JP2018516941A

JP2018516941A - 癌の早期骨転移の画像診断剤

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Publication number: JP2018516941A
Application number: JP2017563143A
Authority: JP
Inventors: 俊太郎岡; 優加奈川; 明治大高; 昌子寺町; 渡邉　聡; 聡渡邉; 敏恵永友
Original assignee: Nihon Medi Physics Co Ltd
Current assignee: Nihon Medi Physics Co Ltd
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2018-06-28
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Abstract

トランス−１−アミノ−［^１８Ｆ］フルオロシクロブタンカルボン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、癌の早期骨転移の画像診断剤を提供する。

Description

本発明は、癌の早期骨転移の画像診断剤に関する。

骨転移の画像診断として、Ｘ線、コンピュータ断層撮影（computed tomography、ＣＴ）、磁気共鳴画像（magnetic resonance imaging、ＭＲＩ）、［^９９ｍＴｃ］ヒドロキシメチレンジホスホン酸テクネチウム（^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰ）や［^９９ｍＴｃ］メチレンジホスホン酸テクネチウム（^９９ｍＴｃ−ＭＤＰ）による骨シンチグラフィー、２−［^１８Ｆ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（^１８Ｆ−ＦＤＧ）によるポジトロン断層撮影（positron emission tomography、ＰＥＴ）が用いられている。Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩによれば、骨転移の形態画像が得られる一方、骨シンチグラフィー、ＰＥＴによれば、骨転移の機能画像が得られるため、これらを併用して骨転移の診断を行うこともなされている。

^１８Ｆ−ＦＤＧは、癌細胞の亢進した糖代謝を反映するため、骨転移に限らず、様々な悪性腫瘍の診断剤として使用されている。一方、^１８Ｆ−ＦＤＧには、（ｉ）糖代謝の盛んな正常組織（例えば、脳や心臓）にも集積してしまう；（ｉｉ）尿排泄性が高く、投与後早期から膀胱に移行するため、膀胱及びその周辺における病態の検出は難しい；（ｉｉｉ）炎症組織に集積するため腫瘍と炎症組織との鑑別が困難である、といった問題もある。このため、近年、糖代謝とは異なる、癌細胞の代謝能の亢進に着目した様々なＰＥＴ用腫瘍診断剤の開発も進められている。たとえば、癌細胞のアミノ酸代謝を反映する剤として、［^１１Ｃ］メチオニン（^１１Ｃ−メチオニン）、トランス−１−アミノ−［^１８Ｆ］フルオロシクロブタンカルボン酸（^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ）などが知られている。中でも、^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅは、^１８Ｆ−ＦＤＧにより描出が困難な前立腺癌を描出できる診断剤として開発が進められている（非特許文献１〜４）。

Shuster D. et al, J. Nucl. Med. (2007), vol. 48, No.1, pp. 56-63 Shuster D. et al, Radiology (2011), vol. 259, No. 3, pp. 852-861 Oka S. et al, Mol. Imaging Biol. (2014), vol. 16, No. 3, pp. 322-329 Inoue Y. et al, Asia Oceania J. Nucl. Med. Biol. (2014), vol. 2, No. 2, pp. 87-94 Nakai T. et al., Eur J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2005), vol. 32, No. 11, pp. 1253-1258

核医学診断では、異なった診断剤が同一検査目的で使用されても、各診断剤固有の集積機序に応じて異なる情報を提示する。たとえば、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰや^９９ｍＴｃ−ＭＤＰは、骨代謝を反映する一方、^１８Ｆ−ＦＤＧは、前述のとおり、癌細胞の亢進した糖代謝を反映する。このため、骨転移の型によって検出能に違いが認められることがある。

一般に骨転移の画像パターンは、造骨型、溶骨型及び混合型に分類されるが、骨シンチグラフィーは、造骨型骨転移に対しては高い感度である一方、溶骨型骨転移は、欠損像又は明らかな変化が見られない。Nakai T. et al., Eur J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2005), vol. 32, No. 11, pp. 1253-1258では、８９人の乳癌患者について全ての部位を総合した「感度」は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰでは「７８．２％」、^１８Ｆ−ＦＤＧでは「８０．０％」となり、両剤に差が見られなかったが、ＣＴで判断した骨転移型別の検出率を見ると、造骨型骨転移の検出率は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰは^１８Ｆ−ＦＤＧよりも高くなった一方で（１００％＞５５．６％）、溶骨型骨転移の検出率は、^１８Ｆ−ＦＤＧでは^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰよりも高くなった（１００％＞７０．０％）ことが報告されている。

