JP2018525193A - 骨形成性骨移植片を調製する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、骨形成性骨移植片を調製する方法に関するものである。本方法は、長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、収集点において、抗凝固化合物を含有するある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ」と題された２０１５年７月３１日出願の米国仮特許出願第６２／１９９，４８０号の利益を主張するものである。

（発明の分野）
本開示は、単核細胞集団の濃縮細胞画分と抗凝固物質とを含む骨形成性骨移植片、並びにその骨形成性骨移植片を調製するためのプロセスに関する。

癒着不能、特に長骨に大きな区域性欠損を伴うものは、重大な治癒課題を呈する。これらの欠損を治癒する１つの方法は、外科用リーマ洗浄吸引器（ＲＩＡ）システムを使用した、長骨、例えば大腿骨又は脛骨の髄管から得られる自己移植片の使用を伴う。このシステムは、例えば、腸骨稜骨移植と比較して、罹患率を抑えかつ迅速性を高めて、より多量の自己移植片を採取することが可能となる利点を有する。ＲＩＡ骨移植片は、大きな部分欠損の修復又は骨移植を必要とする他の臨床状況のいずれにおいても、骨移植片の使用に関連する際に新しい「金字塔」として出現している。依然として残っている１つの問題は、採取中に利用可能となる間葉系幹細胞、内皮前駆細胞及びその他の前駆細胞を含む大量の細胞が現状では失われているか又は十分に利用されていないことである。

一般に、外科用リーマは、駆動シャフトの遠位端部で変位されるドリルと類似した回転カッティングヘッドを利用している。髄内リーミングにおいて使用するための骨カッティングデバイスは、髄管が直線状であることはまれであり、通常はある程度の湾曲を有するため、典型的には可撓性の駆動シャフトを使用している。また大部分のリーマは、リーマ及び駆動シャフトの両方を貫く中心長手ボアを有している。中心ボアは、最初に髄管の中に挿入されて、前進するリーマの軌道として機能する、長尺で小径のガイドピン又はワイヤを受容するように意図されたものである。リーマは、人工股関節全置換及び人工膝関節全置換、長骨の骨折を安定化させるための釘の挿入、髄内の骨切り術、及び移植を目的とした骨採取などの外科手技に対する骨の髄管を調製するために整形外科手術において使用される。

髄内管吸引サンプルから特定の細胞型を単離及び採取する従来の方法は通常、サンプルの遠心分離を伴う。遠心分離の間、細胞の集団は、より小さな加速度からより大きな加速度へとの軸線に沿った相対位置に移動し、その密度に従って層内に濃縮して、プロセス中に他のより高密度の細胞型及び低密度の細胞型並びに血漿を置換する。

現状では、髄内リーミングの間に採取される流出液の大部分は医療廃棄物として処分されている。大量に存在し（約２５０ｃｃ〜３０００ｃｃ）、骨の治癒を促進しない外部からの流体、細胞及び組織（ＲＢＣ、血漿、潅流液、脂肪細胞、トリグリセリド、コレステリルエステル、アディポカイン（adpokine）として作用する特定のタンパク質など）が存在するがゆえに、治療上有益な細胞を分離する実用的方法は存在しない。既存の細胞分離法は通常、密度勾配（例えば、遠心分離）、濾過（例えば、接線流濾過）及びその他の方法に基づいている。非常に大きな濾過表面積が必要とされ、また目詰まり、凝固、及び細胞死に関連する複雑性がゆえに、細胞レベルで流出液を濾過することは実用的ではない。流出液の全体積から細胞を分離及び採取する方法として、遠心分離が用いられてきたが、既存のシステムには欠点がある。殆どの市販のシステムは、個々の容器当たり約５０ｃｃ超、又は４容器遠心分離システムにおける各遠心分離サイクルごとに合計２００ｃｃを超える流体を処理することができず、殆どの髄内リーミング手技において存在する多量の流出液を処理するには実用的ではない。

加えて、血液凝固とリーミングツールによって発生する粘着性の脂肪粒子の凝集との相互作用が原因で、採取される移植材料の有用性に関して問題が生じ得る。血液凝固又は凝結は、出血を停止する身体の自然な手段の１つである。これは、一部は血中に常に存在し、また一部は損傷組織又は活性化血小板から放出される、多くの凝結因子が複雑に連なったものである。血管の内層が破壊されると、血小板が引き寄せられて血小板血栓を形成する。これらの血小板は、血清トロンビン分子に結合するトロンビン受容体をその表面上に有し、それらは漿液中の可溶性フィブリノーゲンを創傷部位でフィブリンに変換する。フィブリンは、血小板に結合された強固な不溶性タンパク質の長い鎖を形成する。第ＸＩＩＩ因子はフィブリンの架橋を完了させ、それによってフィブリンは硬化及び収縮する。架橋したフィブリンは血餅を完成させる血小板血栓の上にメッシュを形成する。最終生成物はフィブリン鎖のメッシュであり、そこに血液細胞が閉じ込められて、出血を止めようとする固体塊が形成される。フィブリン凝塊による骨成長を促進する細胞の捕捉は、外傷性傷害の部位における骨組織の再生に有害となり得る。

血液凝固カスケードは、リーマヘッドが大腿骨又は脛骨の髄管内の血管又は他の組織の内皮裏層に損傷を与えた後、ほぼ即座に始まる。開始されると、このプロセスは通常不可逆的であり、特定の場合には、リーミングヘッドの切断によって霧化される髄管内に存在する脂肪組織だけでなく、すべての有用な細胞移植材料までもが凝塊マトリックスに閉じ込められて、骨移植片として使用できなくなる。元の外傷及び髄内管のリーミングの両方によって引き起こされる組織損傷に応答して形成された新生血管による細胞の血管再生を、強粘着性の脂肪粒子と織り合わされたフィブリン凝塊が塞ぎ、防止するため、これらの閉じ込められた細胞は多くの場合、死亡する。先行技術に記載されている既存の方法は、最終収集の時点で抗凝固物質を生成した流出液と共に入れること、又はある量の流出液（典型的には５０ｃｃ以下）を採取し、これを一定量の抗凝固物質の入った別の容器に加えることに依存している。これらの方法の主な欠点は、抗凝固物質の流出液への迅速な比例混合を促進せず、したがって、凝固カスケードの開始を阻止すること、並びに細胞回収率及び生存率の両方に関して次善のものとなることである。

結果として、髄内管の採取された生物学的成分の、骨形成性骨移植片としての使用を改善するための方法を見出すことが当該技術分野において必要とされており、また採取された材料が凝塊マトリックス内で不可逆的に結合するのを防止するために、採取された材料内における凝固カスケードを阻止することが更に必要とされている。

本開示は、骨形成性骨移植片を調製する方法について説明するものである。本方法は、
長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有するある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含み得る。

本方法は、
長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料を採取する工程と、
ある量の細胞材料に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有する採取されたある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を更に含み得る。

本開示はまた、骨形成性骨移植片を調製する方法について記述するものであり、その方法は、
長骨の髄内管から採取された単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有する採取されたある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む。

一実施形態によれば、採取する工程は、外科用リーミングデバイスを用いて長骨の髄内管を吸引する工程を含む。別の実施形態によれば、抗凝固物質は、流出液に連続的に導入される。更なる実施形態では、抗凝固物質は、流出液に比例的に導入される。抗凝固物質の連続的及び比例的導入は、凝塊形成を阻止し、骨形成及び血管形成細胞の再生能力を保護する方法として有利である。採取された流出液を即効性の抗凝固物質で満たすことにより、凝固カスケードが阻止され、採取された材料の細胞生存率が向上され得る。凝固カスケードは組織の損傷が生じると直ちに始まるので、流出液が髄管から出現した後に、凝固カスケードを妨害するために、抗凝固物質が流出液へと比例的に分配され得るのが早ければ早いほど、採取される細胞材料及び単核細胞（ＭＮＣ）集団が骨再生により有用となり得る。

一実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を骨伝導性又は骨誘導性のマトリックスと組み合わせる工程を含む。一実施形態では、流出液は収集に先立って濾過され、濾過する工程は粗残留物を流出液から除去する。更なる実施形態では、本方法は、濾過された粗残留物からの自己骨移植片を保持する工程を含み得る。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を粗残留物から得られた自己骨移植片と組み合わせる工程を含み得る。別の実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を二次自己骨移植片と組み合わせる工程を含み得、二次自己骨移植片は、採取部位とは異なる解剖学的部位から得られる。更なる実施形態では、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を同種移植片又は合成骨代用材と組み合わせる工程を含み得る。

