JP2018517701A - 改変されたケモカインペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、治療用アンタゴニストであり得る改変されたケモカインペプチドに関する。具体的には、本発明は、癌を処置するためおよび腫瘍増殖を阻害するための改変されたケモカインに関する。
ケモカインは、誘導性の、分泌性の、構造的にかつ関連する低分子(約8〜14kD)の群である。ケモカインは、4つのサブファミリー、例えば、CXC、CC、CX3CおよびCに分けられる。ケモカインはまた、2つの主要な機能的サブファミリーにも分類される:「恒常的ケモカイン」および「炎症性ケモカイン」。
癌は先進国では最も一般的な死亡原因である。もし癌が早期に診断されれば、首尾よく処置される可能性は高い。癌の診断と処置にはかなりの進歩が見られているが、これらの薬物は深刻な副作用を引き起こすか、または無効である。したがって、癌の処置または癌の予防のための新規な方法または新規な組成物が必要とされている。
本発明は、新規なケモカインを提供する。本発明の新規なケモカインは、CXCL1(配列番号3)、CXCL2(配列番号4)、CXCL3(配列番号5)、CXCL5(配列番号:6)、CXCL6(配列番号:7)、CXCL7(配列番号:8)、CXCL8(配列番号:2)およびhG31P(配列番号:1)などの、ELR−CXCケモカインまたはCXCR1もしくはCXCR2に対する高い結合親和性を有する物質に由来する。本発明においては、本発明におけるこの種のケモカインに応じて改変されており、これは主に、元の30sループ領域に置換されたPASQFの特徴的な配列に依存する(図1)。このPASQFは、非ELR−CXCケモカインであるCXCL10ケモカインにもともと存在する。
ボイデン(Boyden)チャンバーアッセイを用いて、LMVECの遊走を評価した。LMVECを、2%FCSを含むHuMedia−EB2上で、8時間培養した。細胞を、1.2×105細胞/cm2の密度で、10μg/mlのフィブロネクチンでコーティングしたポリカーボネート膜(Sigma−Aldrich)上に播種した。10ng/mlのCXCL8、CXCL6、CXCL1、CXCL5、およびCXCL8−IP10またはIL8−F17LIP10を、それぞれ、ボイデンチャンバーの底に添加した。LMVECを、Boydenチャンバー上で37℃で4時間培養し、次いでDiff−Quick(Harleco)で固定して染色した。遊走した細胞の数を、HPF(X200)によってカウントした。
BALB/cヌード雄性マウス(Bltw:NU−Foxn1nu、4〜6週齢)を入手して、特定の病原体のない条件下で、層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。ヌードマウス異種移植アッセイのために、単層培養したGFP陽性PC3細胞(PC−3−GFP)を採取し、3匹のヌードマウスの右脇腹にマウス1匹につき5×106細胞を皮下接種した。2〜4週間後、移植のために腫瘍を採取した。実験の最後に、これらの3匹のマウス由来の腫瘍異種移植片を、リセット(reset)し、スライスし(1mm3切片)、次いで、局所麻酔および滅菌手術条件下で、レシピエントのヌードマウスの前立腺組織に移植した。全部で24匹の動物が移植物を受けた。5日後(0日目)、その動物を、100μlの生理食塩水(対照群)または本発明の配列(配列番号13(IL8−17LIP10)、0.5mg/kg)(実験群)で24日間の皮下注射について、2つの群に分類した(12匹の動物/群)。成長腫瘍のGFP蛍光画像を、515nm発光フィルターを備える解剖顕微鏡の光学的構成の下で、デジタルカメラを用いて12、18および24日に撮影した。腫瘍容積は、式:容積=(長さ×幅2)/2を用いて算出した。24日目に、全てのマウスを屠殺して、腫瘍のGFP蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式:密度=微小血管長/腫瘍面積を用いて算出した。各マウス由来の腫瘍サンプルを、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のための標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
パラフィン包埋前立腺癌異種移植切片を脱ろうし、PBSに再水和した。詳細には、切片をPBSで3回リンスし、10mMのクエン酸ナトリウム(pH6.0)中で15分間熱処理した。3%の過酸化水素で10分間処理することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を、PBSを用いて繰り返し3回すすぎ、タンパク質ブロッキング溶液(PBS中に5%正常ウマ血清、pH7.5)と共に室温で15分間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、次いでマウスモノクローナル抗VEGF抗体(1:50)、ウサギポリクローナル抗NF−κB抗体、またはヤギポリクローナル抗CD31抗体(1:50)とともに、4℃で20時間インキュベートした。