近年、病理組織学的には癌細胞が骨梁間（骨髄）に浸潤・増殖しているが、骨梁に溶骨性や造骨性変化をきたさない骨梁間型の骨転移も提唱されている。この骨梁間型骨転移を含む、溶骨反応が起こる以前の転移や、造骨型骨転移の早期骨転移は、骨シンチグラフィーやＣＴでは捉えることが難しい。

骨梁間型骨転移の検出は、^１８Ｆ−ＦＤＧでも可能であるが、^１８Ｆ−ＦＤＧの場合は骨折や炎症反応で滲出する炎症細胞にも取りこまれるため、偽陽性を示す恐れがある。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、癌の早期骨転移を精度よく検出できる技術を提供することにある。

本発明の一態様は、トランス−１−アミノ−［^１８Ｆ］フルオロシクロブタンカルボン酸（^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ）又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、癌の早期骨転移の画像診断剤を提供するものである。

また、本発明の別の態様は、癌の早期骨転移の画像診断剤を製造するための、^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ又はその薬学的に許容される塩の使用を提供するものである。

本発明によれば、骨シンチグラフィーやＣＴなどの既存の画像診断では検出が難しいタイプの骨転移を精度よく検出することができる。

図１（ａ）〜（ｊ）は、ラット乳癌溶骨型骨転移モデルを用いた、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの評価結果を示す図である。（ａ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のＸ線撮像の結果を示す図である。（ｂ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨の薄切面の外観を示す図である。（ｃ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のオートラジオグラムを示す図である。（ｄ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のトルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｅ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図である。（ｆ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のＸ線撮像の結果を示す図である。（ｇ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨の薄切面の外観を示す図である。（ｈ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のオートラジオグラムを示す図である。（ｉ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のトルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｊ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図である。図２（ａ）〜（ｊ）は、ラット乳癌溶骨型骨転移モデルを用いた、^３Ｈ−ＦＤＧの評価結果を示す図である。（ａ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のＸ線撮像の結果を示す図である。（ｂ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨の薄切面の外観を示す図である。（ｃ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のオートラジオグラムを示す図である。（ｄ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のトルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｅ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図である。（ｆ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のＸ線撮像の結果を示す図である。（ｇ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨の薄切面の外観を示す図である。（ｈ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のオートラジオグラムを示す図である。（ｉ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のトルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｊ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図である。図３（ａ）〜３（ｊ）は、ラット乳癌溶骨型骨転移モデルを用いた、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰの評価結果を示す図である。（ａ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のＸ線撮像の結果を示す図である。（ｂ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨の薄切面の外観を示す図である。（ｃ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のオートラジオグラムである。（ｄ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のトルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｅ）は、健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図である。（ｆ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のＸ線撮像の結果を示す図である。（ｇ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨の薄切面の外観を示す図である。（ｈ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のオートラジオグラムを示す図である。（ｉ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のトルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｊ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図である。図４（ａ）〜４（ｃ）は、前立腺癌患者の^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅによるＰＥＴ／ＣＴ画像である。（ａ）が頭部画像であり、（ｂ）が胸部画像であり、（ｃ）が骨盤部画像である。図５（ａ）〜５（ｃ）は、前立腺癌患者の核医学画像である。（ａ）が、最大値投影法による^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅのＰＥＴ画像であり、（ｂ）が骨シンチグラフィーの前面画像であり、（ｃ）が骨シンチグラフィーの背面画像である。図６（ａ）〜６（ｄ）は、乳癌細胞移植後６日目のラット乳癌骨梁間型骨転移モデルを用いたトリプルトレーサーオートラジオグラフィー（ＡＲＧ）の評価結果を示す図である。（ａ）は、トルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｂ）は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰオートラジオグラムを示す図である。（ｃ）は、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅオートラジオグラムを示す図である。（ｄ）は、^３Ｈ−ＦＤＧオートラジオグラムを示す図である。図７（ａ）〜７（ｄ）は、乳癌細胞移植後８日目のラット乳癌骨梁間型骨転移モデルを用いたトリプルトレーサーオートラジオグラフィーの評価結果を示す図である。（ａ）は、トルイジンブルー染色の結果を示す図である。（ｂ）は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰオートラジオグラムを示す図である。（ｃ）は、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅオートラジオグラムを示す図である。（ｄ）は、^３Ｈ−ＦＤＧオートラジオグラムを示す図である。図８（ａ）〜８（ｄ）は、乳癌細胞移植後１１日目のラット乳癌溶骨型骨転移モデルを用いたトリプルトレーサーオートラジオグラフィーの結果を示す図である。（ａ）は、ＭＲＭＴ−１移植肢から摘出した下肢骨の薄切面の外観を示す図である。（ｂ）は、^３Ｈ−ＦＤＧオートラジオグラムを示す図である。（ｃ）は、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅオートラジオグラムを示す図である。（ｄ）は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰオートラジオグラムを示す図である。（ｅ）は、トルイジンブルー染色の結果を示す図である。