本開示はまた、骨形成性骨移植片に関するものである。本開示による骨形成性骨移植片は、髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、抗凝固化合物とを含み得る。一実施形態では、骨形成性骨移植片は、濃縮細胞画分と抗凝固化合物との均質な混合物を含む。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片は、骨誘導性又は骨伝導性マトリックスと更に組み合わされてもよい。別の実施形態によれば、骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片、合成骨代用材、若しくは自己骨移植片、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、骨移植片組成物中の単核細胞集団の濃度は、約１．０×１０^６／ｍｌ〜約１０００．０×１０^６／ｍｌの範囲である。

以下の面は、例として、ただし限定としてではなく、本文書で検討される様々な実施形態を一般的に示したものである。上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより理解が深まるであろう。
市販の外科用リーミングデバイスのリーミングヘッドの側面図である。 外科用リーミングデバイスの遠位端部の側面図である。 外科用リーミングデバイスの近位端部の側面図である。 外科用リーミングデバイスの底面図である。 本開示の一実施形態による単核細胞及びＣＤ３４＋細胞含有量及び処理からの回収率のグラフ表示である。 本開示の別の実施形態に従って得られた流出液の様々な成分のコロニー形成単位を測定するデータのグラフ表示である。

本文書において、「ａ」又は「ａｎ」なる語は、１つ又は１つよりも多くのものを含むために用いられ、「又は」なる語は、特に断らないかぎりは非限定的な「又は」のことを指して用いられる。更に、本明細書で用いられ、他の意味で定義されていない語法又は用語法は、あくまで説明を目的としたものであって限定を目的としたものではない点を理解されたい。更に、本文書において参照されるすべての刊行物、特許、及び特許文献は、恰も個別に参照により援用されたのと同様にしてそれらの全容を参照により本明細書に援用するものである。値の範囲が表されている場合、別の実施形態においては、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値までが含まれる。同様に、先行する「約」によって値が近似の形式で表現された場合、その特定値により別の実施形態が形成されることが理解されるであろう。範囲はいずれも包括的であり、組み合わせが可能である。更に、範囲で記述される値への言及は、その範囲内のあらゆる値が含まれる。分かりやすさのために別々の実施形態として本明細書に述べられる本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて示される場合もある点も認識されるであろう。逆に、簡潔のために単一の実施形態として記載される本発明の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の下位の組み合わせで提示されてもよい。

定義
本明細書で使用される「吸引流（aspiration stream）」、「吸引液（aspirant）」、及び「アスピレーション流（aspirating stream）」、並びにそれらの派生語は、外科的リーミング又は等価な外科手技中に長骨の髄内管から採取されるあらゆる材料として定義されている。そのような材料には、限定するものではないが、灌流液、骨組織及び細胞、骨内膜細胞及び組織、脂肪組織及び細胞、骨髄及び骨髄間質、血管細胞及び組織、幹細胞及び／又は前駆細胞（間葉細胞、造血細胞、及び内皮幹細胞／前駆細胞）並びに血液（血小板、赤血球、血漿、顆粒球、リンパ球、単球などの個々の構成成分を含む）が含まれ得る。

本明細書で用いられる「流出液流」及び「流出液」並びにそれらの派生物は、必要に応じて、いくつかのプロセスによって吸引流から分離され得る吸引流の構成成分として定義される。この分離プロセスは濾過を含み得るが、これに限定されない。流出液を吸引流から分離するために濾過が利用される場合、流出液はフィルタを通過するいかなるものをも構成し得る。したがって、本明細書で定義されるように、「流出液流」及び「流出液」並びにそれらの派生物は、「吸引流」の構成成分であるとみなされ、そのため、分離／濾過プロセス又は工程に先立って「吸引流」に対して又は「吸引流」に向かって実施されるプロセスへの言及には必然的に「流出液流」が含まれる。

本明細書で用いられるとき、「粗残留物」は、流出液の一部ではない吸引流の残部として定義される。例えば、濾過が用いられる場合、「粗残留物」は、流出液中の、フィルタを通過しないものである。「粗残留物」の成分は、フィルタの平均孔径に依存して変化し得るが、典型的には、フィルタの平均孔径よりも大きい断面寸法を有する成分が含まれることになる。しかしながら、フィルタを通過すると予想される、フィルタの平均孔径よりも小さい流出液中の成分が、フィルタを利用する通常の操作プロセス中に、フィルタ上に、又はフィルタ表面にあるより大きな成分の凝集若しくは凝塊の中に捕捉されることもあり、そのため、粗残留物は、特定の実施形態では、濾過された流出液中に同様に含まれることになる少量の成分を含むことを理解されたい。「粗残留物」の典型的な成分には、例えば、骨粒子、脂肪の凝集又は凝塊、及び血餅、並びにそれらの組み合わせが含まれ得る。

本開示は、骨形成性骨移植片を調製する方法について説明するものである。本方法は、
長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料を採取する工程と、
ある量の細胞材料に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有する採取されたある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含み得る。

本明細書で開示される方法は、一実施形態によれば、外科手技、例えば長骨（例えば大腿骨）の髄内管のリーミングによって手術中に得られた流出液から単核細胞（ＭＮＣ）を単離し、また拡張によって、この細胞集団のサブセット（例えば、間葉系幹細胞）を単離することができる。典型的には、流出液は、とりわけ、髄内管から吸引されるいくつかの生物学的成分を含む異種の生物学的流体であると考えられ得る。例示的な非限定的リストには、例えば、骨髄及び骨髄間質、骨内組織、脂肪（黄色骨髄）、内皮質骨片、骨幹端骨片、血小板及びその他の一般的に知られている骨又は骨髄関連組織が含まれ得る。流出液中に含まれ得る細胞の中には、赤血球、顆粒球及び単核細胞がある。多くの細胞型が単核細胞集団を構成する。例示的かつ非限定的なリストには、例えば、ＣＤ４５＋（白血球細胞）、ＣＤ４５−、ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋（造血幹細胞）、Ｃ１０５＋、ＣＤ２７１＋、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮細胞、内皮前駆細胞、骨細胞、骨膜細胞、Ｔ細胞、間質細胞及び脂肪細胞が含まれ得る。単核細胞集団内には、例えば、間葉系、造血系及び内皮系の幹細胞及び前駆細胞など、骨の治癒に寄与し得る細胞がある。しかしながら、典型的に採取された流出液量に含まれる全体的な単核細胞集団は、流出液の総量のごくわずかな割合、特定の場合には１％未満を構成するにすぎない。流出液の残りの体積は、主に赤血球、潅流液（irrigant）、その他の流体、血漿、脂肪及び脂肪組織である。

細胞材料の採取
本開示によれば、骨形成性骨移植片を調製するための方法は、長骨の髄内管からある量の細胞材料を採取することを含む。一実施形態によれば、採取は、吸引流と組み合わせて外科用リーマを利用して達成され得る。例示的な実施形態では、採取は、灌流を更に含む。外科用リーマは、当該技術分野において周知である。例示的なリーマが、参照によって本明細書に援用される米国特許第６，３３２，８８６号に図示及び説明されている。

図１〜４に示すように、外科用リーミングデバイス１０は、リーミングデバイスの遠位端部３０に位置するリーマヘッド２０を有する。可撓性カニューレチューブ４０は、チューブ４０の遠位端部でリーマヘッド２０に連結され、リーマヘッド２０とデバイス１０の近位端部５０との間で近位側に延びている。リーマヘッド２０、チューブ４０の遠位端部のいずれか又は両方が、チューブ４０のカニュレーションと流体連通している１つ以上の開口部２２、２４を有し得る。カニューレチューブ４０は、１つを超えるカニュレーション、例えば２つのカニュレーションをチューブ内に有し得る。そのような実施形態では、複数のカニュレーションがチューブ４０内で互いから別々にかつ同一の広がりを持って延びていてもよく、そのため、カニュレーションの各々は独立した別個の流量を維持することができる。例えば２つのポートなど、１つ以上のポート５２、５４が、デバイス１０の近位端部５０に配置され、チューブ４０のカニュレーションと流体連通している。したがって、一実施形態では、１つ以上のポート５２、５４の各々は、チューブ４０内のカニュレーションのうちの１つ以上の各々にそれぞれ連結することができ、そのため、１つ以上のポート５２、５４の各々は、デバイスの遠位端部において、１つ以上の開口部２２、２４の各々との別々の独立した流体連通をなし得る。一実施形態によれば、外科用リーミングデバイス１０は、２つの近位ポート５２、５４と、潅注ポート５４と、吸引ポート５２とを含む。外科用リーミングデバイス１０は、２つの独立した同延のカニュレーション、すなわち、潅注流カニュレーションと、吸引流カニュレーションとを有する可撓性チューブ４０を更に含む。更に、遠位端部３０において、デバイス１０は、潅注流カニュレーションに連結された１つ以上の潅注流開口部２２と、それとは別に、吸引流カニュレーションに連結された１つ以上の吸引流開口部２４とを含む。そのような実施形態では、潅注流４４は、流体供給部５６を外科用リーマ１０の潅注ポート５４に結合することによって導入され、吸引流４２は、真空源を吸引ポート５２に結合することによって形成される。潅注流４４は、流体供給部５６から潅注ポート５４を通って更に潅注流カニュレーションへと向かう方向に流動し、潅注流開口部２２を通ってデバイスから流出して髄内管の中へと向かうことができる。吸引流４２は、髄内管から吸引流開口部２４を通って吸引流カニュレーションの中へと向かう方向に流動し、吸引流ポート５２を通って外科用リーミングデバイスから流出することができる。

