JP2018519836A - Cho細胞における改善された一過性タンパク質発現のための系及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図6A
Description
本出願は、米国特許法§119(e)条に基づき、2015年7月13日に出願された、「System and Method for Improved Transient Protein Expression in CHO Cells」と題する米国仮特許出願第62/191,969号に対して優先権を主張し、その出願は、本出願と同じ出願人であり、その全内容は、本明細書に完全に記載されるかのように、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明は、概して、トランスフェクション及び細胞培養の分野に関する。具体的には、本発明は、培養された浮遊CHO細胞における組換えタンパク質の収量発現に好適なトランスフェクション系を提供する。本発明はさらに、培養された浮遊CHO細胞における組換えタンパク質の高収量発現のための系及び方法に関する。
したがって、浮遊状態で真核細胞の成長を可能にし、同時に低減された操作量で細胞のトランスフェクションを可能にする細胞培地及び一過性トランスフェクション系が当該技術分野において依然として必要である。かかる培地は、好ましくは、高密度への哺乳類細胞の成長を容易にし、かつ/または組換えタンパク質の発現レベルを増大し、細胞集塊を低減し、また血清、トランスフェリン、インスリンなどの動物タンパク質による補足を必要としない無血清及び/もしくは既知組成及び/もしくは無タンパク質培地、ならびに/または動物由来の材料を欠く培地であるべきである。好ましくは、この種類の培地は、293細胞及びCHO細胞など、上皮細胞及び線維芽細胞を含む、通常付着依存性である哺乳類細胞の浮遊増殖を可能にする。好ましくは、かかる培地は、現在利用可能な培地で典型的に得ることができるよりも高い密度で、前述の細胞型の増殖及び培養も可能にするであろう。加えて、かかる培養培地は、バイオテクノロジー産業において、培養された哺乳類細胞によって産生された多量の商業的または科学的に重要な生物学的物質(例えば、ウイルス、組換えタンパク質、生物学的製剤、組換え抗体など)の、容易で、より費用効果が高くかつ効率的な産生及び精製を可能にし、哺乳類細胞の増殖を採用する方法においてより一貫した結果をもたらす。これら及び他の必要性は、本発明によって満たされる。
参照による組み込み
以下の説明において、細胞培養及び組換えDNA技術において使用されるいくつかの用語が広範囲にわたって用いられる。かかる用語が与えられる範囲を含む仕様及び特許請求の範囲の明確かつより一貫性のある理解を提供するために、以下の定義が提供される。
対象のタンパク質は、直接的だけでなく、好ましくはシグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、組換えにより産生され得る。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及び処理される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。
発現ベクター及びクローニングベクターの両方は、1つ以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製することができる核酸配列を含有する。一般的に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体DNAと関係なく複製することができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。かかる配置は、様々な細菌、酵母、及びウイルスに関して周知である。プラスミドpBR322からの複製起点は大半のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド起源は酵母に好適であり、種々のウイルス起源(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV)は哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点構成成分は、哺乳類発現ベクターに必要ではない(SV40起源は、典型的には、単に初期プロモーターを含有するため、使用され得る)。
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される、選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を付与する、(b)栄養要求欠損を補完する、あるいは(c)複合培地から入手不可能な重要な栄養素、例えば、BacilliのためにD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
d)プロモーター構成成分
高等真核生物による本発明による対象のタンパク質をコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加または増強されることが多い。現在、哺乳類遺伝子からの多くのエンハンサー配列が知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−胎児タンパク質、及びインスリン)。排他的ではないが、多くの場合、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側(bp100〜270)のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のための増強要素に関して、Yaniv,Nature 297:17−18(1982)も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の位置5’または3’でベクター内にスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから部位5’に位置する。さらなるエンハンサーが当該技術分野において既知であり、例えば、哺乳離もしくはウイルス遺伝子から得られる、またはそれに由来するエンハンサーを含み得る。本明細書における使用に想定される1つの特に好ましいエンハンサーは、ウッドチャック肝炎転写後調節要素(WPRE)である。
