JP2018523492A - 低毒性感染症の検出及び治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年7月24日に出願された米国仮特許出願第62/196,508号の優先権の利益を主張するものであり、その全容は、本明細書において参照により援用される。
DMS=18.71−11.24*log10(miR−29a−3p)+10.4*log10(miR−574−3p)。
(1)天然椎間板組織の3つの試料から誘導されたNP細胞は、P.acnes(PA)(顔面座瘡から誘導されたATCC 6919)を介して、または感染した椎間板組織から直接に誘導されたPAを介して、他の細菌種(例えば、E.coli、Staphylococcus、Corynebacterium)に感染する。
(2)さまざまな時点で、細菌細胞内の発生をサイトカイン応答、及びDAPI蛍光色素で評価する。
(3)細胞内空間内の細菌によって誘発されたマイクロRNAプロファイルを同定する。第1のプロファイル(プロファイル1a)は、全ての細菌種に共通のプロファイルであり、第2のプロファイル(プロファイル1b)は、組織試料内の汚染検出用のP.acnesまたはE.coliなどに特異的なプロファイルである。
(4)NP細胞培養物の感染後のさまざまな時点において、マイクロRNAプロファイル(プロファイル1a、及びプロファイル1b)を同定する。急性感染症のモデルとして、試料固定に先立って起こる汚染(例えば、インビトロ汚染信号)を示すプロファイルを同定する際には、30〜60分用いる場合がある。慢性感染症をモデリングして、慢性感染症を示すプロファイルを同定する場合には、長期(例えば、1日間、7日間、及び21日間)にわたるインキュベーションが用いられる。
(1)チェコ共和国において約500例の登録患者が椎間板手術を受け、手術時点、ならびに6週間、6か月間及び12か月間のフォローアップで、臨床データが収集される。
(2)各組織試料は、以下の3つの部分に分けられる。
1.細菌DNA事象のDNA精製、及びqPCR評価用。メタゲノム手法用に、DNAを抽出直後に−80℃で貯蔵する。
2.マイクロRNAプロファイルのRNA精製及びqPCR評価用。安定化溶液(RNAlater)を用い、RNAを採取する。
3.微生物評価用に、室温にて組織をできるだけ早急に微生物学部門に移送する。今後の研究に備えて、血漿及び尿もまた採取し、−80℃で貯蔵する。
(3)試料1をDNA精製に使用し、全ての試料においてP.acnesのDNAをqPCRにより定量する。加えて、Staphylococciなどの他の細菌種を定量できる。
(4)培養及びqPCRの両方で陽性である試料については、多重PCR及び/またはシークエンシングで、コロニー及び椎間板組織中のPA菌株を同定する。汚染を排除するために、同じ菌株を同定する必要がある。培養及びqPCRで、同じ菌株に対して陽性の試料はマイクロRNAプロファイリングに対して基準陽性であると見なされる。
(5)培養で陰性、及びqPCR(例えば、PA、Staphylococci)で陰性(あるいは、陰性試料が存在しない場合、低レベルの陽性)の試料は、マイクロRNAプロファイリングに対して基準陰性であると見なされる。
(6)PA陽性×20例、Staphylococci陽性×10例、及び陰性×30例を、マイクロRNAプロファイリング用に使用する。
(7)椎間板組織における細菌の発生に関連する共通のマイクロRNAプロファイルを、PA×20例及びStaph×10例とその対照である陰性試料×30例に由来するマイクロRNAプロファイルと比較することによって同定する。PA+の20例及びStaph+の10例と、その対照である陰性試料とを、別個に比較することによって、細菌に特異的なプロファイルを特定する。
(8)インビトロマイクロRNAシグニチャとインビボマイクロRNAシグニチャとの比較を行う。
試料500例中、培養ではN例の陽性患者、qPCRではN1例の陽性患者が存在し、同定されたマイクロRNAシグニチャに基づいて診断アルゴリズムが開発され、miRNAシグニチャにより患者N3例が陽性とされるであろう。
患者コホート、及び基準P.acnes試料の定義
平均年齢44±13歳の患者326例(男性186例、及び女性140例)が、前向き研究に登録した。臨床的に明らかな術後椎間板炎を発症した患者はいなかった。ゴールドスタンダードの定量的な細菌培養を行ってP.acnes数を算出し、リアルタイムPCRを行って、椎間板組織検体内のゲノム数を検出した。細菌培養及びリアルタイムPCRに用いられた手技については、「方法」の節で詳述する。培養では130例(40%)がP.acnes陽性であった。P.acnes計数は100〜9000CFU/mlの範囲に及び、その中央値は400CFU/mlであった。リアルタイムPCRで、P.acnesゲノムは、98例(30%)において検出不可能であった。P.acnes陽性228例の椎間板組織内のP.acnesゲノムの数は2〜4531の範囲に及び、その中央値は256ゲノム/総DNA500ngであった。培養(≧103CFU/ml、75パーセンタイル)及びリアルタイムPCR(DNA500ng中、ゲノム500例以上、75パーセンタイル)の両方で、P.acnes含量の多いことによって特徴づけられる椎間板組織試料が、基準P.acnes陽性例(N=45、14%)と見なされた。他方、細菌培養及びリアルタイムPCRの両方で陰性の試料は、基準P.acnes陰性例(N=72.22%)として使用された。これらのP.acnes基準症例は、3相バイオマーカー研究において、グローバルマイクロRNAの発現プロファイリング、診断マイクロRNAの同定、ならびに診断マイクロRNAスコア(DMS)の検証及び開発に使用された。
