JP2018523474A - サルモネラ血清型ｄ１の迅速な検出のための組成物および方法 - Google Patents

サルモネラ血清型ｄ１の迅速な検出のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、（例えば、食品、環境試料、生物学的試料、またはその他の材料の中の）サルモネラを検出するための迅速で正確な方法を特色とする。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2015年7月20日に出願された米国仮特許出願第62/194,640号に基づく優先権を主張する。この出願の全内容が、参照によって本明細書に組み入れられる。
発明の背景
サルモネラは、世界中の食品由来疾患の最も一般的な病原体のうちの一つである。それは、ヒトおよび動物の両方において多数の感染の原因となる。実際、サルモネラは、世界中で毎年およそ9380万のヒト感染および155,000の死亡を引き起こす。サルモネラ感染は、動物またはヒトの糞便によって汚染された肉、卵、および生鮮品のような食物の摂取に関連している。サルモネラ病の主因は、鳥肉および卵である。サルモネラの蔓延を防止することの重要性を認識して、2014年に、米国FDAが、サルモネラを検出するための改善された方法を開発するよう米国科学者に喚起した。食品中のサルモネラを検出する現在の方法は、困難で、高価で、多くの時間を要する。サルモネラによって汚染された食品が動物またはヒトの食物連鎖に入るのを防止するため、迅速で正確な検出法が緊急に必要とされている。
下記のように、本発明は、（例えば、食品、環境試料、生物学的試料、またはその他の材料の中の）サルモネラを検出するための迅速で正確な方法を特色とする。
一つの局面において、本発明は、試料中のサルモネラを検出する方法を特色とする。本法は、核酸分子の等温増幅を許容する条件の下で、ニッキング酵素、dNTP、検出可能プローブ、およびポリメラーゼの存在下で、サルモネラ核酸分子に特異的に結合する順方向プライマーおよび逆方向プライマーと試料とを接触させる工程、ならびに試料中のサルモネラ由来アンプリコンを検出する工程を含み、以下の標的配列：
Figure 2018523474
を検出する。
別の局面において、本発明は、試料中のサルモネラを検出する方法を特色とする。本法は、Nt.BstNBI（NEB）ニッキング酵素、dNTP、Bst DNAポリメラーゼI、および以下の配列：
Figure 2018523474
を有する検出可能プローブの存在下で、それぞれ以下の配列：
Figure 2018523474
を有する順方向プライマーおよび逆方向プライマーと試料とを接触させる工程；ならびに
サルモネラアンプリコンの存在または欠如を検出する工程であって、サルモネラアンプリコンの存在によって試料中のサルモネラが同定される、工程を含む。
別の局面において、本発明は、以下の順方向プライマー：
Figure 2018523474
および逆方向プライマー：
Figure 2018523474
（配列中、「m」は修飾の位置を示す）より選択されるプライマーを特色とする。
別の局面において、本発明は、順方向プライマー：
Figure 2018523474
および逆方向プライマー：
Figure 2018523474
（配列中、「m」は修飾の位置を示す）より選択される順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含有しているプライマーの対を特色とする。
別の局面において、本発明は、以下の配列：
Figure 2018523474
のうちの一つを含有しているプローブを特色とする。
別の局面において、本発明は、プライマーが以下の配列：
Figure 2018523474
を含有しており、検出可能プローブが以下の配列：
Figure 2018523474
を含有している、プライマーおよびプローブの組み合わせを特色とする。
別の局面において、本発明は、ニッキング酵素、dNTP、ポリメラーゼ、
順方向プライマー：
Figure 2018523474
および逆方向プライマー：
Figure 2018523474
（配列中、「m」は修飾の位置を示す）より選択される順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに
以下の配列：
Figure 2018523474
のうちの一つを含有しているプローブを含有しているキットを特色とする。
別の局面において、本発明は、ニッキング酵素、dNTP、ポリメラーゼ、
以下の配列：
Figure 2018523474
を含有しているプライマー、および
以下の配列：
Figure 2018523474
を含有している検出可能プローブ
を含有しているキットを特色とする。
本明細書に詳述された本発明の上記の局面または他の局面の様々な態様において、試料は、食品、環境試料、生物学的試料、またはその他の材料を含有している。前記の局面の具体的な態様において、食品は、動物またはヒトの消費用である。前記の局面の他の態様において、食品は、コンパニオンアニマルの消費用のペットフードである。前記の局面のさらに他の態様において、食品は、農産物、鳥肉、魚、もしくは牛肉であるかまたはそれらに由来する。前記の局面のさらに他の態様において、環境試料は、水、土壌、下水、肥料、または表面スワブ試料である。前記の局面のさらに他の態様において、生物学的試料は、糞便または血液試料である。前記の局面のさらに他の態様において、試料は、培養培地である。前記の局面のさらに他の態様において、表面スワブ試料は、ブーツスワブ、ハンドルのスワブ、装置もしくは機械類のスワブ、家禽小屋の内表面のスワブ、またはエッグベルト、デスカレーター、ファン、もしくは通路の表面のスワブである。
他の態様において、試料は、卵または卵製品である。さらに他の態様において、卵製品は、卵白および/または卵黄である。前記の局面の他の態様において、サルモネラは、血清型D1である。前記の局面のさらに他の態様において、サルモネラは、S エンテリティディス（enteriditis）、S チフィ（typhi）、S プローラム（pullorum）、S ダブリン（dublin）、S ガリナラム（gallinarum）、およびS センダイ（sendai）からなる群より選択される。
前記の局面のさらに他の態様において、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、
順方向プライマー：
Figure 2018523474
および逆方向プライマー：
Figure 2018523474
（配列中、「m」は修飾の位置を示す）からなる群より選択される。前記の局面のさらに他の態様において、アンプリコンは、以下の配列：
Figure 2018523474
のうちの一つを含有しているプローブによって検出される。前記の局面のさらに他の態様において、プローブは、蛍光成分およびクエンチャーを含有している。前記の局面のさらに他の態様において、蛍光成分は、FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、ROX、CalRed610nm、VIC、Cy5、およびCy3からなる群より選択され、クエンチャーは、5'Iowa Black（登録商標）RQ（5IabRQ）、ダブシル（dabcyl）、ダブシル（dabsyl）、およびBlack Hole Quencher2（BHQ2）からなる群より選択される。前記の局面のさらに他の態様において、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、それぞれ以下の配列：
Figure 2018523474
を含み、プローブは、以下の配列：
Figure 2018523474
を含有している。前記の局面のさらに他の態様において、ニッキング酵素は、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI（NEB）、Nb.Bpu10I（Fermantas）、Nb.BsmI（NEB）、Nb.BsrDI（NEB）、Nb.BtsI（NEB）、Nt.AlwI（NEB）、Nt.BbvCI（NEB）、Nt.Bpu10I（Fermentas）、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI（NEB）、Nt.BstNBI（NEB）、およびNt.CviPII（NEB）のうちの一つまたは複数である。前記の局面のさらに他の態様において、ポリメラーゼは、Bst DNA ポリメラーゼI、Gst DNAポリメラーゼI、Gka DNAポリメラーゼ I、SD DNAポリメラーゼ、およびそれらの誘導体または変異体である。前記の局面のさらに他の態様において、方法は、サルモネラの存在について圃場、作物、群れ、食物加工施設、および食物取扱い施設からなる群より選択される場所をモニタリングするために、定期的に使用される。前記の局面のさらに他の態様において、モニタリングは、約2週間毎、1ヶ月毎、3ヶ月毎、6ヶ月毎、9ヶ月毎、または12ヶ月毎に実施される。前記の局面のさらに他の態様において、修飾は、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アルキル、2'-アリル、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2'-ヒドロキシル（RNA）、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-(CH2)2-O-2'-架橋、および2'-O-(N-メチルカルバメート)からなる群より選択される。
本発明の他の特色および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明白になるであろう。
