JP2018516855A

JP2018516855A - 梗塞における閉塞した血管の再疎通のための方法で使用するためのａｄａｍｔｓ１３を含む組成物

Info

Publication number: JP2018516855A
Application number: JP2017552120A
Authority: JP
Inventors: プライマオアー，バルバラ; ロッテンシュタイナー，ハンスペーター; シャイフリンガー，フリードリヒ; マイヤー，シモンデ; デノーム，フレデリック
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2018-06-28
Anticipated expiration: 2036-05-26
Also published as: JP2021138699A; JP6877356B2; GB201510870D0; EA201792130A1; EP3302533A1; MX2017013384A; US20210128701A1; AU2016268389A1; CN107635577A; BR112017025142A2; WO2016191565A1; HK1249863A1; US20180110842A1; AU2022203572A1; KR20180006376A; CA2979940A1

Abstract

梗塞を有する対象における閉塞した血管の再疎通のための方法及び組成物をここに提供する。その方法は、特定の投薬量及び梗塞検出後の特定の時間範囲で、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を対象に投与する工程を含む。本明細書に記載するように、ＡＤＡＭＴＳ１３は、安定な閉塞から長時間後に投与された場合でさえ、閉塞した血管を好都合に再疎通させ、さらに梗塞サイズを低減させる。従って、そのような方法及び組成物は、血管閉塞により生じた梗塞の治療に有用である。

Description

関連出願の相互参照

本願は、その開示の全てが本願に組み込まれる、２０１５年５月２６日出願の米国仮特許出願第６２／１６６，５８６号に基づく優先権を主張する。

梗塞を有する対象における閉塞した血管の再疎通のための方法及び組成物をここに提供する。その方法は、特定の投薬量及び梗塞検出後の特定の時間範囲で、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を対象に投与する工程を含む。本明細書に記載するように、ＡＤＡＭＴＳ１３は、安定な閉塞から長時間後に投与された場合でさえ、閉塞した血管を好都合に再疎通させ、さらに梗塞サイズを低減させる。従って、そのような方法及び組成物は、血管閉塞により生じる梗塞の治療に有用である。

梗塞は、十分な血液供給の喪失により生じる、器官に巨視的領域の壊死組織をもたらすプロセスである。動脈の供給は、ある障害物（例えば、血栓又は脂肪質のコレステロールの沈着）によって中から妨害され、或いは外傷によって機械的に圧縮され又は破裂され得る。梗塞は通常アテローム性動脈硬化に関連し、そこでアテローム性プラークが破裂し、血栓が表面上に形成し、それが血流を塞ぎ及び時には下流の他の血管を塞ぐ塞栓を形成する。消化管(gut)の一部がヘルニアになり又は捻転した場合のように、場合によっては、梗塞は血液供給の機械的妨害を含む。

梗塞は通常、出血の量によって２つのタイプに分けることができる：１つ目のタイプは貧血性梗塞であり、心臓、脾臓、及び腎臓のような実質臓器（solid organs）に影響を及ぼす。その閉塞は最も多くは血小板からなり、臓器は白く又は青白くなる。２つ目は、出血性梗塞であり、例えば、肺、脳等に影響を及ぼす。その閉塞はより多くの赤血球細胞及びフィブリンストランドからなる。

梗塞における臓器傷害の重篤でかつ不可逆的な性質のため、梗塞のレベル及び程度を低減する新規かつ有効な方法に対する明確な必要性が存在する。

本明細書は、梗塞を有する対象において閉塞した血管を再疎通する方法を提供する。その方法は、特定の投薬量及び梗塞検出後の特定の時間範囲で、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を対象に投与する工程を含む。本明細書に記載するように、ＡＤＡＭＴＳ１３は、安定な閉塞から長時間後に投与された場合でさえ、閉塞した血管を好都合に再疎通させ、さらに梗塞サイズを低減させる。従って、そのような方法及び組成物は、血管閉塞により生じる梗塞の治療に有用である。例示的な実施形態において、梗塞は脳梗塞である。

１つの態様では、梗塞を有する対象における閉塞した血管の再疎通のための方法をここに提供する。その方法は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、それにより閉塞した血管を再疎通させる。この方法において、医薬組成物は、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、又は２，０００Ｕ／ｋｇの用量で対象に投与される。例示的な実施形態において、梗塞は脳梗塞である。

第２の態様では、梗塞を有する対象における閉塞した血管の再疎通の方法をここに提供する。この方法は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、それにより閉塞した血管を再疎通させる。この方法において、医薬組成物は、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に対象に投与される。例示的な実施形態において、梗塞は脳梗塞である。

第３の態様では、対象における閉塞した血管の再疎通により、対象において梗塞を治療する方法をここに提供する。その方法は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、それにより梗塞を治療する。そのような方法において、医薬組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、又は２，０００Ｕ／ｋｇの用量で対象に投与される。例示的な実施形態において、梗塞は脳梗塞である。