Exiqon製リアルタイムPCRベースの技術を使用して、基準P.acnes陽性の椎間板組織の12例及びP.acnes陰性試料×12例において、マイクロRNAの754例の発現プロファイリングを遂行した。1群中の平均Ct(閾値サイクル)が35未満であるmiRNAのみを、統計的評価の対象とした。マイクロRNAの発現量をRNU38Bに対して正規化した。「方法」の節に記載されているように、P.acnes陽性及び陰性の椎間板組織試料中、マイクロRNA×20例がそれぞれ異なった様式で発現した(表4に要約されている)。
本方法に記載されているように、我々は、個別マイクロRNAの発現アッセイ(Life Technologies)、及び2つの基準遺伝子用アッセイを使用して、発見フェーズからの16候補miRNA、ならびに35椎間板組織試料中のRNU38B及びRNU48(基準P.acnes陽性15例、及び基準陰性20例)の発現量を特定した。マイクロRNAの発現量を、2つの基準遺伝子(RNU38B、及びRNU48)の平均値に対して相対的に定量した。全ての試料が、Ct(RNU38B)<34且つ/またはCt(RNU48)<31で、品質管理に合格した。P.acnes陽性及び陰性の椎間板組織試料において、発現量が有意に異なることが確認されたマイクロRNAは5つ存在し、それらのうち2つは、多重仮説検定に対しP値を調整した後でさえも依然として有意であった(表5、図4)。
miR−29a−3p=2−(Ct(miR−29a−3p)−平均(Ct(RNU48)、及びCt(RNU38B)))
miR−574−3p=2−(Ct(miR−574−3p)−平均(Ct(RNU48)、及びCt(RNU38B)))
式1:
DMS=18.71−11.24*log10(miR−29a−3p)+10.4*log10(miR−574−3p)
個々のマイクロRNAの発現アッセイ(Life Technologies)、及び基準遺伝子に対するアッセイを使用してmiR−29a−3p及びmiR−574−3pの発現量を定量し、トレーニングフェーズと同様にDMS、RNU38B及びRNU48を構成した。独立した58例(基準P.acnes陽性18例、基準陰性40例)におけるDMSの適用によって、その分析性能が高度であることが確認され、試料の分類精度が95%に達し、従ってP.acnesの状態に比例していることが明らかにされた(表6及び表7、図6)。しかも、コアグラーゼ陰性Staphylococci(CoNS)陽性培養による椎間板組織試料の10例はDMS陰性であり、P.acnesに対するDMSの特異性を示しているか、あるいは少なくとも、DMSが椎間板組織内で二番目に最も頻繁に観察された微生物(CoNS)の存在による影響を受けないことを示している(図7)。
Ct(miR−29a−3p)=25.02;Ct(miR−574−3p)=31.35;Ct(RNU38B)=31.58;Ct(RNU48)=28.76
品質管理:Ct(RNU38B)<34且つCt(RNU48)<31の場合、RNA試料は有効である。
miR−29a−3p=2−(25.02−(28.76+31.58)/2)=35.5062
miR−574−3p=2−(31.35−(28.76+31.58)/2)=0.4414
DMS(id4)=18.71〜11.24*log10(35.5062)+10.4*log10(0.4414)=−2.41
DMS(id4)=−2.41<DMS((陽性カットオフ)=−0.01の場合、試料はP.acnes陽性である。
[試料ID30−陰性]
Ct(miR−29a−3p)=26.49;Ct(miR−574−3p)=31.73;Ct(RNU38B)=32.43;Ct(RNU48)=30.07
品質管理:Ct(RNU38B)<34且つCt(RNU48)<31の場合、RNA試料は有効である。
miR−29a−3p=2−(26.49−(30.07+32.43)/2)=27.0959
miR−574−3p=2−(31.73−(30.07+32.43)/2)=0.7170
DMS(id30)=18.71〜11.24*log10(27.0959)+10.4*log10(0.7170)=1.1
DMS(id30)=1.1>DMS((陽性カットオフ)=−0.01の場合、試料はP.acnes陰性である。
臨床上の決定を行う目的で、P.acnesに感染した椎間板を使用し、その診断(細菌の培養及び/またはリアルタイムPCR)に標準の方法を適用すれば、1/3を超える患者が、潜在的に有害な抗生物質治療を感染することなしに受けることとなる。多大な時間を必要とし、且つかなり汚染され易い標準の診断技法は、これを、分析性能を有するDMSで完全に置き換えることができ得る。それによって、脊髄疾患患者におけるこれらの不必要な有害処置を防ぐための解決策が得られる。
患者:
