JP2018522583A - 血管新生を阻害するための融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、血管新生を阻害する生物学に関する。特に、本発明は、インテグリン活性化パスウェイ及びもう１つの血管新生因子活性化パスウェイを阻害する融合タンパク質、これら融合タンパク質の組成物に加え、その製造方法及び使用方法に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、血管新生を阻害する生物学に関する。特に、本発明は、血管新生因子活性化パスウェイを阻害する融合タンパク質、これら融合タンパク質の組成物、及びその製造方法及び使用方法に関する。

血管新生は、現存する脈管構造から新たな血管を生じさせる過程である。それは、胚発生に加え、組織及び損傷修復等の生理学上の一連の変化において重要な役割を担う（非特許文献１）。血管新生の生理学的な段階は、詳細に明らかにされており、細胞外マトリックスのタンパク質分解、内皮細胞の増殖、移行及び管腔への会合、壁細胞の補充及び分化、並びに細胞外マトリックスの産生に関与する（非特許文献２）。病的な血管新生は、腫瘍形成、目の疾患（例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫又は黄斑変性症）、関節炎、乾癬、線維性疾患、炎症性疾患、及び動脈硬化症で起こりうる（非特許文献３）。

病的な血管新生は、より異質かつ無秩序であって、ねじれた血管構成、多様な大きさの低酸素な空間、不均一かつ不完全な血管壁及び血管内壁、並びに効果的ではない灌流を示すことが多い（非特許文献４）。疾患での新しい血管形成におけるこれらの確かな特性は、血管新生を治療標的とすることを課題としている。ルセンティス（登録商標）、アイリーア（登録商標）、又はアバスチン（登録商標）の適応外使用のような抗ＶＥＧＦ治療は一般には視覚機能を安定化又は改善するが、抗ＶＥＧＦ治療後２年以内に、処置した目全体のおよそ半分で網膜下の傷（線維症）が進行し、失敗に終わった原因の１つとされる（非特許文献５）。網膜下の線維症において決定的な役割の多くを果たすのは、線維化過程（細胞増殖、細胞移動及びＥＣＭ再構築）に関与する成長因子及びマトリックス細胞のタンパク質と考えられる。その複雑さにも関わらず、血管新生の過程に係る我々の知識の増加に伴って、抗血管新生薬の開発には、大きな関心が寄せられる領域が残されている。

現在、血管形成の過程において重要な役割を果たすものの多くが同定され、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーが主な役割を担う。ヒトＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ及び胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）の６種からなる。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＰＩＧＦの複数のアイソフォームが択一的なＲＮＡスプライシングを介して生じる（非特許文献６）。ＶＥＧＦ−Ａは、血管新生に関する主要因であって、それはＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２の両方に結合する。ＶＥＧＦ−Ａシグナルを遮断することで血管新生を阻害する方法が、特定のがん、網膜の新生血管及び虚血性疾患の処置に関して奏功する治療法を確立した（非特許文献７〜１０）。

他の成長因子、サイトカイン、ケモカインは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン２０（ＩＬ−２０）、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド（ＣＣＬ２８、ＣＣＬ２１）及びＣ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５）等の走化性因子、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、及び表面抗原分類（ＣＤ）等の免疫細胞表面タンパク質等である。これら因子は、血管新生関連疾患において過剰発現し、重要な役割を果たすことが報告されている（非特許文献１１、１２）。これらの下流パスウェイの活性化を抑制するために上記因子を標的とすることで、血管新生関連疾患を抑えられる可能性がある。

また、細胞表面受容体のファミリーであるインテグリンは、内皮細胞表面で過剰発現することが見出されており、血管新生の際に成長及び新たな管の形成の維持を促すと考えられている。インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質と相互作用するヘテロ二量体の細胞表面受容体であって、多くの生物学的過程に関して重要である。様々な種類の細胞でのインテグリンの発現が腫瘍の進展に関与し、成長因子受容体とクロストークするそれらの能力のために、それらは魅力的な治療標的となっている（非特許文献１３、１４）。特に、インテグリンαｖβ３は、腫瘍細胞及び血管新生の内皮細胞の双方で上方制御され、腫瘍細胞の移動、血管新生、及び調節不全の細胞シグナル伝達において重要である。したがって、インテグリンαｖβ３のアンタゴニストは、その抗血管新生及び抗腫瘍特性に関して集中的に研究されている（非特許文献１５）。

ディスインテグリンは、マムシの仲間のヘビ毒液に発見されたペプチドであり、β１及びβ３に関連するインテグリンの機能を主に阻害する。それらは、まずはインテグリンαＩＩｂβ３の阻害剤として同定され、続いて他のインテグリンに高い親和性で結合し、ＲＧＤ含有タンパク質とインテグリンとの相互作用を阻害することが示された。それらは約４から７つのジスルフィド結合を有する４７から８４個のアミノ酸を含み、同様のＲＧＤモチーフを有する（非特許文献１６〜１９）。ディスインテグリンファミリーに保存されたＲＧＤ配列は、インテグリンの認識においてもっとも重要な役割を担っている。ディスインテグリンは、２４種のインテグリン中の８種と相互作用することが見出され、インテグリンを介した細胞付着、移動及び血管新生を阻害した（非特許文献２０、２１）。ディスインテグリンが新生血管内皮及び転移腫瘍を標的とすることが動物実験によって示されたことは、がん治療でのその用途の可能性を示唆する。インテグリンへのＲＧＤ含有タンパク質の特異的な結合は、構造及びＲＧＤモチーフ周辺局所の配列の両方の作用である。ＲＧＤ含有タンパク質のＲＧＤモチーフの傍らにある残基がインテグリンへのその結合特異性及び親和性に影響することが多くの研究によって示された（非特許文献２２、２３）。

Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７；２３５：４４２−７ Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７３：２９８−３０７ Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９９５；６（３）：２３０−４７ Ｊａｉｎ ＲＫ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３；９（６）：６８５−９３ Ｄａｎｉｅｌ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１４；１２１（３）：６５６−６６ Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２００２，２（２）：１６５−７５ Ｍａｊｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．，１９９７，２８３（１）：４０２−１０ Ｗｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４，１０：１４５−７ Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０１２，１５（２）：１７１−８５ Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９５，９２：１０４５７−６１ Ｅｌｓｈａｂｒａｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ （２０１５） １８：４３３−４４８ Ｂｒｉａｎ Ｐ．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００１ Ｄｅｃ ７；８９（１２）：１１０４−１０ Ｓｔａｕｎｔｏｎ ＤＥ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；９１：１１１−５７ Ａｖｒａａｍｉｄｅｓ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；８：６０４−６１７ Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ ＪＳ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ １０：９−２２ ＭｃＬａｎｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９８ ２１９：１０９−１１９ Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９４ ３１：２８９−３００ Ｃａｌｖｅｔｅ ＪＪ．，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００５ １１：８２９−８３５ Ｂｌｏｂｅｌ ＣＰ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９２ ４：７６０−７６５ ＭｃＬａｎｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００８ １３：６６１７−６６３７ Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００７ １３：２８６０−２８７１ Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９３ ２６８：１０５８−１０６５ Ｒａｈｍａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９８ ３３５：２４７−２５７

血管新生は、様々な成長因子及びシグナル伝達受容体が関与する複雑な生物学的過程であって、シグナル伝達カスケードにおける１つの分子を標的としても、がん等の疾患における制御できない血管新生に対して有効な臨床的治療を提供できない。したがって、血管新生及び疾患の進展を有効に阻害する協力的な方法で、いくつかの重要な血管新生因子に結合することができる革新的な治療の開発の要求が高まっている。

本明細書に開示される発明は、いくつかの血管新生因子に拮抗するように複数の標的に特異的に結合するポリペプチドを開示する。また、本発明は、選択的なインテグリンパスウェイ及び他の血管新生のパスウェイを阻害する融合タンパク質を提供する。さらに本発明は、上記融合タンパク質を含む組成物を提供する。さらに本発明は、ベクターを含む組成物を提供し、該ベクターは、融合タンパク質をコードする核酸を含む。さらに本発明は、血管新生の疾患、眼疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、及び／又はがんの治療又は予防のための上記融合タンパク質の製造方法及び使用方法を開示する。

本発明によれば、融合タンパク質は、ディスインテグリン、抗インテグリンαｖβｘ抗体、抗インテグリンα５β１抗体、インテグリンαｖβｘ又はα５β１を標的とするフィブロネクチン及びそれらのインテグリン結合フラグメントからなる群から選択されるインテグリン結合ペプチドと、血管新生因子を標的とする他のタンパク質結合ペプチドと、Ｆｃドメインと、を含み、ｘが１、３、５、６又は８である。いくつかの実施の形態では、血管新生因子は、アンジオポエチン（ＡＮＧ）、エフリン（Ｅｐｈ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ニューロピリン（ＮＲＰ）、プラスミノーゲン活性剤、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン２０（ＩＬ−２０）、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド（ＣＣＬ２８、ＣＣＬ２１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５）のような走化性因子、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、及び表面抗原分類（ＣＤ）のような免疫細胞表面タンパク質、及びその受容体を含む。

１つの態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するインテグリン結合ペプチドと、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドと、Ｆｃドメインと、を含む融合タンパク質を提供し、当該インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する。

他の態様によれば、本発明は、ディスインテグリン及びそのインテグリン結合フラグメントを含むインテグリン結合ペプチドと、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドと、Ｆｃドメインと、を含む融合タンパク質を提供し、当該インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施の形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端からＮ末端に、当該インテグリン結合ペプチド、当該Ｆｃドメイン及び他のタンパク質結合ペプチドを含む。いくつかの実施の形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、当該インテグリン結合ペプチド、当該Ｆｃドメイン及び他のタンパク質結合ペプチドを含む。融合タンパク質のさらなる実施の形態では、インテグリン結合ペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有する。

他の実施の形態によれば、本発明は、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列を含むインテグリン結合タンパク質と、イムノグロブリンＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有するヒト又はヒト化定常サブ領域と、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を有する他のタンパク質結合ペプチドと、を含む融合タンパク質も提供する。融合タンパク質のさらなる実施の形態では、インテグリン結合ペプチドが配列番号２に少なくとも８５％の配列相同性を有する。

１つの態様によれば、本発明は、本明細書に開示された発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。

他の態様によれば、本発明は、本明細書に開示された発明に係る融合タンパク質の二量体を提供する。

他の態様によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質の製造方法を提供し、該製造方法は、本発明に係る核酸配列を含むベクターで遺伝子導入された宿主細胞を、融合タンパク質を産生する条件下で培養することと、当該宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収することと、を含む。