反応後、切片をPBSで3回洗浄し、二次抗体の適切な希釈物とともに、37℃で40分間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、切片をビオチン化ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗ヤギポリ免疫グロブリンと共に暗所で30分間インキュベートした。発色のために、切片を、PBSを用いて3回洗浄し、ジアミノベンジジン溶液中で10分間インキュベートし、次いでヘマトキシリンで1分間対比染色した(Kollmarら、2007)。陰性対照の切片を、一次抗体の代わりにPBSとともにインキュベートした。染色された切片の強度は、撮影された切片をグレースケール(スケール0〜255)に変換した後に測定し、Image−Pro 6.0 Microsoftを使用して計算した集積光学濃度(IOD)で表した。各群について、5つのマウス腫瘍異種移植片を分析した。異なる切片で無作為に選択された、1つの腫瘍あたり5つの撮影された切片を用いて、あらゆる腫瘍異種移植のグレイ値を平均した(Csillik et al.,2005)。CD31の免疫組織化学的分析を用いて微小血管密度を測定し、微小血管密度の測定値は、Image−Pro 6.0 Microsoftを使用して算出した、微小血管面積の平均パーセンテージを表している。
C57BL/6ヌードマウスを、特定の病原体の下で層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。5×106個の細胞のLLW2細胞(ルイス肺癌)を、マウス1匹あたり5×106個の細胞を用いて3匹のマウスの右四半分に注射した。2〜4週間後、移植のために腫瘍を採取した。この例では、24匹のマウスに移植した。移植の5日後、24匹のマウスを4つの群(1群6匹)に分類した。A群:500μg/kgのCXCL8−IP10の週4回の投与。B群:500μg/kgのCXCL8−IP10の週2回の投与。C群:250μg/kgのCXCL8−IP10の週2回の投与。D群:100μlの生理食塩水を毎日皮下投与した。腫瘍容積は、式:容積=(長さ×幅2)/2を用いて算出した。24日目に、全てのマウスを屠殺し、腫瘍のGFP蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式:密度=微小血管長/腫瘍面積を用いて算出した。各マウスの腫瘍サンプルを、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のために標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
好中球の走化性は、改善されたボイデンチャンバーマイクロ走化性アッセイによって評価した。白血球は、一般的な濃度勾配により末梢血から採取した。好中球は、低濃度勾配領域の底から得て、赤血球混入は低張溶解によって除去した。精製した好中球(5×106/ml)をHBSS溶液(400mg/LのKCl、60mg/LのKH2PO4、8000mg/L、NaCl、350mg/LのNaHCO3、90mg/LのNaH2PO47H2Oおよび1000mg/Lのグルコース)に再懸濁し、次いで、Calcein AM(Invitrogen、Stockholm、Sweden)培地中で37℃で30分間培養した。ケモカイン(例えば、20ng/mlのCXCL8)を、下部チャンバー上で、単独で、または他のアンタゴニスト(例えば、IL8−IP10F17L)と組み合わせて配置し、精製した好中球を上部チャンバー上に置いた。5μmの細孔径のポリカーボネートフィルターを使用して、上部および下部チャンバーを分けた。細胞を5%CO2加湿雰囲気中で、37℃で30分間培養した後、未遊走細胞およびフィルターを除去し、遊走した細胞を溶解して、VICTOR3(Perkin−Elmer、UK、励起:485nm;発光:530nm)を用いて分析した。細胞遊走のパーセンテージは、走化性指数(chemotaxis index:CI)の値によって示された。CI=(アンタゴニスト強度−HBSS強度)/(CXCL8強度−HBSS強度)×100%であり、ここで「アンタゴニスト強度」は、アンタゴニストによって引き起こされる細胞遊走であり、「CXCL8強度」は、CXCL8によって引き起こされる細胞遊走であり、かつ「HBSS強度」は、重力によって引き起こされる細胞遊走である。
癌細胞株のRNA(表1)を、TRIzol試薬(Invitrogen、America)により、それぞれ標準的な手順を用いて抽出し、RNAをNanoDrop(登録商標)ND−1000分光光度計で定量した。cDNA逆転写キット(Prime Script(商標)RT試薬キット、タカラ、日本)を用いて、サンプルのRNAの逆転写を行い、そのサンプルを氷上に置いた後、遺伝子発現分析を行った。GAPDHは、内部対照群であった。RT−PCR反応は、SYBR(Premix Ex Taq(商標)、タカラ、日本)で行い、ここでは、CXCLのプライマーは:5’−gagcactccataaggcacaaa−3’(フォワード)および5’−atggttccttccggtggt−3’(リバース)を、CXCL8について;5’−gaccaacatcgcagacacat−3’(フォワード)および5’−tgcttgtctcgttccacttg−3’(リバース)をCXCR1について;5’−ggctaagcaaaatgtgatatgtacc−3’(フォワード)および5’−caaggttcgtccgtgttgta−3’(リバース)をCXCR2について含んだ。