通常、リーミング手技では、髄内管へのアクセスは、外科用の突き錐、ドリル、又はその他の同様のデバイスを用いて作られた開口部を介して得られる。アクセスが得られると、流体供給部５６が開放されて、上記で詳述したようにデバイス１０を通って潅注流４４が開始される。リーマヘッド２０が起動され、回転し始める。真空源が起動され、リーマヘッド２０が管内に挿入される。髄内管内に進入すると、潅注流４４は髄内管の空間内へと流動し始める。リーマヘッド２０が髄内管内で十分に遠くへ前進され、それによって吸引流ホール２４が管内に位置すると、吸引流４２は、前述のように流動し始めて、単核細胞集団を含むある量の細胞材料を採取することになる。吸引流４２は、一実施形態によれば、流出液の内容物を規定することができるだけでなく、粗残留物を含むその他の成分を含むことができる。したがって、吸引流４２は、上記で説明したように流出液の単核細胞集団を含むある量の採取された細胞材料を含む。

本開示によれば、骨形成性骨移植片を調製するための方法は、流出液を収集するのに先立って流出液を濾過する工程を更に含み得る。一実施形態によれば、流出液を濾過する工程は、流出液を吸引流の残部から分離するために、粗残留物並びにその他の大きな組織片を流出液から除去するように濾過する工程を含む。殆どの事例では、外科用リーマから抜け出す吸引流はフィルタアセンブリへと流動するが、そのフィルタアセンブリは、フィルタを含み得ると共に、フィルタの下流のある流動点に配設された中間収集点を含み得るものであり、また流出液を収集し得るものである。一実施形態によれば、フィルタは、約５００マイクロメートルの範囲の平均孔径を有し得る。

一実施形態によれば、濾過する工程は、フィルタの表面にあるある量の粗残留物を捕捉する。一実施形態では、濾過する工程は、粗残留物中に含まれるある量の自己骨移植片を保持する。保持された自己骨移植片は後に、以下でより完全に説明するように、骨形成性骨移植片を調製する際に使用され得る。

抗凝固物質の導入
本開示によれば、骨形成性骨移植片を調整するための方法は、ある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程を含む。また、採取されたある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程を含む、骨形成性骨移植片を調製するための方法も開示される。

例えば、本開示の一実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する方法は、
長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有するある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む。

本開示の別の実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する方法は、
長骨の髄内管から採取された単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有する採取されたある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む。

抗凝固化合物は当該技術分野において周知である。抗凝固物質の例示的かつ非排他的なリストには、例えば、ヘパリン、抗凝固クエン酸デキストロース−Ａ（ＡＣＤＡ）、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、クエン酸リン酸デキストロースアデニン（ＣＰＤＡ）、及びビバラルジン、並びにそれらの組み合わせが含まれ得る。一実施形態によれば、抗凝固化合物は、約２部〜約１０部（重量で）の流出液対抗凝固化合物の範囲である量の細胞材料に導入される。別の実施形態によれば、抗凝固化合物は、約６部〜約８部（重量で）の流出液対抗凝固化合物の範囲である量の細胞材料に導入される。更なる実施形態によれば、抗凝固化合物は、濃縮細胞画分を得るのに十分な時間量にわたって、凝固を阻止するのに十分な量で流出液に導入される。抗凝固物質を用いて凝固を阻止するのに十分な時間量は様々となり得、例えば、約８時間未満、約７時間未満、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、又は約１時間未満となり得る。

一実施形態によれば、抗凝固化合物は、抗凝固物質容器から流出液の中へと連続的に導入される。更なる実施形態では、抗凝固化合物は、流出液の中へと比例的に導入される。比例的に導入することにより、例えば、抗凝固物質と混合された所定量の流出液のサンプルが、そのプロセスの別の時点で取られた別のそのようなサンプルとほぼ同じ流出液対抗凝固物質の比を有することが可能となる。

例示的な実施形態では、例えば、吸引液と抗凝固物質との静的な混合によって達成される抗凝固化合物及び吸引液の比例的導入など、抗凝固化合物の比例的導入は、流出液と抗凝固物質との静的な混合によるものである。そのようなインライン混合チャンバは、チャンバがインライン位置に固定されたままであり、また２種類の液体が同時に蛇行して通過することによって混合が引き起こされるという点で、「静的ミキサ」と呼ばれる。更なる実施形態によれば、静的混合は蛇行混合である。特定の実施形態によれば、流出液への抗凝固化合物の導入は、それらが、抗凝血化合物と流出液との蛇行混合を引き起こす内部形状を有するインライン混合チャンバを通過するときに生じ、したがって、これらの２種類の流体がインライン混合チャンバを通過するときには、流出液中における抗凝固化合物の均質な分布が完成している。

一実施形態によれば、抗凝固物質は、フィルタアセンブリの上流で流出液の中に（すなわち、吸引流の中に）計量供給され、静的ミキサを通過する間に流出液と混合され得る。このようにして、抗凝固物質は完全にフィルタアセンブリの上流で、単核細胞集団を含む細胞材料と、自己骨移植片を含む粗残留物との両方と、凝固を阻止するのに十分な量で混合することができる。別の実施形態では、抗凝固物質は、フィルタアセンブリ内に導入されてもよく、やはり単核細胞集団を含む細胞材料と、自己骨移植片を含む粗残留物との両方と完全に混合することができる。別の実施形態によれば、抗凝固物質は、フィルタアセンブリの下流で流出液の中に計量供給され、静的ミキサを通過する間に流出液と混合されてもよい。更なる実施形態によれば、抗凝固物質容器は、浮遊微生物が容器に侵入して、吸引流を生成しフィルタを通して引き込む減圧にのみ応答して開放するダックビル弁などの一方向弁を通して分配されるある量の抗凝固物質と置き換わるのを防止するために、０．２マイクロメートルの孔径のフィルタを含むが、これについては既に説明した。一実施形態によれば、吸引流は、フィルタの下流に配置された吸込みキャニスタの中へと引き込まれることができるが、特定の実施形態では、吸込みキャニスタとフィルタがフィルタアセンブリを形成すると見なされ得る。

一実施形態によれば、抗凝固化合物は、外科用リーミングデバイスへと下流に移動すること及び患者の髄管に進入することを防止する方式で導入される。別の実施形態によれば、抗凝固物質は、潅注流へと導入され、例えば、潅注流へと連続的に導入され、そのため、抗凝固物質は、髄管内である量の細胞材料の中へと導入され、吸引流において採取され得る。一実施形態によれば、抗凝固物質は、流出液ラインに配管された固定容積の（また必要に応じて空気置換フィルタを装備している）硬質容器に収容されている。一実施形態によれば、抗凝固物質は、標準的なＩＶバッグなどの軟質容器に収容され、これは標準的なタケノコ継手を介して静的ミキサの真空ラインに後に連結される。代替的に、抗凝固物質ラインが、Ｙ字形の継手を介して一次（真空ライン）に接続されてもよい。別の実施形態では、抗凝固物質と流出液は、乱流混合を誘発するように計画された様式で、例えばこの目的で設計されたノズルにおいて組み合わされる。一実施形態によれば、抗凝固物質は、正圧を誘発するように蠕動ポンプを使用して流出液の中へとポンピングされる。一実施形態によれば、抗凝固物質は、重力の影響下で流出液ライン中へと滴注される。一実施形態によれば、抗凝固物質は、軟質容器（例えば、血圧測定用カフ）の壁に加えられる圧力の影響下でポンピングされる。

流出液の収集
本開示によれば、骨形成性骨移植片を調製するための方法は、収集点において、抗凝固化合物を含有するある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程を含む。一実施形態によれば、流出液を収集する工程は、中間収集点において収集する第１の工程を含む。一実施形態によれば、中間収集点は、フィルタアセンブリの一部でありかつ流出液が濾過された後にその流出液を収集する、例えば吸込みキャニスタなどの構造体を含み得る。一実施形態では、抗凝固化合物と流出液は、中間収集点における収集に先立って、比例的に混合されている。更なる実施形態によれば、流出液は後に処理収集点において収集される。処理収集点は、所望の濃縮細胞画分が流出液から分離され得るように流出液を処理することが可能なデバイスを含み得る。そのような分離デバイスは当該技術分野において知られており、例えば遠心分離機を挙げることができる。