他の態様によれば、本発明は、有効量の融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、血管新生の疾患を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施の形態では、血管新生の疾患は、関節リウマチ、炎症性関節炎、変形性関節炎、眼及び全身のがん、腫瘍関連転移及び浸潤、突発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は肝線維症、糖尿病性腎症及び／又は腎線維症、皮膚線維症又はケロイド、創傷治癒、心臓線維症、及び虚血で誘導される脳卒中を含む全身の線維性疾患、血管形成又は虚血によって特徴づけられる眼疾患（脈絡膜の血管形成を含む）、ぶどう膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症及び糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞症及び網膜分枝静脈閉塞症（ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯ）、ヒト未熟児網膜症（ＲＯＰ）、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、症候性硝子体黄斑癒着、及び緑内障を含む。いくつかの実施の形態では、本発明の融合タンパク質は、インテグリン結合ペプチドと他のタンパク質結合ペプチドとの間にリンカー配列を含む。いくつかの実施の形態では、本発明の融合タンパク質は、他のタンパク質結合ペプチドの上流にシグナル配列を含む。

他の態様によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供する。

他の態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むインテグリン結合ペプチドと、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦ抗体及びそれらのフラグメントからなる群から選択される他のタンパク質結合ペプチドと、Ｆｃドメインと、を含む、複数の血管新生因子を標的とするポリペプチドを提供し、当該インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を含む。

いくつかの実施の形態では、本発明のポリペプチドにおけるＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ１−Ｄ７を含む。いくつかの実施の形態では、本発明のポリペプチドにおけるＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ｉ）ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２（Ｄ２）及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３（Ｄ３）、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号１０に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、を含む。いくつかの実施の形態では、本発明のポリペプチドにおけるＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ＰＤＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン１−５を含む。いくつかの実施の形態では、本発明のポリペプチドにおけるＰＤＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ｉ）ＰＤＧＦＲβのＩｇ様ドメイン１−３、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号１１に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、を含む。いくつかの実施の形態では、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインとインテグリン結合ペプチド又はＶＥＧＦ受容体若しくはＰＤＧＦ受容体の細胞外ドメインとの間にＧｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｇ_９）リンカーをさらに含む。

本明細書は、本発明を当業者が実施するのに十分なものである。本明細書に記載及び説明されたものの他に本発明の様々な改変が、添付の特許請求の範囲内で上記の説明から本技術分野の当業者にとって明らかである。本明細書で引用されたすべての文献、特許及び特許出願があらゆる目的にために、その全体を参照することで本明細書に組み入れられる。

例示的な実施の形態に係る上記の及び他の目的、態様、特徴及び利点が、より明らかになり、そして添付の図面と合わせて以下の説明を参照することでより理解される。

本発明の１つの実施の形態に係る例示的な融合タンパク質の組成物を示す図である。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された、精製された融合タンパク質１を示す図である。 ＶＥＧＦリガンド結合アッセイを示す図である。 αｖβ３競合的結合アッセイを示す図である。 ＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ増殖を示す図である。 ＣＨＯ−αｖβ３細胞付着の阻害を示す図である。 融合タンパク質による管形成阻害効果を示す図である。 融合タンパク質による管形成阻害効果を示す図である。 融合タンパク質による管形成阻害効果を示す図である。 融合タンパク質による管形成阻害効果を示す図である。 融合タンパク質による管形成阻害効果を示す図である。 融合タンパク質による管形成阻害効果を示す図である。 融合タンパク質による管形成阻害効果を示す図である。 融合タンパク質によるダッチベルティッドウサギにおけるＶＥＧＦ誘導漏出の用量反応阻害を示す１つの実施の形態を提示する。 融合タンパク質によるダッチベルティッドウサギにおけるＶＥＧＦ誘導漏出の用量反応阻害を示す１つの実施の形態を提示する。 融合タンパク質によるダッチベルティッドウサギにおけるＶＥＧＦ誘導漏出の用量反応阻害を示す１つの実施の形態を提示する。 融合タンパク質によるダッチベルティッドウサギにおけるＶＥＧＦ誘導漏出の用量反応阻害を示す１つの実施の形態を提示する。 ラットでの融合タンパク質によるレーザー誘導された脈絡膜の血管形成（ＣＮＶ）における損傷範囲の縮小を示す１つの実施の形態を提示する。矢印（黒色三角）はレーザー損傷の位置を示す。 ラットでの融合タンパク質によるレーザー誘導された脈絡膜の血管形成（ＣＮＶ）における損傷範囲の縮小を示す１つの実施の形態を提示する。矢印（黒色三角）はレーザー損傷の位置を示す。 ラットでの融合タンパク質によるレーザー誘導された脈絡膜の血管形成（ＣＮＶ）における損傷範囲の縮小を示す１つの実施の形態を提示する。矢印（黒色三角）はレーザー損傷の位置を示す。

特段定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同様の意味を有する。

本明細書で用いられる場合、文脈で明示しない限り、単数形態はその指し示す複数のものを含む。したがって、例えば“結合ドメイン”との言及は、複数の結合ドメイン及び本技術分野の当業者に知られるそれと同等のものを含む。

本明細書で用いられる場合、用語“ポリペプチド”及び“タンパク質”は、交換可能に用いられてもよく、天然のタンパク質のアミノ酸配列又は１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、及び／又は置換等の１つ以上の変異を伴うアミノ酸配列を有するペプチドの長鎖を意味する。

“融合タンパク質”は、共有結合で１つに結合された複数の部分を有するタンパク質を意味し、各部分は異なるタンパク質由来である。

本発明は、ディスインテグリン（アミノ酸配列の開示に関しては米国特許第７９４３７２８号明細書及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／４６３２２明細書を参照し、その全体を参照することで、それぞれが本明細書に組み入れられる）、抗インテグリンαｖβｘ抗体（アミノ酸配列の開示に関しては米国特許第６１６００９９号明細書及び米国特許第８３５００１０号明細書を参照し、その全体を参照することで、それぞれが本明細書に組み入れられる）、抗インテグリンα５β１抗体、インテグリンアイソフォームαｖβｘ又はα５β１を標的とするフィブロネクチン（アミノ酸配列の開示に関しては米国特許出願公開第２０１５／０２１８２５１号明細書を参照し、その全体を参照することで、本明細書に組み入れられる）、及びそれらのインテグリン結合フラグメントからなる群から選択されるインテグリン結合ペプチドと、血管新生因子を標的とする他のタンパク質結合ペプチドと、Ｆｃドメインと、を含み、ｘが１、３、５、６又は８である、融合タンパク質を提供する。

本明細書で用いられる場合、用語“抗体”は、ジスルフィド結合で相互に結合した４本のポリペプチド鎖、２本の重鎖及び２本の軽鎖から構成されるイムノグロブリン分子を意味することが意図される。全長の重鎖は、可変領域ドメインＶＨ並びに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシ末端にある。全長の軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む。抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）は、１本の軽鎖と、１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖の分子とジスルフィド結合を形成できない。Ｆａｂ’フラグメントは、１本の軽鎖と、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間の定常領域をさらに含む１本の重鎖とを含み、鎖間ジスルフィド結合が２本の重鎖間に形成され、二特異性抗体を形成する。可変フラグメント（Ｆｖ）領域は重鎖及び軽鎖からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）は、重鎖の及び軽鎖の可変領域が可動性リンカーを介して結合しているＦｖ分子であって、抗原結合領域を形づくる１本のポリペプチド鎖を形成している。一本鎖抗体は、国際公開第１９８８／０１６４９号及び米国特許第４９４６７７８号明細書及び米国特許第５２６０２０３号明細書に詳細が開示されている。本明細書で用いられる場合、用語“抗体”は、２本の全長Ｌ鎖及び２本の全長Ｈ鎖を有するイムノグロブリン分子、並びに抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆｖ領域、ｓｃＦｖ等、そのフラグメントを包含する。

用語“Ｆｃドメイン”は、単量体の又は多量体の形態によらず、抗体の非抗原結合部分の配列を含む分子又は配列を意味する。Ｆｃの元来のイムノグロブリンの起源は、好ましくはヒトから生じたもので、いずれのアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤ由来であってもよい。全長のＦｃは、次のＩｇ重鎖領域：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなり、ＣＨ１及びＣＨ２領域は、典型的には可動性ヒンジ領域で結合している。

本発明は、ディスインテグリン及びそのインテグリン結合フラグメントを含むインテグリン結合ペプチドと、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドと、Ｆｃドメインと、を含む、融合タンパク質を提供し、当該インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を含む。本発明に係る実施の形態では、ディスインテグリン及びそのインテグリン結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する。

本明細書で用いられる場合、“ディスインテグリン”は、インテグリンの強い可溶性リガンドであるシステインリッチタンパク質の部類又はポリペプチドを意味する。ＲＧＤモチーフは、単量体のディスインテグリンの大半に保存されたトリペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）であって、インテグリン結合ループに位置する。本明細書で説明されるディスインテグリンは、ヘビ毒液から単離されるか、野生型の形態由来であって、様々なインテグリンのアイソフォームに選択的に結合又は該アイソフォームを標的とするために、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する。本明細書で用いられる場合、用語“ＲＧＤモチーフの近隣”は所定のペプチド又はポリペプチドの配列におけるＲＧＤモチーフから１５〜２０個のアミノ酸以内のあらゆるアミノ酸残基に生じるあらゆる変異を意味する。

また、ディスインテグリンの他のアミノ酸配列変異型も考えられる。例えば、ディスインテグリンの結合親和性及び／又は他の生物学的特性がタンパク質をコードするアミノ酸配列を変えることで改良され得る。ディスインテグリン変異体は、タンパク質をコードする核酸配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成による改変の導入によって調製できる。当該改変は、ディスインテグリンの核酸配列又はアミノ酸配列内の欠失、挿入及び／又は置換等の変異を含む。最終のコンストラクトがインテグリンスーパーファミリーに含まれるものへの結合及び／又はインテグリン活性化パスウェイの阻害等の所望の特性を有するように、ディスインテグリンの最終のアミノ酸コンストラクトを得るために欠失、挿入及び置換のあらゆる組み合わせがなされ得る。

タンパク質又はポリペプチドの生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えばシート又はヘリックス構造のような置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ、の維持に対するその影響において大きな違いをもたらす置換を選択することで行われる。

変異生成に好ましい部位である融合タンパク質における特定の残基又は領域を同定するのに有用な方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４：１０８１−１０８５に記載された“アラニンスキャンニング変異生成”として知られる。例えば、標的となる結合相手とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすために、残基又は複数の標的残基が同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような帯電した残基）、中性又は負に帯電したアミノ酸（もっとも好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換される。そして、置換の部位に、若しくは置換の部位に関して、さらなる、又は他の変異を導入することで、置換に対して機能的な感受性を示すこれらアミノ酸の位置が絞り込まれる。このようにして、アミノ酸配列の変異を導入するための部位が事前に決められるが、変異の特質それ自体は事前に決められる必要はない。例えば、所定部位の変異の性能を分析するために、無作為な変異生成が標的のコドン又は領域で行われ、発現した融合ポリペプチドバリアントが所望の活性に関して評価される。例えば、その安定性を向上させるために、システイン結合が融合タンパク質又はタンパク質の構成要素に付加されてもよい。