組み入れ基準としては、感覚欠損有りもしくは無しの腰椎または腰仙部神経根障害で、相関する腰椎または仙骨神経根の分布において対応する臨床的に意義ある運動障害を伴うもの(撮像基準を参照)、あるいは保守的な手段では治り難い神経根痛(坐骨神経痛または大腿骨痛)を伴うもの、下肢伸展挙上陽性試験、皮膚分節感覚欠損、筋緊張運動障害及び/または深部腱反射低下などの身体検査所見に合致すること、最新式磁気共鳴映像方法によるもしくはコンピュータ断層装置による腰仙脊髄の撮像に、臨床的に罹患した神経根及び身体的検査と相関する分布にて遊離髄核隔離または椎間板ヘルニア/突起が示されることが含まれていた。除外基準としては、共存感染もしくは免疫無防備状態、手術以前の月におけるコルチコステロイドまたは抗生物質の使用、トラウマ、未知の放射線量、炎症性関節炎、または他のリウマチ性疾患の診断が含まれていた。収集された疫学データ及び臨床データは、性別、年齢、椎間板疾患部、ヘルニアの種類、既往の脊髄手術の有病率、硬膜外ステロイド注射、術後椎間板炎の発症に関するものであった。書面によるインフォームド・コンセントが、各患者から得られた。本研究は、施設内審査委員会(IRB)により承認された。
ポビドンヨードの3組調製物を手術部位にこすり付けて、標準の滅菌技術を使用してドレープした。全ての症例において皮膚切開前に標準の周術期抗生物質を投与した。セファゾリンが、ほとんどの症例において投与される標準の抗生物質であった。ペニシリンアレルギーのある患者では、バンコマイシンまたはクリンダマイシンのいずれかが投与された。皮膚切開の対象となる厳密な位置を術中X線透視で案内し、後部正中アプローチを用いて鋭的剥離及び電気焼灼を行った。自家保定牽引子(カスパル型)が配置された後、手術用顕微鏡の下で、Penfield解剖器具及びKerrison骨鉗子を用い、必要に応じて黄色靱帯を切除した。横断神経根を穏やかに収縮させて、椎間板ヘルニアを露出させ、環状欠損部の近くの椎間板腔において髄核の残存疎性断片と共に摘出した。全ての組織試料を、汚染を最小限に抑える方法で取り扱い、密閉した滅菌済の試料カップ内で保持した後、標識化の対象として現場に渡し、実験室に移送した。実験室で、椎間板組織試料が更に分析された。我々は、摘出標本からできるだけ多くの材料を得ようと試みたので、試料サイズを精密には測定せず、3×3×5〜10×5×5mmと概測した。処理前に試料を凍結せず、手術後2〜4時間以内に培養が確立された。
個別包装された滅菌済のガンマ線照射メス、及び滅菌済のガンマ線照射ペトリ皿を使用して、新鮮な椎間板組織試料をより小さな断片に切断した。これらの断片のうちの1つを2mlのDNA非含有の微量遠心分離管に入れて、P.acnesのDNA分析処理を行うまで−80℃で貯蔵した。クラス2の生物学的安全キャビネット内で、滅菌乳棒、及び無菌石英砂(粒径:0.1〜0.5mm;Penta,Czech Republic)を入れた乳鉢、ならびに無菌状態の生理食塩水を用いて、組織の処理及び均質化を行った。均質化された組織試料を、7%ヒツジ血液及びビタミンKを補給したWilkins Chalgren Anaerobic Agar(Hi Media Laboratories,India)に接種した。接種されたプレートを、Anaerobic Work Station(Ruskinn Technology,UK)内で、37℃にて好気的に(窒素80%、CO210%、及びH210%)14日間インキュベートし、細菌の増殖を評価した。試料中の細菌の量は、ホモジネート1ml中のコロニー形成単位(CFU)として表された。Rapid ANA II System(Remel,USA)を使用して、MALDI−TOF(microflex(商標)LTMALDI−TOF System+ソフトウェア+バクテリアスペクトルライブラリ、Bruker Corp.)で、生化学的に細菌を同定した。
凍結した組織試料(湿潤重量の中央値:130mg、範囲:20〜180mg)を解凍し、新たに開封した滅菌済の針、メス及びピンセット一組を使って小型断片に切断して、滅菌済の2ml微量遠心分離管に移した。500μlのATL緩衝液(Qiagen,Germany)に50μlのプロテイナーゼK(20mg/ml)(Qiagen)を溶解した溶液中に、組織試料の小断片を更に懸濁させて、サーモミキサーの中で56℃、650rpmで一晩消化させた。一連の並列処理済の試料のそれぞれに対し滅菌水入りの管をラボ汚染対照として使用し、組織の消化からDNA単離、リアルタイムPCR分析までを、全ラボプロセスに従って行った。QIAamp UCP Pathogen Mini Kit(Qiagen)を使用して、メーカーの指示書に記載されているとおりに、DNAを抽出した。Nanodrop 2000(Thermofischer,USA)を使用し、あるいはDNA濃度が5ng/μl未満の試料用に蛍光色素及びQubit 3.0蛍光光度計(Life Technologies,USA)使用して、DNAの濃度を分光測定で測定した。