濃縮細胞画分の分離
本開示によれば、骨形成性骨移植片を調製するための方法は、流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程を含む。一実施形態によれば、デバイスは、例えば遠心分離などによって、濃縮細胞画分を流出液から分離することができる。

例示的な分離デバイスが、例えば参照によって全体が本明細書に援用される米国特許第８，７４７，２８９号に図示及び説明されている。当該技術分野において知られているように、細胞材料の個々の細胞成分は、様々な密度を有し得る。一実施形態によれば、流出液は複数のスピンサイクルによって処理され得る。各スピンサイクルの完了後、処理された流出液の望まれていない画分が分離デバイスからデカントされるか、あるいは別様に除去され得る。このようにして、骨形成性骨移植片の調製に使用するために、濃縮細胞画分が流出液から分離されるが、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含んでいる。一実施形態によれば、濃縮細胞画分は、例えば、遠心分離中に流出液の残りの画分を除去することなどによって、遠心分離プロセス中に流出液から分離され得る。一実施形態によれば、元の細胞材料は総単核細胞集団を有し、濃縮細胞画分は細胞材料の単核細胞集団の少なくとも８０％を含有する。更なる実施形態によれば、濃縮細胞画分は、細胞材料の単核細胞集団の少なくとも９０％を含有する。

骨形成性骨移植片
本開示による骨形成性骨移植片は、髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、抗凝固化合物とを含み得る。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片は、骨誘導性又は骨伝導性マトリックスと更に組み合わされてもよい。別の実施形態によれば、骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片、合成骨代用材、若しくは自己骨移植片、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、骨移植片組成物中の単核細胞集団の濃度は、約１．０×１０^６／ｍｌ〜約１０００．０×１０^６／ｍｌの範囲である（骨形成性骨移植片を骨伝導性又は骨誘導性マトリックスと組み合わせる前）。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片は、注入可能な組成物、成形可能な若しくは柔軟な組成物、又は硬質の固体組成物であり得る。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片は、二次的な量の抗凝固物質を含み得るが、この二次的な量の抗凝固物質は、骨移植片の植込み部位に治療効果をもたらし得るものである。

一実施形態によれば、マトリックスは多孔質マトリックスであり得る。そのような実施形態では、マトリックスの多孔質性は、マトリックス内での濃縮細胞画分及び抗凝固物質の取り込みを可能にし得る。別の実施形態によれば、マトリックスは非多孔質であってもよい。更なる実施形態において、濃縮細胞画分及び抗凝固物質は、マトリックスとの均一な分布をもたらすようにマトリックスとブレンド又は別の方法で混合され得る。

本開示によれば、骨形成性骨移植片を調製するための方法が説明される。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を骨伝導性又は骨誘導性のマトリックスと組み合わせる工程を含む。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を粗残留物から得られた自己骨移植片と組み合わせる工程を含み得る。別の実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を二次自己骨移植片と組み合わせる工程を含み得、二次自己骨移植片は、採取部位とは異なる解剖学的部位から得られる。更なる実施形態では、骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を同種移植片又は合成骨代用材と組み合わせる工程を含み得る。一実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する工程は、追加量の抗凝固物質を骨移植片に加える工程を含み、追加される量は、骨移植片中の抗凝固物質の全濃度を所望の治療レベルに増加させるのに十分のものである。

一実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する方法は、骨形成性骨移植片を骨欠損部位に付ける工程を含む。例示的な一実施形態によれば、この方法は、開示された工程のすべてを手術中に単一の手技で実施する工程を含む。これは、外科手技の回数を低減するだけでなく、細胞を保存する必要性を低減するという利点を有するが、これらは結果として、汚染及び細胞生存率の低下を生じ得るものである。一実施形態によれば、各工程の術中実行は６時間以内である。

採取された細胞の量が骨欠損の修復のために臨床的に必要な量を超える更なる実施形態によれば、骨形成性骨移植片を調製する方法は、過剰量の濃縮細胞画分及び抗凝固物質を保存する工程を更に含み得、第２の、第３の、又はそれ以上の骨形成性骨移植片を調製する工程を更に含み得る。例えば、骨形成性骨移植片を調製する方法は、濃縮細胞画分及び抗凝固物質の１つ以上の過剰部分を凍結保護、凍結、及び極低温で保存する工程を含み得、また第２の、第３の、又はそれ以上の骨形成性骨移植片を、低温保存された過剰部分から調製する工程を含み得る。

本開示による骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、自己骨（自己移植）、同種骨（同種移植）、並びに合成骨代用材を含み得る。自己骨は、上記で既に説明したように、髄管から採取され得ると共に、腸骨稜などの二次的な解剖学的部位からも取られ得る。自己骨は、患者自身の身体を起源とするため、拒絶の危険性がより低い。また、自己骨は、骨伝導性特性に加えて、骨誘導性及び骨形成特性も提供することができる。高い中実（solid）骨含有量を有する自己骨スカフォールドは、より低い中実骨含有量を有する自己骨よりも高い骨伝導性の可能性を有する。同種骨スカフォールドは、自己スカフォールドと同じ骨伝導性特性を提供する。同種スカフォールドは、屍体サンプル、例えば組織バンクから得ることができる。

一実施形態によれば、骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、合成骨代用材を含む。合成骨代用材は、多孔性であっても非多孔性であってもよい。用語「多孔質」には、マクロ多孔質（平均孔径が１００ｕｍ以上）、メソ多孔質（平均孔径が１００ｕｍ未満であるが、１０ｕｍ以上）及びマイクロ多孔質（平均孔径が１０ｕｍ未満）が含まれるが、これらに限定されない。孔は、いかなるサイズ、形状若しくは分布を有してもよく、又は所定の許容範囲内にあってもよい。加えて、孔は、相互接続していてもよいし相互接続していなくてもよい。一実施形態において、孔の直径は約７５０ｕｍまでの範囲のサイズであってもよい。別の実施形態において、孔径は約５００μｍまでの範囲であり、孔の約７５％は少なくとも１００μｍのサイズであり、孔の残りの２５％は１０μｍ以下のサイズである。

一実施形態では、合成骨代用材は、例えばリン酸カルシウム系化合物などのセラミック骨代用材を含む。リン酸カルシウムの好適な例としては、非晶質リン酸カルシウム、結晶性リン酸カルシウム、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、リン酸カルシウム化合物は、アパタイトであってもよい。アパタイトは、通常はヒドロキシアパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、フルオロアパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（Ｆ）_２、クロルアパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（Ｃｌ）_２及びブロモアパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（Ｂｒ）_２を指すリン酸カルシウム鉱物の群であり、シリケート（ＳｉＯ_４ ^４−）及びカーボネート（ＣＯ_３ ^２−）置換ヒドロキシアパタイトの両方を更に含み得るが、ここで、置換はヒドロキシ及び／又はホスフェート基の１つ以上に対するものである。別の実施形態では、セラミック骨代用材は、β−リン酸三カルシウムＣａ_３（ＰＯ_４）_２，（ｂ−ＴＣＰ）を含む。

骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、修復される特定の骨欠損に所望される任意の形状をなし得る。一実施形態によれば、マトリックスは、多孔質又は非多孔質のいずれかであり得るモノリシック組成物である。好適な形状としては、例えば、球形、立方形、くさび形、楕円形、円筒形、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。別の実施形態では、マトリックスは、複数の多孔質顆粒又は非多孔質顆粒であり得る。マトリックスの比表面積は様々であり得る。例えば、マトリックスが多孔質顆粒である場合、比表面積は、約０．１ｍ^２／ｇ〜約１００ｍ^２／ｇの範囲であり得る。

骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、任意のサイズ又は形状を有するセラミック骨代用材の粒子又は顆粒であり得る。顆粒は、カルシウム化合物を所望の粒子サイズ又は粒径に研磨又は挽くことにより得ることができる。一実施形態では、顆粒の平均径は約０．０５ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の大きさである。別の実施形態では、顆粒の平均径は約０．０７５ｍｍ〜約５ｍｍの範囲の大きさである。別の実施形態では、顆粒の平均径は約０．０７５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲の大きさである。別の実施形態では、顆粒の平均径は約１．４ｍｍ〜約２．８ｍｍの範囲の大きさである。別の実施形態では、顆粒の平均径は約２．８ｍｍ〜約５．６ｍｍの範囲の大きさである。別の実施形態では、顆粒の平均径は約０．１ｍｍ〜約０．７５０ｍｍの範囲の大きさである。

本開示の別の実施形態によれば、骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、骨形成性骨移植片が、修復される骨の領域に適合するように所望通りに成形され得る、例えば成形可能な又は柔軟なインプラントに形成され得るように、高分子バインダーと更に組み合わされてもよい。