したがって、本明細書に記載されるディスインテグリンの変異体は、本明細書に開示されるあらゆる融合タンパク質の構成要素となり得る。いくつかの実施の形態では、ディスインテグリンは、ロドストミン（配列番号１）、トリフラビン（配列番号３）、エチスタチン（配列番号４）、トリムクリン（配列番号５）、エレガンチン（配列番号６）及びトリグラミン（配列番号７）からなる群から選択されるディスインテグリンのアミノ酸配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施の形態では、ディスインテグリンは、ロドストミン（配列番号１）、トリフラビン（配列番号３）、エチスタチン（配列番号４）、トリムクリン（配列番号５）、エレガンチン（配列番号６）又はトリグラミン（配列番号７）のＲＧＤモチーフに、又は該ＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施の形態では、ディスインテグリンは、ディスインテグリン変異体（配列番号２）のアミノ酸配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号２におけるＸａａは、ディスインテグリンの野生型形態と異なるアミノ酸配列バリアントを産生するために挿入、置換又は欠失のいずれかによって改変され得る様々な位置を示す。いくつかの実施例によれば、野生型ロドストミン（配列番号１）のＲＧＤモチーフにおけるグリシン（Ｇｌｙ）に対応する配列番号２の位置５０にあるＸａａが、ロドストミン変異体を得るためにグリシン以外の天然起源のアミノ酸に置換されてもよい。また、他の実施例では、配列番号２における１つ以上のＸａａが、ロドストミン変異体を得るために野生型ロドストミン（配列番号１）の対応する位置に本来あるもの以外の天然起源のアミノ酸に置換されてもよい。さらに、ディスインテグリン変異体は配列番号２におけるあらゆるＸａａに１つだけの変異を含むものに限定されず、配列番号２におけるＸａａの複数の位置、又はディスインテグリン（例えば配列番号３〜７）の他の共通配列における対応する位置で起こる複数の変異も本発明の範囲に包含されることが指摘される。

また、上記のアミノ酸配列に関連して、ディスインテグリンのバリアントが主に説明されたが、アルボラブリン（Ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）、アプラギン（Ａｐｐｌａｇｉｎ）、バシリシン（Ｂａｓｉｌｉｃｉｎ）、バトロキソスタチン（Ｂａｔｒｏｘｏｓｔａｔｉｎ）、ビチスタチン（Ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ）、セレベリン（Ｃｅｒｅｂｅｒｉｎ）、セラスチン（Ｃｅｒａｓｔｉｎ）、クロタトロキシン（Ｃｒｏｔａｔｒｏｘｉｎ）、ズリシン（Ｄｕｒｉｓｓｉｎ）、フラボリジン（Ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）、フラボスタチン（Ｆｌａｖｏｓｔａｔｉｎ）、ハリシン（Ｈａｌｙｓｉｎ）、ハリスタチン（Ｈａｌｙｓｔａｔｉｎ）、ジャララシン（Ｊａｒａｒａｃｉｎ）、ジャラスタチン（Ｊａｒａｓｔａｔｉｎ）、キストリン（Ｋｉｓｔｒｉｎ）、ラチェシン（Ｌａｃｈｅｓｉｎ）、ルトシン（Ｌｕｔｏｓｉｎ）、モロシン（Ｍｏｌｏｓｓｉｎ）、サルモシン（Ｓａｌｍｏｓｉｎ）、サキサチリン（Ｓａｘａｔｉｌｉｎ）、テルゲミニン（Ｔｅｒｇｅｍｉｎｉｎ）、トリメスタチン（Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）、トリムターゼ（Ｔｒｉｍｕｔａｓｅ）、ウスリスタチン（Ｕｓｓｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ビリジアン（Ｖｉｒｉｄｉａｎ）及びＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有するそれらの変異体等のヘビ毒液をコードするポリペプチド配列又はヌクレオチド配列も本発明の範囲に包含される。

理論に縛られることはないが、ディスインテグリンがインテグリンスーパーファミリーに含まれるものと結合し、多価のインテグリン受容体とのその相互作用を遮ることでインテグリン活性化パスウェイを阻害すると、本明細書では考えられる。いくつかの態様では、ディスインテグリンは、限定されないがインテグリンアイソフォームαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α５β１及び／又はαｖＩＩｂβ３等のインテグリンスーパーファミリーに含まれるものに結合する。

本発明によれば、融合タンパク質の他のタンパク質結合ペプチドは、腫瘍抗原、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに含まれるもの、ヘッジホッグファミリーに含まれるもの、受容体型チロシンキナーゼ、プロテオグリカン関連分子、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーに含まれるもの、Ｗｎｔ関連分子及び血管新生の標的からなる群から選択される標的に結合する受容体タンパク質であってもよい。

本発明のいくつかの実施の形態によれば、他のタンパク質結合ペプチドは、血管新生の標的に特異的に結合してもよく、該標的は、限定されないが、アンジオポエチン（ＡＮＧ）、エフリン（Ｅｐｈ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ニューロピリン（ＮＲＰ）、プラスミノーゲン活性剤、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）及びそれらの受容体等である。したがって、本発明の実施の形態によれば、他のタンパク質結合ペプチドは、血管新生の標的に結合する及び拮抗する受容体タンパク質の細胞外部分を含んでもよい。他の実施の形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、血管新生因子受容体の細胞外部分に結合してもよい。

いくつかの実施の形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、ＶＥＧＦリガンドに結合する抗ＶＥＧＦ抗体（そのアミノ酸配列の説明のために国際公開第２０１５／２００９０５号を参照し、参照することでその全体が本明細書に組み入れられる）、又はＶＥＧＦ受容体に結合する抗ＶＥＧＦＲ１若しくは抗ＶＥＧＦＲ２抗体（そのアミノ酸配列の説明のために米国特許第５８７４５４２号明細書を参照し、参照することでその全体が本明細書に組み入れられる）であってもよい。また、他の実施の形態では、他のタンパク質結合ペプチドはＰＤＧＦリガンドに結合する抗ＰＤＧＦ抗体（そのアミノ酸配列の説明のために米国特許第５０９４９４１号明細書を参照し、参照することでその全体が本明細書に組み入れられる）、又はＰＤＧＦ受容体に結合する抗ＰＤＧＦＲベータ抗体（そのアミノ酸配列の説明のために米国特許第９２６５８２７号明細書を参照し、あらゆる目的のために参照することでその全体が本明細書に組み入れられる）であってもよい。

特定の実施の形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３のいずれか１つと同様にＶＥＧＦに結合する。いくつかの実施の形態では、他のタンパク質結合ペプチドは本明細書に開示されたＶＥＧＦＲのいずれかのＶＥＧＦＲの少なくとも１つの細胞外部分を含む。例えば、他のタンパク質結合ペプチドは、少なくとも１つのＶＥＧＦＲ１の細胞外部分又は１つのＶＥＧＦＲ２の細胞外部分を含む。他の実施例では、他のタンパク質結合ペプチドは、Ｉｇ様ドメイン２（Ｄ２）のようなＶＥＧＦＲ１の細胞外部分１つと、Ｉｇ様ドメイン３（Ｄ３）のようなＶＥＧＦＲ２の細胞外部分１つと、を含む。いくつかの態様では、他のタンパク質結合ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲ１の細胞外部分１つと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲ２の細胞外部分１つと、を含む。いくつかの態様では、他のタンパク質結合ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の細胞外部分の融合を含む。

他の実施の形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）：ＰＤＧＦＲ−α及びＰＤＧＦＲ−βのいずれか１つと同様にＰＤＧＦに結合する。いくつかの実施の形態では、他のタンパク質結合ペプチドは本明細書に開示されたＰＤＧＦＲのいずれかのＰＤＧＦＲの少なくとも１つの細胞外部分を含む。例えば、他のタンパク質結合ペプチドは、少なくとも１つのＰＤＧＦＲ−αの細胞外部分又は１つのＰＤＧＦＲ−βの細胞外部分を含む。他の実施例では、他のタンパク質結合ペプチドは、Ｉｇ様ドメイン１−３のようなＰＤＧＦＲ−βの細胞外部分１つを含む。いくつかの態様では、他のタンパク質結合ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分を含む。

また、他の実施の形態によれば、本発明は、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列を含むインテグリン結合ペプチドと、イムノグロブリンＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むヒト又はヒト化定常サブ領域と、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様Ｄ２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様Ｄ３を含む他のタンパク質結合ペプチドと、を含む融合タンパク質を提供する。融合タンパク質のさらなる実施の形態では、インテグリン結合タンパク質は、配列番号２に少なくとも８５％の配列相同性を有する。

参照のポリペプチド又は核酸配列に関して、用語“パーセント（％）配列相同性”は、必要であれば、最大のパーセント配列相同性が得られるように配列を位置合わせし、ギャップを導入し、配列相同性の一部としていかなる同類置換も考慮せずに、参照のポリペプチド又は核酸配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドに一致する候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドの割合として定義される。アミノ酸又は核酸のパーセント配列相同性を決定することを目的とするアライメントは、例えば公共の利用可能なコンピュータソフトウェアプログラム、例としてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）に開示されたようなもの、そしてＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等を用いて本技術分野において様々な方法で行われる。本技術分野の当業者は、比較される配列の全長に渡って最大のアライメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズム等、アライメントを評価するために適したパラメータを決定することができる。本明細書における目的に関して、所定のアミノ酸配列Ｂへの、所定のアミノ酸配列Ｂとの、又は所定のアミノ酸配列Ｂに対する、所定のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列相同性は、次のように、分数Ｘ／Ｙの１００倍で算出され、ここでＸはプログラムによるＡとＢのアライメントでの配列アライメントプログラムによって完全に一致すると評価されたアミノ酸残基の個数であって、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同じではない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列相同性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列と同じではないことが理解される。

本発明は２つの融合タンパク質を含む二量体の融合タンパク質を提供し、各融合タンパク質は、本明細書に開示された任意の融合タンパク質を含む。１つの実施の形態では、二量体の融合タンパク質は、２つの同じ融合タンパク質を含む。他の実施の形態では、二量体の融合タンパク質は、２種の異なる融合タンパク質を含んでもよい。本明細書に開示された融合タンパク質は、２つ以上の同一の融合タンパク質の多量体を形成してもよいし、又はヒト若しくはヒト化抗体の定常サブ領域を含む多量体形成ドメインを介して異種の融合タンパク質を形成してもよい。いくつかの実施の形態では、ヒト又はヒト化抗体の定常サブ領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域及びＩｇＥ Ｆｃ領域からなる群から選択される。さらなる実施の形態では、いくつかの実施の形態では、ヒト又はヒト化抗体の定常サブ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域及びｌｇＧ４ Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの態様では、サブ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む。Ｆｃ領域を含むイムノグロブリンをコードするアミノ酸配列は、本技術分野でよく知られている。

融合タンパク質の構成要素は、互いに直接結合するか、あるいはリンカーを介して結合してもよい。概して、用語“リンカー”は、１種以上の分子、例えば１つ以上の構成要素であるドメインとの間に挿入された核酸、アミノ酸又は非ペプチド部分を意味する。例えば、リンカーは、取り扱い易くするために構成要素間の興味のある所望の部位を得るのに用いられてもよい。また、リンカーは、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を増強し、構成要素がその最適な立体構造及び／又はその標的分子との適した相互作用を得るように立体的な障害を抑制するために与えられてもよい。リンカー配列は、受容体成分に本来結合する１つ以上のアミノ酸を含んでもよく、又は融合タンパク質の発現を増強するため、興味のある特に所望の部位をもたらすため、構成要素であるドメインが最適な立体構造を形成するため、及び／又はその標的分子と構成要素との相互作用を強めるために用いられる付加された配列であってもよい。