本発明において「画像診断剤」とは、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）に用いられるものであり、具体的には、生体内に投与後、体内から放出される放射線をＰＥＴ装置で検出・画像化することにより、非侵襲的に病態の診断を可能にするものである。

本発明において癌の「骨転移」とは、骨以外の組織に生じた癌を初発として骨に転移が生じた病態である。「骨以外の組織に生じた癌」としては、乳癌，腎癌，甲状腺癌，多発性骨髄腫，悪性リンパ腫、前立腺癌、肺小細胞癌、肝癌、膵癌が挙げられる。本発明の画像診断剤の対象として、好ましくは、乳癌、前立腺癌である。骨転移には、溶骨型、造骨型、骨梁間型があるが、これらの型は混合していてもよく、全体の病巣に対して優位になっていればよい。

本発明において「癌の早期骨転移」とは、溶骨反応が起こる以前の骨転移、早期の造骨型骨転移、及び、骨梁間骨転移のいずれかをいう。「骨梁間骨転移」とは、病理組織学的には癌細胞が骨梁間（骨髄）に浸潤・増殖しているが、何ら骨変化が起こらないものをいう。

本発明の画像診断剤の有効成分は、^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ又はその薬学的に許容される塩である。

^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅは、公知の方法で合成することができ、例えば、Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, （1999）, vol. 42, pp.215-225の記載の方法を用いて得ることができる。

本発明において、「塩」とは、医薬として許容されるものであれば限定されない。例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸；酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸（グルクロン酸、ガラクツロン酸など）、α‐ヒドロキシ酸（クエン酸、酒石酸など）、アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、芳香族酸（安息香酸、ケイ皮酸など）、スルホン酸（ｐ−トルエンスルホン酸、エタンスルホン酸など）などの有機酸；アミノ酸（グリシン、アルギニンなど）、アンモニア、第一級、第二級及び第三級アミン及び環状アミン（ピペリジン、モルホリン、ピペラジンなど）などの有機塩基；又は、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化マンガン、水酸化鉄、水酸化銅、水酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、水酸化リチウムなどの無機塩基から誘導される塩が挙げられる。

本発明の画像診断剤は、非経口的手段によって投与されることが好ましく、剤形としては、注射剤がより好ましい。好ましくは、水溶液であり、適宜、ｐＨ調節剤、製薬学的に許容される可溶化剤、等張化剤、安定剤及び／又は酸化防止剤などの追加成分を含んでいてもよい。

本発明の画像診断剤中の^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの含有量は、使用時にＰＥＴ撮像が可能となる放射能量を有していれば特に限定されないが、例えば、使用時に５０〜７４０ＭＢｑの放射能量を有していれば、成人に対するＰＥＴ撮像に実用的である。