本発明は、治療用アンタゴニストであり得る改変されたケモカインペプチドに関する。具体的には、本発明は、癌を処置するためおよび腫瘍増殖を阻害するための改変されたケモカインに関する。
ケモカインは、誘導性の、分泌性の、構造的にかつ関連する低分子(約8〜14kD)の群である。ケモカインは、4つのサブファミリー、例えば、CXC、CC、CX3CおよびCに分けられる。ケモカインはまた、2つの主要な機能的サブファミリーにも分類される:「恒常的ケモカイン」および「炎症性ケモカイン」。
癌は先進国では最も一般的な死亡原因である。もし癌が早期に診断されれば、首尾よく処置される可能性は高い。癌の診断と処置にはかなりの進歩が見られているが、これらの薬物は深刻な副作用を引き起こすか、または無効である。したがって、癌の処置または癌の予防のための新規な方法または新規な組成物が必要とされている。
本発明は、新規なケモカインを提供する。本発明の新規なケモカインは、CXCL1(配列番号3)、CXCL2(配列番号4)、CXCL3(配列番号5)、CXCL5(配列番号:6)、CXCL6(配列番号:7)、CXCL7(配列番号:8)、CXCL8(配列番号:2)およびhG31P(配列番号:1)などの、ELR−CXCケモカインまたはCXCR1もしくはCXCR2に対する高い結合親和性を有する物質に由来する。本発明においては、本発明におけるこの種のケモカインに応じて改変されており、これは主に、元の30sループ領域に置換されたPASQFの特徴的な配列に依存する(図1)。このPASQFは、非ELR−CXCケモカインであるCXCL10ケモカインにもともと存在する。
ボイデン(Boyden)チャンバーアッセイを用いて、LMVECの遊走を評価した。LMVECを、2%FCSを含むHuMedia−EB2上で、8時間培養した。細胞を、1.2×105細胞/cm2の密度で、10μg/mlのフィブロネクチンでコーティングしたポリカーボネート膜(Sigma−Aldrich)上に播種した。10ng/mlのCXCL8、CXCL6、CXCL1、CXCL5、およびCXCL8−IP10またはIL8−F17LIP10を、それぞれ、ボイデンチャンバーの底に添加した。LMVECを、Boydenチャンバー上で37℃で4時間培養し、次いでDiff−Quick(Harleco)で固定して染色した。遊走した細胞の数を、HPF(X200)によってカウントした。
BALB/cヌード雄性マウス(Bltw:NU−Foxn1nu、4〜6週齢)を入手して、特定の病原体のない条件下で、層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。ヌードマウス異種移植アッセイのために、単層培養したGFP陽性PC3細胞(PC−3−GFP)を採取し、3匹のヌードマウスの右脇腹にマウス1匹につき5×106細胞を皮下接種した。2〜4週間後、移植のために腫瘍を採取した。実験の最後に、これらの3匹のマウス由来の腫瘍異種移植片を、リセット(reset)し、スライスし(1mm3切片)、次いで、局所麻酔および滅菌手術条件下で、レシピエントのヌードマウスの前立腺組織に移植した。全部で24匹の動物が移植物を受けた。5日後(0日目)、その動物を、100μlの生理食塩水(対照群)または本発明の配列(配列番号12(IL8−17LIP10)、0.5mg/kg)(実験群)で24日間の皮下注射について、2つの群に分類した(12匹の動物/群)。成長腫瘍のGFP蛍光画像を、515nm発光フィルターを備える解剖顕微鏡の光学的構成の下で、デジタルカメラを用いて12、18および24日に撮影した。腫瘍容積は、式:容積=(長さ×幅2)/2を用いて算出した。24日目に、全てのマウスを屠殺して、腫瘍のGFP蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式:密度=微小血管長/腫瘍面積を用いて算出した。各マウス由来の腫瘍サンプルを、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のための標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
パラフィン包埋前立腺癌異種移植切片を脱ろうし、PBSに再水和した。詳細には、切片をPBSで3回リンスし、10mMのクエン酸ナトリウム(pH6.0)中で15分間熱処理した。3%の過酸化水素で10分間処理することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を、PBSを用いて繰り返し3回すすぎ、タンパク質ブロッキング溶液(PBS中に5%正常ウマ血清、pH7.5)と共に室温で15分間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、次いでマウスモノクローナル抗VEGF抗体(1:50)、ウサギポリクローナル抗NF−κB抗体、またはヤギポリクローナル抗CD31抗体(1:50)とともに、4℃で20時間インキュベートした。