JP2018531611A5 - - Google Patents
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Claims (23)
- ポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチドが、酵母のメタノール誘導性プロモーター配列、改変アルファシグナル遺伝子配列、血栓特異的ストレプトキナーゼをコードする核酸配列及び転写終了因子配列を含み、前記血栓特異的ストレプトキナーゼをコードする核酸配列が、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6及び配列番号:8から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも85%の同一性を有することを特徴とする発現カセット。
- 前記血栓特異的ストレプトキナーゼヌクレオチド配列をコードする核酸配列が、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6及び配列番号:8から成る群から選択される、請求項１に記載の発現カセット。
- 前記改変アルファシグナル遺伝子配列が、配列番号:10に示されるとおりである、請求項１に記載の発現カセット。
- 請求項１〜３のいずれか1項に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:23、配列番号:26及び配列番号:28から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも85%の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の発現ベクター。
- 前記血栓特異的ストレプトキナーゼ（CSSK）をコードする核酸配列が、（a）ストレプトコッカス・エクィシミリスによって生成されるストレプトキナーゼ（SK）、又はプラスミノーゲンを活性化する能力を有するSKの誘導体；及び（b）ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメイン4及び5（FBD4,5）、又はフィブリン親和性を有するFBD4,5の誘導体を含む、請求項１に記載の発現カセットを発現する形質転換酵母細胞。
- 請求項１又は２に記載の改変アルファシグナル配列を発現する形質転換酵母細胞であって、血栓特異的ストレプトキナーゼ（CSSK）を細胞外に生成することを特徴とする形質転換酵母細胞。
- 配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:27及び配列番号:29から成る群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも85%の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項４に記載の発現ベクター。
- 配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:23、配列番号:26及び配列番号:28から成る群から選択される核酸配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- 前記CSSKが、
a．配列番号:11に示されるポリペプチド配列と少なくとも85%の同一性を有するストレプトキナーゼ配列、及び
b．前記ストレプトキナーゼ配列のN-末端及びC-末端の各々に配列番号:22に示されるポリペプチド配列と少なくとも85%の同一性を有するポリペプチド配列、
を含む、請求項６に記載の形質転換酵母細胞。 - 前記CSSKが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6及び配列番号:8から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項６に記載の形質転換酵母細胞。
- 前記酵母が、ピキア属（Pichia）、ハンセヌラ属（Hansenula）、トルロプシス属（Torulopsis）及びカンジダ属（Candida）の種から成る群から選択されるメチル栄養性酵母である、請求項６に記載の形質転換酵母細胞。
- 前記酵母が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・アノモラ（Pichia anomola）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、及びカンジダ・ボイディニイ（Candida boidinii）から成る群から選択される、請求項１２に記載の形質転換酵母細胞。
- 前記酵母が、ピキア・パストリスである、請求項１３に記載の形質転換酵母細胞。
- 前記酵母が、アクセッション番号MTCC25071を有するピキア・パストリスである、請求項１４に記載の形質転換酵母細胞。
- グリコシル化され、80,515 Daの分子量を有し、更に細胞外態様によって分泌される、請求項10〜15のいずれか1項に記載の形質転換酵母細胞によって生成される血栓特異的ストレプトキナーゼ。
- 請求項１６に記載の血栓特異的ストレプトキナーゼ及び医薬的に許容できる担体を含むことを特徴とする組成物。
- 心筋梗塞、血管血栓症、肺塞栓症、脳卒中、急性虚血性卒中、狭心症、一過性虚血性発作、深部静脈血栓症、冠状動脈介入処置に続く血栓性再閉塞、末梢血管血栓症、心不全、シンドロームX及び少なくとも1つの冠状動脈の狭窄から成る群から選択される疾患の治療又は予防を必要とする対象における前記疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、請求項１６に記載の血栓特異的ストレプトキナーゼ含むことを特徴とする医薬組成物。
- 酵母細胞をスクリーニングして血栓特異的ストレプトキナーゼを産生する形質転換酵母細胞を識別する方法であって、以下の工程、
（a）少なくとも1つの酵母細胞を請求項５に記載のベクターで形質転換して、形質転換酵母細胞を入手する工程；
（b）少なくとも1つの形質転換酵母細胞をBMMY培地培養液でメタノールとともに培養して、CSSKタンパク質の発現を誘導する工程；
（c）前記培地培養液を前記形質転換酵母細胞から分離して、上清を入手する工程；
（d）前記上清をプラスミノーゲン活性化について試験する工程；及び
（e）前記細胞の上清でプラスミノーゲン活性化を検出することによって、血栓特異的ストレプトキナーゼを産生する形質転換酵母細胞を識別する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 工程（d）のプラスミノーゲン活性化試験が、前記上清とプラスミノーゲン及び発色団と組合せ、そして405nmにおける光の吸収の変化を検出することにより行われる、請求項１９に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲン活性化が、既知量のCSSKを示す参照値に対して測定される、請求項２０に記載の方法。
- 工程（e）で識別された細胞のCSSK生成をSDS-PAGE分析によって確認する工程を更に含む、請求項１９に記載の方法。
- 血液血栓の位置指向分解のための医薬組成物であって、請求項１６に記載の血栓特異的ストレプトキナーゼを含むことを特徴とする医薬組成物。
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