好ましくは、リンカーは融合タンパク質内の機能的な各構成要素の構造を妨げずに融合タンパク質の構成要素の柔軟性を増加させる。いくつかの実施の形態では、リンカー部分は長さ２から１００個のアミノ酸のペプチドリンカーである。例示的なリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ（Ｇ）ｎ及びＧｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）リンカーのような少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリンカーペプチド等である。本明細書に開示されるＧＳリンカーは、限定されないが（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＳＧ）ｎ、（Ｇ_２Ｓ）ｎ、Ｇ_２Ｓ_２Ｇ、（Ｇ_２ＳＧ）ｎ、（Ｇ_３Ｓ）ｎ、（Ｇ_４Ｓ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎＧｎ及びＧＳＧ_４ＳＧ_４ＳＧ等であって、ｎは１以上である。（Ｇ）ｎリンカーの１つの例は、Ｇ_９リンカー等である。適した直鎖ペプチドは、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン及びアラニル及び／又はセリニル及び／又はプロリニル及び／又はグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチド等である。リンカー部分は、本明細書に開示された融合タンパク質の任意の構成要素を結合するために用いられてもよい。いくつかの実施の形態では、リンカーが受容体タンパク質の細胞外部分とイムノグロブリンの定常サブ領域との間に用いられる。他の実施の形態では、リンカーがディスインテグリン又はそのバリアントとイムノグロブリンの定常サブ領域との間に用いられる。特定の実施の形態では、融合タンパク質は、受容体タンパク質の細胞外部分とディスインテグリン又はそのバリアントとの間のリンカー、及びディスインテグリン又はそのバリアントとイムノグロブリンの定常サブ領域との間のリンカーを含む。本発明の具体的な形態では、融合タンパク質は、４つを超えなければ少なくとも１つのリンカーを含んでもよい。

本明細書に開示された融合タンパク質は、宿主細胞から融合タンパク質を分泌するために機能するシグナルペプチドを含んでもよく、あるいは含まなくてもよい。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、興味のあるタンパク質をコードする核酸配列に機能するように結合される。いくつかの実施の形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施の形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを含まない。

さらに、本発明で説明される融合タンパク質は、タンパク質結合ペプチドの改変された形態を含んでもよい。例えば、融合タンパク質の構成要素は、例えばあらゆるタンパク質結合ペプチドへの糖鎖修飾、シアル酸付加、アセチル化及びリン酸化等の翻訳後修飾がなされてもよい。

実施の形態は、ほとんどの場合、融合タンパク質に含まれる２つのタンパク質結合ペプチドに関して記載されているが、本発明は、血管新生の過程の阻害に対して何らかの付加的な又は相乗的な効果をもたらすために２つ以上のタンパク質結合ペプチドを組み入れた融合タンパク質も考慮する。例えば、他の血管新生の標的に結合する、又は既存の２つのタンパク質結合ペプチドに関連する血管新生因子アンタゴニストとして機能する付加的なタンパク質結合ペプチドがあってもよい。

本発明は、本明細書に開示される本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸を提供する。さらに本発明は、本明細書に開示される融合タンパク質を製造する方法を提供する。該方法は、本発明の核酸配列を含むベクターで遺伝子導入された宿主細胞を培養することと、適した条件下で宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収することと、を含む。

本明細書で用いられる場合、用語“ポリヌクレオチド”又は“核酸”は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれか、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体の形態を意味する。したがって、この用語は、限定されないが、一本鎖、二本鎖又は多重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン又はピリミジン塩基又は他の天然の、科学的に又は生化学的に修飾された、非天然の、あるいは誘導されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。

融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素をコードする単離された核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はあらゆる他の形態等のＲＮＡの形態、あるいは限定されないが、クローニング若しくは合成的に作製された、又はそのあらゆる組み合わせで得られたｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ等のＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖若しくは一本鎖、又はそのあらゆる組み合わせであってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１本の鎖の一部は、センス鎖として知られるコードする鎖であってよく、又はそれはアンチセンス鎖としても呼ばれるコードしていない鎖であってもよい。融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素をコードする単離された核酸分子は、本技術分野で知られる様々な方法で調製されてよく、それは限定されないが天然源からの単離、又はオリゴヌクレオチドを介した変異生成、及び事前に調製されたバリアント又は融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素の非バリアント型のカセット式変異生成等である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，４ｔｈｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０１２）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）を参照されたい。

“ベクター”は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏいずれでも宿主細胞に輸送されるべき核酸を含む組み換えプラスミドを意味する。

本発明は、タンパク質の発現のために、融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素をコードする１種以上の核酸配列の細胞への導入のための核酸輸送媒体の使用を予期する。核酸輸送媒体の例は、リポソーム、天然ポリマー及び合成ポリマー等の生体適合性ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルス外皮、金属粒子、及びバクテリア、バキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルス等のウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター及び様々な真核生物及び原核生物の宿主で記載される本技術分野で典型的に用いられる他の組み換え媒体である。いくつかの実施の形態では、核酸輸送媒体は、プラスミドのような発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの通常の機能を確立するあらゆる要素（例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー選択マーカー）及び複製開始点を含んでもよい。プロモーターは本質的な、誘導可能な、又は制止可能なプロモーターであってもよい。核酸を細胞に輸送できるいくつかの発現ベクターが本技術分野で知られており、融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素の細胞内での産生のために用いられてもよい。発現した融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素は、本技術分野で知られた、及び本明細書に記載されたような従来技術に従って、細胞から収集され、精製されてもよい。

本明細書で提供されるのは、本明細書に記載された融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞である。融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素をコードする核酸（例えば、血管新生因子受容体の細胞外部分、ディスインテグリン又はそのバリアント及び／又はイムノグロブリンの定常サブ領域）が本技術分野で知られているあらゆる手段で標的細胞に提供され得る。いくつかの実施の形態では、興味のあるタンパク質をコードする核酸は、プラスミドのような発現ベクター内にある。他の実施の形態では、興味のあるタンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクター内にあり、該ベクターは、パッケージ化されており、ビリオンが細胞の感染に用いられてもよい。遺伝子導入及び形質転換の方法が、興味のあるタンパク質をコードする核酸を標的細胞に導入するのに適切に用いられることが知られている。ポリマー、リポソーム又はナノスフィアを利用する処方が、興味のあるタンパク質をコードする核酸の輸送に用いられてもよい。本発明に係る組み換えコンストラクトで形質転換又は遺伝子導入される細胞は、当業者にとって使いやすいものであればいずれでもよい。使用され得る例示的な細胞の種類は、バクテリア、酵母、真菌、昆虫、植物及び哺乳類の細胞等である。いくつかの実施の形態では、形質転換される又は遺伝子導入される細胞が、細胞又は哺乳類の宿主のために提供されてもよい。細胞又は哺乳類の宿主への輸送に適した細胞は、あらゆる起源、腫瘍又は細胞株由来の任意の哺乳類の細胞の種類等である。

本発明の融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素を産生するために用いられる細胞は、本技術分野の当業者に知られ、かつ選択された宿主細胞の培養に適した培地で成長される。通常、所定の培地には、必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子、ＤＨＦＲ、塩、緩衝液、ヌクレオシド、抗生物質、微量元素、及びグルコース又は同等のエネルギー源が補われる。また、あらゆる他の必要な栄養が本技術分野の当業者に知られる適切な濃度で加えられてもよい。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された細胞でこれまでに用いられたものであって、本技術分野の当業者にとって明らかである。

タンパク質は、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥ等のシリカ又は陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿法、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いたゲルろ過、疎水性親和性樹脂、マトリックスに固定化された適切な結合相手を用いたリガンド親和性、遠心分離、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣｏｒｅ、ウエスタンブロットアッセイ、アミノ酸及び核酸配列解析、並びに生物学的活性のような広く知られている方法で精製され、同定されてもよい。いくつかの実施の形態では、融合タンパク質は宿主細胞で発現され、限定されないが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィ、プロテインＧ親和性クロマトグラフィ、緩衝液交換、分子ふるいクロマトグラフィ、限外濾過、及び透析等の１つ以上の標準の精製技術の組み合わせを用いてそこから精製される。したがって、回収された融合タンパク質は、実質的に不純物を含まない。さらなる実施の形態では、回収される融合タンパク質は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のいずれかの純粋さである。

本明細書に開示される融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素は、限定されないが、標的とする結合相手への親和性、競合的結合、阻害活性、細胞増殖の阻害、腫瘍成長の阻害、及び血管新生の阻害等の生物学的活性に関して特徴づけられ、又は評価されてもよい。いくつかの実施の形態では、本明細書に開示される融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで生物学的活性に関して評価され得る。結合親和性の評価のための多くの方法が本技術分野で知られており、融合タンパク質又は融合タンパク質の構成要素の結合相手への結合親和性の決定に使用され得る。結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）値又は半分最大効果濃度（ＥＣ_５０）値で表されてもよい。

本明細書におけるいずれかの実施の形態では、融合タンパク質は、活性の阻害（例えば、血管新生因子活性及び／又はインテグリン活性の阻害）に関して、１μΜ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、又は０．００１ｎＭ以下のＥＣ_５０を有する。本明細書におけるいずれかの実施の形態では、融合タンパク質は、結合相手（血管新生因子及び／又はインテグリン）に対して、約１．０ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ又は５ｐＭ未満のＫｄを有し、Ｋｄはこれらの値の間のあらゆる値も含む。

また、本発明は、ディスインテグリン、抗インテグリンαｖβｘ抗体、抗インテグリンα５β１抗体、インテグリンαｖβｘ又はα５β１を標的とするフィブロネクチン、及びそれらのインテグリン結合フラグメントからなる群から選択されるインテグリン結合ペプチドと、血管新生因子を標的とする他のタンパク質結合ペプチドと、Ｆｃドメインと、を含む融合タンパク質を含有する医薬組成物を提供し、ｘは１、３、５、６又は８である。本発明の組成物は、治療上有効量の融合タンパク質を含む。

用語“治療上有効量”は、所望の生物学的又は臨床効果を引き出すのに必要とされる治療的な活性化合物の量を意味する。本発明の実施の形態によれば、“治療上有効量”は、臨床上の結果等の有益又は所望の結果をもたらすのに十分な量である。治療上有効量が１回以上の投与において投与され得る。疾患状態に関して、治療上有効量は、疾患の進展を改善し、安定化し、又は遅延させるのに十分な量である。本発明の具体的な実施の形態によれば、治療上有効量は、血管形成、血管透過性、浮腫、炎症、網膜症、線維症又はがんによって特徴づけられる疾患等、異常な血管新生を特徴とする障害を治療し又は予防するのに必要とされる融合タンパク質の量である。

