，并且将其在环境温度下搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。向60mg结晶化合物I添加0.3mL PEG400。将悬浮液在环境温度下搅拌。将3mL以上所述的透明质酸溶液添加至化合物I和PEG400悬浮液。将悬浮液在环境温度下搅拌以形成均匀分布的悬浮液。
实施例10(b)-按照以上所述的程序制备含有2％结晶化合物II的均匀悬浮液。
实施例11.制剂I的制备
向5mL无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水添加50mg寡肽(PuraMatrixTMPeptide Hydrogel,Corning,NY)，并且将其在环境温度下搅拌2小时以形成透明、均匀的溶液。向60mg结晶化合物I添加0.3mL PEG400。将悬浮液在环境温度下搅拌。将3mL以上所述的寡肽溶液添加至化合物I和PEG400悬浮液。将悬浮液在环境温度下搅拌以形成均匀分布的悬浮液。
实施例12.制剂J的制备
向5mL无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水添加500mg HPMC(40cp-60cp)，并且将其在环境温度下搅拌过夜以形成透明、均匀的溶液。向60mg结晶化合物I添加0.3mL PEG400。将悬浮液在环境温度下搅拌。将3mL以上所述的HPMC溶液添加至化合物I和PEG400悬浮液。将悬浮液在环境温度下搅拌以形成均匀分布的悬浮液。
实施例13.豚鼠PK
使用以上提供的生物功能部分的部分E中所述的方法评估本文所述的液体组合物。将实施例5(a)-实施例5(d)中所述的那样制备的液体组合物各自吸入1mL注射器中。使用装满的1mL注射器，将液体组合物在5℃回填至适应28号针的100μL Hamilton注射器。然后使Hamilton注射器升温至室温。
用氯胺酮和甲苯噻嗪使雄性Hartley豚鼠(300g-350g)麻醉。将三十微升的以上液体组合物经鼓膜递送，以使药物沉积至圆窗膜。递送是单侧的。将动物以侧卧位置于温暖的室中，保持给药耳朵向上，直至它们从麻醉中恢复。
在施用后的各个时间点，通过CO2吸入使动物安乐死。收集血液和脑脊液并且储存在-80℃。将动物斩首，去除颞骨并且打开大泡以暴露耳囊。使用微毛细管从顶点收集同侧和对侧的外淋巴。从耳囊中取出同侧耳蜗并且储存在-80℃。使用以上生物功能部分的部分E中所述的LC/MS/MS分析所有收集的组织。
在各个时间点经鼓膜注射结晶形式或无定形形式的本发明的制剂后，使用LC/MS/MS在外淋巴流体和耳蜗组织中测量化合物I和化合物II的浓度。当以无定形形式给药时，在第1天和第7天，外淋巴和耳蜗中的化合物I的浓度高于Atoh1的人NSC EC50。当以结晶形式给药时，在第1天至第28天，化合物I的浓度高于NSC EC50。当以无定形形式给药时，在第1天和第7天，外淋巴和耳蜗中的化合物II的浓度高于Atoh1的人NSC EC50。当以结晶形式给药时，在第1天至第42天，化合物II的浓度高于人NSC EC50Atoh1。外淋巴和/或耳蜗组织中的本发明化合物的浓度高于Atoh1的人NSC EC50，表明主题化合物可以在人类中对毛细胞再生和听力恢复是有效的。令人惊讶地，pK结果表明含有结晶化合物I和结晶化合物II的制剂与含有各自无定形形式的制剂相比，提供了化合物I和化合物II对内耳的更长久的暴露。以下表3列出了使用结晶化合物I的水性制剂的研究结果，而以下表4列出了结晶化合物II的水性制剂的研究结果。结晶化合物I的水性制剂的结果也图示地示于图5A和图5B，而结晶化合物II的水性制剂的结果图示地示于图6A和图6B。
表3
表4
尽管为了清楚和理解的目的，已通过示例和实例相当详细地描述了以上内容，但是本领域技术人员应当理解，可以在不背离本公开内容的主旨的情况下进行诸多和各种修改。因此，应当清楚地理解，本文所公开的形式仅仅是示例性的，并不旨在限制本公开内容的范围，而是还涵盖了本发明的真实范围和主旨内的所有修改和替代形式。

Claims (30)

1.具有下式的结晶化合物I：
特征在于X-射线粉末衍射图谱在8.2°、13.8°、14.0°、18.4°和20.9°±0.15°2θ处有峰。
2.如权利要求1所述的结晶化合物I，特征在于X-射线粉末衍射图谱在4.6°、8.2°、9.2°、13.8°、14.0°、18.2°、18.4°、20.9°、23.8°和27.7°±0.15°2θ处有峰。
3.如权利要求1所述的结晶化合物I，特征在于X-射线粉末衍射图谱在3.0°、4.6°、8.2°、9.2°、10.4°、13.8°、14.0°、16.4°、18.2°、18.4°、18.8°、19.1°、20.9°、21.5°、22.2°、22.7°、23.0°、23.8°、24.3°、24.7°、25.2°、26.5°、26.6°、27.1°、27.7°、28.1°、28.3°、28.6°、29.0°、30.0°、31.2°、31.5°、31.8°、32.1°、32.4°、35.1°、35.6°、35.8°、36.4°、36.7°、38.4°、38.8°、39.8°、40.5°和40.8°±0.15°2θ处有峰。
4.如权利要求1所述的结晶化合物I，特征还在于具有在约238.5℃处的差示扫描量热吸热开始。
5.具有下式的结晶化合物II：
特征在于X-射线粉末衍射图谱在8.4°、15.2°、16.0°、20.6°和22.6°±0.15°2θ处有峰。
6.如权利要求5所述的结晶化合物II，特征在于X-射线粉末衍射图谱在6.5°、8.4°、15.2°、16.0°、19.9°、20.6°、22.6°、24.5°、25.1°和30.6°±0.15°2θ处有峰。
7.如权利要求5所述的结晶化合物II，特征在于X-射线粉末衍射图谱在6.5°、8.4°、10.1°、13.1°、14.6°、15.0°、15.2°、16.0°、17.6°、18.0°、18.4°、19.6°、19.9°、20.1°、20.6°、20.9°、21.2°、22.2°、22.6°、23.3°、23.5°、23.8°、24.5°、24.9°、25.1°、25.8°、26.1°、26.7°、26.8°、27.5°、27.8°、29.6°、30.6°、31.2°、32.3°、32.9°、33.2°、33.9°、34.4°、35.4°、36.3°、36.7°、37.3°、37.7°、38.0°、38.9°、40.0°、40.2°、40.8°和41.6°±0.15°2θ处有峰。