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参照は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書において使用されるように、他に特記されない限り、以下の用語は、下記の与えられた意味を有する。
「アンプリコン」とは、関心対象のポリヌクレオチドの増幅において生成されたポリヌクレオチドを意味する。一例において、アンプリコンは、サルモネラsefAポリヌクレオチドの少なくとも一部分を含む。
「塩基置換」とは、相補的なヌクレオチド鎖の間のハイブリダイゼーションの有意な混乱を引き起こさない核酸塩基ポリマーの置換基を意味する。
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有している（containing）」、および「有する（having）」等は、米国特許法において与えられた意味を有していてよく、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味することができ；「から本質的になる」または「本質的になる」は、同様に、米国特許法において与えられた意味を有し、その用語は、無制限であり、列挙されたものの基本的なまたは新規の特徴が、列挙されたもの以上の存在によって変化しない限り、列挙されたもの以上の存在を可能にするが、先行技術の態様は除外する。
「相補的な」または「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソンクリック型またはフーグスティーン型のいずれかの塩基対合によって、別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。相補的な塩基対合には、G-CおよびA-Tの塩基対合が含まれるのみならず、イノシンのようなユニバーサル塩基を含む塩基対合も含まれる。パーセント相補性とは、第2の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソンクリック型塩基対合）を形成することができる核酸分子内の連続残基の割合（％）を示す（例えば、第1のオリゴヌクレオチドの全部で10個のヌクレオチドのうちの5個、6個、7個、8個、9個、または10個のヌクレオチドが、10個のヌクレオチドを有する第2の核酸配列と塩基対合する場合、それは、それぞれ、50％、60％、70％、80％、90％、および100％相補的であることを表す）。パーセント相補性が少なくともある割合（％）であることを決定するため、第2の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソンクリック型塩基対合）を形成することができる核酸分子内の連続残基の割合（％）が計算され、最も近い整数に丸められる（例えば、第1のオリゴヌクレオチドの全部で23個のヌクレオチドのうちの12個、13個、14個、15個、16個、または17個のヌクレオチドが、23個のヌクレオチドを有する第2の核酸配列と塩基対合する場合、それは、それぞれ、52％、57％、61％、65％、70％、および74％を表し；それぞれ、少なくとも50％、50％、60％、60％、70％、および70％の相補性を有する）。本明細書において使用されるように、「実質的に相補的」とは、生物学的条件の下でハイブリダイズすることができるような鎖間の相補性をさす。実質的に相補的な配列は、60％、70％、80％、90％、95％、またはさらには100％の相補性を有する。さらに、生物学的条件の下で2本の鎖がハイブリダイズすることができるか否かを、ヌクレオチド配列を調査することによって決定する技術は、当技術分野において周知である。
「検出する」とは、検出される分析物の存在、欠如、または量を同定することをさす。一つの態様において、分析物はサルモネラポリヌクレオチドである。実施例において、本発明のアッセイは、本発明のマトリックスにおけるサルモネラの存在を検出する。
「検出可能プローブ」とは、関心対象のモエティに連結された時に、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段を介して関心対象のモエティを検出することを可能にする組成物を意味する。例えば、有用な検出可能モエティには、放射性同位体、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、（例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。一つの態様において、検出可能プローブは、分子ビーコンである。
「食品」とは、動物またはヒトの消費用の材料を意味する。
「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシーの条件の下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載された遺伝子）またはそれらの一部分の間で二本鎖分子が形成されることを意味する（例えば、Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507を参照すること）。ハイブリダイゼーションは、ワトソンクリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の水素結合であり得る水素結合によって、相補的な核酸塩基の間で起こる。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的な核酸塩基である。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてその遺伝子に隣接している遺伝子が除去されている核酸（例えば、DNA、RNA）を意味する。従って、その用語には、例えば、ベクター；自律複製性のプラスミドもしくはウイルス；もしくは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAへ組み込まれた組換えDNA；または他の配列と無関係の別の分子（例えば、PCRもしくは制限酵素消化によって作製されたcDNAもしくはゲノム断片もしくはcDNA断片）として存在する組換えDNAが含まれる。さらに、その用語には、DNA分子から転写されたRNA分子、および付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAが含まれる。
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、ネイティブ状態において見出される通常それに付随している成分が様々な程度に除去されている材料をさす。「単離する」とは、最初の起源または環境からのある程度の分離を意味する。「精製する」とは、単離より高度の分離を意味する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に物質的に影響を与えず、その他の有害な結果も引き起こさないよう、他の材料が十分に分離されている。即ち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって作製された時には、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地が、または化学合成された時には、化学的前駆物質もしくはその他の化学物質が、実質的に除去されている場合、精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じることを意味することができる。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受けることができるタンパク質については、異なる修飾が、異なる単離されたタンパク質を生じることができ、それらは別々に精製され得る。
「ニッキング剤」とは、二本鎖核酸分子内の特定の構造を認識しそれに結合し、その認識された特定の構造に結合することによって、一本の鎖において隣り合っているヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を破断し、それによって、ニック部位に先行する末端ヌクレオチドにおいて遊離の3'ヒドロキシル基を作出することができる化学エンティティを意味する。好ましい態様において、3'末端は、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによって伸長され得る。例示的なニッキング剤には、ニッキング酵素、RNAザイム、DNAザイム、および遷移金属キレート剤が含まれる。
本明細書において使用されるように、「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、および一本鎖型もしくは二本鎖型のそれらのポリマーをさす。その用語には、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、合成の、天然に存在する、天然に存在しない、公知の類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含有している核酸が包含される。そのような類似体の例には、非限定的に、2'修飾型ヌクレオチド（例えば、2'-O-メチル、2'-Fヌクレオチド）が含まれる。
「定期的」とは、規則的な間隔を意味する。定期的なモニタリングには、例えば、毎日、週2回、月2回、月1回、年2回、または年1回、投与される試験のスケジュールが含まれる。