反応後、切片をPBSで3回洗浄し、二次抗体の適切な希釈物とともに、37℃で40分間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、切片をビオチン化ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗ヤギポリ免疫グロブリンと共に暗所で30分間インキュベートした。発色のために、切片を、PBSを用いて3回洗浄し、ジアミノベンジジン溶液中で10分間インキュベートし、次いでヘマトキシリンで1分間対比染色した(Kollmarら、2007)。陰性対照の切片を、一次抗体の代わりにPBSとともにインキュベートした。染色された切片の強度は、撮影された切片をグレースケール(スケール0〜255)に変換した後に測定し、Image−Pro 6.0 Microsoftを使用して計算した集積光学濃度(IOD)で表した。各群について、5つのマウス腫瘍異種移植片を分析した。異なる切片で無作為に選択された、1つの腫瘍あたり5つの撮影された切片を用いて、あらゆる腫瘍異種移植のグレイ値を平均した(Csillik et al.,2005)。CD31の免疫組織化学的分析を用いて微小血管密度を測定し、微小血管密度の測定値は、Image−Pro 6.0 Microsoftを使用して算出した、微小血管面積の平均パーセンテージを表している。
C57BL/6ヌードマウスを、特定の病原体の下で層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。5×106個の細胞のLLW2細胞(ルイス肺癌)を、マウス1匹あたり5×106個の細胞を用いて3匹のマウスの右四半分に注射した。2〜4週間後、移植のために腫瘍を採取した。この例では、24匹のマウスに移植した。移植の5日後、24匹のマウスを4つの群(1群6匹)に分類した。A群:500μg/kgのCXCL8−IP10の週4回の投与。B群:500μg/kgのCXCL8−IP10の週2回の投与。C群:250μg/kgのCXCL8−IP10の週2回の投与。D群:100μlの生理食塩水を毎日皮下投与した。腫瘍容積は、式:容積=(長さ×幅2)/2を用いて算出した。24日目に、全てのマウスを屠殺し、腫瘍のGFP蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式:密度=微小血管長/腫瘍面積を用いて算出した。各マウスの腫瘍サンプルを、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のために標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
好中球の走化性は、改善されたボイデンチャンバーマイクロ走化性アッセイによって評価した。白血球は、一般的な濃度勾配により末梢血から採取した。好中球は、低濃度勾配領域の底から得て、赤血球混入は低張溶解によって除去した。精製した好中球(5×106/ml)をHBSS溶液(400mg/LのKCl、60mg/LのKH2PO4、8000mg/L、NaCl、350mg/LのNaHCO3、90mg/LのNaH2PO47H2Oおよび1000mg/Lのグルコース)に再懸濁し、次いで、Calcein AM(Invitrogen、Stockholm、Sweden)培地中で37℃で30分間培養した。ケモカイン(例えば、20ng/mlのCXCL8)を、下部チャンバー上で、単独で、または他のアンタゴニスト(例えば、IL8−IP10F17L)と組み合わせて配置し、精製した好中球を上部チャンバー上に置いた。5μmの細孔径のポリカーボネートフィルターを使用して、上部および下部チャンバーを分けた。細胞を5%CO2加湿雰囲気中で、37℃で30分間培養した後、未遊走細胞およびフィルターを除去し、遊走した細胞を溶解して、VICTOR3(Perkin−Elmer、UK、励起:485nm;発光:530nm)を用いて分析した。細胞遊走のパーセンテージは、走化性指数(chemotaxis index:CI)の値によって示された。CI=(アンタゴニスト強度−HBSS強度)/(CXCL8強度−HBSS強度)×100%であり、ここで「アンタゴニスト強度」は、アンタゴニストによって引き起こされる細胞遊走であり、「CXCL8強度」は、CXCL8によって引き起こされる細胞遊走であり、かつ「HBSS強度」は、重力によって引き起こされる細胞遊走である。
癌細胞株のRNA(表1)を、TRIzol試薬(Invitrogen、America)により、それぞれ標準的な手順を用いて抽出し、RNAをNanoDrop(登録商標)ND−1000分光光度計で定量した。cDNA逆転写キット(Prime Script(商標)RT試薬キット、タカラ、日本)を用いて、サンプルのRNAの逆転写を行い、そのサンプルを氷上に置いた後、遺伝子発現分析を行った。GAPDHは、内部対照群であった。RT−PCR反応は、SYBR(Premix Ex Taq(商標)、タカラ、日本)で行い、ここでは、CXCLのプライマーは:5’−gagcactccataaggcacaaa−3’(フォワード)および5’−atggttccttccggtggt−3’(リバース)を、CXCL8について;5’−gaccaacatcgcagacacat−3’(フォワード)および5’−tgcttgtctcgttccacttg−3’(リバース)をCXCR1について;5’−ggctaagcaaaatgtgatatgtacc−3’(フォワード)および5’−caaggttcgtccgtgttgta−3’(リバース)をCXCR2について含んだ。