8.如权利要求5所述的结晶化合物II，特征还在于具有在约173℃处的差示扫描量热吸热开始。
9.用于鼓室内施用的水性药物组合物，包含：
(1)活性剂，其选自权利要求1至8中任一项所述的结晶化合物，以及
(2)药物可接受的水溶液，其包含：
(A)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407；或者
(B)(i)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407，以及
(ii)约0.5重量％(w/w)至4重量％(w/w)的羟丙基甲基纤维素，其具有40cP-60cP或等级为80cP-120cP的标称粘度；或者
(C)(i)约10重量％(w/w)至20重量％(w/w)的泊洛沙姆407，以及
(ii)约0.1重量％(w/w)至0.3重量％(w/w)的974P；或者
(D)(i)约0.5重量％(w/w)至8重量％(w/w)的透明质酸；或者
(E)(i)约0.5重量％(w/w)至4重量％(w/w)的透明质酸，以及
(ii)约5体积％至20体积％的聚乙二醇400；
其中所述活性剂以所述水溶液的约0.01％w/v至约20％w/v存在。
10.如权利要求9所述的水性药物组合物，其中所述水溶液包含：
(A)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407；或者
(B)(i)约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407，以及
(ii)约0.5重量％(w/w)至4重量％(w/w)的羟丙基甲基纤维素，其具有40cP-60cP或等级为80cP-120cP的标称粘度；或者
(C)(i)约10重量％(w/w)至20重量％(w/w)的泊洛沙姆407，以及
(ii)约0.1重量％(w/w)至0.3重量％(w/w)的974P。
11.如权利要求9或10所述的水性药物组合物，其中所述水溶液包含约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407。
12.如权利要求9至11中任一项所述的水性药物组合物，其中所述水溶液的pH为约7.0至8.0。
13.如权利要求9至12中任一项所述的水性药物组合物，其中所述水溶液还包含缓冲剂。
14.如权利要求13所述的水性药物组合物，其中所述缓冲剂选自(i)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或其组合；以及(ii)三(羟基甲基)氨基甲烷。
15.如权利要求9至14中任一项所述的水性药物组合物，其中所述活性剂以约0.1％w/v至5％w/v存在。
16.如权利要求9至14中任一项所述的水性药物组合物，其中所述水溶液包含约15重量％(w/w)至18重量％(w/w)的泊洛沙姆407。
17.如权利要求9所述的水性药物组合物，包含：
(1)权利要求1至4中任一项所述的结晶化合物I，以及
(2)包含约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407的药物可接受的水溶液，其中pH为约7.0至8.0；并且
其中所述结晶化合物I以所述水溶液的约0.01％w/v至20％w/v存在。
18.如权利要求17所述的水性药物组合物，其中所述水溶液包含约15重量％至18重量％的泊洛沙姆407。
19.如权利要求17或18所述的水性药物组合物，其中所述结晶化合物I以约0.1％w/v至5％w/v存在。
20.如权利要求9所述的水性药物组合物，包含：
(1)权利要求5至8中任一项所述的结晶化合物II；以及
(2)包含约15重量％(w/w)至25重量％(w/w)的泊洛沙姆407的药物可接受的水溶液，其中pH为约7.0至8.0；并且
其中所述结晶化合物II以所述水溶液的约0.01％w/v至20％w/v存在。
21.如权利要求20所述的水性药物组合物，其中所述水溶液包含约15重量％至18重量％的泊洛沙姆407。
22.如权利要求20至21所述的水性药物组合物，其中所述结晶化合物II以约0.1％w/v至5％w/v存在。
23.治疗耳部病症的方法，包括向有需要的患者鼓室内施用治疗有效量的选自权利要求1至8中任一项所述的结晶化合物的活性剂至所述患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述耳部病症为听力损失。
25.治疗耳部病症的方法，包括向需要此类治疗的患者鼓室内施用权利要求9至22中任一项所述的水性药物组合物至所述患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述耳部病症为听力损失。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述水性药物组合物以每周一次至每3个月一次的频率施用。
28.治疗听力损失的方法，包括向需要此类治疗的患者鼓室内施用水性药物组合物至所述患者的耳部中的圆窗膜或其附近的区域，所述水性药物组合物包含(1)活性剂，其选自权利要求1至8中任一项所述的结晶化合物；以及(2)水溶液，其包含约15重量％(w/w)至18重量％(w/w)的泊洛沙姆407，其中pH为约7.0至8.0；并且其中所述活性剂以约0.1％w/v至5％w/v存在。
29.如权利要求28所述的治疗听力损失的方法，其中所述活性剂为权利要求1至4中任一项所述的结晶化合物I。
30.如权利要求28所述的治疗听力损失的方法，其中所述活性剂为权利要求5至8中任一项所述的结晶化合物II。
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