「ポリメラーゼアレスト（polymerase-arresting）分子」とは、ポリヌクレオチド鋳型上のポリメラーゼの進行を防止するかまたは有意に低下させる、ポリヌクレオチド鋳型/プライマーに関連したモエティを意味する。好ましくは、そのモエティは、ポリヌクレオチドへ組み込まれる。一つの好ましい態様において、そのモエティは、鋳型上のポリメラーゼの進行を防止する。
「ポリメラーゼ伸長」とは、入って来るモノマーを鋳型ポリヌクレオチド上の結合パートナーとマッチさせるポリメラーゼの順方向の進行を意味する。
「参照」とは、標準条件または対照条件を意味する。
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および/またはその他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムが使用され得、e-3〜e-100の確率スコアが、密接に関連した配列を示す。
「特異的産物」とは、プライマーオリゴヌクレオチドの相補的な標的配列へのハイブリダイゼーションおよびその後のポリメラーゼによって媒介される標的配列の伸長から得られるポリヌクレオチド産物を意味する。
「特異的に結合する」とは、本発明のポリヌクレオチドには結合するが、試料、例えば、生物学的試料の中の他のポリヌクレオチドは実質的に認識せず結合しない本発明のオリゴヌクレオチドプローブを意味する。
「実質的に等温の条件」とは、単一の温度であるか、または有意に変動しない狭い温度範囲内にあることを意味する。
「標的核酸分子」とは、分析されるポリヌクレオチドを意味する。そのようなポリヌクレオチドは、標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。「標的核酸分子」という用語は、最初の標的配列のアンプリコンもさす。
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の値の全ての速記であることが理解される。例えば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。
特別に明示されるかまたは前後関係から明白でない限り、本明細書において使用されるように、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容差の範囲内、例えば、平均値の2標準偏差内と理解される。約とは、明示された値の10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.1％以内、0.05％以内、または0.01％以内と理解されてよい。そうでないことが前後関係から明白でない限り、本明細書に提供される数値は、全て、約という用語によって修飾されている。
本明細書における変項の定義における化学基のリストの列挙には、単一の基または列挙された基の組み合わせとしてのその変項の定義が含まれる。本明細書における変項または局面についての態様の列挙には、単一の態様または他の態様との組み合わせもしくはその一部分としてのその態様が含まれる。
本明細書に提供される組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれか一つまたは複数と組み合わせられてよい。
図1は、サルモネラsefA遺伝子の配列を提供する。標的配列領域は、下線付きの太字で示される。図1の下半分には、sefA遺伝子の配列の一部分が示される。矢印は、ニック認識部位ならびに順方向プライマーおよび逆方向プライマーおよびプローブの設計において使用された配列の位置を示す（プライマーおよびプローブの配列は図2に提供される）。 図2は、sefA標的配列領域を増幅するための例示的なプライマー配列、およびアンプリコンを検出するための例示的なプローブ配列を提供する。スモールキャピタル文字で示されたプローブ配列内の塩基は、ステム領域の一部であり、標的配列領域の一部分に相補的ではない塩基を示す。sefA標的配列領域は図1に示される。 図3は、sefA標的配列領域を増幅するための例示的なプライマー配列、およびアンプリコンを検出するための例示的なプローブ配列を提供する。sefA標的配列領域は図1に示される。各プライマーの「テール」領域は、下線付きの文字で示される。テール領域は、ニッキング酵素のための認識部位を含有しており、標的配列領域の一部分に相補的ではない。修飾を有する塩基は、太字で示される。 図4Aは、本明細書に記載された反応において使用される内部対照プローブの例示的な配列を提供する。内部対照プローブは、基質に対するニッキング酵素およびポリメラーゼの活性によって放出され蛍光を発することができる、消光されたフルオロフォアを有するニッキング反応および伸長反応のための核酸基質分子を含む。この点に関して、内部対照プローブは、ニッキング増幅反応に存在するニッキング酵素およびポリメラーゼ酵素の両方の活性についての対照を提供する。図4Bは、図4Aに示された配列を有する内部対照プローブが添加された、本明細書に記載された増幅反応から得られた結果を示す等温増幅プロットを提供する。 図5は、非凍結乾燥フォーマットでのDNAble D1群特異的サルモネラ検出アッセイを使用したサルモネラ・エンテリカ「sefA」領域の分析的検出限界（ALOD）を示す等温増幅プロットを提供する。図5に示された結果は、図3に示されたプライマーおよびプローブを使用して得られた。その反応は、細菌培養物1ml当たり5×103コロニー形成単位（CFU）が、25細胞（または25コピーのS エンテリカゲノム）/ DNAble反応（検出限界）に相当する、新鮮培養試料から精製されたゲノムDNAを使用した。反応は、サーモサイクラー（RocheサーモサイクラーLC480）において定量化された。図5中、「cp/rxn」は「コピー数/反応」をさし、「NTC」は「鋳型なし対照」をさす。 図6Aは、凍結乾燥フォーマットでのDNAble D1群特異的サルモネラ検出アッセイを使用したサルモネラ・エンテリカ「sefA」領域の分析的検出限界（ALOD）を示す等温の増幅プロットを提供する。図6Aに示された結果は、図3に示されたプライマーおよびプローブを使用して得られた。その反応は、精製されたゲノムDNAを使用した。反応は、AXXINリーダを使用して定量化された。図6A中、「cp/rxn」は「コピー数/反応」をさし、「NTC」は「鋳型なし対照」をさす。 図6Bは、図6Aに示された反応における内部対照の等温増幅プロットを提供する。反応は、AXXINリーダを使用して定量化された。 図7は、凍結乾燥フォーマットでのDNAble D1群特異的サルモネラ検出アッセイを使用したサルモネラ・エンテリカ「sefA」領域の検出（ALOD）を示す等温増幅プロットを提供する。図7に示された結果は、図3に示されたプライマーおよびプローブを使用して得られた。その反応は、細胞の粗調製物（未精製のゲノムDNA）を使用した。反応は、AXXINリーダを使用して定量化された。「NTC」は「鋳型なし対照」をさす。 図8は、DNAble D1群特異的サルモネラ検出アッセイを使用したサルモネラ・エンテリカ「sefA」領域の検出（ALOD）を示す等温増幅プロットを提供する。図7に示された結果は、図3および図4Aに示されたプライマーおよびプローブを使用して得られた。各プロットにおいて、濃い曲線は内部対照曲線である。「1:9」と示された上の列において、反応は、1:9の体積比で混合された卵および培地の混合物から得られた試料を使用した。「1:2」と示された上の列において、反応は、1:2の体積比で混合された卵および培地の混合物から得られた試料を使用した。卵試料は、トリプチックソイブロス（TSB）＋2％サプリメント中で一晩濃縮された。「NTC」は「鋳型なし対照」をさす。「1:2」反応および「1:9」反応において得られた結果の類似性は、アッセイの頑強性を示す。
発明の詳細な説明
下記のように、本発明は、試料（例えば、食品、環境試料、生物学的試料、またはその他の材料）の中のサルモネラを検出するための迅速で正確な方法を特色とする。
本発明は、食物、環境試料（例えば、水、土壌、下水、もしくはその他の廃棄物）、生物学的試料（例えば、糞便）、またはその他の試料を、等温ニッキング増幅反応を使用してアッセイすることによって、サルモネラを検出することができることの発見に、少なくとも一部、基づく。具体的には、食物または環境試料を等温ニッキング増幅反応を使用してアッセイすることによって、血清型D1型のサルモネラを検出することができる。
サルモネラ
サルモネラ種は、鞭毛を有するグラム陰性通性嫌気性菌である。現在の分類によって別々の種と見なされる1800を超える公知の血清型が存在する。本発明の態様において、サルモネラ血清型はD1である。サルモネラ血清型D1には、S エンテリティディス、S チフィ、S プローラム、S ダブリン、S ガリナラム、およびS センダイが含まれるが、これらに限定されるわけではない。最も一般的なヒトおよび動物の病原体には、S チフィ、S パラチフィ（paratyphi）-A、S スコットメレリ（schottmuelleri）、S コレレスイス（choleraesuis）、S チフィムリウム（typhimurium）、およびS エンテリティディス（enteritidis）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。最も一般的な保有動物は、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、およびウシであり；その他の多数の家畜および野生動物も、これらの生物を保有している。
サルモネラ症は、臨床的には、一般的なサルモネラ胃腸炎（下痢、腹部疝痛、および発熱）から、即座の抗生物質治療を必要とする重篤な熱性全身性疾病である（腸チフスを含む）腸熱にまで及ぶ。病巣感染および無症候性キャリア状態が存在する。サルモネラ症の最も一般的な型は、自己限定性の無併発性胃腸炎である。