高分子バインダーは、ホモポリマー類及びコポリマー類（即ち、２種以上の異なるモノマー単位を含むポリマー類）などのポリマー類、並びにポリマーとコポリマーとのブレンド、混合物及び組み合わせを含んでもよい。ポリマーは、吸収性ポリマー、非吸収性ポリマー、又はこれらの組み合わせであってもよい。一実施形態において、高分子バインダーは吸収性ポリマーを含み、この高分子バインダーは、非吸収性ポリマーを実質的に含まない。一実施形態によれば、高分子バインダーはインビボで吸収性であり、吸収性ポリマーを含む。高分子バインダーのポリマー（類）はまた、合成ポリマー、非合成ポリマー（即ち、植物又は動物から得られたポリマー）、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。

高分子バインダーを調製するのに有用な好適なポリマーには、これらに限定するものではないが、Ｌ−ラクチドから選択されるモノマーのホモポリマー又はコポリマー；Ｌ−乳酸；Ｄ−ラクチド；Ｄ−乳酸；グリコリド；α−ヒドロキシ酪酸；α−ヒドロキシ吉草酸；α−ヒドロキシ酢酸；α−ヒドロキシカプロン酸；α−ヒドロキシヘプタン酸；α−ヒドロキシデカン酸；α−ヒドロキシミリスチン酸；α−ヒドロキシオクタン酸；α−ヒドロキシステアリン酸；ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、β−プロピオラクチド；β−プロピオ乳酸；γ−カプロラクトン；β−カプロラクトン；ε−カプロラクトン、γ−ブチロラクトン、ピバロラクトン、テトラメチルグリコリド；テトラメチルグリコール酸；ジメチルグリコール酸；トリメチレンカーボネート；ジオキサノン；液晶ポリマーを形成するモノマー；セルロースを形成するモノマー；セルロースアセテートを形成するモノマー；カルボキシメチルセルロースを形成するモノマー；ヒドロキシプロピルメチルセルロースを形成するモノマーから選択されるモノマーのホモポリマー又はコポリマー；ポリカプロラクトン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンアジペート）、ポリ（ブチレンオキシド）及びそれらの混合物から選択されるマクロジオールを含むポリウレタン前駆体、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、シクロヘキサンジイソシアネート、水素化メチレンジフェニレンジイソシアネート、及びそれらの混合物から選択されるイソシアネート官能性化合物、並びにエチレンジアミン、１，４−ブタンジオール、１，２−ブタンジオール、２−アミノ−１−ブタノール、チオジエチレンジオール、２−メルカプトエチルエーテル、３−ヘキシン−２，５−ジオール、クエン酸及びそれらの混合物から選択される連鎖延長剤、並びに上記のうちの２つ以上の任意の組み合わせが挙げられる。

一実施形態において、高分子バインダーは、吸収性ポリマーを含む。吸収性ポリマーの好適な例としては、例えば、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチド、グリコリド、ラクトン、ラクタム、ε−カプロラクトン、炭酸トリメチレン、環状カーボネート、環状エーテル、パラ−ジオキサノン、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシプロピオン酸、β−ヒドロキシ吉草酸、単糖類、コラーゲン、フィブリン、アルブミンから選択されるモノマーから誘導されるポリマー、及び上記のうちの２つ以上の任意の組み合わせが挙げられる。

別の実施形態では、高分子バインダーは、吸収性合成ポリマーを含む。吸収性合成ポリマー類の非限定的な例としては、例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）（コ）ポリマー、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（コ）ポリマー、ポリグリコリド（コ）ポリマー、ポリカプロラクトン（コ）ポリマー、ポリ（テトラメチルグリコール酸）（コ）ポリマー、ポリジオキサノン（コ）ポリマー、ポリヒドロキシブチレート（コ）ポリマー、ポリヒドロキシバレレ−ト（コ）ポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（テトラメチルグリコール酸−コ−ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン−コ−Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）コポリマー、ポリ（ヒドロキシブチレート−コ−ヒドロキシバレレート）コポリマー、液晶（コ）ポリマー、これらの組み合わせ、又はこれらのコポリマーが挙げられる。

一実施形態によれば、骨形成性骨移植片は、髄管由来の単核細胞集団及び抗凝固化合物を含む濃縮細胞画分から本質的になることができ、そのため、骨移植片は、骨欠損の修復に治療的に影響を及ぼすように骨形成性骨移植片の機能を著しく変える成分を含まない。更なる一実施形態によれば、骨形成性骨移植片は、髄管由来の単核細胞集団、抗凝固化合物、及び骨誘導性又は骨伝導性マトリックスを含む濃縮細胞画分から本質的になることができ、そのため、骨移植片は、骨欠損の修復に治療的に影響を及ぼすように骨形成性骨移植片の機能を著しく変える成分を含まない。

Ｄｅｐｕｙ Ｓｙｎｔｈｅｓ（リーマ／洗浄器／吸引器（ＲＩＡ））から市販されている外科用リーマを用いて、細胞材料のサンプルをヒトの長骨から各手技（実験１〜１０又は患者１〜１０と呼ぶ）で採取した。処理された各採取後の流出液の量が以下の表３に示されている。

流出液は、フィルタアセンブリと真空源との間に配置されたラインから術中に収集した。しなければ処理システムのファウリングを引き起こすであろう破片を濾過するために、追加のフィルタが任意に使用されてよい。また、しなければ臨床的に有用となり得る細胞の更なる集団を収集するために、追加のフィルタが加えられてもよい。抗凝固物質、この場合はヘパリンを、抗凝固物質に対して約６〜８部（重量）の流出液の割合で、制御された様式で流出液中に導入した。抗凝固物質をフィルタアセンブリの下流に導入した。抗凝固物質を、外科用リーミングデバイスの中へと上流に移動するのを防止する様式で、静的ミキサを通して流出液に比例的に導入した。流出液及び抗凝固物質を、処理収集点へとデカントされる前に、フィルタの下流に配置された中間収集チャンバ（例えば、吸込みキャニスタ）に収集した。後の試験及び分析に使用するために、前処理された流出液のサンプルを採取した。

処理収集点は、市販のＳｙｎＧｅｎＸ−Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍと共に入手可能な使い捨てカートリッジであった。カートリッジの各々は、最大２４０ｍｌの収集流出液を処理することが可能であり、最大４個のカートリッジをＳｙｎＧｅｎＸ−Ｌａｂ遠心分離機に配置することができる（１回のサイクルで処理され得る総流出液量は約１０００ｍｌである）。各実験から採取した流出液を別々に処理し、均一に混合し、別々のカートリッジに分割した。遠心分離サイクルはプログラム可能であり、「高速スピンサイクル」（その間に主コンパートメントにおける密度に応じた細胞の層別化が生じる）と、「低速スピンサイクル」（その間に専用コンパートメントに関する赤色細胞の枯渇及び採取コンパートメントへの臨床的に関連する細胞の採取が生じる）とを含み得る。ＳｙｎｇｅｎＸ−Ｌａｂシステムは、カートリッジと、再使用可能なバッテリ駆動式のファームウェア指示制御モジュールとを含み、これには、加速度計と４つの赤外線（ＩＲ）センサとが含まれている。加速度計は、密度に応じた細胞画分の層別化が正しい重力で起こることを保証し、ＩＲセンサは、所定量のＲＢＣがカートリッジの枯渇コンパートメントに移送され、所定量のＭＮＣ、血小板及び血漿がカートリッジの採取コンパートメントに移送されることを保証する。処理システムは、流出液から過剰の赤血球、潅流液、血漿及び顆粒球を枯渇させることが可能となり得る。処理システムはまた、流出液からのＭＮＣの８０％超を含む濃縮細胞画分（以下のデータに示す通り）を分離することも可能である。単核細胞集団（一般に「バフィーコート」と呼ばれる）を含有する血漿画分、ＲＢＣ画分及び濃縮細胞画分をカートリッジの各々からチューブに取り出し、更なる試験及び分析のためにラベル付けした。