真核宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞)において使用される発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含有する。かかる配列は、通常、真核またはウイルスDNAもしくはcDNAの非翻訳領域である、5’及び時折3’から得ることができる。これらの領域は、mRNAコード抗体の非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。1つの有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026及び本明細書に開示される発現ベクターを参照されたい。
本発明はさらに、高レベルの対象のタンパク質を発現するための方法に関する。本発明の方法は、(a)浮遊状態で増殖される哺乳類細胞を得ることと、(b)浮遊状態で細胞の増殖を支持するのに十分な条件下で、細胞を本発明の培養培地と接触させ、培養された細胞を、対象のタンパク質をコードする発現可能な核酸でトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を1つ以上の発現エンハンサーと接触させ、定義された期間にわたって、対象のタンパク質の発現を可能にする条件下でトランスフェクトされた細胞を培養し、細胞を採取することを含む、浮遊状態で哺乳類細胞(特に上述されるもの、及びとりわけ、293細胞、293 F細胞、PER−C6細胞、CHO細胞もしくはその誘導体(CHO−S細胞、浮遊CHO細胞、CHO−S−2H2細胞、ExpiCHO−S(商標)細胞、CapT細胞、COS−7L細胞、及びSp2/0細胞、またはこれらの任意の誘導体を含む)を培養することを含み得る。
CHO発現系:
一部の実施形態による本明細書に記載されるCHO発現系は、浮遊適応チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(CHO−S−2H2細胞)に基づく高収量一過性トランスフェクション系である。CHO発現系は、(1)CHO−S−2H2細胞、(2)高密度成長培地、例えば、ExpiCHO発現培地など、(3)本系において使用するのに最適化されたカチオン性トランスフェクション試薬、例えば、ExpiFectamineCHO試薬、(4)発現エンハンサー組成物、(5)成長調節因子組成物、(6)任意選択で、複合体化培地、例えば、OptiPro(商標)SFM複合体化培地、及び(7)任意選択で、ヒトIgG抗体陽性対照ベクターを含み得る。
ExpiCHO−S細胞
CHO−S−2H2細胞系は、CHO−S細胞系のクローン誘導体である。CHO−S−2H2細胞は、ExpiCHO発現培地における高密度浮遊培養に適応している。凍結細胞は、ExpiCHO発現培地に供給され、その中で直接解凍され得る。
高密度成長培地、例えば、ExpiCHO発現培地は、高密度培養及び浮遊状態でのCHO−S細胞のトランスフェクションに具体的に適応した既知組成培地である。
本系において使用するための成長調節因子組成物は、長期高密度一過性トランスフェクションを支持するために、高密度成長培地と共に機能するように設計された、最適化された既知組成の無血清で無タンパク質の動物起源を含まない製剤である。一部の事例では、「成長調節因子」、「成長エンハンサー」、及び「フィード」(例えば、図5に示される概略図など)という用語は、互換可能に使用され得る。
カチオン性トランスフェクション試薬、例えば、ExipFectamine(商標)CHO試薬は、高密度CHO−S−H2H培養内への核酸のトランスフェクションを最適化する。
発現エンハンサー:
i.Opti−Pro(商標)SFM複合体化培地
OptiPro(商標)SFMは、ExpiFectamineCHO試薬とプラスミドDNAを複合体化するために使用される無血清の動物起源を含まない培地であり、効率的なトランスフェクションを通して高タンパク質発現を提供する。
ii.陽性対照ベクター
pcDNA3.4ベクター(100μLの1mg/mL溶液)におけるヒトIgG抗体陽性対照は、ExpiCHO−S細胞においてトランスフェクション及び発現の陽性対照として提供される。ExpiCHO−S細胞におけるこのタンパク質の発現により、以下の特徴を有する培養培地内に分泌されるIgGが得られる:
標準的なプロトコル:約0.5〜1g/Lがトランスフェクション後8〜10日目に採取される
高力価プロトコル:1.0〜1.5g/Lがトランスフェクション後10〜12日目に採取される
最大力価プロトコル:>1.5g/Lがトランスフェクション後12〜14日目に採取される
陽性対照ベクターを使用することにより、培養の生存率は、トランスフェクション翌日におよそ95%のはずであり、トランスフェクション実行を通して70%付近にとどまる。
2.ExpiCHO発現系に対する重要な背景情報
以下は、典型的な一過性CHOプロトコルとは異なってもよく、またトランスフェクションの最良の結果を達成するのに役立つ、ExpiCHO発現系のいくつかの主要な特徴である。
・ExpiCHO−Sは、およそ17時間の倍加時間の高密度成長条件に適応した頑強な細胞系である。ExpiCHO−S細胞は、振盪フラスコ培養において、約4〜15×106細胞/mLに及ぶ広い対数期成長窓を有し、約20×106細胞/mLの最大密度を有する。