いくつかの実施の形態では、医薬組成物は、約０．５から約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０から約８０ｍｇ／ｍＬ、例えば約４０、５０、６０、７０又は８０ｍｇ／ｍＬ、もっとも好ましくは約４０±約５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で緩衝液に処方された融合タンパク質を含む融合タンパク質を含む。他の好ましい実施の形態では、融合タンパク質は、約４０ｍｇ／ｍＬより多くのタンパク質濃度において緩衝液で処方される。

特定の実施の形態では、緩衝液は、約６．５から８、より好ましくは約７から７．５、さらに好ましくは約７．２のｐＨであるリン酸緩衝液である。リン酸緩衝液は、約５から２０ｍＭリン酸ナトリウム、例えば５、１０、１５又は２０ｍＭリン酸ナトリウム、より好ましくは約１０ｍＭリン酸ナトリウムと、約２０から６０ｍＭ塩化ナトリウム、より好ましくは約４０ｍＭ塩化ナトリウムと、約１から１０％重量／体積（ｗ／ｖ）スクロース、より好ましくは約５％ｗ／ｖスクロースと、約０．０１から０．０５％ｗ／ｖの界面活性剤、より好ましくは約０．０３％ｗ／ｖポリソルベート２０と、を含む。

他の特定の実施の形態では、緩衝液は、約５から８、より好ましくは約６から７、さらに好ましくは約６．８のｐＨであるヒスチジン緩衝液である。ヒスチジン緩衝液は、約１０から５０ｍＭヒスチジン、例えば１０、２０、３０、４０又は５０ｍＭヒスチジン、より好ましくは約２５ｍＭヒスチジンと、約１０から３０ｍＭ塩化ナトリウム、例えば１０、２０又は３０ｍＭ塩化ナトリウム、より好ましくは約２０ｍＭ塩化ナトリウムと、約１から１０％ｗ／ｖスクロース、例えば１、２、４、６、８又は１０％ｗ／ｖスクロース、より好ましくは約６％ｗ／ｖスクロースと、約０．０１から０．０５％ｗ／ｖの界面活性剤、より好ましくは約０．０３％ｗ／ｖポリソルベート２０と、を含む。

また、本発明は、個体又は対象におけるインテグリン関連疾患を治療又は予防するための、本発明に係る組成物の使用に関する。“個体”又は“対象”は、哺乳類である。哺乳類は、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長目の動物（例えば、ヒト及びサル等のヒトではない霊長目の動物）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等である。いくつかの実施の形態では、疾患の１つ以上の特徴又は症状を治療又は予防する方法は、融合タンパク質を含む、有効量の組成物を個体に投与することを含む。

本明細書に記載される方法は、限定されないが、炎症疾患、眼疾患、自己免疫疾患又はがん等の様々な疾患の治療のために使用され得る。いくつかの実施の形態では、治療される疾患は、限定されないが、関節リウマチ、炎症性関節炎、変形性関節炎、がん、線維症、網膜色素変性症、ぶどう膜炎（前部ぶどう膜炎又は後部ぶどう膜炎等）及び血管形成又は虚血によって特徴づけられる眼疾患（脈絡膜の血管形成、糖尿病性網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症、ポリープ状の脈絡膜の血管新生等）等である。

本明細書に記載される組成物は、限定されないが、静脈内、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、くも膜下腔内、経皮、経胸膜、動脈内、局所、吸入性、粘膜、皮下、経皮、胃腸内、関節内、嚢内、脳室（心室）内、脳内、尿道内、肝臓内及び腫瘍内等の任意の経路を介して個体に投与され得る。いくつかの実施の形態では、組成物は、（例えば静脈内注射で）全身に投与される。いくつかの実施の形態では、組成物は（例えば動脈内又は眼内注射で）局所的に投与される。

いくつかの実施の形態では、組成物は、眼又は眼組織に直接投与される。いくつかの実施の形態では、組成物は、眼に局所的に、例えば点眼で投与される。いくつかの実施の形態では、組成物は、眼に（眼内注射）又は眼に関連する組織に投与される。組成物は、例えば、眼内注射、眼窩周囲への注射、網膜下注射、硝子体内注射、脈絡膜上腔内注射、経中隔への注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、サブテノン（ｓｕｂ−Ｔｅｎｏｎ’ｓ）注射、眼球後への注射、眼球周囲への注射、又は後強膜近傍（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）輸送によって投与され得る。これらの方法は本技術分野で知られている。組成物は、例えば、硝子体、房水、強膜、結膜、強膜と結膜との間の領域、網膜脈絡膜組織、網膜黄斑、又は個体の眼の他の領域若しくは近傍に投与されてもよい。

組成物の最適な有効量は、経験的に決定されてもよく、疾患の種類及び重症度、投与経路、疾患の進展及び健康状態、個体の重さ及び体面積に依存する。この決定は本技術分野における当業者の技術範囲内である。また、融合タンパク質を含む組成物は、週に６回、週に５回、週に４回、週に３回、週に２回、週に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、９ヶ月ごとに１回、又は１年に１回投与され得る。

別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって広く理解されるものと同じ意味を有する。好ましい方法及び物質が本明細書で説明されるが、本明細書で説明されるものと類似の又は同等の、あらゆる方法及び物質が本発明の実行又は試験に用いられ得る。本明細書で言及されたすべての刊行物が、該刊行物の引用に関する方法及び／又は物質を説明するために、参照することで本明細書に組み入れられる。

限定ではなく説明を目的として提示される以下の実施例で、本発明がさらに説明される。

実施例１：ロドストミン変異タンパク質の産生
ディスインテグリンの発現方法
オーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術がロドストミン（Ｒｈｏ）変異コンストラクトの作製に用いられた。発現キット及び酵母導入ベクターであるｐＰＩＣＺａＡをインビトロジェンより購入した。遺伝子変異に対応する相補的な配列に加え、ＥｃｏＲ１認識部位及び精製を容易にするための６つのヒスチジン残基を含むセンスプライマーと、Ｓａｃ ＩＩ認識部位及びＴＴＡ停止コドンを含むように設計されたアンチセンスプライマーと、を用いてＰＣＲ増幅した遺伝子配列によって、遺伝子変異コンストラクトが作製された。ＰＣＲ産物が精製され、続いて酵母組み換えベクターであるｐＰＩＣＺａＡのＥｃｏＲ１部位及びＳａｃ ＩＩ部位にクローン化された。組み換えプラスミドが大腸菌コンピテント細胞ＤＨ５ａに形質転換され、低塩ルリアブロス（ＬＢ、１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ及び１．５％寒天、ｐＨ７．０）と、２５μｇ／ｍＬの抗生物質ゼオシンと、を含む寒天プレートで、コロニーが選択された。単一のコロニーが選択され、配列解析のためのプラスミドが増幅された。ＤＮＡ配列解析によってクローンが確認された後、１０μｇのプラスミドが調製され、Ｓａｃ Ｉ酵素で消化することで直鎖化された。直鎖状のコンストラクトがキット（Ｐｉｃｈｉａ ＥａｓｙＣｏｍｐ；インビトロジェン）を用いてピキア株Ｘ３３に形質転換され、ＹＰＳＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース、２％寒天、及び１Ｍソルビトール）と、１００μｇ／ｍＬのゼオシンと、を用いた寒天プレートで、クローンが選択された。遺伝子がピキアゲノムに組み込まれたことを確かめるためにＰＣＲ解析でピキア組み込み体が解析された。遺伝子挿入された複数のコピーを有する多数のクローンから最もタンパク質の発現が高いクローンが選択された。

ディスインテグリンの精製方法
Ｒｈｏ変異体が次のように作製された。１００μＬの備蓄細胞が２００ｍＬの酵母抽出物ペプトンブドウ糖（ＹＰＤ）培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン及び２％ブドウ糖）及び１００μｇ／ｍＬのゼオシンで４８時間、３０℃で培養された。次に細胞が８００ｍＬのＹＰＤ培地に移された。さらに４８時間後、細胞が遠心分離で収集され、１Ｌの最小メタノール培地（硫酸アンモニウムを含み、アミノ酸を含まない１．３４％酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）、４×１０^−５％ビオチン及び１％メタノール）で培養された。タンパク質の発現を誘導するために、２日間で２４時間毎に１回、１％メタノールが添加された。遠心分離後の上清が収集され、５ＬのＨ_２Ｏで２回、さらにｐＨ８の５Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び２００ｍＭ ＮａＣｌで１回、透析された。最終溶液がニッケル−キレートカラムに流され、２００ｍＭイミダゾールの勾配で溶出された。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで産生された組み換えＲｈｏタンパク質が、１５％から１８％のアセトニトリル勾配の逆相Ｃ１８ ＨＰＬＣによってさらに精製された。トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、タンパク質の精製が９５％より高いことを確認した。

実施例２：ＶＥＧＦＲ／Ｒｈｏ変異融合タンパク質の産生
合わせてＶＥＧＦ ｔｒａｐとして知られる、配列番号８のＦｌｔ−１受容体（ＶＥＧＦＲ１）の細胞外ドメインＤ２及び配列番号９のＦｌｔ−１受容体（ＶＥＧＦＲ２）の細胞外ドメインＤ３がＶＥＧＦリガンドへの結合のためのタンパク質成分として供された。ＶＥＧＦリガンド及びインテグリンの両方に結合するように、配列番号１０のＶＥＧＦＲ１ Ｄ２／ＶＥＧＦＲ２ Ｄ３及び配列番号１３のＲｈｏ変異体を含む融合タンパク質が産生された。

事前に作製された、ヒトイムノグロブリンＧ１ ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（ＩｇＧ１ Ｆｃ）に結合したＶＥＧＦ ｔｒａｐがＶＥＧＦＲ１ Ｄ２／ＶＥＧＦＲ２ Ｄ３−Ｒｈｏ変異体混成物をコードするＤＮＡコンストラクトの作製に用いられた。ＶＥＧＦ ｔｒａｐの説明のためにＨｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２，９９（１７）：１１３９３−１１３９８が参照され、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。配列番号１６の融合タンパク質は、配列番号１０のＶＥＧＦＲ１ Ｄ２／ＶＥＧＦＲ２ Ｄ３と配列番号１３のＲｈｏ変異体とを、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ_４Ｓ）の少なくとも１種のペプチドリンカーを介して連結することで構築された。

また同様に、配列番号１５の融合タンパク質２及び配列番号１７の融合タンパク質３が、配列番号１２及び配列番号１４のＲｈｏ変異体それぞれを、配列番号１０のＶＥＧＦＲ１ Ｄ２／ＶＥＧＦＲ２ Ｄ３に融合させることで作製された。配列番号１８の融合タンパク質４は、市販のＶＥＧＦ Ｔｒａｐであるアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）と配列番号１３のＲｈｏ変異体とを融合させることで作製された。図１は、本発明の１つの実施の形態における融合タンパク質の構造の概要を示す。ＳＳは配列番号２０のシグナルペプチド配列であって、ＣＨＯ細胞からのタンパク質の分泌を促進する。ＶＥＧＦ ｔｒａｐは、ヒトＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の細胞外Ｉｇ様ドメイン２及び３を構成する。Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３領域である。ＧＳはリンカーである。Ｒｈｏ変異体は、米国特許第７９４３７２８号明細書及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／４６３２２の明細書に開示されており、参照によりその配列が本明細書に組み入れられる。