以下、実施例を記載して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。

＜実施例１：ラット乳癌溶骨型骨転移モデルを用いた評価＞
１．材料
（１）乳癌細胞（ＭＲＭＴ−１）浮遊液の調製
ラット乳癌細胞株ＭＲＭＴ−１は理化学研究所バイオリソースセンターより入手した。ＭＲＭＴ−１は、ウシ胎仔血清（American Type Culture Collection）を１０％、ペニシリン（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）を１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）を０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で含む培地ＲＰＭＩ１６４０（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）を用いて継代培養した。移植当日、培養容器中の培地を除去し、３７℃で保温したトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）を培養容器内に加え、３７℃で約５分間静置した。ＭＲＭＴ−１が培養容器面から剥がれたのを確認したのち、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液と等量の上記培地を培養容器内に加えた。遠心分離（８００回転／分、５分間）でＭＲＭＴ−１を沈澱し、上澄み液を除去したのち、ＭＲＭＴ−１をハンクスバッファ（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）に２．５×１０^５個／ｍＬの濃度で浮遊した細胞浮遊液を作製した。

（２）ラット乳癌溶骨型骨転移モデルの作製
９週齢の雄性ＳＤラット（日本エスエルシー株式会社）をイソフルラン（マイラン製薬社製）麻酔下で、右後肢鼠径部に消炎鎮痛剤であるメタカム０．５％注射液（ベーリンガーインゲルハイムベトメディカジャパン社製）を０．２ｍｇ／ｋｇの割合で皮下注射した後、鼠径部皮膚を切開した。次いで、伏在動脈、伏在静脈及びそれに並行する神経を筋肉より剥離し、遊離させ、膝窩動脈分岐部より遠位部において、伏在動脈の下に縫合糸（３−０）を通した。また、浅腹壁動脈分岐部周囲の組織を剥離し、浅腹壁動脈分岐部と膝窩動脈分岐部の間（浅腹壁動脈分岐部より少し遠位部）にて、大腿動脈の下に縫合糸（３−０）を通した。その後、伏在動脈周囲に、パパベリン塩酸塩注４０ｍｇ（日医工社製）を数滴滴下して血管平滑筋を弛緩させ、伏在動脈及び大腿動脈の下に通した縫合糸の端をそれぞれ鉗子で挟み、伏在動脈及び大腿動脈を吊り上げることにより、伏在動脈及び大腿動脈を圧迫し、綿棒を伏在動脈の下に挿入して伏在動脈を保定して、伏在動脈の遠位部から中枢方向に注射針を刺入し、ＭＲＭＴ−１浮遊液（０．１ｍＬ）をゆっくり注入した。注射針の刺入部に外科用接着剤（アロンアロファＡ「三共」（商標登録）、東亞合成社製）を１滴滴下し、術野から採取した皮下脂肪片を刺入部に被せて、刺入部を塞いだ。伏在動脈及び大腿動脈から縫合糸を抜糸し、血流を再開させ、大腿動脈から腹大動脈周囲の皮下脂肪を整復し、縫合糸（５−０）で皮膚を閉じた。最後に抗生物質であるホスミシンＳ静注用０．５ｇ（明治製菓ファルマ株式会社製）を１０〜２０ｍｇ／ｋｇの割合で皮下注射した。作製したモデル動物は、移植１２から１４日目にて下記の実験に使用した。

（３）トランス−１−アミノ−３−フルオロシクロブタン−１−［^１４Ｃ］カルボン酸（^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ）の調製
Nucl.Med.Biol.39,109-119記載の方法に準じて調製した。