・継代培養時に、4〜6×106生細胞/mL(すなわち、初期の対数成長)に達したExpiCHO−S細胞を使用することが理想的である。この初期対数成長窓の外側の密度で継代培養される細胞は、経時的により長い倍加時間及び低力価を示す場合がある。必要な場合は、継代培養時に、初期の播種密度を増加させて標的の4〜6×106生細胞/mL密度を達成する。
・トランスフェクション前に、解凍後2回以上の継代にわたって、新しく解凍した細胞を培養において回復させる。
・プラスミドDNA及びExpiFectamineCHO試薬の複合体化は、冷試薬(4°C)を使用して、室温で行う。組み合わされたら、ExpifectamineCHO/DNA複合体を直ぐにフラスコに添加してもよいが、性能を全く失うことなく、最大5分間保持することができる。より長い保持時間(最大10分間)は、性能のわずかな喪失をもたらす場合がある。10分を超える保持時間は推奨されない。十分な混合を確実にするために、使用前にExpiFectamine試薬を必ず4〜5回転倒させる。
・最大の柔軟性のために、CHO発現系は、優先度により3つの異なるプロトコルを提供する(追加の情報については表1を参照されたい)。
・標準的なプロトコル:トランスフェクション後1日目に単一フィード、発現実行を通してフラスコを37°Cに維持。
・高力価プロトコル:トランスフェクション後1日目に単一フィード、トランスフェクション後1日目にフラスコを32°Cに変更。
・最大力価プロトコル:トランスフェクション後1日目及び5日目にフィード、トランスフェクション後1日目にフラスコを32°Cに変更。
注記:大半のタンパク質に関して、最大力価プロトコルを使用して得られた力価は、標準的なプロトコルよりも2〜3倍大きいが、一部のタンパク質は、タンパク質の性質により、温度を変更することなく、標準的なプロトコルを使用して、同様に、または良好に発現する。
・このプロトコルは、以下のCorningポリカーボネート製のバッフルの付いていない、通気式フラスコを使用して開発された:125mL:#431143、250mL:#431144、500mL:#431145、1L:#431147、3L:#431252。
3.ExpiCHO−S細胞を培養するための一般的なガイドライン
i.一般的な細胞の取り扱い
CHO−S−2H2細胞の成長及び維持のため、以下の一般的なガイドラインに従う。
・細胞と接触する全ての溶液及び機器は、減菌されなければならない。常に適切な無菌技法を使用し、層流フード下で作業する。
・実験を開始する前に、解凍後2回以上の継代にわたって、新しく解凍した細胞を培養において回復させる。
・トリパンブルー排除試験方法による血球計数器または自動細胞計数器を使用して、細胞生存率を決定する。対数期の培養は>95%生存可能であるべきである。
ii.培地の調製
・ExpiCHO発現培地は、GlutaMAX(商標)−I試薬と共に製剤化される。追加の補足を必要としない。
b.CHO−S−2H2の解凍及び維持
i.はじめに
以下のプロトコルに従い、ExpiCHO−S細胞を解凍し、細胞培養を開始する。CHO−S−2H2細胞系は、90%ExpiCHO発現培地及び10%DMSOにおいて、1×107生細胞/mLで1mLの細胞を含有するバイアルで供給される。CHO−S−2H2細胞を、キットと共に供給される、予め温めたExpiCHO発現培地中に直接解凍する。
ii.必要な材料
・CHO−S−2H2細胞
・ExpiCHO発現培地
・125mLのポリカーボネート製の使い捨ての減菌通気式Erlenmeyer振盪フラスコ
・生細胞密度及び生存率パーセントを決定するための試薬及び機器(例えば、血球計数器または自動細胞計数器、トリパンブルー)
・8%CO2の加湿条件の37℃のインキュベータ中の125±5rpmに設定された軌道式振盪機
注記:このプロトコルの振盪速度は、19mm(3/4インチ)の軌道直径の使用を前提とする。他の軌道直径の振盪機に関して、以下の方程式を使用して対応する振盪速度を決定する:
d1=古い振盪機のスロー長であり、d2=新しい振盪機のスロー長であり、
r1=古い振盪機のrpmであり、r2=新しい振盪機のrpmスロー長である。
通常使用される換算:
19mmスローで125rpm=25mmスローで110rpm
19mmスローで70rpm=25mmスローで60rpm
iii.CHO−S−2H2細胞の解凍
1.細胞のバイアルを液体窒素貯蔵場所から取り出し、37℃の水浴で1〜2分間旋回させて、少量の氷のみが残るまで細胞を迅速に解凍する。バイアルを水中に浸漬しない。
2.70%エタノールで拭くことによって、バイアルを除染する。
3.2mLまたは5mLのピペットを使用して、バイアルの全内容物を、予め温めた30mLのExpiCHO発現培地が入った125mLのポリカーボネート製の使い捨ての減菌の通気キャップ付きErlenmeyer振盪フラスコ内に移す。
4.125±5rpmで回転する軌道式振盪機プラットホーム上の8%CO2の加湿条件の37℃のインキュベータ中で細胞をインキュベートする。
5.解凍翌日に、生細胞密度及び生存率パーセントを決定する。細胞生存率は、解凍の1日後、>95%のはずである。
6.細胞密度及び生存率の監視を続け、以下の手順により、培養が4〜6×106生細胞/mL(典型的には、解凍後3〜4日)に達したら、細胞を継代培養する。
iv.ExpiCHO−S細胞の日常的な継代培養
注記:以下のガイドラインは、125mLのErlenmeyerフラスコ内での30mL培養に基づく。培養体積は、他のフラスコサイズに比例して拡張することができる。
1.生細胞密度及び生存率パーセントを決定する。
2.生細胞密度を使用して、下の表の推奨される播種密度により、新しい125mLのフラスコに播種するのに必要な細胞浮遊体積を計算する。
4.培養が4〜6×106生細胞/mLの密度に達するまで、125±5rpmで回転する軌道式振盪機プラットホーム上の8%CO2の加湿条件を含む37℃のインキュベータ中でフラスコをインキュベートする。