配列番号１６のアミノ酸配列を有する融合タンパク質１を産生するため、融合タンパク質１をコードするＤＮＡ配列におけるコドンが、ＣＨＯ細胞での発現のために最適化された。配列番号２１の核酸配列を有するシグナルペプチドとともに、配列番号１９の核酸配列を有する、コドンが最適化されたＤＮＡが発現ベクターでクローン化された。遺伝子導入の７２時間前に、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞が４ｍＭグルタミン（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ ２０７８−０６）及び１％ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ １１０６７−０３０）を含むＣＤ ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ １２４９０−００３）に２×１０^５細胞／ｍＬで播かれた。宿主細胞は、Ｉｎｆｏｒｓ撹拌機（３６．５℃、湿度７５％、６％ＣＯ_２、１１０ＲＰＭ）でインキュベートされ、使用前に細胞密度が評価された。発現プラスミドＤＮＡの適量が宿主細胞に加えられ（使用体積１Ｌ又は５Ｌ）、ポリマー系遺伝子導入試薬が添加された。遺伝子導入された培養物が４時間、Ｉｎｆｏｒｓ撹拌機（３６．５℃、湿度７５％、６％ＣＯ_２、１１０ＲＰＭ）でインキュベートされ、所有の供給液が添加された。遺伝子導入から１０日後に遺伝子導入された培養物が回収された。研究材料の調製のために上清が精製された。精製方法は、除濁、プロテインＡ親和性クロマトグラフィ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌによる濃縮、サイズ排除クロマトグラフィ、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒによる透析及び処方緩衝液でのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌによる最終濃縮である。

抗ＶＥＧＦ及び抗インテグリン活性を兼ね備えた融合タンパク質が構築され、発現され、精製され、特徴づけられた。図２は、精製された融合タンパク質１をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付ける図である。分子マーカーはレーンＭに流されている。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒトＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の一部からなる、改変されたＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（陽性対照１；配列番号２２）の非還元形態及び還元形態がそれぞれレーン１及び２に流されている。市販のＶＥＧＦ−ｔｒａｐであるアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）（陽性対照２）の非還元形態及び還元形態がそれぞれレーン３及び４に流されている。融合タンパク質１の非還元形態及び還元形態がそれぞれレーン５及び６に流されている。各タンパク質試料につき３μｇの量が各レーンに流された。図２に示されたように、両方の陽性対照及び融合タンパク質１が還元条件及び非還元条件において高い整合性及び純度を示したことが結果から明らかである。融合タンパク質１の最終濃度は、調製した処方緩衝液中におよそ４０ｍｇ／ｍＬであった（２８０ｎｍでの吸光度に基づく）。

各コンストラクトを用いた細胞遺伝子導入によるタンパク質ホモダイマーの産生がＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び生物活性分析によって確認された。

実施例３：ヒトＶＥＧＦ_１６５への融合タンパク質の結合親和性
本発明に係る融合タンパク質のＶＥＧＦ−ＡのスプライスバリアントであるヒトＶＥＧＦ_１６５への結合親和性の評価に、直接結合酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が用いられた。

ＶＥＧＦ Ｔｒａｐは、治療用途のために設計された可溶性ＶＥＧＦ受容体であって、現在、ＡＭＤの治療に関してＦＤＡに承認されている。ＶＥＧＦ Ｔｒａｐは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＶＥＧＦＲ２の第３番目のＩｇ様ドメイン３（Ｄ３）に融合したＶＥＧＦＲ１の第２番目のＩｇ様ドメイン２（Ｄ２）を含む（Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２ Ａｕｇ ２０；９９（１７）：１１３９３−８）。ＶＥＧＦ Ｔｒａｐは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＰＩＧＦを標的とする。市販のＶＥＧＦ Ｔｒａｐであるアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）が陽性対照２として加えられた。

９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬのコーティング液（１μｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ_１６５を含む１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２）が添加され、プレートが４℃で一晩、インキュベートされた。４００μＬの１×ＰＢＳ緩衝液でウェルが２回洗浄され、余分な液体がペーパータオルで慎重に除去された。

各ウェルに４００μＬのブロッキング液（５ｇの無脂肪スキムミルクを含む１００ｍＬの１×ＰＢＳ）が添加され、プレートが室温で１時間、インキュベートされた。１×ＰＢＳ緩衝液でウェルが２回洗浄された。

融合タンパク質及び対照試料が、最高のタンパク質濃度を１０ｎＭとして、ブロッキング液で３倍に連続希釈された。１００μＬの連続希釈された試料が各ウェルに添加された。プレートが覆われ、室温で１時間、プレート撹拌機（〜１００ｒｐｍ）上でインキュベートされた。ウェルが洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄された。

ブロッキング液で１：２５００に希釈された１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体が各ウェルに添加された。プレートに蓋がされ、室温で１時間、プレート撹拌機上でインキュベートされた。プレートが洗浄緩衝液で３回洗浄された。

各ウェルに１００μＬの３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が添加され、プレートが３〜５分間インキュベートされ、反応を促進させた。反応を止めるために、１００μＬのストップ液（１Ｎ ＨＣｌ）が各ウェルに加えられた。

ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、吸収波長４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度（ＯＤ）が測定された。吸光度が融合タンパク質又は対照のタンパク質濃度に対してプロットされ、シグナルが最大有効濃度の半分であった濃度（ＥＣ_５０）が決定された。

評価された本発明の融合タンパク質のＥＣ_５０値で表される結合親和性は、０．１０と０．２１ｎＭとの間であった。ＥＬＩＳＡの結果が表１に示されている。

実施例３の結果は、本発明の実施形態に係る融合タンパク質が高い親和性でＶＥＧＦ_１６５に結合することを示した。これは図３にも示されている。

実施例４：インテグリンαｖβ３への融合タンパク質の競合的結合
本発明の融合タンパク質１のインテグリンαｖβ３への結合親和性を評価するために競合的結合が用いられた。野生型Ｒｈｏ（配列番号１）及びＲｈｏバリアントＫＧ（配列番号１３）が実施例１に従って合成され、それぞれ陽性対照３及び陽性対照４として競合的結合アッセイの対象とされた。

１μｇ／ｍＬで溶解したビクトロネクチンを含むコーティング液が９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加され、プレートが４℃で一晩、インキュベートされた。ウェルがＰＢＳ緩衝液で２回洗浄され、余分な液体がペーパータオルで慎重に除去された。

ブロッキング液（５ｇの無脂肪スキムミルクを含む１００ｍＬの１×ＰＢＳ）が各ウェルに添加され、プレートが室温で１時間、インキュベートされた。ウェルが１×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄された。

いくつかの濃度の陽性対照３、陽性対照４及び融合タンパク質１が、所定濃度の可溶性インテグリンαｖβ３と混合された。１００マイクロリットル（１００μＬ）の連続希釈された試料が各ウェルに添加された。プレートが覆われ、室温で１時間、プレート撹拌機（〜１００ｒｐｍ）上でインキュベートされた。ウェルが洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄された。

希釈された抗インテグリンαｖ一次抗体が添加され、インキュベートされ、続いて洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を含むブロッキング液が各ウェルに添加された。プレートに蓋がされ、室温で１時間、プレート撹拌機上でインキュベートされた。プレートが洗浄緩衝液で３回洗浄された。

各ウェルに１００μＬの３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が添加され、プレートが３〜５分間インキュベートされ、反応を促進させた。反応を止めるために、１００μＬのストップ液（１Ｎ ＨＣｌ）が各ウェルに加えられた。

ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、吸収波長４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度（ＯＤ）が測定された。吸光度が融合タンパク質又は対照のタンパク質濃度に対してプロットされ、シグナルが最大阻害濃度の半分であった濃度（ＩＣ_５０）が決定された。

評価された本発明に係る融合タンパク質のＩＣ_５０値で表される競合的結合は、２．２と１６ｎＭとの間であった。結果が表２に示され、図４にも示されている。

実施例５：融合タンパク質によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイが本発明の融合タンパク質の機能性を評価するために行われた。市販のＶＥＧＦ Ｔｒａｐであるアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）が陽性対照２として加えられた。

１００μＬのコーティング液（１％ゼラチンを含む再蒸留水）が９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加され、プレートが３７℃で２時間又は一晩、インキュベートされた。ウェルが１×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄された。

３５００個のヒト臍帯静脈内皮細胞を含む内皮細胞成長培地が各ウェルに添加され、プレートが３７℃で一晩、インキュベートされた。

融合タンパク質試料が、最高のタンパク質濃度を３００ｎＭとして、アッセイ緩衝液（Ｍｅｄｉｕｍ−１９９ １×Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔｓ、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×抗生物質／抗真菌剤）で希釈された。融合タンパク質試料がＶＥＧＦ_１６５に混合され（８ｎｇ／ｍＬ）、混合物が室温で一晩、インキュベートされた。続いて、ウェルが２００μＬの１×ＰＢＳで洗浄された。

１００μＬのＶＥＧＦ_１６５／試料混合物が各ウェルに添加され、プレートが５％ＣＯ_２、３７℃で７２時間、インキュベートされた。インキュベーションに続いて、１０μＬのＭＴＳ検出試薬（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）＋フェナジンメトサルフェートを含む蒸留されたＰＢＳ）が各ウェルに添加され、プレートが３７℃で２．５時間、インキュベートされた。

ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、吸収波長４９０ｎｍにおける各ウェルの吸光度（ＯＤ）が測定された。吸光度が融合タンパク質又は対照のタンパク質濃度に対してプロットされ、細胞増殖が５０％阻害された濃度（ＩＣ_５０）が決定された。

評価された本発明に係る融合タンパク質の細胞増殖の阻害（ＩＣ_５０）が、０．０３９と０．１０３ｎＭとの間であることが示された。増殖アッセイの結果が表３に示され、図５にも示されている。陽性対照２及び融合タンパク質１の両方が、ＶＥＧＦ依存のＨＵＶＥＣ増殖の阻害において同程度の活性を示した。

実施例６：融合タンパク質によるαｖβ３及びα５β１細胞付着の阻害
αｖβ３過剰発現ＣＨＯ細胞のフィブリノーゲンへの付着及びα５β１発現Ｋ５６２細胞のフィブロネクチンへの付着が融合タンパク質存在下で評価された。

９６ウェルのｌｍｍｕｌｏｎ−２マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）が、５０〜５００ｎＭの濃度で基質を含む１００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で被覆され、４℃で一晩、インキュベートされた。基質及びその被覆濃度は、フィブリノーゲン（Ｆｇ）が２００μｇ／ｍＬで、フィブロネクチン（Ｆｎ）が２５μｇ／ｍＬであった。２００μＬの熱変性させた１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で各ウェルを、室温で１．５時間インキュベートすることで非特異的なタンパク質結合部位がブロックされた。熱変性ＢＳＡが除かれ、各ウェルが２００μＬのＰＢＳで２回洗浄された。