前述のリアルタイムPCRアッセイを、P.acnesの16S rRNA遺伝子の131−bp領域を増幅するために以下のプライマーを使用して実施した::フォワードプライマー5’−GCGTGAGTGACGGTAATGGGTA−3’(配列番号1)、リバースプライマー5’−TTCCGACGCGATCAACCA−3’(配列番号2)及びTaqManプローブ5’−AGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCG−3’(配列番号20)。PCR反応混合物15-μl中には、DNA試料6,75μl、各プライマー5pmol、及びTaqManプローブ2pmol、ならびに1X TaqMan遺伝子発現Master Mix(Life Technologies,USA)が含有されていた。QuantStudio 12K Flexシステム(Life Technologies,USA)を、熱サイクリングプロファイル(50℃で2分間、95℃で10分間、ならびに95℃で15秒間及び60℃で1分間の50サイクル)にて使用した。合成されたP.acnesアンプリコン(131bp)(Integrated DNA Technologies,USA)の6とおりの濃縮物(10〜106コピー)の複製5つを用いて作成された内部標準曲線で、試料中のP.acnesゲノム当量を推定した。上述のラボ汚染対照、及びPCR陰性対照を、全てのそれぞれのPCR反応に含めた。試料ごとにアッセイを2回ずつ行い、16S rRNA遺伝子コピーの平均数を計算した。ラボ汚染を排除するため、ラボ汚染対照において検出された16S rRNA数を、組織試料中のコピー数から減算した。P.acnes中の16S rRNAオペロン(3コピー/細胞)のコピーの既知数を使用して、各試料中の細菌ゲノムの数を最終的に計算し、椎間板組織試料から抽出された総DNA500ng中の細菌ゲノム数として表した。標本品質及び核酸抽出、ならびに阻害増幅プロセスの評価を可能にするため、ヒトのβグロビン遺伝子を内部対照として含めた。
凍結した組織試料を解凍し(湿潤重量の中央値:100mg、範囲:20〜145mg)、滅菌済の針、メス及びピンセット一組を使って小型断片に切断し、滅菌済の2ml微量遠心分離管に移した。500μlのATL緩衝液(Qiagen,Germany)に50μlのプロテイナーゼK(20mg/ml)(Qiagen)を溶解した溶液中に、組織試料の小断片を更に懸濁させて、56℃にて650rpmで一晩消化させた。miRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して、メーカーの指示書に記載されているとおりに、マイクロRNA及び他の小型RNAを含めた総RNAを抽出した。Nanodrop 2000(Thermofischer,USA)を使用し、あるいはRNA濃度を5ng/μl未満の試料用に蛍光色素、及びQubit 3.0蛍光光度計(Life Technologies,USA)を使用して、RNAの濃度を分光測定で測定した。
MicroRNA Ready-to-Use PCR Panels(Exiqon,Vedbaek,Denmark)を使用して、miRNAの発現プロファイリングを実行した。データ正規化用に、2枚1組のカード(Human Panel I+II、V4.M)を使用して、ヒトmiRNA×752例及び内在性コントロール×6例を定量できるようにした。Universal cDNA Synthesis Kit(Exiqon,Vedbaek,Denmark)及び総RNA100ngを使用し、標準のプロトコールに従って、第一鎖cDNAの合成を実行した。その後、ExiLENT SYBR Greenマスターミックス、及びマイクロRNAに特異的なPCR増幅プライマーを使用して、リアルタイムPCR増幅を行い、且つLNA(商標)(Exiqon,Vedbaek,Denmark)を用いて最適化した。QuantStudio 12K Flexシステム(Life Technologies,USA)を使用して、最終的な測定を実行した。
TaqMan MicroRNA Assayプロトコール(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)に従い、遺伝子に特異的なプライマーを使用して、総RNAから相補性DNAを合成した。逆転写酵素反応を行うため、RNA試料10ng、50nMのステムループRTプライマー、RT緩衝液×1、各dNTP0.25mM、MultiScribe逆転写酵素3.33Uμl−1、及びRNase阻害剤0.25Uμl−1(いずれも、TaqMan マイクロRNA Reverse Transcription Kitより、Applied Biosystems製、Foster City,CA,USA)を使用した。反応混合物(10μl)を、16℃で30分間、42℃で30分間、85℃で5分間インキュベートし、続いて4℃にて保持した(T100(商標)Thermal Cycler;Bio−Rad,Hercules,CA,USA)。QuantStudio 12K Flex リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)を使用して、リアルタイムPCRを実行した。PCR反応混合物20-μl中には、RT製品1.33μl、1×TaqMan(NoUmpErase UNG)Universal PCR Master Mix及びプライマー1μl、ならびにTaqMan MicroRNA Assayキットのプローブミックス(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)が含まれていた。反応物を96ウェルの光学プレートで95℃にて10分間インキュベートし、続いて、95℃にて15秒間、及び60℃にて1分間のインキュベートを40サイクル行った。