２．方法
乳癌細胞移植後１２日目のラット乳癌溶骨型骨転移モデルを、マイクロフォーカスＸ線拡大撮像システム（μＦＸ−１０００，富士フイルム社製）で撮影した後、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ（１．０５ＭＢｑ、２．７５ＭＢｑ／ｋｇ）を尾静脈投与し、３０分後に屠殺した。左右後肢をＳＣＥＭ（セクションラボ社製）に包埋後、イソペンタン／ドライアイスまたはヘキサン／ドライアイスで急速凍結し、クライオスタット（Leica Instruments GmbH製）を用いて１０μｍ厚に薄切した。この際、試料面にＣｒｙｏｆｉｌｍｔｙｐｅＩＩＣ（９）（セクションラボ社製）を張り付け薄切することにより、１０μｍ厚の骨切片を作製した。骨切片は、ＣｒｙｏｆｉｌｍｔｙｐｅＩＩＣ（９）を下にしてスライドグラス（松浪硝子工業社製）に両面テープで張り付け、イメージングプレート（ＧＥヘルスケアジャパン社製）上で１週間露光させ、スキャナータイプ画像解析装置（ＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ７０００ＩＰシステム、ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いてオートラジオグラム画像解析を行った。
また、比較として、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅに代えて、^３Ｈ−ＦＤＧ（アメリカンラジオラベルドケミカルズ社製）、又は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰ（日本メジフィジックス社製）を投与したものを用意した。^３Ｈ−ＦＤＧを投与した場合は、投与量を６．６６ＭＢｑ（１８．４ＭＢｑ／ｋｇ）にする以外は同様な操作を行った。^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰを投与した場合は、乳癌細胞移植後１４日目のラット乳癌溶骨型骨転移モデルに２０．３ＭＢｑ（５８．０ＭＢｑ／ｋｇ）投与した後、２時間後に屠殺し、イメージングプレートへの露光時間を２時間とした以外は同様な操作を行った。イメージングプレートの種類は^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ及び^３Ｈ−ＦＤＧのβ線核種ではＴＲを、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰのγ線核種はＳＲを用いた。
その後、各切片についてトルイジンブルー染色及びヘマトキシリン・エオジン染色にて病理学的評価を行った。トルイジンブルー染色では、スライドグラスに貼り付けた１０μｍ厚の骨切片をクライオスタットから取出し、室温にて約１分間乾燥したのち、無水エタノール（和光純薬工業社製）に約３〜５秒間浸し、さらに４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液（和光純薬工業社製）に１分間以上浸した。流水中にて約１０秒間水洗したのち、０．０５％トルイジンブルー溶液（ｐＨ７．０）（和光純薬工業社製）に約５分間浸した。流水中にて約３０秒間水洗したのち、骨切片表面に専用封入剤ＳＣＭＭ−Ｒ３（セクションラボ社製）を数滴滴下し、カッターでＣｒｙｌｏｆｉｌｍｔｙｐｅＩＩＣ（９）の両端を切り取った。骨切片を下にして、別のスライドグラスに置き、専用封入剤（Ｒ２・Ｒ３）重合装置（ライカマイクロシステムズ社製）にて専用封入剤を重合した。
また、ヘマトキシリン・エオジン染色では、上述同様に無水エタノール及び４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液に骨切片を浸したのち、ヘマトキシリン３Ｇ（サクラファインテックジャパン社製）に約２分間浸し、流水中にて約３０秒間水洗した。次に、エオジン（サクラファインテックジャパン社製）に約１分間浸したのち、流水中にて約３０秒間水洗した。骨切片表面に専用封入剤ＳＣＭＭ−Ｒ２（セクションラボ社製）を数滴滴下したのち、トルイジンブルー染色と同様に専用封入剤を重合した。