食物において摂取された病原性サルモネラは、胃酸関門を通過しても生存し、小腸および大腸の粘膜に侵入し、毒素を産生する。上皮細胞への侵入は、炎症反応を誘導する炎症誘発性サイトカインの放出を刺激する。急性炎症応答は、下痢を引き起こし、潰瘍化および粘膜の破壊をもたらし得る。細菌は、腸から伝播され、全身性疾患を引き起こす場合がある。
核酸増幅方法
核酸増幅テクノロジーは、サルモネラの複雑な生物学的過程の理解、検出、同定、および定量化の手段を提供した。本発明は、等温ニッキング増幅反応においてDNAを増幅することによる試料中のサルモネラの検出を提供し、サルモネラの全ての血清型を検出するために設計される。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNA融解およびDNAポリメラーゼを使用したDNAの酵素的複製のための反応物の加熱および冷却の繰り返しのサイクルからなる、DNAを増幅するために使用される一般的なサーマルサイクリング依存性の核酸増幅テクノロジーである。リアルタイム定量的PCR（qPCR）は、生物学的試料中の所定の核酸配列のコピーの数を定量化するために使用される技術である。現在、qPCRは、反応の間中のリアルタイムでの反応産物の検出を利用し、増幅プロファイルを、各反応の開始時に既知の量の核酸（または未知の被験核酸に対する既知の相対比の核酸）を含有している対照の増幅と比較する。対照の結果は、典型的には、標準反応増幅曲線の対数部分に基づき、標準曲線を構築するために使用される。これらの値は、増幅曲線が標準対照量と比較される場所に基づき、未知物の量を内挿するために使用される。
PCRに加えて、以下のものを非限定的に含む、非サーマルサイクリング依存性の増幅系または等温核酸増幅テクノロジーが存在する：ニッキング増幅反応、ローリングサークル増幅（RCA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、ループによって媒介される増幅（LAMP）、鎖置換増幅（SDA）、転写によって媒介される増幅（TMA）、自家持続配列複製（3SR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）、シングルプライマー等温増幅（SPIA）、Qβレプリカーゼ系、およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）。
等温ニッキング増幅反応は、PCRサーモサイクリングとの類似性を有する。PCRと同様に、ニッキング増幅反応は、プライマーと呼ばれる、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を利用する。さらに、標的配列のニッキング増幅反応は、標準的なPCRの場合と同様に、標的配列の対数増加をもたらす。標準的なPCRと異なり、ニッキング増幅反応は等温で進行する。標準的なPCRにおいては、DNAの2本の鎖を分離させるため、温度が上げられる。ニッキング増幅反応においては、被験試料中に存在する特定のニッキング部位において、標的核酸配列にニックが入れられる。ポリメラーゼが、ニック部位に浸入し、既存の相補DNA鎖の置換と共に、ニックを入れられた標的ヌクレオチド配列（添加された外来性DNA）の相補鎖合成を開始する。鎖置換複製過程は、温度上昇の必要性を省く。この時点で、プライマー分子が、添加された外来性DNAから置換された相補配列にアニールする。ここで、ポリメラーゼが鋳型の3'末端から伸長し、以前に置換された鎖に相補的な鎖を作出する。次いで、第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、新たに合成された相補鎖にアニールし、ニッキング酵素認識配列を含むDNAの二重鎖を作成しながら伸長する。次いで、この鎖が、ニックを入れられ、その後、ポリメラーゼによる鎖置換伸長を受け、それによって、最初の標的DNAのいずれかの側にニック部位を有するDNAの二重鎖が作製される。これが合成された後、分子は、新しい鋳型分子による置換された鎖の複製を通して指数関数的に増幅され続ける。さらに、鋳型に導入されたニック部位におけるニックトランスレーション合成の作用の繰り返しを通して、各産物分子からも直線的に増幅が進行する。結果は、10分未満で増幅が起こる、PCRサーモサイクリングよりはるかに迅速な、標的シグナル増幅の極めて迅速な増加である。
ニッキング増幅アッセイ
本発明は、等温ニッキング増幅アッセイにおいて増幅されたサルモネラ標的核酸分子の検出を提供する。そのようなアッセイは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。例えば、各々その全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開2009/0081670、PCT出願2009/012246、米国特許第7,112,423号および第7,282,328号を参照すること。本明細書に記載された方法において有用なDNAポリメラーゼは、鎖置換活性と共に、標的核酸分子に結合したオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の3'ヒドロキシル末端および/または二本鎖DNA分子のニック部位における3'ヒドロキシル末端を伸長するため、ヌクレオチドの取り込みを触媒することができる。そのようなポリメラーゼは、また、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くかまたは実質的に低下した活性を有し、好熱性であるものを含み得る。6個の3'末端ヌクレオチドを含むプライマー領域に2'修飾型ヌクレオチドを有するプライマーを含む方法において有用なDNAポリメラーゼには、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くかまたは実質的に低下した活性を有し、鎖置換活性を有する、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）としても分類されるバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、ならびにゲオバチルス属を含む近縁の細菌株、単離物、および種から単離されたDNAポリメラーゼIの誘導体およびバリアントが含まれる。例示的なポリメラーゼには、Bst DNAポリメラーゼI、Gst DNAポリメラーゼI、またはGka DNAポリメラーゼIのラージフラグメントが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的なポリメラーゼには、SD DNAポリメラーゼ（Ignatov et al.,2014 Biotechniques,1;57(2):81-7.doi：10.2144/000114198）も含まれるが、これに限定されるわけではない。例示的なポリメラーゼには、本明細書に詳述されたポリメラーゼの誘導体または変異体も含まれる。
ニッキング酵素は、二本鎖DNAに結合し、二重鎖の一方の鎖を切断する。本発明の方法において、ニッキング酵素は、上の鎖（ニッキング剤認識部位の5'-3'配列を含む鎖）を切断する。本明細書に開示された本発明の具体的な態様において、ニッキング酵素は、認識部位の3'下流で上の鎖のみを切断する。例示的な態様において、反応は、産物配列がニッキング部位を含有しないよう、結合部位の下流で切断するかまたはニックを入れるニッキング酵素の使用を含む。結合部位の下流で切断する酵素の使用は、ポリメラーゼがニッキング酵素を置換する必要なしに、より容易に伸長することを可能にする。理想的には、ニッキング酵素は、ポリメラーゼと同一の反応条件の下で機能性である。例示的なニッキング酵素には、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI（NEB）、Nb.Bpu10I（Fermantas）、Nb.BsmI（NEB）、Nb.BsrDI（NEB）、Nb.BtsI（NEB）、Nt.AlwI（NEB）、Nt.BbvCI（NEB）、Nt.Bpu10I（Fermentas）、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI（NEB）、Nt.BstNBI（NEB）、およびNt.CviPII（NEB）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ニッキング酵素認識部位の配列は、表1に提供される。
（表１）ニッキング酵素認識配列
Figure 2018523474
ニッキング酵素には、制限エンドヌクレアーゼの切断活性を修飾することによって作出された改変型ニッキング酵素も含まれる（NEB expressions July 2006,vol 1.2）。制限エンドヌクレアーゼが、DNA内の認識配列に結合する時、各鎖を加水分解するための各酵素内の2個の触媒部位が、平行に進行する2個の独立の加水分解反応を駆動する。改変型制限酵素は、二重鎖の一方の鎖のみを加水分解して、切断されるのではなく「ニックを入れられた」DNA分子（3'-ヒドロキシル、5'-リン酸）を産生するよう改変されていてよい。ニッキング酵素には、修飾型CRISPR/Casタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、およびニッカーゼ活性を有するジンクフィンガーヌクレアーゼも含まれ得る。