使用したマイクロRNAアッセイはmiR−574−3p(ID:002349)、miR−29a−3p(ID:002112)、miR−497−5p(ID:001043)、miR−29c−3p(ID:000587)、miR−99b−5p(ID:000436)、miR−195−5p(ID:000494)、miR−28−5p(ID:000411)、miR−30a−3p(ID:000416)、miR−146b−5p(ID:001097)、miR−34a−3p(ID:002316)、miR−140−3p(ID:002234)、miR−125a−5p(ID:002198)、miR−423−5p(ID:002340)、miR−125b−5p(ID:000449)、miR−28−3p(ID:002446)、miR−125b−2−3p(ID:002158)である。基準遺伝子の定量には、RNU38B(ID:001004)及びRNU48(ID:001006)の、2とおりのアッセイを使用した。
閾値サイクルデータを、SDS 2.0.1ソフトウェア(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)で計算した。個々のマイクロRNAリアルタイムPCR反応をいずれも3回ずつ実行した。測定された全てのmiRNAの平均発現量を、グローバルマイクロRNAの発現プロファイリングではRNU38Bを使用し、個々のマイクロRNAの測定においてはRNU38BとRNU48との平均を用いて正規化した。続いて、発現量を2−ΔCt方法により分析した。Exiqon製microRNA Ready−to−Use PCR Panelに付属している6種の可能な遺伝子による標準geneNormアルゴリズム及びNormFinderアルゴリズムを併用して、RNU38B(SNORD38B)を内在性対照として選択した。1群中の平均Ct(閾値サイクル)が35未満であるmiRNAのみを、統計的評価の対象とした。P.acnes陽性例及びP.acnes陰性例中、分析されたmiRNAのレベル間の統計的差異をノンパラメトリックのマン・ホイットニー検定で評価し、多重仮説検定用にBenjamimi−Hochberg補正を施した。個々のマイクロRNAの発現量を、2つの基準遺伝子(RNU38B、及びRNU48)の平均値に対して相対的に定量した。Ct(RNU38B)>34且つ/あるいはCt(RNU48)>31に該当する試料を、本研究から除外した。診断マイクロRNAスコア(DMS)式を、miR−29a−3p及びmiR−574−3p発現量の線型組み合わせに基づいて作成した。ROC分析を通して、P.acnes陽性例とP.acnes陰性例とを判別するための最適なカットオフ値を得た。GraphPad Prismバージョン7.00(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)を使用して計算を行った。0.05未満のP値は、統計的に有意であると見なされた。
Claims (94)
- 患者における低毒性感染症の検出方法であって、
低毒性感染症の原因となる片利共生微生物が患者試料中に存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験することと、
前記試料由来のRNAプロファイルを低毒性感染症を示すRNAシグニチャについて評価して、偽陽性及び/または偽陰性と真正の低毒性感染症とを判別することと
を含む、前記方法。 - 前記患者が炎症状態の症状を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記炎症状態の症状が、変性椎間板疾患(DDD)、慢性腰痛(CLBP)、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍、前立腺炎、前立腺癌から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項2または3に記載の方法。
- 前記試料が椎間板組織である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項5に記載の方法。
- 前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項6に記載の方法。
- 前記患者が慢性腰痛(CLBP)及び/または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 手術時に前記試料が採取される、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料の一部にPropionibacterium acneが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中にStaphylococcus種、Corynebacterium種、Lactobacillus種、Pseudomonas種、Enterococcus種、Streptococcus種、Bacillus種、Citrobacter種、E.coli,Moraxella種、Haemophilus種、Neisseria種、Clostridium種、Entrobacter種、及びKlebsiella種のうちの1種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料の少なくとも一部が消化され、DNAが単離される、請求項12または13に記載の方法。