３．結果
結果を図１〜３に示す。図１（ａ）〜（ｊ）は、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの結果を示す図であり、図２（ａ）〜（ｊ）は、^３Ｈ−ＦＤＧの結果を示す図であり、図３（ａ）〜（ｊ）は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰの結果を示す図である。図１（ａ）〜（ｅ）、図２（ａ）〜（ｅ）、図３（ａ）〜（ｅ）が健常肢（左後肢）から摘出した下肢骨であり、図１（ｆ）〜（ｊ）、図２（ｆ）〜（ｊ）、図３（ｆ）〜（ｊ）がＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）から摘出した下肢骨である。図１（ａ）（ｆ）、図２（ａ）（ｆ）、図３（ａ）（ｆ）がＸ線撮像の結果であり、図１（ｂ）（ｇ）、図２（ｂ）（ｇ）、図３（ｂ）（ｇ）が外観図であり、図１（ｃ）（ｈ）、図２（ｃ）（ｈ）、図３（ｃ）（ｈ）がオートラジオグラムであり、図１（ｄ）（ｉ）、図２（ｄ）（ｉ）、図３（ｄ）（ｉ）がトルイジンブルー染色の結果であり、図１（ｅ）（ｊ）、図２（ｅ）（ｊ）、図３（ｅ）（ｊ）がヘマトキシリン・エオジン染色の結果である。
図１（ｆ）の矢印Ａは、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のＸ線画像で認められた溶骨病変の部位を示している。図１（ｇ）の矢印Ａは、図１（ｆ）の矢印Ａと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）の外観図で認められた骨転移巣の部位を示している。図１（ｈ）の矢印Ａは、図１（ｆ）の矢印Ａと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のオートラジオグラムで^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの集積が認められた部位を示している。図１（ｉ）の矢印Ａは、図１（ｆ）の矢印Ａと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のトルイジンブルー染色像で認められた骨転移巣の部位を示している。図１（ｊ）の矢印Ａは、図１（ｆ）の矢印Ａと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のヘマトキシリン・エオジン染色像で認められた骨転移巣の部位を示している。これらの結果から、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅは溶骨病変部の骨転移に集積することが確認された。
一方、図１（ｆ）の矢印Ｂは、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のＸ線画像で溶骨病変が認められない部位を示している。図１（ｇ）の矢印Ｂは、図１（ｆ）の矢印Ｂと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）の外観図で認められた骨転移巣の部位を示している。図１（ｈ）の矢印Ｂは、図１（ｆ）の矢印Ｂと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のオートラジオグラムで^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの集積が認められた部位を示している。図１（ｉ）の矢印Ｂは、図１（ｆ）の矢印Ｂと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のトルイジンブルー染色像で認められた骨転移巣の部位を示している。図１（ｊ）の矢印Ｂは、図１（ｆ）の矢印Ｂと同一部位で、ＭＲＭＴ−１移植肢（右後肢）のヘマトキシリン・エオジン染色像で認められた骨転移巣の部位を示している。これらの結果から、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅは、Ｘ線画像からは検出できない溶骨病変が形成される以前の骨転移にも集積することが確認された。^３Ｈ−ＦＤＧについても、図２（ｆ）〜（ｊ）の矢印Ａ及び矢印Ｂで示したとおり、溶骨病変部及び溶骨病変が形成される以前の骨転移に集積することが確認された。以上の結果から、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅは、^３Ｈ−ＦＤＧと同様に、溶骨病変部及び溶骨病変が形成される以前の骨転移への集積が確認された。一方、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰには、成長板及び一次海綿骨近傍（矢印Ｃ）に集積が認められたが、溶骨病変部（矢印Ａ）及び溶骨病変が形成される以前の骨転移巣（矢印Ｂ）にはいずれも集積が見られなかった。

＜実施例２：前立腺癌患者のＰＥＴ撮像＞
本試験は、ヘルシンキ宣言に基づく倫理的原則及びＧＣＰを遵守して実施した。試験の実施に先立って、本人から自由意思による試験参加の同意を文書により得た。

１．患者
前立腺針生検で病理組織学的に前立線癌と診断された未治療の男性患者（６９歳男性）であって、ＰＳＡが５８９．１７ｎｇ／ｍＬ、Ｇｌｅａｓｏｎスコアが８の患者を選択した。

２．試験薬剤
ＷＯ２００８／７５５２２記載の方法で製造した^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ製剤（ＮＭＫ３６、日本メジフィジックス株式会社製）を用いた。

３．ＰＥＴ／ＣＴ
前日の夕食後から絶食し，^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ製剤２ｍＬ（２６３．１ＭＢｑ）を静脈より投与し，生理食塩液でフラッシュした。^１８Ｆ−Ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ製剤の投与は、前立腺癌原発巣のＰＥＴ／ＣＴ画像評価への影響を避けるため、前立腺針生検を実施した日（１日目とする）から２２日目以降に行った。^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ製剤投与直後からＰＥＴ／ＣＴカメラ（ＧＥヘルスケア社製ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＰＥＴ／ＣＴ６００）を用いて吸収補正を目的に全身のＣＴ画像を撮像し、その後，全身ＰＥＴを投与後３０分までに終了した。

４．既存画像撮像
^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅのＰＥＴ／ＣＴ画像の比較対照として，^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅのＰＥＴ／ＣＴ実施日の２８日前までに全身造影ＣＴ及び骨シンチグラフィーを撮像した。全身造影ＣＴは，非イオン性造影剤（バイステージ、富士フイルムメディカル社製）を投与した後，９０秒後からスライス厚５ｍｍ以下で頚部から骨盤部まで８０列の多列検出器型ＣＴ（東芝社製ＡｑｕｉｌｉｏｎＰｒｉｍｅ）を用いてＣＴ画像（管電圧：１２０ｋＶ）を撮像した。骨シンチグラフィーは，^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰ（クリアボーン（登録商標）注、日本メジフィジックス社製）を７４０ＭＢｑ投与した後，２時間後から全身プラナー像（エネルギーウィンドウ：１４０ｋｅＶ±１０％）を撮像した。