例示的かつ非限定的な試験プロトコルを以下に説明する。
１）ＲＩＡ吸込みキャニスタから、生理食塩水で希釈された抗凝固処理済みの流出液４８０ｍＬ（２カートリッジの手技）又は９６０ｍＬ（４カートリッジの手技）をデカントする。
２）流出液サンプルを完全に混合し、ラベル付けしたチューブに１０ｍＬ以上、収集する（試験用に保管する）
３）社内分析のために更に３つの１ｍＬサンプルを収集する。
４）流出液の１ｍＬチューブ１本につき２回、Ｓｙｓｍｅｘ読取り値を取得する（脂肪含有量が原因で読取りが異常である場合がある）。
５）流出液の他の２本の１ｍＬチューブを４００×ｇで５分間スピンさせる。上清を除去し、ペレットを軽く叩き、１ｍＬの食塩水に細胞を懸濁する。各チューブの２つのＳｙｓｍｅｘ読取り値を取得し、スピンされていない流出液の読取り値と比較する。
６）スピンされていない流出液の重複フローサイトメトリー分析を取得する（以下の説明を参照）。
７）流出液サンプルを完全に混合し、２台又は４台のＳｙｎＧｅｎＸ−２０００ ＤＣに２００〜２４０ｍＬの流出液を装填する。
８）プログラムされた制御モジュールにカートリッジを取り付け、遠心分離機でカートリッジを処理する。
９）両方のカートリッジからバフィーコートを採取し（それぞれ約７〜１０ｍＬ）、ラベル付けしたコニカルチューブ内で組み合わせる。
１０）バフィーコートチューブを完全に混合し、更なる分析のために１ｍＬのサンプルを収集する。
１１）試験のために残りのバフィーコートを保管する。
１２）バフィーコートの２つのＳｙｓｍｅｘ読取り値を取得する。総有核細胞（ＴＮＣ）の濃度が高すぎて正常な読取りが得られない場合、必要に応じてバフィーコートを食塩水で希釈し、更に２つのＳｙｓｍｅｘ読取り値を取得する。希釈率（Ｘ）を下の表に記録する。
１３）バフィーコートの重複フローサイトメトリー分析を取得する（以下の説明を参照）。バフィーコートをＳｙｓｍｅｘ読取りのために希釈した場合、希釈したサンプルを使用する。バフィーコートが希釈されていない場合は、サンプルをそのままで使用する。
１４）両方のカートリッジから血漿を収集し、ラベル付けしたコニカルチューブ内で組み合わせる。
１５）血漿を完全に混合し、社内分析のために１ｍＬのサンプルを収集する。
１６）試験のために、ラベル付けしたチューブに残りの１２ｍＬ以上の血漿を保管する。
１７）血漿の２つのＳｙｓｍｅｘ読取り値を取得する。
１８）血漿の重複フローサイトメトリー分析を取得する（以下の説明を参照）。
１９）両方のカートリッジからＲＢＣを収集し、ラベル付けしたコニカルチューブ内で組み合わせる。
２０）ＲＢＣチューブを完全に混合し、社内分析のために１ｍＬのサンプルを収集する。
２１）試験のために、ラベル付けしたチューブに残りの１ｍＬ以上のＲＢＣを保管する。
２２）ＲＢＣの２つのＳｙｓｍｅｘ読取り値を取得する。ＴＮＣの濃度が高すぎて正常な読取りが得られない場合、必要に応じてＲＢＣを食塩水で希釈し、更に２つのＳｙｓｍｅｘ読取り値を取得する。希釈率（Ｘ）を下の表に記録する。
２３）ＲＢＣの重複フローサイトメトリー分析を取得する。ＲＢＣをＳｙｓｍｅｘ読取りのために希釈した場合、希釈したサンプルを使用する。ＲＢＣが希釈されていない場合は、サンプルをそのままで使用する。

所望の濃縮細胞画分及び望まれていない細胞画分のフローサイトメトリー分析のためのプロトコルは以下の通りである。
１）Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（ＢＤ）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔから１０本のＴｒｕＣｏｕｎｔチューブを入手する。
２）各チューブに「Ｐｒｅ−１」、「Ｐｒｅ−２」、「Ｐｏｓｔ−１」、「Ｐｏｓｔ−２」、「Ｐｌａｓｍａ−１」、「Ｐｌａｓｍａ−２」、「ＲＢＣ−１」、「ＲＢＣ−２」、「Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｐｒｅ」、及び「Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｐｏｓｔ」とラベル付けする。
３）各チューブの側面に記載されているＴｒｕＣｏｕｎｔビーズカウントを下の表に記録する。
４）試験されるサンプルが入手可能でありかつ準備ができている場合にのみチューブを調製する。
５）サンプルを分析する準備が完了すると、キットからＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓボトルの２０μＬと７−ＡＡＤの２０μＬを各チューブ（アイソタイプの対照チューブを除く）に、底部の金属板のすぐ上で加える。
６）アイソタイプの対照チューブに、２０μＬのＰＥ−抗マウスＩｇＧ抗体、２０μＬのＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ４５抗体、及び２０μＬの７−ＡＡＤを底部の金属板のすぐ上で加える。
７）試験サンプル（「Ｐｒｅ」流出液、「Ｐｏｓｔ」バフィーコート、血漿、又はＲＢＣサンプル）を完全に混合し、先端が金属板又はチューブの側面に触れないようにして１００μＬのサンプルを対応する２本のチューブに金属板のすぐ上で加える。「Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｐｒｅ」チューブに対しては「Ｐｒｅ」流出液を加え、「Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｐｏｓｔ」チューブに対しては「Ｐｏｓｔ」バフィーコートを加える。
８）チューブを短時間ボルテックスし、室温で２０分間暗所に置く。
９）チューブをインキュベートしながら、キットから３ｍＬの１０倍の溶解緩衝液を２７ｍＬのＤＩ水に加えることによって、コニカルチューブ中に３０ｍＬの１倍の溶解緩衝液を調製する。チューブを混合する。
１０）各チューブに２ｍＬの１倍の溶解緩衝液を加え、チューブが再キャップされていることを確認し、短時間ボルテックスして混合する。
１１）室温で１０分間暗所に置く。
１２）分析する準備が完了するまで、直ちに暗所で氷上に置き、１時間以内に分析する。
１３）ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６コンピュータ上のＣＤ３４／４５分析ワークスペースを使用して、各サンプルを分析する。
１４）ＴＮＣカウント、ＭＮＣカウント、ＣＤ３４カウント、生存率、フローサイトメータによるビーズカウント、及びフローサイトメータによって処理された体積を以下の表に記録する。
１５）次の式を用いて、１ｍＬ当たりのＴＮＣ、ＭＮＣ及びＣＤ３４細胞の濃度を決定する。

１６）サンプルの総体積に上記で決定した濃度を乗算することによって、ＴＮＣ、ＭＮＣ、ＣＤ３４細胞、及びＣＤ４５細胞の総数を決定する。
１７）重複した「Ｐｒｅ」、「Ｐｏｓｔ」、「Ｐｌａｓｍａ」、及び「ＲＢＣ」チューブの平均を決定する。
１８）「Ｐｏｓｔ」平均値対「Ｐｒｅ」平均値、「Ｐｌａｓｍａ」平均値対「Ｐｒｅ」平均値、及び「ＲＢＣ」平均値対「Ｐｒｅ」平均値におけるＴＮＣ、ＭＮＣ、ＣＤ３４、及びＣＤ４５細胞の回収率を決定する。

前処理された流出液、血漿、ＲＢＣ、及びバフィーコートの各々のサンプルを、他の試験に加えてフローサイトメトリー分析に付し、そのデータを以下に示す。

細胞回収データ
表１のデータは、平均してＭＮＣの９２％超、流出液中に存在していたＣＤ３４＋細胞のほぼ９９％が濃縮細胞画分中に回収されたことを示している。これらの値は、９０．０％を超える物質収支値を有する実験のみを含む実験２〜１０（それぞれ９４．６％及び〜１００％）に関して更に高くなっている。本明細書で用いられるとき、「物質収支」は、収集されたＲＩＡ流出液の全量に存在する標的細胞の総数とパーセンテージとして比較した、実験サイクルの終わりに（米国特許第８，７４７，２８９号に記載されている使い捨て型処理カートリッジの）採取チャンバ、赤血球枯渇チャンバ及び主処理チャンバで回収された標的細胞の数として定義される。報告された回収値は、チャンバ内にあるＲＩＡ流出液中の標的細胞の初期数の９５％〜１０５％の範囲内で信頼できるものである。

回収された細胞の生存率
７−アミノアキシノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）は、細胞生存性染色液として使用される蛍光化合物である。７−ＡＡＤは無傷の細胞膜を容易には通過せず、したがって、試験すると、損傷した膜を有する細胞は７−ＡＡＤで染色され、無傷の細胞膜を有する生きた細胞は依然として暗色である。

アネキシンＡ５は、細胞表面上でホスファチジルセリン（ＰＳ）を発現している細胞、アポトーシスにおいて見出される事象、並びに他の形態の細胞死を検出するための非定量的プローブとして使用される。アネキシンＡ５親和性アッセイは通常、適切な緩衝液中でアネキシンＶと蛍光若しくは酵素ラベル、ビオチン若しくは他のタグ、又は放射性元素のコンジュゲートを用いる。アッセイは、ＰＳ及びＰＥ膜事象のアネキシンＶ染色を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）又は７−アミノアクチノマイシンＤ（ＡＡＤ−７）による細胞核内のタンパク質の染色と組み合わせたものであり、アポトーシス細胞及び壊死細胞から生存細胞を区別する。検出はフローサイトメトリーによって行われる。