- 前記片利共生微生物のDNAが増幅される、請求項14に記載の方法。
- 前記試料中の前記片利共生微生物(複数可)が、PCR、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーションもしくはメタゲノム分析で検出または定量される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、感染性臨床試料由来のRNAプロファイル及び非感染性臨床試料由来のRNAプロファイルでトレーニングされる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記片利共生微生物の存在に対して試験結果が陽性(すなわち高含量)である臨床試料、及び前記片利共生微生物の存在に対して試験結果が陰性(すなわち低含量)である臨床試料由来のRNAプロファイル用いて、RNAシグニチャをトレーニングする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記片利共生微生物が存在するかどうかが、定量的PCRまたはシークエンシング(培養、免疫化学法、分光法もしくはインサイチュ・ハイブリダイゼーションの少なくとも1つを用いたもの)から任意選択的に選択される少なくとも2つの検出方法により判別される、請求項18に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、片利共生微生物及び非感染性細胞に感染した細胞培養からのRNAプロファイルでトレーニングされたクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞培養がNP細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャがマイクロRNAシグニチャである、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、長いノンコーディングRNAシグニチャであり、任意選択的にlncRNA、lincRNAまたはT−UCRの1つ以上を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、小型ノンコーディングRNAを含み、任意選択的にpiRNA、snRNA、snoRNA、及びcircRNAの1つ以上を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャがmRNAシグニチャである、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が片利共生病原体にインビトロ感染する、請求項20または21に記載の方法。
- 慢性感染症をモデリングするため、前記細胞を少なくとも1週間インビトロ感染させる、請求項26に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、100以下のRNA、または75以下のRNA、または50以下のRNA、または25以下のRNA、または10以下のRNA、または5以下のRNA、または4以下のRNAの相対的発現を含む、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、2つまたは3つのRNAの相対的発現を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記RNAが、表2から選択されるmiRNAである、請求項29または30に記載の方法。
- 前記RNAが、表4、表5、または図8から選択されたmiRNAである、請求項29または30に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、miR−29a−3p及びmiR−574−3pの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項29〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 手術時に陽性試料に対して局所抗生物質または消毒剤リンスが施される、請求項11に記載の方法。
- 手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項11に記載の方法。
- 手術後に陽性試料に対して経口、IVまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項10に記載の方法。
- 臨床組織試料中の片利共生微生物の低毒性感染症を検出する方法であって、前記方法が、
前記組織中のmiRNAプロファイルを検出することと、
低毒性感染症を示すmiRNAシグニチャに対して前記miRNAプロファイルを評価することと
を含み、