５．視覚的画像評価
^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅのＰＥＴ／ＣＴ、全身造影ＣＴ及び骨シンチグラフィーの画像評価については、それぞれ２名の画像判定委員が被験者背景の盲検下で独立して判定を行い、２名の判定が異なった場合には合議で判定した。骨シンチグラフィーの全身プラナー像と全身造影ＣＴ画像を読影し、それらの総合所見から骨転移の有無を判定した。

６．結果
結果を図４（ａ）〜（ｃ）、５（ａ）〜（ｃ）に示す。図４（ａ）〜（ｃ）は^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅのＰＥＴ／ＣＴ画像であり、図４（ａ）が頭部画像、図４（ｂ）が胸部画像、図４（ｃ）が骨盤部画像である。また、図５（ａ）が、最大値投影法による^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅのＰＥＴ画像であり、図５（ｂ）が骨シンチグラフィーの前面画像であり、図５（ｃ）が骨シンチグラフィーの背面画像である。図４（ａ）〜（ｃ）、５（ａ）〜（ｃ）中、矢印で示す部位が図５（ｂ）、（ｃ）の骨シンチグラフィーでは描出されず、さらに全身造影ＣＴでも描出されなかった部位である。このように、^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの画像では、骨シンチグラフィーと全身造影ＣＴでは描出されなかった病変が描出された。

＜実施例３：トリプルトレーサーオートラジオグラフィー＞
１．材料
（１）乳癌細胞（ＭＲＭＴ−１）浮遊液の調製
実施例１で調製した乳癌細胞（ＭＲＭＴ−１）浮遊液と同様に調製した。

（２）ラット乳癌骨転移モデルの作製
１２週齢の雄性ＳＤラット（日本エスエルシー株式会社）を用い、左右両方の伏在動脈にＭＲＭＴ−１懸濁液を投与し、移植後６日目または８日目に下記の実験に供した以外は、実施例１で作製したラット乳癌溶骨型骨転移モデルと同様にして、骨梁間型骨転移モデルを作製した。移植後６日目のモデルでは右後肢のみ、移植後８日目のモデルでは左肢のみに病変が見られた。
また、１２週齢の雄性ＳＤラット（日本エスエルシー株式会社）を用い、移植後１１日目に下記の実験に供した以外は、実施例１で作製したラット溶骨型骨転移モデルと同様にして、溶骨型骨転移モデルを作製した。

（３）^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの調製
実施例１で調製した^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅと同様に調製した。

２．方法
乳癌細胞移植後６日目若しくは８日目のラット乳癌骨梁間型骨転移モデル、又は、乳癌細胞移植後１１日目のラット乳癌溶骨型骨転移モデルを一晩絶食させ、１％イソフルラン（ファイザー社製）麻酔した後、トレーサーとして２．７５ＭＢｑ／ｋｇの^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅ、７４ＭＢｑ／ｋｇの^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰ（日本メジフィジックス社製）および１８．５ＭＢｑ／ｋｇの^３Ｈ−ＦＤＧ（アメリカンラジオラベルドケミカルズ社製）を同一のラットに尾静脈投与した。屠殺まで、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅおよび^３Ｈ−ＦＤＧは、３０分間、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰは２時間循環させた。動物を腹部大動脈から採血することにより麻酔下で屠殺した。次いで、脛骨および大腿骨を取り出し、ＳＣＥＭ（セクションラボ社製）に包埋後、イソペンタン／ドライアイスで凍結させた。Kawamotoのフィルム法（Kawamoto T. Arch. Histol. Cytol. 2003;66:123-43）に記載されているように、−２０℃でＣＭ３０５０Ｓクライオスタット（Leica Biosystems社製）を用いて凍結試料を切片化した（病理学的およびオートラジオグラフィー標本のためのそれぞれ５μｍ厚および１０μｍ厚の骨切片）。１５個の連続切片を得、各切片をスライドグラス上に載せた。^９９ｍＴｃ同位体による画像を得るために、低エネルギーの^３Ｈを吸収する１２μｍ厚のポリエステルフィルム（ルミラー（登録商標）、東レ株式会社製）に乾燥済の１０μｍ厚の骨切片を包み、これにＳＲイメージングプレート（富士フイルム社製）を１時間露出させた。これらの条件下で、^１４Ｃは、１時間の露出後でもＳＲイメージングプレートの黒化を引き起こさず、したがって^９９ｍＴｃオートラジオグラフの^１４Ｃによる交差汚染を排除した。^９９ｍＴｃ−オートラジオグラフ切片に隣り合う２つの凍結切片を−２０℃で５日間保存し、^９９ｍＴｃを完全に崩壊させた。その後、ＴＲイメージングプレート（富士フイルム社製）を、乾燥切片に１２μｍ厚のポリエステルフィルムを伴った状態及び伴わない状態で７日間露出し、^１４Ｃ画像および^３Ｈ＋^１４Ｃ混合画像をそれぞれ得た(Obata T. et al. RADIOISOTOPES. 2000;49:623-36)。イメージングプレートは、ＦＬＡ−７０００画像解析装置（ＧＥヘルスケアＵＫ社製）で現像した。最後に、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４８、ＮＩＨ）を使用し、^１４Ｃ＋^３Ｈ画像から^１４Ｃ画像を取り除くことによって^３Ｈ画像を生成した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してすべての画像を処理し、以下に述べるように関心領域（ＲＯＩ）分析を行った。５μｍ厚の骨切片については、実施例１と同様にトルイジンブルー染色にて病理学的評価を行った。