特許出願番号６２／ＵＳ２０１５／４６３２２と起源が同じであるインテグリンαｖβ３を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−αｖβ３）がＤＭＥＭで維持された。ＡＴＣＣから取得したヒト赤白血病Ｋ５６２が特許出願番号６２／ＵＳ２０１５／４６３２２に記載されたように維持され、５％ＦＣＳを含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地で培養された。収集されたＫ５６２が１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で洗浄され、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び５００μΜ ＭｎＣｌ_２を含むＴｙｒｏｄｅ’ｓ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５）に再懸濁された。細胞（ＣＨＯ及びＫ５６２）が３×１０^５細胞／ｍＬに希釈され、１００μＬの細胞がアッセイに使用された。Ｒｈｏ及びその変異体が培養された細胞に添加され、５％ＣＯ_２、３７℃で１５分間インキュベートされた。Ｒｈｏ及びそのバリアントが０．００１〜５００μＭの濃度で阻害剤として使用された。そして、処理された細胞が被覆されたプレートに加えられ、５％ＣＯ_２、３７℃で１時間インキュベートされた。次に、インキュベーション液が除かれ、２００μＬのＰＢＳで２回洗浄することで非付着細胞が除去された。結合した細胞がクリスタルバイオレット染色で定量された。簡単には、ウェルが１００μＬの１０％ホルマリンで１０分間固定され、乾燥された。次に、５０マイクロリットル（５０μＬ）の０．０５％クリスタルバイオレットが室温で２０分間、ウェルに加えられた。各ウェルが２００μＬの蒸留水で４回洗浄され、乾燥された。１５０μＬの着色液（５０％アルコール及び０．１％酢酸）を添加することで、カラー化が行われた。結果として６００ｎｍでの吸光度が読まれ、その値は、付着した細胞の個数に相関した。

細胞付着の阻害の算定は次の式によって行った。

上記の式において、ＴＡは“試験物”を意味し、ＮＣは“陰性対照”を意味し、ＰＣは“陽性対照”を意味する。

ＩＣ_５０は特定のインテグリンによって仲介される細胞付着の５０％阻害に要するディスインテグリンのバリアントの濃度（ｎＭ）として定義される。このため、より低いＩＣ_５０は各インテグリンの細胞付着活性の阻害におけるディスインテグリンのバリアントの高い特異性又は有効性、結果として各インテグリンへのディスインテグリンのバリアントの結合活性（又は選択性）が高いことを示す。ＩＣ_５０の結果が表４にまとめられている。図６は、融合タンパク質１によるＣＨＯ−αｖβ３細胞付着の阻害を示す図である。

実施例７：ＨＵＶＥＣ管形成の融合タンパク質による阻害
ＨＵＶＥＣ（１．５×１０^４細胞／ウェル）がマトリゲルで被覆された９６ウェルプレートに播かれた。６つの用量（０．１μΜ、０．３μΜ、１μΜ、３μΜ、１０μΜ、及び３０μΜ）の融合タンパク質１及び媒体が成長培地とともに、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で各ウェルに添加された。１８時間のインキュベーション後、毛管のようなネットワークに似ている上皮細胞管の形態が光学顕微鏡で評価された。管の長さ全体の途絶（抗血管新生）が各写真から測定され、媒体対照群と比較して評価された。そして、管形成の最小阻害濃度（ＭＩＣ≧３０％）が決定され、抗血管新生の程度の評価に用いられた。すべての試験でスラミンが抗血管新生の陽性対照（陽性対照５）として使用された。

評価された融合タンパク質１の管形成の阻害（ＩＣ_５０）が０．１μＭ未満であると評価され、陽性対照４よりも高い有効性を示した。管形成アッセイの結果が表５に示されている。図７Ａ−Ｇは、融合タンパク質１がそれぞれ０．１μΜ、０．３μΜ、１μΜ、３μΜ、１０μΜ、及び３０μΜの用量で添加された場合の管形成に対する融合タンパク質１の阻害作用を示す図である。

実施例８：融合タンパク質によるダッチベルティッド（Ｄｕｔｃｈ Ｂｅｌｔｅｄ）ウサギにおけるＶＥＧＦ誘導漏出の阻害
本発明の融合タンパク質が、血管漏出防止におけるその有効性を評価するために、血管透過性のｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験された。このモデルでは、制御できない網膜漏出を誘導するために、ウサギの眼の硝子体にＶＥＧＦが注射された。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したヒトＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の部分からなる組み換え融合タンパク質であるアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、及びＶＥＧＦ−Ａを阻害することで血管新生を阻害する組み換えヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）がそれぞれ陽性対照２及び６として加えられた。

１つの実施の形態では、医薬組成物は２５ｍＭヒスチジン緩衝液、２０ｍＭ ＮａＣｌ、６％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベートを含むｐＨ６．０の処方緩衝液に、２０，０００μｇ／ｍＬの融合タンパク質１を含んでいた。

ダッチベルティッドウサギがイソフルラン（３−５％）を用いて麻酔され、その眼が眼科用ベタジン溶液で処置された。続いて、ウサギの眼が滅菌食塩水で洗浄され、塩酸リドカイン（２％注射剤）又はプロパラカイン（０．５％）が眼表面に使用された。

１日目に、本発明の融合タンパク質、媒体（陰性）対照、又は参照（陽性）対照があらかじめ決められた用量でＢＤ ３００μＬインスリン注射器（３１ｇａ×５／１６インチ）を用いて、ダッチベルティッドウサギの硝子体内に注射された。針が眼の背側の側頭部の象限（ｄｏｒｓｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｑｕａｄｒａｎｔ）を通って、角膜輪部のおよそ３−４ｍｍ後ろかつ背側の直筋の３−４ｍｍ横に挿入され、５０μＬの溶液が輸送された。３日目に、外因性のＶＥＧＦ_１６５を同じ眼に注射することで血管漏出が誘導された。

漏れやすさ及びねじれを評価するために、ＶＥＧＦ注射から３日後にすべての用量群について蛍光眼底血管造影法（ＦＡ）が０（通常）から４（重症）のスケールを用いて行われた。

融合タンパク質の投与、ＶＥＧＦ誘導、及び評価の前に、視覚刺激の兆候がドレーズ評価システムを用いてスコア化された。ドレーズ分析によれば、ウサギのすべての眼が投与開始前は正常であった。眼の最小の炎症に係る一過性の兆候が、硝子体内への投与後にすべての処置群で観察され、硝子体内への処置に起因すると考えられた。本試験の経過において明白な薬剤に関連する知見はなかった。

媒体対照群に関するＦＡは、網膜血管系の漏出及びねじれに関連する最高の平均スコア（２．５８）であった。２つの参照陽性対照群２及び６が０及び０．２５の平均スコアであったことは、網膜血管系の漏出及びねじれを顕著に抑制することを示している。試験された本発明の融合タンパク質が０．１６７の平均スコアであったことは、ＶＥＧＦに誘導される網膜の漏出及びねじれの抑制において、陽性対照と同等に有効であることを示す。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果は表６に示されている。図８Ａ−Ｄは、融合タンパク質１及び陽性対照によるダッチベルティッドウサギにおけるＶＥＧＦで誘導される漏出の阻害を明示する代表的なＦＡを示す。

実施例９：ダッチベルティッドウサギにおけるＶＥＧＦ誘導性漏出の融合タンパク質による用量反応阻害
血管漏出の防止におけるその用量反応有効性を評価するために、本発明の融合タンパク質がいくつかの用量で網膜血管透過性のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて試験された。このモデルでは、ヒトＶＥＧＦＲ_１６５が網膜漏出を誘導するためにウサギの硝子体内に注射された。

１日目に、ダッチベルティッドウサギの硝子体内に、いくつかの用量の本発明の実施の形態に係る融合タンパク質１、媒体（陰性）対照、又は参照（陽性）対照が注射された。３日目に同じ眼に外因性のＶＥＧＦ_１６５を注射することで血管漏出が誘導された。

漏れやすさ及びねじれを評価するために、ＶＥＧＦ誘導の３日後（６日目）にすべての用量群についてＦＡが０（通常）から４（重症）のスケールを用いて行われた。

融合タンパク質の投与、ＶＥＧＦ誘導、及び評価の前に、視覚刺激の兆候がドレーズ評価システムを用いてスコア化された。ドレーズ分析によれば、ウサギのすべての眼が投与開始前は正常であった。眼の最小の炎症に係る一過性の兆候が、硝子体内への投与後にすべての処置群で観察され、硝子体内への処置に起因すると考えられた。本試験の経過において明白な薬剤に関連する知見はなかった。

最初の外因性ＶＥＧＦ注射に関して、媒体対照群に関するＦＡは、網膜血管系の漏出及びねじれに関連する最高の平均スコア（３．４）であった。２つの参照陽性対照群が０の平均スコアであったことは、網膜血管系の漏出及びねじれを顕著に抑制することを示している。試験された本発明の融合タンパク質（融合タンパク質１）が１００、５００及び１０００μｇの用量でそれぞれ０．０８、０．４２及び０．１７の平均スコアであったことは、ＶＥＧＦに誘導される網膜の漏出及びねじれの抑制において陽性対照と同等に有効であることを示す。

用量反応ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果が表７に示されている。

実施例１０：ラットでの融合タンパク質によるレーザー誘導された脈絡膜の血管形成（ＣＮＶ）における損傷範囲の縮小
ブラウンノルウェイラットの眼が１％サイクロジル溶液で膨張され、光から保護された。膨張に続いて、ケタミンとキシラジンとの混合物を用いてラットが麻酔された。１日目に５３２ｎｍのレーザーを用いて各眼の網膜に３箇所の熱傷による病変がつくられた。

３日目に、ケタミンとキシラジンとの混合物を用いて動物が麻酔され、その眼が膨張され、所定の用量で５μＬの融合タンパク質１、媒体（陰性対照）、又は陽性対照２（参照）が、３３規格針を備えるハミルトン注射器を用い動物の両眼の硝子体に注射された。

損傷形成の成功を確認するために、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ小動物眼底鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて眼底画像が損傷形成前、熱傷による病変形成後及び２２日目に撮像された。熱傷による病変の血管形成を評価するために、動物は２２日目に１μＬ／ｇ体重で１０％フルオレセインナトリウムのＩＰ注射を受けた。図９Ａ−Ｃに示されるように、フルオレセイン血管造影図から損傷範囲が評価され、用量群間で比較された。ここで、図９Ａは媒体の図を示し、図９Ｂは陽性対照２の図を示し、図９Ｃは融合タンパク質１の図を示す。図９Ａ−Ｃにおける矢印（黒色三角）は、レーザー損傷部位を示す。