第４の態様では、対象における閉塞した血管の再疎通により、対象において梗塞を治療する方法をここに提供する。その方法は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、それにより梗塞を治療する。この方法において、医薬組成物は、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に対象に投与される。例示的な実施形態において、梗塞は脳梗塞である。

上記の方法のある実施形態において、医薬組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、又は２，０００Ｕ／ｋｇの用量で、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に対象に投与される。

第５の態様では、梗塞を有する対象における閉塞した血管の再疎通の方法をここに提供する。その方法は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、それにより閉塞した血管を再疎通させる。この方法において、医薬組成物は、対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルを、投与前の対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０倍に増加させる量で対象に投与される。この方法のある実施形態において、医薬組成物は、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に対象に投与される。例示的な実施形態において、梗塞は脳梗塞である。

本発明の方法のある実施形態において、対象における局所脳血流量は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む組成物を投与されていない対照と比較して、少なくとも２５％まで改善される。ここに提供される方法のある実施形態において、局所脳血流量は、対照における局所脳血流量と比較して少なくとも５０％改善される。ここに提供される方法のある実施形態において、局所脳血流量は、対照における局所脳血流量と比較して少なくとも７５％改善される。

例示的な実施形態において、単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質はグリコシル化されている。ある実施形態において、単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、１時間より長い血漿中半減期を有する。ある実施形態では、単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞により組換え技術で生成される。ある実施形態では、単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＣＨＯ細胞により組換え技術で生成される。

ここに提供される方法の例示的な実施形態において、医薬組成物は、複数回、又は連続注入によって、投与される。ある実施形態では、その投与は、医薬組成物を投与されていない対照における出血のレベルと比較して、出血のレベルを増加させない。ある実施形態において、その投与は梗塞体積を低減する。

ある実施形態において、梗塞体積は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む組成物を投与されていない対照における梗塞体積と比較して、少なくとも５０％低減される。

第６の態様では、脳梗塞を経験した対象において、感覚運動機能の回復を改善する方法をここに提供する。この方法は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、その対象における局所脳血流量は、対照における局所脳血流量と比較して少なくとも２５％まで改善される。