ニッキング増幅反応は、典型的には、例えば、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）のようなヌクレオチドを含む。反応は、放射標識（例えば、32P、33P、125I、35S）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC））、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素を含むが、これらに限定されるわけではない検出可能モエティを含むdNTPの存在下で実施されてもよい。反応は、ニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を提供する、ある種の塩および緩衝液をさらに含む。
本発明は、前記のような増幅戦略を利用して、リアルタイムでニッキング増幅反応をモニタリングする方法を提供する。一つの態様において、定量的核酸増幅は、既知の量の対照増幅と平行の標的核酸増幅を利用する。標的核酸の量は、対照の起源（外的対照であるか内的対照であるか）に基づき、絶対的定量化または相対的定量化（半定量的）として計算され得る。例えば、基質分子を、既存のニッキング増幅反応に添加し、従って、ニッキング増幅反応における外的対照分子として使用することができる。基質分子は、基質に対するニッキング酵素およびポリメラーゼの活性によって放出され蛍光を発することができる消光されたフルオロフォアを有するニッキング反応および伸長反応のための核酸基質分子であり得る。この点に関して、外的対照分子は、ニッキング増幅反応に存在するニッキング酵素およびポリメラーゼ酵素の両方の活性についての対照を提供する。平行での実行を通して、外的対照反応は、第一の増幅反応に認識可能な程度に干渉しない。例えば、外的対照は、dNTPのような反応成分を大量に消費しない。外的対照は、非特異的なポリメラーゼ伸長およびバックグラウンド干渉をもたらし得る3'末端の形成を最小化するために設計されていてよい。外的対照分子は、特定の時間に開始するよう「調整」されていてもよい。未知のヌクレオチド配列の定量化は、反応の別々のセットもしくは同一の反応のいずれかにおける一連の既知の標的配列との未知物の対数閾値増幅の比較を通して；または陽性結果（未知物が閾値を越える場合）もしくは陰性結果（未知物が閾値を越えない場合）のいずれかを示す閾値を生ずる内部の内的もしくは外的な共増幅産物として達成され得る。
3'認識領域
本発明は、プライマー-標的形成が安定しており、サルモネラ核酸増幅反応性能を増強する可能性を有する3'認識配列を有するプライマーを提供する。3'認識領域は、サルモネラ核酸分子、例えば、サルモネラ核酸分子の相補配列に特異的に結合する。
具体的には、3'認識配列を有する本発明のプライマーは、ニッキング増幅アッセイにおいて有用である。さらに、サルモネラ標的特異的3'認識領域は、1個または複数個の2'修飾型ヌクレオチド（例えば、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アルキル、2'-アリル、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2'-ヒドロキシル（RNA）、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-ブリッジ、4'-(CH2)2-O-2'-ブリッジ、および2'-O-(N-メチルカルバメート)）を含む。理論に拘束はされないが、認識領域への1個または複数個の2'修飾型ヌクレオチドの組み込みは、プライマー/鋳型の分子間および/または分子内の相互作用（例えば、プライマー二量体形成）を低下させるかまたは排除し、それによって、等温増幅中のバックグラウンドシグナルを低下させるかまたは排除することが仮定される。2'修飾型ヌクレオチドは、好ましくは、標的配列と塩基対合する塩基を有する。具体的な態様において、サルモネラ標的特異的認識領域における2個以上の2'修飾型ヌクレオチド（例えば、2個、3個、4個、5個、またはそれ以上の2'修飾型ヌクレオチド）は、連続している（例えば、修飾型ヌクレオチドのブロック）。いくつかの態様において、2'修飾型ヌクレオチドのブロックは、標的特異的認識領域の3'末端に位置する。他の態様において、2'修飾型ヌクレオチドのブロックは、サルモネラ標的特異的認識領域の5'末端に位置する。2'修飾ヌクレオチドのブロックが標的特異的認識領域の5'末端に位置する時、2'修飾型ヌクレオチドは、1個または複数個の非修飾型ヌクレオチド（例えば、2個、3個、4個、5個、またはそれ以上の2'未修飾ヌクレオチド）によってニック部位から分離されていてよい。出願人は、1個もしくは複数個の2'修飾型ヌクレオチドまたは2'修飾型ヌクレオチドのブロックの位置が、増幅の速度論を改変することを見出した。1個もしくは複数個の2'修飾ヌクレオチドまたは2'修飾ヌクレオチドのブロックが認識領域の5'末端もしくはその近傍またはニック部位の近位に位置する時、リアルタイム増幅反応は、検出までの減少した時間を示した。さらに、シグナル曲線が縮小し、曲線の傾きがシフトした。
関連する態様において、1個または複数個の2'修飾型ヌクレオチドを有するプライマーの比を、反応の「調整」のため、検出までの時間および/または反応の効率を改変し、反応速度論の予測可能な調節をもたらすために使用することができる。認識配列の3'末端に1個または複数個の2'修飾ヌクレオチドを有するプライマーと、認識配列の5'末端に1個または複数個の2'修飾型ヌクレオチドを有するプライマーとの比の増加は、シグナル曲線を縮小させ、曲線の傾きをシフトさせた。反応を「調整」し、検出までの時間および反応の効率の両方を操作する手段を提供し得ることは有利である。内部対照を使用した相対的定量化は、2個の重要な条件が満たされることを必要とする。第1に、反応の検出までの時間を修飾して、非競合反応条件を作出し得ることが有益である。従って、（関心対象の標的と比べて）後の時点で検出可能であるよう対照反応に影響を与えることによって、対照反応は、関心対象の標的が低い初期量で存在する時ですら、関心対象の特異的標的を打ち負かすことがない。第2に、真の相対量計算を確実にするため、対照反応および特異的標的反応はマッチした効率を有することが必要とされる。「調整」条件を使用して各反応の効率を調節することによって、十分な相対的定量化計算を可能にするよう反応をマッチさせることが可能になる。反応の調整は、定量的PCR（qPCR）において、標的核酸増幅および参照核酸増幅（例えば、内部標準）の効率をマッチさせるために使用され得る。さらに、標的核酸増幅および内部標準増幅のために同一の効率を提供しながら、増幅産物の検出の時間が分離されるよう、標的核酸および内部標準の増幅曲線を改変することができる。反応内のオリゴヌクレオチド構造の特定の組み合わせおよび比の使用を通して、調整された反応性能を可能にする条件を作出することが可能である。
標的核酸分子
本発明の方法および組成物は、被験試料中のサルモネラ核酸分子の増幅および/または同定のために有用である。標的配列は、サルモネラ核酸分子を含む事実上任意の試料から増幅される。
例示的な被験試料には、環境試料、農産物またはその他の食糧およびそれらの抽出物、体液（例えば、血液、血清、血漿、糞便、または胃液）、組織抽出物、ならびに培養培地（例えば、病原体細胞のような細胞が培養された液体）が含まれる。所望により、試料は、生物学的試料から核酸分子を単離するために典型的に使用される標準的な方法を使用して、ニッキング増幅反応に含める前に精製される。
一つの態様において、プライマーは、試料中のサルモネラの存在を検出するため、病原体の標的核酸を増幅する。本発明の方法は、試料中の25コピーまたは50コピーのサルモネラゲノムの検出を提供する。
適用
本発明のプライマーを使用した標的核酸増幅は、サルモネラ核酸分子の迅速な検出のために有用な特徴を有する。本発明の組成物および方法は、迅速な回答が望まれる汚染された食品の検出のために特に有用である（例えば、15分、10分、9分、8分、7分、6分、5分、またはそれ以下で検出可能な増幅）。
具体的な態様において、本発明は、圃場、輸送用容器、倉庫、大穀物倉庫、食物加工施設、食料品店、レストラン、厨房、またはヒトもしくは動物の消費用の食物が取り扱われるか、保管されるか、もしくは調製されるその他の現場における、サルモネラニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。他の態様において、試料は、水、土壌、廃棄物（例えば、糞便もしくは肥料）、表面スワブ（例えば、ブーツスワブ）、または下水を含むが、これらに限定されるわけではない環境試料である。具体的な態様において、本発明は、家禽およびトリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、野生の群れ）、家禽が加工される施設（例えば、農場、屠殺場、養鶏場）、ならびに卵および卵製品（例えば、卵の白身または卵白）を含む家禽由来食料をアッセイするために有用である。他の態様において、本発明は、サーモサイクリング装置へのアクセスが利用不可能であるかまたは極端に高価であろう現地調査におけるニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。さらに他の態様において、本発明は、迅速な定量的回答が望まれる状況におけるニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。
具体的な態様において、本発明は、表面スワブをアッセイするために有用である。表面スワブには、エッグベルト、デスカレーター（フィンガー、ベルト、もしくはバスケットエリアを含む）、ファン、または通路の表面のスワブが含まれるが、これらに限定されるわけではない。表面スワブには、ブーツスワブ、ハンドルのスワブ、ステンレス鋼表面のスワブ、装置もしくは機械類のスワブ、または家禽小屋もしくは農場家屋の内表面のスワブが含まれるが、これらに限定されるわけではない。具体的な態様において、本発明は、卵をアッセイするために有用である。卵白および/または卵黄のような卵の中身がアッセイされ得る。具体的な態様において、殻が割れているか、ひびが入っているか、または壊れている卵は、アッセイされる試料に含まれない。