前記miRNAシグニチャは、少なくとも2つの検出方法で前記片利共生微生物の存在に対して陽性(すなわち高含量)である組織試料由来のmiRNAプロファイル、及び前記少なくとも2つの方法で前記片利共生微生物の存在に対して陰性(すなわち低含量)である組織試料由来のmiRNAプロファイルを用いてトレーニングされる、前記方法。 - 前記検出方法が、核酸増幅、DNAシークエンシング、微生物培養、免疫化学法、分光法及びインサイチュ・ハイブリダイゼーションから選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記検出方法が定量的PCR及び微生物培養である、請求項38に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、10以下のRNA、または5以下のRNA、または4以下のRNAの相対的発現を含む、請求項37〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、2つまたは3つのRNAの相対的発現を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記RNAが、表2から選択されるmiRNAである、請求項41または42に記載の方法。
- 前記RNAが、表4または表5から選択されるmiRNAである、請求項41または42に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、miR−29a−3p及びmiR−574−3pの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記患者が、慢性腰痛(CLBP)、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍から選択される炎症状態を有する、請求項37〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記試料が椎間板組織である、請求項47に記載の方法。
- 前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項48に記載の方法。
- 前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項49に記載の方法。
- 前記患者が慢性腰痛(CLBP)及び/または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項46〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項46〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 手術時に前記試料が採取される、請求項37〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項37〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中にPropionibacterium acneが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を更に試験する、請求項37〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中にStaphylococcus種、Corynebacterium種、Lactobacillus種、Pseudomonas種、Enterococcus種、Streptococcus種、Bacillus種、Citrobacter種、E.coli、Moraxella種、Haemophilus種、Neisseria種、Clostridium種、Entrobacter種、及びKlebsiella種のうちの1種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項37〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料の一部が消化され、DNAが単離される、請求項47または48に記載の方法。
- DNAが増幅される、請求項57に記載の方法。
- 前記試料中の前記片利共生微生物(複数可)が、PCR、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、及びメタゲノム分析の1つ以上で検出または定量される、請求項55〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中に前記片利共生病原体が存在するかどうかが他の技法では試験されない、請求項37に記載の方法。
- 前記試料中に前記片利共生病原体が存在するかどうかがPCR及び/または培養では試験されない、請求項37に記載の方法。
- 手術時に陽性試料に対して局所抗生物質または消毒剤リンスが施される、請求項37に記載の方法。
- 手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項37に記載の方法。
- 手術後に陽性試料に対して経口、IVまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項37に記載の方法。
- 低毒性感染症の治療方法であって、低毒性感染症を有すると判定された患者に抗生物質を投与することを含み、前記低毒性感染症が、前記部位からの細胞中のRNAシグニチャの存在によって検出され、前記RNAシグニチャが低毒性感染症を示す、前記方法。
- 前記患者において前記片利共生微生物が存在することが、任意選択的にPCR、培養、または顕微鏡検査のうちの1つ以上で、低毒性感染症の症状を呈する部位から採取された試料中に検出される、請求項65に記載の方法。