注記:この初期対数成長窓の外側の密度で継代培養される細胞は、経時的により長い倍加時間及び低力価を示す場合がある。継代培養時に、初期の播種密度を修正して標的の4〜6×106生細胞/mL密度を達成する。
5.ステップ1〜4を繰り返してトランスフェクション用の細胞を維持または拡張する。
c.ExpiCHO−S細胞のトランスフェクト
i.はじめに
高密度浮遊ExpiCHO−S培養の最適なトランスフェクションのために、トランスフェクションキットに含まれるExpiFectamineCHO試薬を使用する。一部の他の無血清培地製剤とは異なり、ExpiCHO発現培地はトランスフェクションを阻害しない。ExpiCHO発現培地は、培地を交換または添加する必要なくトランスフェクションを可能にするように具体的に製剤化される。
ii.必要な材料
・ExpiCHO発現培地中で培養されたCHO−S−2H2細胞
・減菌のフェノール及び塩化ナトリウムを含まず、大半はスーパーコイルDNAを含有するプラスミドDNA調製物
・ヒトIgG抗体陽性対照ベクター(キットにおいて提供される100μLの1mg/mL溶液)
・ExpiFectamineCHO(商標)試薬(4°C)
・OptiPro(商標)SFM複合体化培地(4°C)
・ExpiCHO発現培地(37℃)
・ポリカーボネート製の使い捨ての減菌Erlenmeyerフラスコ
・8%CO2の加湿条件の37℃のインキュベータ中の軌道式振盪機
・5%CO2の加湿条件の32℃のインキュベータ中の軌道式振盪機(OPTIONAL:以下のプロトコルステップ8を参照されたい)
・生細胞密度及び生存率パーセントを決定するための試薬及び機器
iii.タンパク質発現の最適化
発現レベルは、発現された特定の組換えタンパク質及び使用されたベクターにより異なるが、ExpiCHO発現系は、1つのトランスフェクションから次のトランスフェクションの任意の特定のタンパク質に関して一貫した発現レベルを呈する。初めてタンパク質を発現するとき、発現実行の長さを最適化するために、時間経過(例えば、トランスフェクション後のいくつかの時間点で細胞または培地を採取する)を行うことを望んでもよい。ExpiCHO発現培地は、ExpiCHOエンハンサー及びExpiCHOフィードと共に最大14日間一過的にトランスフェクトされた培養を支持するように設計される。
iv.トランスフェクションの拡張
ExpiCHO発現系は、125mL〜3Lのフラスコサイズに拡張可能である。大きいフラスコサイズ(すなわち、3Lのフラスコ)に関して、培養の振盪速度は、125rpmから70rpmに減速されなければならない(表1を参照されたい)。
1フィードは、初期培養体積の30%を表す
2フィードは、初期培養体積の約25%を表す
3フィードは、初期培養体積の16%を表す
ExpiCHO−S細胞のトランスフェクト
手順は125mLのフラスコにおけるExpiCHO−S細胞の開始体積が25mLのトランスフェクションに関して以下に詳述し、体積は比例して拡張され得る(参考に表1を参照されたい)。我々は、系の性能を確保するために、Beta Testキットの一部として含まれるヒトIgG抗体陽性対照ベクターの発現を試験することを推奨する。
1.細胞がおよそ4〜6×106生細胞/mLの密度に達するまでExpiCHO−S細胞を継代培養し、維持する。
2.トランスフェクションの前日に、ステップ1からのExpiCHO−S細胞を、3〜3.5×106生細胞/mLの最終密度に継代培養して、次の日におよそ7〜10×106生細胞/mLの密度を達成する。生存率は、トランスフェクションを進めるためには>95%であるべきである。
3.新しい予め温めたExpiCHO発現培地を添加することにより、ステップ2からの細胞を6×106生細胞/mLの最終密度に希釈する。
4.ExpiFectamineCHO/プラスミドDNA複合体を以下のように調製する:
注記:トランスフェクトされる培養体積のmL当たり0.5〜1.0μgの範囲の総プラスミドDNAが大半のタンパク質に適切である。
a)ExpiFectamineCHO試薬瓶を穏やかに4〜5回転倒して十分に混合する。
b)冷OptiPRO培地でプラスミドDNAを希釈する。チューブを旋回させるか、または穏やかに渦流することにより混合する。
c)冷OptiPRO培地でExpiFectamineCHO試薬を希釈する。上下に穏やかにピペット操作することにより混合する。
d)希釈したExpiFectamineCHO試薬を希釈したDNAに添加する。上下に穏やかにピペット操作することにより混合する。
5.ExpiFectamineCHO/プラスミドDNA複合体を室温で1〜5分間インキュベートし、次いで、ステップ3からの振盪機フラスコに全溶液を移し、添加中はフラスコを旋回させる。
6.125rpm(3Lの振盪フラスコに関しては70rpm)で回転する軌道式振盪機上の空気中8%CO2の加湿条件の37℃のインキュベータ中で細胞をインキュベートする。
7.翌日(トランスフェクション後18〜22時間)、選択されたプロトコルにより、以下の添加を行う:
a)標準的なプロトコル:150μLのExpiCHOエンハンサー及び7.5mLのExpiCHOフィードをフラスコに添加し、添加中はフラスコを旋回させる。振盪している空気中8%CO2の加湿条件の37℃のインキュベータにフラスコ(複数可)を戻す。
b)高力価プロトコル:150μLのExpiCHOエンハンサー及び6mLのExpiCHOフィードをフラスコに添加し、添加中はフラスコを旋回させる。振盪している空気中5%CO2の加湿条件の32℃のインキュベータにフラスコ(複数可)を戻す。
c)最大力価プロトコル:150μLのExpiCHOエンハンサー及び4mLのExpiCHOフィードをフラスコに添加し、添加中はフラスコを旋回させる。振盪している空気中5%CO2の加湿条件の32℃のインキュベータにフラスコ(複数可)を戻す。トランスフェクション後5日目に、さらに4mLのExpiCHO Feedを添加し、振盪している32℃のインキュベータにフラスコ(複数可)を戻す。