実施例１１：サルでの融合タンパク質によるレーザー誘導ＣＮＶにおける損傷範囲の縮小
サルで確立された、レーザーで誘導されたＣＮＶモデルで融合タンパク質が試験される。５３２ｎｍのダイオードレーザー光凝固を用いて６から９箇所の熱傷が各眼の斑の周りに形成され、０．５−４ｍｇの本発明の融合タンパク質が同日に硝子体内に注射される。

２０日後に、２．５％可溶性ペントバルビタール（１ｍＬ／ｋｇ）の静脈内注射で動物が安静にされる。眼を開けたままにするために瞼が固定され、眼底カメラを用いてカラー写真が撮像される。

フルオレセイン色素（２０％フルオレセインナトリウム；０．０５ｍＬ／ｋｇ）が下肢の静脈に注射される。色素の注射後、いくつかの時点で、ＣＮＶ損傷に関連するフルオレセインの漏出を検査するために動脈相、初期の静動脈相、及びいくつかの後期の静動脈相を含む写真が撮像される。

実施例１２：異種移植マウスにおける融合タンパク質による同所性のヒト膠芽細胞腫腫瘍成長の阻害
ヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７−ＭＧ（２．５×１０^５細胞／２μＬ、ルシフェラーゼ細胞）がＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに移植され、同所性の異種移植モデルが確立される。

腫瘍成長に対する本発明の融合タンパク質の阻害効果を評価するために、腫瘍細胞がヌードマウスに移植され、３から３０ｍｇ／ｋｇの範囲のいくつかの濃度の本発明の実施の形態に係る融合タンパク質が週に２回、マウスの静脈内に投与される。腫瘍成長及び動物の生存率が８週まで毎週評価される。

実施例１３：ブレオマイシン誘導線維症マウスにおける融合タンパク質による肺線維症の阻害
体重２０±２ｇの雄のＣ５７ＢＬ／６マウスが肺線維症の誘導及び線維症の阻害における融合タンパク質の影響に用いられる。動物がイソフルランで麻酔され、続いて、１日目に、１．５ＩＵ／ｋｇ（２５μｌの生理食塩水に溶解）のブレオマイシンの単回用量が気管内に投与される。ブレオマイシンのこの投与は肺の線維症を再現性よく引き起こすことが知られており、１０−２０％の死亡率をもたらし得る。

陽性対照としてニンテダニブが１日あたり１０−５０ｍｇ／ｋｇで、日ごとに経口で強制投与される。投与量は、１０ｍＬ／ｋｇ体重である。陰性対照として、融合タンパク質媒体がＩＶ注射で動物に投与される。非処置対照がブレオマイシン投与後の肺の病理変化の検査に使用される。いくつかの用量の融合タンパク質１及び媒体が１日１回、１日目から開始して２１日目まで静脈内に投与される。体重等の臨床所見が毎日検査される。２２日目に動物が犠牲にされる。細胞数及びＴＧＦ−β１を調べるために気管支肺胞洗浄液が収集される。

線維症の発症に対する本発明の融合タンパク質の阻害効果を評価するために、肺組織が採取され、緩衝液中で均質化され、標準曲線に比較してヒドロキシプロリンの変化が評価される。線維症の発現及び炎症特異的バイオマーカーを集めるために、他の病理組織学実験が行われる。

本発明が、その具体的な実施の形態に関連して詳細に説明されたが、本技術分野の当業者にとって、本発明の要旨と範囲を逸脱しない範囲で様々な変更及び改変がなされ得ることが明らかである。

ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
479685SEQLIST.TXTというファイル名でＡＳＣＩＩフォーマット化された配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表の公式なコピーは、２０１６年６月１７日に作成され、３７ｋｂのファイルサイズを有し、明細書とともに提出された。このＡＳＣＩＩフォーマット化された文書に含まれる当該配列表は、本明細書の一部であって、その全体が参照によって本明細書に取り込まれる。

（付記）
（付記１）
ディスインテグリン、抗インテグリンαｖβｘ抗体、抗インテグリンα５β１抗体、インテグリンαｖβｘ又はα５β１を標的とするフィブロネクチン、及びそれらのインテグリン結合フラグメントからなる群から選択されるインテグリン結合ペプチドと、
血管新生因子を標的とする他のタンパク質結合ペプチドと、
Ｆｃドメインと、
を含み、
ｘが１、３、５、６又は８である、
融合タンパク質。

（付記２）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するインテグリン結合ペプチドと、
ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドと、
Ｆｃドメインと、
を含み、
前記インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する、
融合タンパク質。

（付記３）
ディスインテグリン及びそのインテグリン結合フラグメントを含むインテグリン結合ペプチドと、
ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドと、
Ｆｃドメインと、
を含み、
前記インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する、
融合タンパク質。

（付記４）
ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２のアミノ酸配列からなる群から選択されるインテグリン結合部分と、
イムノグロブリンＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むヒト又はヒト化定常サブ領域と、
ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を有する他のタンパク質結合ペプチドと、
を含む、融合タンパク質。

（付記５）
Ｃ末端からＮ末端に、前記インテグリン結合ペプチド、前記Ｆｃドメイン及び前記他のタンパク質結合ペプチドを含む、付記１から３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。

（付記６）
Ｎ末端からＣ末端に、前記インテグリン結合ペプチド、前記Ｆｃドメイン及び前記他のタンパク質結合ペプチドを含む、付記１から３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。

（付記７）
前記インテグリン結合ペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有する、付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質。

（付記８）
前記インテグリン結合ペプチドが配列番号２に少なくとも８５％の配列相同性を有する、付記７に記載の融合タンパク質。

（付記９）
付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードする核酸。

（付記１０）
付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質の二量体。

（付記１１）
付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、ベクター。

（付記１２）
付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、前記融合タンパク質を産生する条件下で培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記融合タンパク質を回収することと、を含む、融合タンパク質の製造方法。

（付記１３）
付記１から４のいずれか一つに記載の有効量の融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、血管新生の疾患を治療／予防する方法。

（付記１４）
前記インテグリン結合ペプチドと前記他のタンパク質結合ペプチドとの間にリンカー配列をさらに含む、付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質。

（付記１５）
前記他のタンパク質結合ペプチドの上流にシグナルペプチド配列をさらに含む、付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質。

（付記１６）
前記血管新生因子は、アンジオポエチン（ＡＮＧ）、エフリン（Ｅｐｈ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ニューロピリン（ＮＲＰ）、プラスミノーゲン活性剤、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤受容体（ｕＰＡＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びその受容体を含む、付記１に記載の融合タンパク質。

（付記１７）
付記１から４のいずれか一つに記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される補助剤、担体又は賦形剤と、を含む組成物。

（付記１８）
前記血管新生の疾患が、関節リウマチ、炎症性関節炎、変形性関節炎、眼及び全身のがん、腫瘍関連転移及び浸潤、突発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は肝線維症、糖尿病性腎症及び／又は腎線維症、皮膚線維症又はケロイド、創傷治癒、心臓線維症、虚血で誘導される脳卒中を含む全身の線維性疾患、血管形成又は虚血によって特徴づけられる眼疾患（脈絡膜の血管形成を含む）、ぶどう膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症及び糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）を含む、付記１３に記載の方法。

（付記１９）
前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインがＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ１−Ｄ７を含む、付記２又は３に記載の融合タンパク質。

（付記２９）
前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインが、ｉ）ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号１０に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、を含む、付記２又は３に記載の融合タンパク質。

（付記２１）
前記Ｆｃドメインと前記インテグリン結合ペプチド又は前記他のタンパク質結合ペプチドとの間にＧＳ又はＧ_９リンカーをさらに含む、付記１から３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。

Claims (21)

1. ディスインテグリン、抗インテグリンαｖβｘ抗体、抗インテグリンα５β１抗体、インテグリンαｖβｘ又はα５β１を標的とするフィブロネクチン、及びそれらのインテグリン結合フラグメントからなる群から選択されるインテグリン結合ペプチドと、
   血管新生因子を標的とする他のタンパク質結合ペプチドと、
   Ｆｃドメインと、
   を含み、
   ｘが１、３、５、６又は８である、
   融合タンパク質。
2. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するインテグリン結合ペプチドと、
   ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドと、
   Ｆｃドメインと、
   を含み、
   前記インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する、
   融合タンパク質。
3. ディスインテグリン及びそのインテグリン結合フラグメントを含むインテグリン結合ペプチドと、
   ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドと、
   Ｆｃドメインと、
   を含み、
   前記インテグリン結合ペプチドは、ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する、
   融合タンパク質。
4. ＲＧＤモチーフに、又はＲＧＤモチーフの近隣に少なくとも１つの変異を有する配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１に少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２のアミノ酸配列からなる群から選択されるインテグリン結合部分と、
   イムノグロブリンＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むヒト又はヒト化定常サブ領域と、
   ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を有する他のタンパク質結合ペプチドと、
   を含む、融合タンパク質。
5. Ｃ末端からＮ末端に、前記インテグリン結合ペプチド、前記Ｆｃドメイン及び前記他のタンパク質結合ペプチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
6. Ｎ末端からＣ末端に、前記インテグリン結合ペプチド、前記Ｆｃドメイン及び前記他のタンパク質結合ペプチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
7. 前記インテグリン結合ペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に少なくとも８５％の配列相同性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
8. 前記インテグリン結合ペプチドが配列番号２に少なくとも８５％の配列相同性を有する、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. 請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
10. 請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質の二量体。
11. 請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、ベクター。
12. 請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、前記融合タンパク質を産生する条件下で培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記融合タンパク質を回収することと、を含む、融合タンパク質の製造方法。
13. 請求項１から４のいずれか一項に記載の有効量の融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、血管新生の疾患を治療／予防する方法。
14. 前記インテグリン結合ペプチドと前記他のタンパク質結合ペプチドとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
15. 前記他のタンパク質結合ペプチドの上流にシグナルペプチド配列をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
16. 前記血管新生因子は、アンジオポエチン（ＡＮＧ）、エフリン（Ｅｐｈ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ニューロピリン（ＮＲＰ）、プラスミノーゲン活性剤、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤受容体（ｕＰＡＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びその受容体を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
17. 請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される補助剤、担体又は賦形剤と、を含む組成物。
18. 前記血管新生の疾患が、関節リウマチ、炎症性関節炎、変形性関節炎、眼及び全身のがん、腫瘍関連転移及び浸潤、突発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は肝線維症、糖尿病性腎症及び／又は腎線維症、皮膚線維症又はケロイド、創傷治癒、心臓線維症、虚血で誘導される脳卒中を含む全身の線維性疾患、血管形成又は虚血によって特徴づけられる眼疾患（脈絡膜の血管形成を含む）、ぶどう膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症及び糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）を含む、請求項１３に記載の方法。
19. 前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインがＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ１−Ｄ７を含む、請求項２又は３に記載の融合タンパク質。
20. 前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインが、ｉ）ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号１０に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、を含む、請求項２又は３に記載の融合タンパク質。
21. 前記Ｆｃドメインと前記インテグリン結合ペプチド又は前記他のタンパク質結合ペプチドとの間にＧＳ又はＧ_９リンカーをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。