ヌードマウス(4〜6週齢)は、国立実験動物センター(台湾)から購入した。PC9細胞を採取し、滅菌リン酸緩衝食塩水中に1×10 7 細胞/mlの密度で再懸濁した。実験群では、PC9細胞を、IL8T12SIP10、CXCL5T12SIP10、IL8T12S、およびCXCL5T12Sを含む改変ケモカインペプチド200μg/mlで前処理した。1×10 6 個のPC9細胞(混合等容積マトリゲル)を、マウスの背部(対照群、IL8T12SIP10群、およびCXCL5T12SIP10群について10匹のマウス;その他はIL8T12S群およびCXCL5T12S群について3匹のマウス)に皮下注射した。次いで、改変ケモカインペプチド(500μg/kg)またはPBS(対照群)を、週3日毎に腹腔内注射により投与した。全てのマウスを21日目に屠殺した。
Claims (12)
- ペプチド配列を含む改変されたケモカインペプチドであって、ここで前記ペプチド配列のN末端が:
(a)「グルタミン酸(E)−ロイシン(L)−アルギニン(R)」配列であって、A特徴の配列として定義され、ここで前記A特徴の配列は、前記改変されたケモカインペプチドのN末端に位置する配列と;
(b)「プロリン(P)−アラニン(A)−セリン(S)−グルタミン(Q)−フェニルアラニン(F)−Cys3」配列であって、B特徴の配列として定義され、ここで前記B特徴の配列は、ケモカインペプチドのN末端から数えて3番目のシステイン(C)の上流に隣接している配列と、
を含み、かつ
ここで、前記改変されたケモカインペプチドは、A特徴の配列、B特徴の配列、および改変された位置からなり、ここで前記改変された位置は、改変されたケモカインペプチドのN末端から数えて17番目、12番目、または13番目の位置に位置する、改変されたケモカインペプチド。 - 前記改変されたケモカインペプチドのN末端から17番目の位置のフェニルアラニン(F)が、ロイシン(L)、バリン(V)、またはイソロイシン(I)で置換されている、請求項1に記載の改変されたケモカインペプチド。
- 前記改変されたケモカインペプチドのN末端から12番目の位置のトレオニン(T)が、セリン(S)で置換されている、請求項1に記載の改変されたケモカインペプチド。
- 前記改変されたケモカインペプチドのN末端から13番目の位置のチロシン(Y)が、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、またはイソロイシン(I)で置換されている、請求項1に記載の改変されたケモカインペプチド。
- 前記改変されたケモカインペプチドの未改変の前駆体が、起源のケモカインペプチドに由来し、ここで前記起源のケモカインペプチドが、N末端から第一のシステインと第二のシステインとの間に位置する、ゼロ〜2個のアミノ酸残基(単数または複数)を有し、かつ前記アミノ酸残基(単数または複数)が、前記アミノ酸残基の数が1〜2個である場合に荷電の有無の極性を有する、請求項1に記載の改変されたケモカインペプチド。
- 前記起源のケモカインペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項5に記載の改変されたケモカインペプチド。
- 前記改変されたケモカインペプチドが、配列番号10、配列番号11、および配列番号12から選択される、請求項1に記載の改変されたケモカインペプチド。
- 請求項1に記載の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- 前記改変されたケモカインペプチドが、癌を処置するため、または腫瘍増殖を阻害するために用いられる、請求項8に記載の薬学的組成物。
- 治療上有効な量の請求項1に記載の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、癌を処置するため、および腫瘍増殖を阻害するための薬学的組成物。
- 前記癌が、前立腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、精巣癌、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝臓癌、喉頭癌、胆嚢癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、または鼻咽頭癌を含む、請求項10に記載の薬学的組成物。
- 前記癌が、CXCR1/2発現、またはCXCL8、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6およびCXCL7からなる多量のケモカインを有する細胞によって特徴付けられ、ここで前記癌が、ケモカイン受容体を発現する癌細胞によって特徴付けられる、請求項11に記載の薬学的組成物。
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