３．結果
骨梁間型骨転移モデルの結果を図６、７に示す。図６は、乳癌細胞移植後６日目の結果を示し、図７は、乳癌細胞移植後８日目の結果を示す。図６（ａ）、図７（ａ）がトルイジンブルー染色の結果であり、矢印で骨梁間型の骨転移巣を示す。乳癌細胞移植後６日目の骨梁間型骨転移巣は、溶骨病変が形成される以前の骨梁間型であり、乳癌細胞移植後８日目の骨梁間型骨転移巣は、溶骨型が混在する骨梁間型である。図６（ｂ）、図７（ｂ）が^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰの結果であり、図６（ｃ）、図７（ｃ）が^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの結果であり、図６（ｄ）、図７（ｄ）が^３Ｈ−ＦＤＧの結果である。
また、溶骨型骨転移モデルの結果を図８に示す。図８（ａ）は、作製した骨切片の外観を示す図であり、図８（ｂ）は、^３Ｈ−ＦＤＧの結果であり、図８（ｃ）は、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅの結果であり、図８（ｄ）は、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰの結果である。図８（ｅ）は、トルイジンブルー染色の結果を示す図である。

図６（ｃ）、図７（ｃ）、図８（ｃ）で示すように、^１４Ｃ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅは、早期の骨転移巣に集積することが確認された。また、図６（ｄ）、図７（ｄ）、図８（ｂ）で示すように、^３Ｈ−ＦＤＧについても、早期の骨転移巣に集積することが確認されたが、図６（ｂ）、図７（ｂ）、図８（ｄ）で示すように、^９９ｍＴｃ−ＨＭＤＰは、早期の骨転移巣には、集積が認められなかった。

以上の結果から、^１８Ｆ−ｆｌｕｃｉｃｌｏｖｉｎｅにより、癌の早期骨転移を検出できることが示唆された。

この出願は、２０１５年６月４日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０１５−１１３５８７号を基礎とする優先権を主張するものであり、その開示の全ては本明細書に組み込まれるものである。

Claims

トランス−１−アミノ−［^１８Ｆ］フルオロシクロブタンカルボン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、癌の早期骨転移の画像診断剤。
前記早期骨転移が、溶骨反応が起こる以前の骨転移である、請求項１に記載の画像診断剤。
前記癌の早期骨転移が、乳癌又は前立腺癌に伴う骨転移である、請求項１又は２に記載の画像診断剤。
ポジトロン断層撮影に用いられる、請求項１乃至３いずれか一項に記載の画像診断剤。
癌の早期骨転移の画像診断剤を製造するための、トランス−１−アミノ−［^１８Ｆ］フルオロシクロブタンカルボン酸又はその薬学的に許容される塩の使用。