具体的な態様において、卵または表面スワブの試料は、連邦官報第69号56823頁（2004年9月22日）および連邦官報第69号60109頁（2004年10月7日）；「家禽小屋からの環境試料中のサルモネラの検出（Detection of Salmonella in Environmental Samples from Poultry Houses）」（http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm114709.htm）；「細菌分析マニュアル、チャプター5 サルモネラ（Bacterial Analytical Manual,Chapter 5 Salmonella）」（2014年5月バージョン）（http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm）において言及された規則案およびファクトシートに記載された方法に従って調製され得る。
本明細書に記載された試料は、本発明において特色とされる方法を使用するか、または本明細書において特色とされる方法と組み合わせて他のアッセイを使用して、選択された時間間隔で収集されかつ/またはアッセイされ得る。例えば、試料は、21 C.F.R.§§118.6(a)、118.7(b)(1)、118.6(c)、118.6(d)、および118.6(e)に記載されるような「卵に関する規則（egg rules）」に記載された手法に従って、収集されかつ/またはアッセイされ得る。
検出可能オリゴヌクレオチドプローブ
本発明は、少なくとも1種のポリメラーゼアレスト分子（例えば、オリゴヌクレオチドが、標的核酸分子に結合することはできるが、検出可能オリゴヌクレオチドプローブを標的として利用した鋳型伸長を支持することはできないようにするヌクレオチド修飾またはその他のモエティ（例えば、クエンチャー、蛍光性モエティ））を含む非増幅可能検出可能ポリヌクレオチドプローブを使用したニッキング増幅反応における標的核酸分子またはそのアンプリコンの定量的検出を提供する。理論によって拘束されることは望まないが、ポリメラーゼ進行を可能にしない1個または複数個のモエティの存在は、オリゴヌクレオチドへの非核酸骨格付加において、または複製ポリメラーゼの停止を通して、ポリメラーゼアレストを引き起こす可能性が高い（即ち、C3スペーサー、損傷を受けたDNA塩基、その他のスペーサーモエティ、O-2-Me塩基）。従って、これらの構築物は、ニッキング増幅反応の過程においてプローブの不当な増幅を防止するかまたは低下させる。これは、増幅を防止するためにニッキング増幅反応の最後に添加されなければならない従来の検出プローブからそれらを区別する。
従来の検出プローブは、リアルタイムでニッキング増幅反応を定量化するためには非実用的であることが判明している。従来の検出プローブがニッキング増幅反応へ組み込まれる場合、これらの従来の検出プローブは、標的と同時に増幅される。これらの検出分子の増幅は、反応の開始時の最初の検出プローブ分子の数のため、正当な標的アンプリコンの検出をマスクする。
本発明は、少なくとも1種のポリメラーゼアレスト分子を含む非増幅可能検出可能ポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリメラーゼアレスト分子には、複製DNAポリメラーゼによる鋳型伸長を阻止し、それによって、検出分子の増幅を防止するが；標的分子または標的分子の増幅されたコピーへの適切なハイブリダイゼーションまたはヌクレオチドスペーシングを可能にすることができる、ヌクレオチド修飾またはその他のモエティが含まれるが、これらに限定されるわけではない。一つの態様において、本発明の検出可能オリゴヌクレオチドプローブは、検出分子の不当な増幅を防止するかまたは低下させる3炭素スペーサー（C3スペーサー）を含む。
一つの態様において、検出可能オリゴヌクレオチドプローブは、相補的なヌクレオチドとの増強された結合親和性を有する1個または複数個の修飾型ヌクレオチド塩基を含む。修飾型塩基の例には、2'フルオロアミダイトおよび2'OMe RNAアミダイト（ポリメラーゼアレスト分子としても機能する）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の検出可能オリゴヌクレオチドプローブは、異なる色のフルオロフォアを含んで合成され得、事実上任意の標的配列とハイブリダイズするよう設計され得る。いくつかの態様において、検出可能オリゴヌクレオチドプローブは、クエンチャーモエティと対にされた蛍光検出可能標識を含む。本明細書に詳述された局面の様々な態様において、蛍光検出可能標識は、FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、ROX、CalRed610nm、VIC、Cy5、またはCy3である。本明細書に詳述された局面の様々な態様において、クエンチャーモエティは、5'Iowa Black（登録商標）RQ（5IabRQ）、ダブシル（dabcyl）、ダブシル（dabsyl）、またはBlack Hole Quencher色素である。それらの著しい特異性を考慮して、本発明の非増幅可能検出可能ポリヌクレオチドプローブは、試料中の単一の標的核酸分子を検出するために使用されるか、または各々異なる標的核酸分子に結合する検出可能オリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて使用される。従って、本発明の非増幅可能検出可能ポリヌクレオチドプローブは、同一の反応において1種または複数種の標的核酸分子を検出し、これらの標的が同時に定量化されることを可能にするために使用され得る。本発明は、本明細書に記載された検出可能オリゴヌクレオチドプローブと共にそのようなフルオロフォアを使用することを包含する。
キット
本発明は、標的サルモネラ核酸分子の検出のためのキットも提供する。そのようなキットは、試料（例えば、食品、環境試料、生物学的試料、またはその他の材料）の中の標的サルモネラ核酸の検出または定量のために有用である。本発明のキットは、例えば、1種または複数種のポリメラーゼ、順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに1種または複数種のニッキング酵素、ならびに本明細書に記載される検出可能プローブを含んでいてよい。1種の標的を増幅すべき場合、1種または2種のニッキング酵素がキットに含まれていてよい。
本発明のキットは、多数の別々の容器、パケット、チューブ（例えば、＜0.2ml、0.2ml、0.6ml、1.5ml、5.0ml、＞5.0ml）、バイアル、マイクロタイタープレート（例えば、＜96穴、96穴、384穴、1536穴、＞1536穴）、ArrayTape等に、成分のうちの一つもしくは複数を含んでいてもよく、または成分がそのような容器において様々な組み合わせで組み合わせられていてもよい。様々な態様において、キットは、陽性対照として使用され得る参照配列に結合しそれを増幅することができるプライマー対をさらに含む。さらに他の態様において、キットは、プライマーを含有している無菌容器を含み；そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野において公知のその他の適当な容器型であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または核酸の保持のために適当なその他の材料で作成されていてよい。
キットの成分は、例えば、1個または複数個の容器に存在してよく、例えば、成分の全てが、1個の容器に存在してもよいし、または、例えば、酵素がプライマーとは別の容器に存在してもよい。成分は、例えば、乾燥していてもよいし（例えば、粉末）または（例えば、化学的に安定化された、熱的に安定化された）安定的な緩衝液の中に存在してもよい。乾性成分は、例えば、凍結乾燥、真空および遠心によって支援された乾燥、ならびに/または自然乾燥によって調製され得る。様々な態様において、ポリメラーゼおよびニッキング酵素は、単一の容器に凍結乾燥形態で存在し、プライマーは、異なる容器に、凍結乾燥されて、フリーズドライされて、または緩衝液中に存在する。いくつかの態様において、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、およびプライマーは、単一の容器に、凍結乾燥形態で存在する。他の態様において、ポリメラーゼおよびニッキング酵素は、異なる容器に分離されていてもよい。
キットは、例えば、反応において使用されるdNTPもしくは修飾型ヌクレオチド、反応のために使用されるキュベットもしくはその他の容器、または凍結乾燥成分を再生するための水もしくは緩衝液のバイアルをさらに含んでいてよい。使用される緩衝液は、例えば、ポリメラーゼおよびニッキング酵素の両方の活性のために適切なものであり得る。使用される緩衝液は、使用される試料の型にも適切なものであり得る。例えば、卵試料の場合、使用される緩衝液は、Chelex-100樹脂またはデフェロキサミンもしくはデフェラシロクスのような鉄特異的キレート剤を含み得る。
本発明のキットは、本明細書に記載された一つもしくは複数の方法を実施するための説明書、および/または本明細書に記載された一つもしくは複数の組成物もしくは試薬の明細書を含み得る。説明書および/または明細書は、印刷物であってよく、キットインサートに含まれていてよい。キットは、そのような説明書または明細書を提供するインターネットサイトが書かれた文書を含んでいてもよい。