8.タンパク質を採取する最適な時間は、発現されるタンパク質の特定の特性及び選択されたプロトコルに依存する。参照のため、ヒトIgG抗体陽性対照がトランスフェクション後の翌日に採取される。
a)標準的なプロトコル:トランスフェクション後8〜10日
b)高力価プロトコル:トランスフェクション後10〜12日
c)最大力価プロトコル:トランスフェクション後12〜14日
キット
一過性CHO系において産生されたモノクローナル抗体の典型的な収量は、10〜100mg/L範囲であり、研究者は、彼らの研究に十分な材料を生成するために大規模なトランスフェクション、複数のトランスフェクション、またはそれらの両方を行うことを強いられる。一過性CHOにおけるタンパク質発現のリットル当たりのグラムまたはより大きいレベルを達成するために、発現系の各構成成分が新しく開発され、得られるCHO一過性発現系において最大性能を得るために個々に及び集合的の両方で、DoEによって最適化された。このプロセスの最初のステップとして、新しい高発現CHOクローンを、既存のGMP CHO−S細胞バンクから単離し、新しい既知組成及び動物起源を含まない細胞培養培地(ExpiCHO発現培地)に適合させた。ExpiCHO発現培地中で維持されるとき、これらの新しい細胞(CHO−S−2H2)は、単一細胞の非集塊表現型を維持しながら、標準的な振盪フラスコ培養において、高密度(>20×106細胞/mL)に迅速に(倍加時間約17時間)成長する。CHO−S−2H2細胞は、経時的に一貫した性能を確実にする継代にわたって優れた成長の安定性(図2A)及びタンパク質発現(図2B)を示す。ExpiCHO発現培地は、6.0×106細胞/mLのトランスフェクションを可能にし、ExpiCHOフィードと共に使用されるとき、最大14日のタンパク質産生実行を通して高細胞生存率(採取時で70〜80%)を維持し、タンパク質精製前に最小限しか/全く事前処理を必要としない極めてきれいな上清を可能にする。
ヒトIgG1ウサギIgG及びエリスロポエチン(Epo)は、推奨される製造者のプロトコル及び上記による本発明のCHO発現系(CHO ES)、FreeStyle(商標)MAX、及びExpi293(商標)発現系において一過的に発現された。CHO ESに関して、最大力価プロトコルが使用された。6または7日目(FreeStyle MAX CHO及びExpi293)または10〜12日目(CHO ES)にタンパク質を採取し、ForteBio OctetまたはELISAにより定量化した。ExpiCHOにおけるタンパク質収量の増幅率は、2つの他のそれぞれの系に関して棒の上に示される。全てのタンパク質はpcDNA 3.4発現ベクターを使用して発現された。データは図3A〜3Cに要約される。図3Aにおいて、Expi293(商標)系と比較して、CHO ES系は、ヒトIgGについて3倍高い力価、ウサギIgGについて4倍高い力価、及びEpoについて2倍高い力価を生成した。FreeStyleCHO発現系と比較して、ExpiCHO系は、ヒトIgGについて160倍高い力価、ウサギIgGについて95倍高い力価、及びEpoについて25倍高い力価を生成した。
CHO ESに関して、最大力価プロトコルが全てのプラスミドに使用された。19/20の抗体に関して、CHO ES系は、Expi293(商標)系よりも高い力価を生成した。これらの20の抗体のうち、1つは、Expi293(商標)系を使用して発現することができなかったが、CHO ES系において82mg/Lをもたらし、1つの抗体はいずれの系においても発現することができなかった。Expi293(商標)と比較して、CHO ESの発現における増幅率は、1.4〜3.9倍の範囲であり、平均増加は2.4倍であった。
最大力価プロトコル(実線、上の曲線)、高力価プロトコル(破線の中央の曲線)、及び標準的な力価プロトコル(ハッチング線の下の曲線)(プロトコルの詳細に関しては上記を参照されたい)を使用して、ヒトIgGがCHO ES系において一過的にトランスフェクトされた。IgG力価は、発現期間を通してForteBio octetにより定量化され、グラフにプロットされた。全てのプロトコルは、トランスフェクトされた培養のリットル当たり少なくとも1グラムのタンパク質を達成した。最大力価プロトコルは、標準的なプロトコルよりもおよそ3倍高い収量を生成し、一方、高力価プロトコルはおよそ2倍高い収量を生成した。タンパク質の収量は、発現された特定のタンパク質に非常に依存し、3つの異なるプロトコルで達成された相対的収量はこの研究において観察された結果を反映していない可能性がある。データを図6Aに示す。図6Bのデータは、3つのCHO ESプロトコルの発現実行中の細胞生存率に対応する。
図7は、示される発現系において発現されたウサギモノクローナル抗体のリガンド結合アッセイからの結果を示す。データは、安定した一過性のCHOならびにExpi293由来タンパク質間で比較可能な性能を示す。
本発明のCHO発現系は、初期の段階の薬物候補スクリーニング中の一過性タンパク質発現のためのCHO細胞の使用に革命を起こすのに役立ち得る。Expi293及びCHO ES一過性発現系により産生された組換えIgGのグリコシル化パターンを、安定したCHO細胞において発現された同じタンパク質と比較した。ExpiCHO系において産生された組換えIgGのグリコシル化は、安定したCHO細胞系のグリコシル化に非常に近いことは明らかであり、一過的に発現された薬物候補がCHOにおいて製造された下流生物学的薬剤を模倣することを確信をもってユーザに提供する。
Claims (63)
- 培養された浮遊CHO細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、
CHO細胞の浮遊培養物を得ることであって、前記CHO細胞が、高密度培養条件下での成長に適応している、得ることと、