前処理された流出液から得たサンプルをバフィーコートのサンプルと比較した。

表２の試験データは、採取した細胞の生存率が流出液の処理全体を通して維持されることを実証している。

回収された細胞の濃度
表３のデータは、採取量及びＭＮＣ回収率が患者間で一貫していることを示しており、したがって、細胞濃度は患者の変動性のみに起因する。

試験データは、１０^６／ｍｌの範囲の値を有する単核細胞濃度を示している。

図２に示すように、表３の試験データは、実験２〜１０における９０％超のＭＮＣ回収率及び９４％超のＣＤ３４＋回収率を示している。患者１からの流出液は分析しなかった。

ファインフィルタからの骨細片回収
実験１〜５にわたってフィルタの粗残留物から自己骨移植片を取得した。自己骨移植片のサンプル（抗凝固物質あり及びなし）を細胞生存率について試験した。データを以下の表４に示す。抗凝固物質を含む自己骨移植片のサンプルは、抗凝固物質を含まないサンプルよりも有意に高い細胞数を有することが示された。

コロニー形成カウント
図３に示すデータ並びに以下の表５に示すデータは、採取されたＭＮＣ濃縮物のコロニー形成能がＲＩＡ流出液自体よりも大きい（約１．５〜３５倍）ことを示している。更に、データはまた、細胞分離が不完全であった（平均ＭＮＣ回収率未満）実験７を除いて、コロニー形成細胞が他の構成層（例えば、ＲＢＣ層及び上清層）ではなく、濃縮細胞画分内のほぼ全体に存在することを示している。

態様
本開示は次の態様を含む。

態様１．骨形成性骨移植片を調製する方法であって、
長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料を採取する工程と、
ある量の細胞材料に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有する採取されたある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む、方法。

態様２．抗凝固化合物は流出液の中へと連続的に導入される、態様１に記載の方法。

態様３．抗凝固化合物は、重量で約２部〜約１０部の範囲の流出液対抗凝固化合物の比率で導入される、態様２に記載の方法。

態様４．抗凝固化合物は流出液の中へと比例的に導入される、態様２又は３のいずれかに記載の方法。

態様５．抗凝固化合物の比例的導入は、流出液と抗凝固物質との静的混合である、態様４に記載の方法。

態様６．抗凝固物質化合物は、流出液に配管された固定容積の硬質容器に収容されている、先の態様のいずれか１つに記載の方法。

態様７．抗凝固化合物は軟質容器に収容され、標準的なタケノコ継手を介して静的ミキサの真空ラインに接続されている、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。

態様８．抗凝固化合物は、Ｙ字型継手を介して真空ラインに接続されたラインを通して導入される、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。

態様９．抗凝固化合物は乱流混合によって導入される、態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。

態様１０．抗凝固物質化合物は、正圧を誘発するように蠕動ポンプを使用して導入される、態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。

態様１１．抗凝固物質化合物は、重力の影響下で滴注として導入される、態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。

態様１２．抗凝固化合物は、軟質容器に加えられる圧力の影響下でポンピングによって導入される、態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。

態様１３．流出液を収集するのに先立って流出液を濾過する工程を更に含む、態様１〜１２のいずれか１つに記載の方法。

態様１４．濾過する工程は流出液から粗残留物を除去する、態様１３に記載の方法。

態様１５．粗残留物からのある量の自己骨移植片を保持する工程を更に含む、態様１４に記載の方法。

態様１６．流出液を収集する工程は、まず中間収集点において収集する工程と、その後に処理収集点において収集する工程とを含む、態様１〜１５のいずれか１つに記載の方法。

態様１７．濃縮細胞画分は、採取された細胞材料の単核細胞集団の少なくとも８０％を含有する、態様１〜１６のいずれか１つに記載の方法。

態様１８．濃縮細胞画分は、採取された細胞材料の単核細胞集団の少なくとも９０％を含有する、態様１〜１７のいずれか１つに記載の方法。

態様１９．骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を骨伝導性又は骨誘導性マトリックスと組み合わせる工程を含む、態様１〜１８のいずれか１つに記載の方法。

態様２０．骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片又は合成骨代用材である、態様１９に記載の方法。

態様２１．骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を自己骨移植片と組み合わせる工程を含む、態様１５に記載の方法。

態様２２．骨形成性骨移植片を調製する工程は、濃縮細胞画分を二次自己骨移植片と組み合わせる工程を含み、二次自己骨移植片は、採取部位とは異なる解剖学的部位から得られるものである、態様１〜２１のいずれか１つに記載の方法。

態様２３．追加量の抗凝固物質を骨形成性骨移植片に加える工程を更に含む、態様１〜２２のいずれか１つに記載の方法。

態様２４．骨形成性骨移植片を骨欠損部に付ける工程を更に含む、態様１〜２３のいずれか１つに記載の方法。

態様２５．それらの工程のすべてが、１回の手技において術中に実施される、態様１〜２４のいずれか１つに記載の方法。

態様２６．採取する工程は、潅注流を含む外科用リーミングデバイスを用いて髄内管を潅注する工程を含む、態様１〜２５のいずれか１つに記載の方法。

態様２７．抗凝固化合物は潅注流の中へと連続的に導入される、態様２６に記載の方法。

態様２８．骨形成性骨移植片を調製する方法であって、
ある量の細胞材料を採取する工程と、
長骨の髄内管から採取された単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、抗凝固化合物を含有する採取されたある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、濃縮細胞画分は単核細胞集団と抗凝固化合物とを含む、工程と、
濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む、方法。

態様２９．流出液は脂肪粒子を含み、濃縮細胞画分を分離する工程は、脂肪粒子を濃縮細胞画分から分離する、態様１〜２８のいずれか１つに記載の方法。

態様３０．濃縮細胞画分のうちの１つ以上の部分を抗凍結剤と組み合わせる工程を更に含む、態様１〜２９のいずれか１つに記載の方法。

態様３１．骨形成性骨移植片組成物であって、
髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、
抗凝固化合物と、を含む、骨形成性骨移植片組成物。

態様３２．骨伝導性又は骨誘導性マトリックスを更に含む、態様３１に記載の骨形成性骨移植片組成物。

態様３３．骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片、合成骨代用材、若しくは自己骨移植片、又はそれらの組み合わせである、態様３２に記載の骨形成性骨移植片組成物。

態様３４．骨移植片組成物中の単核細胞集団の濃度は１×１０^６／ｍＬ〜約１０００．０×１０^６／ｍＬの範囲である、態様３１〜３３のいずれか１つに記載の骨形成性骨移植片組成物。

態様３５．抗凝固化合物は、ヘパリン、ＡＣＤＡ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ、及びビバラルジン、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、態様３１〜３４のいずれか１つに記載の骨形成性骨移植片組成物。

態様３６．骨移植片組成物中の抗凝固化合物の濃度は、１時間超にわたって凝結を阻止するのに十分なものである、態様３１〜３５のいずれか１つに記載の骨形成性骨移植片組成物。

態様３７．骨形成性骨移植片組成物であって、
髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、
抗凝固化合物と、から本質的になる、骨形成性骨移植片組成物。

態様３８．骨形成性骨移植片組成物であって、
髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、
抗凝固化合物と、
骨伝導性又は骨誘導性マトリックスと、から本質的になる、骨形成性骨移植片組成物。

態様３９．抗凍結剤を更に含む、態様３６の骨形成性骨移植片組成物。

態様４０．骨形成性骨移植片組成物であって、
髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、抗凝固化合物と、抗凍結剤と、から本質的になる、骨形成性骨移植片組成物。

以上、本開示を複数の実施形態に基づいて説明したが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、例えば添付の特許請求の範囲に示されるような様々な変更、代替及び改変を本明細書において行い得る点が理解されるはずである。したがって、本開示の範囲は本明細書で説明するプロセス、製造、物質の組成、方法及び工程の特定の実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。例えば、一実施形態による上記に述べたような様々な特徴は、特に断らないかぎりは他の実施形態に取り入れることができる。更に、当業者であれば本開示から容易に認識されるように、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うか又は実質的に同じ結果を実現する既存の、又は将来的に開発されるプロセス、製造、物質の組成、方法、又は工程を本開示に基づいて利用することが可能である。

当業者であれば、添付の特許請求の広義の範囲から逸脱することなく、本発明に様々な改変及び修正を行うことができることを理解するであろう。これらのうちのいくつかは上記で検討されており、その他は、当業者には明らかとなるであろう。