本発明の実施は、他に示されない限り、十分に当業者の理解範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を利用する。そのような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第2版(Sambrook,1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(Gait,1984)；「Animal Cell Culture」(Freshney,1987)；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir,1996)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos,1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel,1987)；「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullis,1994)；「Current Protocols in Immunology」(Coligan,1991)のような文献に充分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用可能であり、従って、本発明の作成および実施において考慮され得る。具体的な態様のための特に有用な技術は、以下のセクションに記述されるであろう。
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法を作成し使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるのであって、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定するためのものではない。
実施例1.サルモネラ由来のDNAの定性的検出のための試験キット
サルモネラの迅速なポイントオブニード（point of need）検出は、その蔓延を防止する介入を達成するために必要とされる。サルモネラ、具体的には、D1血清型群のサルモネラに由来するDNAの定性的検出のための試験キットを生成した。試験キットは、sefA遺伝子内の領域を検出する。sefA標的遺伝子の配列は、図1に提供される。検出アッセイは、等温核酸増幅法に基づく。
被験試料を卵から調製した。新鮮な卵混合物（即ち、卵黄および卵白の均質化された混合物）の試料を、1:10 w/vまたはv/vの試料と培地との比で、2％修飾型緩衝ペプトン水（mBPW）を含むトリプチックソイブロス培地と合わせ、次いで、（本明細書において「濃縮試料」と呼ばれる）濃縮された試料/培地混合物を入手するため、12〜16時間、37℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、1mlの濃縮試料を微量遠心管に置き、10,000×Gで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを（トリス-Hcl、EDTA二ナトリウム塩、トリトンX 100、およびChelex-100樹脂を含む）100μLのMB9緩衝液に懸濁させ、95℃で5分間加熱した後、デブリをペレット化するため、10,000×Gで5分間遠心分離する。遠心分離の最後に、上清を（MB9およびアジ化ナトリウムを含む）MB1緩衝液で1:10比に希釈する。
次いで、5μLの希釈された上清を50μLの反応緩衝液（RB1）と混合する。50μLのこの混合物を、凍結乾燥マスターミックスに移す。マスターミックスは、再懸濁させ、その後、関心対象の試料によってアッセイするため、予め調製され凍結乾燥されていた。50μL反応のためのマスターミックス組成物は、以下の試薬を含む：順方向プライマー（250nM）、逆方向プライマー（250nM）、リアルタイム分子ビーコンプローブ（300nM）、リアルタイム内的対照プローブ（100nM）、dNTP（1X、300nM）、Bst DNAポリメラーゼ（1X、約20単位）（NEB Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase、カタログ番号M0538M）、およびNt.BstNBIニッキング酵素（1X、7.52単位）（NEB Nt.BstNBI、カタログ番号R0607L）。次いで、その混合物を、均質化し、20分間の蛍光読み取りのためにアッセイする。プライマーおよびプローブの配列は、図2〜4に提供される。
増幅および検出の反応は、高いシグナルノイズ比、指数関数的増幅の早い開始、急な増幅の傾き、迅速な検出までの時間、および反復されたアッセイ反応の間の低いシグナル分散を示した。全ての標的対照試料がロバストなシグナルを示した。アッセイをさらに試験し、サルモネラD1血清型を検出した。さらに、アッセイは、S.パラチフィAを除き、非サルモネラまたは非サルモネラD1血清型を検出しなかった。S.パラチフィAは、D1血清型サルモネラではないが、sefA遺伝子を含有していることが公知であるため、予想された例外であった。これらの結果は、サルモネラ、特に、D1血清型サルモネラの迅速で高感度の検出のための組成物および方法が提供されたことを示している。
実施例2.サルモネラの分析的検出限界（ALOD）
図5は、図1に示されるsefA領域を標的とするDNAbleアッセイ反応の標的ゲノムDNA希釈系列の等温増幅プロットを示す。反応は、Roche Diagnostics Inc.からのLC480サーモサイクラーで実施された。標的特異的なプローブシグナルは、533〜610nmの蛍光チャンネルで検出された。全ての反応が、（マスターミックスが凍結乾燥されなかったことを除き）本明細書中の前記の反応条件の下で、図3に示されるプライマープローブ濃度を使用して、50μl体積でセットアップされた。0コピー/反応（標的なし対照反応または「NTC」）、25コピー/反応、50コピー/反応、500コピー/反応、および5,000コピー/反応の範囲の様々な量の精製されたサルモネラ・エンテリカゲノムDNAが、反応に添加された。標的sefA領域の信頼性のある検出は、25コピー/50μl反応まで証明される。
図6Aは、AXXINリーダで実施されたsefA遺伝子の領域Iを標的とするDNAbleアッセイ反応の等温増幅プロットを示す。図6Bは、これらの増幅反応における内的対照からのシグナルを示す。全ての反応が、本明細書中の前記の反応条件の下で、図3に示されるプライマープローブ濃度を使用して、50μl体積でセットアップされた。0コピー/反応（標的なし対照反応または「NTC」）、25コピー/反応、50コピー/反応、500コピー/反応、および5,000コピー/反応の範囲の様々な量の精製されたサルモネラ・エンテリカゲノムDNAが、反応に添加された。標的sefA領域の信頼性のある検出は、25コピー/50μl反応まで証明される。
図7は、AXXINリーダで実施されたsefA遺伝子内の領域を標的とするDNAbleアッセイ反応の等温増幅プロットを示す。全ての反応が、本明細書中の前記の反応条件の下で、図3に示されるプライマープローブ濃度を使用して、50μl体積でセットアップされた。0 CFU/反応（NTC、即ち、標的なし対照反応）、104 CFU/反応、および105 CFU/反応の範囲のコロニー形成単位（CFU）に等しい数の生サルモネラ細胞を接種された細菌培養物から抽出されたサルモネラ・エンテリカゲノムDNAを含有している粗試料が、反応に添加された。sefA標的の信頼性のある検出は、104 CFU / 50μl反応まで証明される。
図8は、sefA遺伝子内の領域を標的とするDNAbleアッセイ反応の等温増幅プロットを示す。全ての反応が、本明細書中の前記の反応条件の下で、図3に示されるプライマープローブ濃度を使用して、50μl体積でセットアップされた。「1:9」と示された上の列において、反応は、1:9の体積比で混合された卵および培地の混合物から得られた試料を使用した。「1:2」と示された上の列において、反応は、1:2の体積比で混合された卵および培地の混合物から得られた試料を使用した。0 CFU/反応（NTC、即ち、標的なし対照反応）、104 CFU/反応、および105 CFU/反応の範囲のコロニー形成単位（CFU）に等しい数の生サルモネラ細胞を接種された細菌培養物から抽出されたサルモネラ・エンテリカゲノムDNAを含有している粗試料が、反応に加えられた。
卵試料を、トリプチックソイブロス（TSB）＋2％サプリメント中で一晩濃縮した。sefA標的の信頼性のある検出は、104 CFU / 50μl反応まで証明される。「1:2」反応および「1:9」反応において得られた結果の類似性は、アッセイの頑強性を示す。
実施例3：サルモネラアッセイの特異性
本明細書中の前記の反応条件を使用して、下に詳述されたサルモネラ株を、DNAble 3.0サルモネラアッセイによって試験した。アッセイは、「Inclusivity」リストに特定されているサルモネラ株（全てのサルモネラ血清型D1群）の全てを成功裡に検出した。アッセイは、「Exclusivity」リストに列挙されている細菌とは交差反応しなかった。例外は、sefA遺伝子を含有している例外的な非D1亜種、サルモネラ・パラチフィAにおける陽性検出である。
INCLUSIVITY（サルモネラD1群）
Figure 2018523474
EXCLUSIVITY（サルモネラ非D1群）
Figure 2018523474
EXCLUSIVITY（非サルモネラ）
Figure 2018523474
Figure 2018523474
Figure 2018523474
他の態様