- 前記抗生物質が局所的に前記部位に投与される、請求項65に記載の方法。
- 前記抗生物質が全身的に投与される、請求項67に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャは、少なくとも2つの検出方法で前記片利共生微生物に対して陽性である組織試料由来のRNAプロファイル、及び前記少なくとも2つの方法で前記片利共生微生物に対して陰性である組織試料由来のRNAプロファイルを用いてトレーニングする、請求項65〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出方法が、核酸増幅、DNAシークエンシング、微生物培養、免疫化学法、分光法及びインサイチュ・ハイブリダイゼーションから選択される、請求項69に記載の方法。
- 前記検出方法が定量的PCR及び微生物培養である、請求項70に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項65〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、10以下のRNA、または5以下のRNA、または4以下のRNAの相対的発現を含む、請求項65〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAシグニチャが、2つまたは3つのRNAの相対的発現を含む、請求項73に記載の方法。
- 前記RNAが、表2から選択されるmiRNAである、請求項73または74に記載の方法。
- 前記RNAが、表4または表5から選択されるmiRNAである、請求項73または74に記載の方法。
- 前記核酸シグニチャが、miR−29a−3p及びmiR−574−3pの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記患者が、慢性腰痛(CLBP)、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍から選択される炎症状態の症状を有する、請求項65〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記試料が椎間板組織である、請求項65に記載の方法。
- 前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項80に記載の方法。
- 前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項81に記載の方法。
- 前記患者が慢性腰痛(CLBP)及び/または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項78〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項78〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 手術時に前記試料が採取される、請求項78〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項78〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中にPropionibacterium acneが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を更に試験する、請求項65〜86のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中にStaphylococcus種、Corynebacterium種、Lactobacillus種、Pseudomonas種、Enterococcus種、Streptococcus種、Bacillus種、Citrobacter種、E.coli、Moraxella種、Haemophilus種、Neisseria種、Clostridium種、Entrobacter種、及びKlebsiella種のうちの1種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項65〜87のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料の一部が消化され、DNAが単離される、請求項87または88に記載の方法。
- 前記片利共生微生物のDNAが増幅される、請求項89に記載の方法。
- 前記試料中の前記片利共生微生物(複数可)が、PCR、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、及びメタゲノム分析の1つ以上で検出または定量される、請求項87〜90のいずれか1項に記載の方法。
- 手術時に陽性試料に対して局所抗生物質が施される、請求項65に記載の方法。
- 手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項65に記載の方法。
- 手術後に陽性試料に対して経口、IVまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項65に記載の方法。
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