浮遊CHO細胞の成長を可能にするように適応した高密度成長培地中で、約2×106〜約2×107細胞/mlの間の細胞密度で、前記CHO細胞を培養することと、
トランスフェクション試薬の存在下で前記CHO細胞を発現ベクターでトランスフェクトすることであって、前記発現ベクターが、発現されたタンパク質を産生することができる核酸配列を含む、トランスフェクトすることと、
第1の期間にわたって、前記トランスフェクトされたCHO細胞をインキュベートすることと、
前記トランスフェクトされたCHO細胞を、少なくとも1つの発現エンハンサー組成物及び少なくとも1つの成長調節因子組成物と接触させることと、
前記発現ベクターが前記タンパク質を発現するような条件下で、第2の期間にわたって、前記トランスフェクションエンハンサー及び成長調節因子の存在下で前記トランスフェクトされたCHO細胞をインキュベートすることと、
前記トランスフェクトされたCHO細胞を採取し、前記発現されたタンパク質を単離することと、を含む、方法。 - 前記第2の期間後に、前記トランスフェクトされた細胞を、再度、前記成長調節因子組成物と接触させ、前記トランスフェクトされたCHO細胞を採取し、前記発現されたタンパク質を単離する前に、第3の期間にわたって、前記トランスフェクトされた細胞をインキュベートする、請求項1に記載の方法。
- 前記第3の期間が、最大約20日間、最大約15日間、最大約14日間、最大約13日間、最大約12日間、最大約11日間、最大約10日間、最大約9日間、最大約8日間、最大約7日間、最大約6日間、最大約5日間、最大約4日間、約20日間、約15日間、約14日間、約13日間、約12日間、約11日間、約10日間、約9日間、約8日間、約7日間、約6日間、約5日間、約4日間である、請求項2に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされた細胞が前記発現エンハンサー組成物及び前記成長調節因子組成物と接触させられた後に、前記トランスフェクトされた細胞が、37℃未満かつ30℃超の温度で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされた細胞が、35℃未満かつ31℃超の温度で培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされた細胞が、約32℃の温度で培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記浮遊CHO細胞が、高密度培養条件下での成長に適応したCHO−S細胞またはCHO−S細胞の誘導体である、請求項1に記載の方法。
- 前記浮遊CHO細胞が、CHO−S−2H2細胞またはCHO−S−クローン14細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記浮遊CHO細胞が、約3×106〜約15×106細胞/ml、約3.5×106〜約12×106細胞/ml、約4×106〜約10×106細胞/ml、約4.5×106〜約9×106細胞/ml、約5×106〜約8×106細胞/ml、約5.5×106〜約7×106細胞/ml、約6×106〜約6.5×106細胞/ml、約6×106〜約6.25×106細胞/mlの間、または約6×106細胞/mlの細胞密度で、トランスフェクション前に培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質または高分子アミン系トランスフェクション試薬を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬が、ポリエチレンイミン(PEI)またはその誘導体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PEIが、直鎖状PEIである、請求項11に記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記浮遊CHO細胞をトランスフェクトする前に、カチオン性脂質が、前記発現と接触させられて、トランスフェクション複合体を形成する、請求項13に記載の方法。
- 前記トランスフェクション複合体が、0℃超かつ20℃未満、15℃未満、10℃未満、8℃未満、または5℃未満の温度で形成される、請求項14に記載の方法。
- トランスフェクション前の前記浮遊培養物の体積が、約20mL〜約1500ml、約25ml〜約1000ml、約30ml〜約750ml、約50ml〜約500ml、約75ml〜約400ml、約100ml〜約200mlの範囲、またはそれらの間の任意の範囲である、請求項1に記載の方法。
- トランスフェクション前の前記浮遊培養物の体積が、約20ml、約25ml、約30ml、約35ml、約40ml、約45ml、約50ml、約55ml、約60ml、約65ml、約70ml、約75ml、約80ml、約100ml、約125ml、約150ml、約175ml、約200ml、約250ml、約300ml、約400ml、約500ml、約750ml、1000ml、もしくは約1500ml、またはそれらの間の任意の体積である、請求項1に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも2つ以上を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも3つ以上を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、及び酪酸ナトリウムを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物が、浮遊細胞の集塊を少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、または少なくとも50%低減する組成物をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 