〔実施の態様〕
（１） 骨形成性骨移植片を調製する方法であって、
長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、前記抗凝固化合物を含有する前記ある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
前記流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、前記濃縮細胞画分は前記単核細胞集団と前記抗凝固化合物とを含む、工程と、
前記濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む、方法。
（２） 骨形成性骨移植片を調製する方法であって、
長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料を採取する工程と、
前記ある量の細胞材料に抗凝固化合物を導入する工程と、
収集点において、前記抗凝固化合物を含有する採取された前記ある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
前記流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、前記濃縮細胞画分は前記単核細胞集団と前記抗凝固化合物とを含む、工程と、
前記濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む、方法。
（３） 前記抗凝固化合物は前記流出液の中へと連続的に導入される、実施態様１又は２に記載の方法。
（４） 前記抗凝固化合物は、重量で約２部〜約１０部の範囲の流出液対抗凝固化合物の比率で導入される、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
（５） 前記抗凝固化合物は前記流出液の中へと比例的に導入される、実施態様１又は２に記載の方法。

（６） 前記抗凝固化合物の前記比例的導入は、前記流出液と前記抗凝固物質との蛇行混合である、実施態様５に記載の方法。
（７） 前記流出液を収集するのに先立って前記流出液を濾過する工程を更に含む、実施態様１〜６のいずれかに記載の方法。
（８） 濾過する工程は前記流出液から粗残留物を除去する、実施態様７に記載の方法。
（９） 前記粗残留物からのある量の自己骨移植片を保持する工程を更に含む、実施態様８に記載の方法。
（１０） 前記流出液を収集する工程は、まず中間収集点において収集する工程と、その後に処理収集点において収集する工程とを含む、実施態様１〜９のいずれかに記載の方法。

（１１） 前記濃縮細胞画分は、前記細胞材料の前記単核細胞集団の少なくとも８０％を含有する、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１２） 前記濃縮細胞画分は、前記細胞材料の前記単核細胞集団の少なくとも９０％を含有する、実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１３） 前記骨形成性骨移植片を調製する工程は、前記濃縮細胞画分を骨伝導性又は骨誘導性マトリックスと組み合わせる工程を含む、実施態様１〜１２のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片又は合成骨代用材である、実施態様１３に記載の方法。
（１５） 前記骨形成性骨移植片を調製する工程は、前記濃縮細胞画分を、前記自己骨移植片を含む骨伝導性又は骨誘導性マトリックスと組み合わせる工程を含む、実施態様９に記載の方法。

（１６） 前記骨形成性骨移植片を調製する工程は、前記濃縮細胞画分を二次自己骨移植片と組み合わせる工程を含み、前記二次自己骨移植片は、前記採取部位とは異なる解剖学的部位から得られるものである、実施態様２、又は実施態様２に従属する実施態様３〜１５のいずれかに記載の方法。
（１７） 追加量の抗凝固物質を前記骨形成性骨移植片に加える工程を更に含む、実施態様１〜１６のいずれかに記載の方法。
（１８） 前記骨形成性骨移植片を骨欠損部に付ける工程を更に含む、実施態様１〜１７のいずれかに記載の方法。
（１９） 前記工程のすべてが、１回の手技において術中に実施される、実施態様１〜１８のいずれかに記載の方法。
（２０） 前記採取する工程は、潅注流を含む外科用リーミングデバイスを用いて髄内管を潅注する工程を含む、実施態様２、又は実施態様２に従属する実施態様３〜１９のいずれかに記載の方法。

（２１） 前記抗凝固化合物は前記潅注流の中へと連続的に導入される、実施態様２０に記載の方法。
（２２） 前記抗凝固物質の前記導入は、前記濾過の上流側である、実施態様７に記載の方法。
（２３） 前記抗凝固物質の前記導入は、前記濾過の下流側である、実施態様７に記載の方法。
（２４） 骨形成性骨移植片組成物であって、
髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、
抗凝固化合物と、を含む、骨形成性骨移植片組成物。
（２５） 骨伝導性又は骨誘導性マトリックスを更に含む、実施態様２４に記載の骨形成性骨移植片組成物。

（２６） 前記骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片、合成骨代用材、若しくは自己骨移植片、又はそれらの組み合わせである、実施態様２５に記載の骨形成性骨移植片組成物。
（２７） 前記骨移植片組成物中の前記単核細胞集団の濃度は１．０×１０^６／ｍＬ〜約１０００．０×１０^６／ｍＬの範囲である、実施態様２４〜２６のいずれかに記載の骨形成性骨移植片組成物。
（２８） 前記抗凝固化合物は、ヘパリン、ＡＣＤＡ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ、及びビバラルジン、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様２４〜２７のいずれかに記載の骨形成性骨移植片組成物。
（２９） 前記骨移植片組成物中の前記抗凝固化合物の濃度は、１時間超にわたって凝結を阻止するのに十分なものである、実施態様２４〜２８のいずれかに記載の骨形成性骨移植片組成物。

Claims (29)

1. 骨形成性骨移植片を調製する方法であって、
   長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料の中に抗凝固化合物を導入する工程と、
   収集点において、前記抗凝固化合物を含有する前記ある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
   前記流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、前記濃縮細胞画分は前記単核細胞集団と前記抗凝固化合物とを含む、工程と、
   前記濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む、方法。
2. 骨形成性骨移植片を調製する方法であって、
   長骨の髄内管からの単核細胞集団を含むある量の細胞材料を採取する工程と、
   前記ある量の細胞材料に抗凝固化合物を導入する工程と、
   収集点において、前記抗凝固化合物を含有する採取された前記ある量の細胞材料を含む流出液を収集する工程と、
   前記流出液から濃縮細胞画分を分離する工程であって、前記濃縮細胞画分は前記単核細胞集団と前記抗凝固化合物とを含む、工程と、
   前記濃縮細胞画分から骨形成性骨移植片を調製する工程と、を含む、方法。
3. 前記抗凝固化合物は前記流出液の中へと連続的に導入される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記抗凝固化合物は、重量で約２部〜約１０部の範囲の流出液対抗凝固化合物の比率で導入される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記抗凝固化合物は前記流出液の中へと比例的に導入される、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記抗凝固化合物の前記比例的導入は、前記流出液と前記抗凝固物質との蛇行混合である、請求項５に記載の方法。
7. 前記流出液を収集するのに先立って前記流出液を濾過する工程を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 濾過する工程は前記流出液から粗残留物を除去する、請求項７に記載の方法。
9. 前記粗残留物からのある量の自己骨移植片を保持する工程を更に含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記流出液を収集する工程は、まず中間収集点において収集する工程と、その後に処理収集点において収集する工程とを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記濃縮細胞画分は、前記細胞材料の前記単核細胞集団の少なくとも８０％を含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記濃縮細胞画分は、前記細胞材料の前記単核細胞集団の少なくとも９０％を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記骨形成性骨移植片を調製する工程は、前記濃縮細胞画分を骨伝導性又は骨誘導性マトリックスと組み合わせる工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片又は合成骨代用材である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記骨形成性骨移植片を調製する工程は、前記濃縮細胞画分を、前記自己骨移植片を含む骨伝導性又は骨誘導性マトリックスと組み合わせる工程を含む、請求項９に記載の方法。
16. 前記骨形成性骨移植片を調製する工程は、前記濃縮細胞画分を二次自己骨移植片と組み合わせる工程を含み、前記二次自己骨移植片は、前記採取部位とは異なる解剖学的部位から得られるものである、請求項２、又は請求項２に従属する請求項３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 追加量の抗凝固物質を前記骨形成性骨移植片に加える工程を更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記骨形成性骨移植片を骨欠損部に付ける工程を更に含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記工程のすべてが、１回の手技において術中に実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記採取する工程は、潅注流を含む外科用リーミングデバイスを用いて髄内管を潅注する工程を含む、請求項２、又は請求項２に従属する請求項３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記抗凝固化合物は前記潅注流の中へと連続的に導入される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記抗凝固物質の前記導入は、前記濾過の上流側である、請求項７に記載の方法。
23. 前記抗凝固物質の前記導入は、前記濾過の下流側である、請求項７に記載の方法。
24. 骨形成性骨移植片組成物であって、
    髄管由来の単核細胞集団を含む濃縮細胞画分と、
    抗凝固化合物と、を含む、骨形成性骨移植片組成物。
25. 骨伝導性又は骨誘導性マトリックスを更に含む、請求項２４に記載の骨形成性骨移植片組成物。
26. 前記骨伝導性又は骨誘導性マトリックスは、同種移植片、合成骨代用材、若しくは自己骨移植片、又はそれらの組み合わせである、請求項２５に記載の骨形成性骨移植片組成物。
27. 前記骨移植片組成物中の前記単核細胞集団の濃度は１．０×１０^６／ｍＬ〜約１０００．０×１０^６／ｍＬの範囲である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の骨形成性骨移植片組成物。
28. 前記抗凝固化合物は、ヘパリン、ＡＣＤＡ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ、及びビバラルジン、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の骨形成性骨移植片組成物。
29. 前記骨移植片組成物中の前記抗凝固化合物の濃度は、１時間超にわたって凝結を阻止するのに十分なものである、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の骨形成性骨移植片組成物。

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