以上の説明から、様々な使用法および条件に適合するよう本明細書に記載された本発明に変動および修飾が施され得ることは明白であろう。そのような態様も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書における変項の定義における要素のリストの列挙には、単一の要素または列挙された要素の組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）としてのその変項の定義が含まれる。本明細書における態様の列挙には、単一の態様または他の態様との組み合わせもしくはその一部分としてのその態様を含む。
本明細書中に言及された特許および公開は、全て、独立の特許および公開が各々参照によって組み入れられると具体的に個々に示されたのと同一の程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。

Claims (30)

  1. 試料中のサルモネラ血清型D1を検出する方法であって、
    核酸分子の等温増幅を許容する条件の下で、ニッキング酵素、dNTP、検出可能プローブ、およびポリメラーゼの存在下で、サルモネラ核酸分子に特異的に結合する順方向プライマーおよび逆方向プライマーと試料とを接触させる工程、ならびに該試料中のサルモネラ由来アンプリコンを検出する工程を含み、
    以下の標的配列：
    Figure 2018523474
    を検出する、前記方法。
  2. 前記試料が、食品、環境試料、生物学的試料、またはその他の材料を含む、請求項1記載の方法。
  3. 前記食品が、動物またはヒトの消費用である、請求項2記載の方法。
  4. 前記食品が、コンパニオンアニマルの消費用のペットフードである、請求項3記載の方法。
  5. 前記食品が、農産物、鳥肉、魚、もしくは牛肉であるかまたはそれらに由来する、請求項3記載の方法。
  6. 前記環境試料が、水、土壌、下水、または表面スワブ試料である、請求項2記載の方法。
  7. 前記生物学的試料が、糞便または血液試料である、請求項2記載の方法。
  8. 前記試料が培養培地である、請求項2記載の方法。
  9. 前記表面スワブ試料が、ブーツスワブ、ハンドルのスワブ、装置もしくは機械類のスワブ、家禽小屋の内表面のスワブ、またはエッグベルト、デスカレーター、ファン、もしくは通路の表面のスワブである、請求項6記載の方法。
  10. 前記試料が、卵または卵製品である、請求項1記載の方法。
  11. 前記卵製品が、卵白および/または卵黄である、請求項10記載の方法。
  12. 前記サルモネラが血清型D1である、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記サルモネラが、S エンテリティディス（enteriditis）、S チフィ（typhi）、S プローラム（pullorum）、S ダブリン（dublin）、S ガリナラム（gallinarum）、およびS センダイ（sendai）からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記順方向プライマーおよび前記逆方向プライマーが、
    順方向プライマー：
    Figure 2018523474
    および逆方向プライマー：
    Figure 2018523474
    （配列中、「m」は修飾の位置を示す）からなる群より選択される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記アンプリコンが、以下の配列：
    Figure 2018523474
    のうちの一つを含むプローブによって検出される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記プローブが、蛍光成分およびクエンチャーを含む、請求項15記載の方法。
  17. 前記蛍光成分が、FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、ROX、CalRed610nm、VIC、Cy5、およびCy3からなる群より選択され、前記クエンチャーが、5'Iowa Black（登録商標）RQ（5IabRQ）、ダブシル（dabcyl）、ダブシル（dabsyl）、およびBlack Hole Quencher2（BHQ2）からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
  18. 前記順方向プライマーおよび前記逆方向プライマーがそれぞれ以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含み、プローブが以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記ニッキング酵素が、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI（NEB）、Nb.Bpu10I（Fermantas）、Nb.BsmI（NEB）、Nb.BsrDI（NEB）、Nb.BtsI（NEB）、Nt.AlwI（NEB）、Nt.BbvCI（NEB）、Nt.Bpu10I（Fermentas）、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI（NEB）、Nt.BstNBI（NEB）、およびNt.CviPII（NEB）からなる群より選択される、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記ポリメラーゼが、Bst DNAポリメラーゼI、Gst DNAポリメラーゼI、Gka DNAポリメラーゼI、SD DNAポリメラーゼ、およびそれらの誘導体または変異体からなる群より選択される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
  21. 以下の工程を含む、試料中のサルモネラを検出する方法：
    Nt.BstNBI（NEB）ニッキング酵素、dNTP、Bst DNAポリメラーゼI、および以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含む検出可能プローブの存在下で、それぞれ以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含む順方向プライマーおよび逆方向プライマーと該試料とを接触させる工程；ならびに
    サルモネラアンプリコンの存在または欠如を検出する工程であって、該サルモネラアンプリコンの存在によって該試料中のサルモネラが同定される、工程。
  22. サルモネラの存在について圃場、作物、群れ、食物加工施設、および食物取扱い施設からなる群より選択される場所をモニタリングするために、定期的に使用される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記モニタリングが、約2週間毎、1ヶ月毎、3ヶ月毎、6ヶ月毎、9ヶ月毎、または12ヶ月毎に実施される、請求項22記載の方法。
  24. 修飾が、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アルキル、2'-アリル、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2'-ヒドロキシル（RNA）、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-(CH2)2-O-2'-架橋、および2'-O-(N-メチルカルバメート)からなる群より選択される、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
  25. 順方向プライマー：
    Figure 2018523474
    および逆方向プライマー：
    Figure 2018523474
    （配列中、「m」は修飾の位置を示す）からなる群より選択される、プライマー。
  26. 順方向プライマー：
    Figure 2018523474
    および逆方向プライマー：
    Figure 2018523474
    （配列中、「m」は修飾の位置を示す）からなる群より選択される順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む、プライマーの対。
  27. 以下の配列：
    Figure 2018523474
    のうちの一つを含む、プローブ。
  28. プライマーが以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含み、検出可能プローブが以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含む、プライマーおよびプローブの組み合わせ。
  29. ニッキング酵素、dNTP、ポリメラーゼ、
    順方向プライマー：
    Figure 2018523474
    および逆方向プライマー：
    Figure 2018523474
    （配列中、「m」は修飾の位置を示す）からなる群より選択される順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに
    以下の配列：
    Figure 2018523474
    のうちの一つを含むプローブ
    を含む、キット。
  30. ニッキング酵素、dNTP、ポリメラーゼ、
    以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含むプライマー、および
    以下の配列：
    Figure 2018523474
    を含む検出可能プローブ
    を含む、キット。
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