浮遊細胞の集塊を低減する前記組成物が、硫酸デキストランを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物中の硫酸デキストランの濃度が、約10mg/ml〜約200mg/ml、約25mg/ml〜約175mg/ml、約50mg/ml〜約150mg/ml、約75mg/ml〜約125mg/ml、約90mg/ml〜約110mg/mlの間、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲である、請求項23に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸(VPA)を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約5mg/ml〜約50mg/ml、約5mM〜約200mMの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項25に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約20mM〜約150mM、約25mM〜約125mM、約50mM〜約100mM、約75mM〜約80mMの範囲である、請求項25に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約50mM〜約150mM、約75mM〜約125mM、約80mM〜約120mM、約90mM〜約110mM、または約100mMである、請求項25に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約10mg/ml〜約20mg/ml、約12mg/ml〜約18mg/ml、約14mg/ml〜約16mg/ml、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項25に記載の方法。
- バルプロ酸の濃度が、約10mg/ml、約10.5mg/ml、約11mg/ml、約11.5mg/ml、約12mg/ml、約12.5mg/ml、約13mg/ml、約13.5mg/ml、約14mg/ml、約14.5mg/ml、約15mg/ml、約15.5mg/ml、約16mg/ml、約16.5mg/ml、約17mg/ml、約17.5mg/ml、約18mg/ml、約18.5mg/ml、約19mg/ml、約19.5mg/ml、もしくは約20mg/ml、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項29に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物が、プロピオン酸ナトリウムを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記培養物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0.2mM〜約100mM、約0.5mM〜約50mM、約0.75mM〜約25mM、約1mM〜約15mM、約1.25mM〜約10mM、約1.5mM〜約5mM、約b0.75mM 約0.8mM、約1mM、約1.2mM、約1.4mM、約1.5mM、約1.5mM、約1.7mM、約2.0mMの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項31に記載の方法。
- 前記培養物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0.1mg/ml〜約0.2mg/mlの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項31に記載の方法。
- 前記発現エンハンサー組成物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0.5mM〜約5mM、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項31に記載の方法。
- 前記発現組成物が、酪酸ナトリウムを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記培養物中の酪酸ナトリウムの最終濃度が、約0.01mM〜約1mM、約0.05mM〜約0.5mM、約0.01mM〜約0.25mM、約5mg/L〜約20mg/L、約8mg/L〜約15m/L、約10mg/L〜約14mg/Lの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項35に記載の方法。
- 前記浮遊培養物の体積が、約25mLμl〜約50Lの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項1に記載の方法。
- 前記浮遊培養物の体積が、約100mLμl〜約1Lの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記浮遊培養物の体積が、約200mLμl〜約500mlの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクションステップの細胞密度が、約1×106〜約20×106細胞/mlの間である、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクションステップの細胞密度が、約2×106〜約6×106の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、前記トランスフェクションステップ後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補足を必要としない、請求項1に記載の方法。
- 前記高密度培養培地が、前記トランスフェクションステップ後に、交換、補充、または補足されない、請求項1に記載の方法。
- 前記高密度成長培地が、75%、80%、85%、90%、95%を上回ったままの細胞生存率で、2.×106細胞/ml〜約2×107細胞/mlを上回る密度で、トランスフェクトされたCHO細胞の成長を促進する無血清/無タンパク質既知組成培養培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記高密度成長培地が、前記発現ベクターでのそのトランスフェクション後に、75%、80%、85%、90%、95%を上回ったままの細胞生存率で、2×106細胞/ml〜約2×107細胞/mlを上回る密度で、トランスフェクトされたCHO細胞の成長を促進する無血清/無タンパク質既知組成培養培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記高密度成長培地が、前記トランスフェクションステップ後に、前記培地の補足、交換、または補充を必要としない、請求項1に記載の方法。
- 前記高密度成長培地が、前記トランスフェクションステップ後に、補足、交換、または補充されない、請求項1に記載の方法。
- 前記発現されたタンパク質を精製することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CHO細胞が、1つ以上の発現増強タンパク質を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記発現増強タンパク質が、AKT、P18、P21、Bcl−XL、及びPKBaからなるリストから選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記CHO細胞が、1つ以上の発現増強タンパク質を一過的に発現する、請求項49に記載の方法。
- 前記CHO細胞が、1つ以上の発現増強タンパク質を安定して発現する、請求項49に記載の方法。
- 前記第1の期間が、約12時間〜約2日間、約15〜約36時間、約16時間〜約30時間、約18〜約28時間、約19〜約26時間、約19〜約25時間、約20〜約24時間の範囲、またはそれらの間の任意の時間である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の期間が、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、約24時間、約25時間、約26時間、約27時間、約28時間、最大48時間、またはそれらの間の任意の時間である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の期間が、最大約20日間、最大約19日間、最大約18日間、最大約17日間、最大約16日間、最大約15日間、最大約14日間、最大約13日間、最大約12日間、最大約11日間、最大約10日間、最大約9日間、最大約8日間、最大約7日間、最大約6日間、最大約5日間、最大約4日間、最大約3日間、またはそれらの間の任意の時間である、請求項1に記載の方法。
- 前記成長調節因子組成物が、複数のアミノ酸を含み、各アミノ酸は、約0.1mg/ml〜約8mg/mlの範囲の濃度を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記成長調節因子組成物が、グルコースをさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 前記成長調節因子組成物中の前記グルコースの浸透圧が、約500mOsm/kg〜約700mOsm/kg、約550mOsm/kg〜約650mOsm/kg、約575mOsm/kg〜約625mOsm/kgの間である、請求項57に記載の方法。
- 前記グルコースの濃度が、約85mg/ml〜約115mg/ml、約90mg/ml〜約110mg/ml、約95mg/ml〜約105mg/mlの範囲である、請求項57に記載の方法。
- 前記成長調節因子組成物が、約1000mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約1100mOsm/kg〜約1400mOsm/kg、約1200mOsm/kg〜約1300mOsm/kgの間の浸透圧、またはそれらの間の任意の浸透圧もしくは範囲を有する、請求項56に記載の方法。
- 前記成長調節因子組成物が、約1100mOsm/kg、約1150mOsm/kg、約1200mOsm/kg、約1250mOsm/kg、約1300mOsm/kg、約1350mOsm/kg、約1400mOsm/kg、約1450mOsm/kg、約1500mOsm/kgの浸透圧を有する、請求項56に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされたCHO細胞が採取されたときの前記培養物の体積が、前記浮遊細胞がトランスフェクトされたときの前記培養物の体積の約150%未満、約145%未満、約140%未満、約135%未満、約130%未満、約125%未満、約120%未満であり、体積の増加は、成長培地の添加、補足、または交換に起因しない、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされたCHO細胞が採取されたときの前記培養物の体積が、前記浮遊細胞がトランスフェクトされたときの前記培養物の体積の約150%未満、約145%未満、約140%未満、約135%未満、約130%未満、約125%未満、約120%未満であり、体積の増加は、前記成長エンハンサー組成物及び前記発現エンハンサー組成物の添加に起因する、請求項1に記載の方法。
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