右中大脳動脈（ＭＣＡ）のＦｅＣｌ_３誘発血栓性閉塞：（Ａ）露出された右側頭骨の２５倍の拡大図。局所的な小開頭により、右ＭＣＡを露出させ、ＭＣＡの走行をブレグマを越えて追跡し、レーザードップラーフロー（ＬＤＦ）プローブを用いて血流をモニタリングする。図１−１の続き。（Ｂ）ＭＣＡの血栓性閉塞は、２０％ＦｅＣｌ_３を染み込ませた小さな濾紙をＭＣＡ上に４分間、局所適用することにより誘発する。（Ｃ）ＦｅＣｌ_３の適用は、ベースライン値の２５％未満まで、ｒＣＢＦの急激な低下をもたらす。（Ｄ）傷害のタイプによって、小さな（閾値傷害）又は大きな（強い傷害）白い血小板に富む血塊（white platelet rich clot）が形成される。ＡＤＡＭＴＳ１３はＭＣＡにおける血栓安定性の決定因子である。ＤＡＭＴＳ１３ＫＯ及び野生型（ＷＴ）動物の両方のＭＣＡにおいてＦｅＣｌ_３誘発傷害を誘発し、ＭＣＡの血栓性閉塞を生じさせる。（Ａ）ＡＤＡＭＴＳ１３の不在は、ＭＣＡのより速い閉塞をもたらす。最初の閉塞までの時間は、ＦｅＣｌ_３適用後ｒＣＢＦが２５％未満に低下するまでの時間として定義した。（Ｂ）閉塞血栓の自然溶解がＡＤＡＭＴＳ１３の不在において損なわれた：閉塞後最初の再疎通までの時間は、ＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスと比較して、ＷＴマウスにおいて有意に短かった。図２−１の続き。（Ｃ−Ｆ）ＭＣＡ領域のｒＣＢＦの代表的なレーザードップラーフローチャートは、ＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスとＷＴマウスとの間の再疎通プロファイルの明確な違いを示す。Ｃ及びＤにおいて、ＷＴマウスの２つの代表的なｒＣＢＦプロットを表わす。Ｃは、血流量がベースライン値まで急速に回復したプロットを表わし、一方、ＤはｒＣＢＦを徐々に回復する過程にある典型的なＷＴマウスを示す。図２−２の続き。Ｅ及びＦに示されている代表的なＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスは、Ｅでは永続的に閉塞されたマウスを示し、Ｆでは再疎通はしているがベースライン値まで完全にはｒＣＢＦを回復できなかったマウスを示す（データは、１３〜１４匹のマウス／群からの結果を示す；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００５）。ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、ＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにおいて、ＭＣＡの再疎通を高め、及び脳を虚血性傷害から救う。ＭＣＡの血栓性閉塞を引き起こす閾値量のＦｅＣｌ_３の局所適用により、ＷＴ及びＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにおいて、閉塞性血栓を形成した。ＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスの一部に、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３（３５００Ｕ／ｋｇ）を閉塞の５分後に投与した。閉塞後、ｒＣＢＦをレーザードップラーフローメトリーによりモニターした。閉塞の２４時間後、ＴＴＣ染色により脳梗塞を決定した。（Ａ）平均した閉塞後ＭＣＡ血流プロファイルは、ｒＣＢＦの回復が、ＷＴ動物と比較して、ＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにおいて有意に損なわれたことを示す。ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の投与（矢印）は、ｒＣＢＦをＷＴの値まで回復させた。（Ｂ）ＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウス、ＷＴマウス、及びｒｈＡＤＡＭＴＳ１３を注射されたＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスの代表的なＴＴＣ染色された脳スライス。図３−１の続き。（Ｃ）閉塞の２４時間後の梗塞サイズのスキャッチャードットプロット。ＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスの梗塞サイズは、ＷＴマウスにみられる梗塞サイズよりも有意に大きかった。梗塞の５分後のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３でのＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスの処置は、梗塞サイズを有意に低減した（ｎ＝１０〜１４マウス／群；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３は、ＷＴマウスのＭＣＡの血流を回復させることにより、永続的な血栓性ＭＣＡ閉塞後の虚血性脳傷害に対する保護効果をもたらす。野生型（ＷＴ）Ｃ５７／Ｂｌ６Ｊマウスの右ＭＣＡに対する重篤なＦｅＣｌ_３誘発傷害を引き起こすことにより、閉塞し安定な血栓は自然溶解に耐性であった。閉塞の５分後に、様々な用量のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３を静脈投与し、ｒＣＢＦを６０分間モニターした。（Ａ）ＭＣＡの血栓性閉塞の後、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３は、用量依存的にＭＣＡのｒＣＢＦを回復させる。（Ｂ）２５％、５０％又は７５％超までｒＣＢＦレベルを回復する動物の割合は、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の用量と共に増加する。図４−１の続き。（Ｃ）閉塞の２４時間後に虚血性脳傷害を評価したとき、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の量の増加に伴い、梗塞サイズの用量依存的減少が観察された。（Ｄ）ビヒクル又は最高用量のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３（３５００Ｕ／ｋｇ）で処理したマウスから採取した３つの連続する冠状脳切片の代表的なＴＣＣ染色（ビヒクル及び３５００Ｕ／ｋｇのｒｈＡＤＡＭＴＳ１３についてそれぞれｎ＝９及び８マウス、より低い用量のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３についてｎ＝５；＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００５）。閉塞の６０分後の遅れたｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、ＭＣＡの血流を回復し、及び虚血性脳傷害を低減することができる。安定なＭＣＡ閉塞を誘発した６０分後に、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３（３５００Ｕ／ｋｇ）又はビヒクルのいずれかでマウスを処置した（矢印）。レーザードップラーフローメトリーでＭＣＡ領域のｒＣＢＦをモニターし、ＭＣＡの再疎通を評価した。（Ａ）ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３で処置したマウスにおいて、ｒＣＢＦの有意な増加がみられた。（Ｂ）脳卒中の結果への影響を評価するため、ＴＣＣ染色した脳切片において梗塞サイズを測定した。図５−１の続き。（Ｃ）ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３を投与されたマウスにおいて、血流の回復に応じて、脳梗塞のサイズが有意に減少した（各群においてｎ＝８；＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００５）。

定義
「再疎通」の語は、内腔の回復又は１つ以上の新規な脈管(channels)の形成による、閉塞後における血管内腔の回復を称する。「再疎通する」の語は、内腔の回復又は１つ以上の新規な脈管の形成によって、閉塞後に血管内腔が回復することを意味する。ここに記載されているある実施態様において、再疎通は、梗塞（例えば、脳梗塞）に関連する閉塞した血管に関係する。再疎通は、当業界で公知の任意の適切な方法を用いて決定できる。再疎通が閉塞した脳血管の再疎通である実施形態では、再疎通は、局所脳血流量（ｒＣＢＦ）の回復により決定される。

「局所脳血流量」及び「ｒＣＢＦ」は、所定時間内における脳の特定領域への血流の量を称する。局所脳血流量は、例えば、本明細書に記載されているレーザードップラーフローモニタリング技術を用いる等、当業界で公知の任意の適切な技術を用いて測定することができる。

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、及び一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーを意味する。特に限定されない限り、その語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、及び天然ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。指摘されない限り、特定の核酸配列は、明確に指示されている配列のみならず、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換(degenerate codon substitutions)）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列も、暗黙に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が、混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成できる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。核酸の語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと交換可能に用いられる。

「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖を作成するのに関与するＤＮＡ断片を意味する。それは、目的のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）の他に、コード領域に先行する及びその後に続く領域（リーダー及びトレイラー）を含み得る。

「アミノ酸」の語は、天然の及び合成のアミノ酸、並びに天然アミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされたものの他に、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸(γ-carboxyglutamate）、及びＯ−ホスホセリン等の、翻訳後修飾されたそれらアミノ酸もある。アミノ酸アナログは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム等）を意味する。そのようなアナログは、修飾Ｒ基（ノルロイシンなど）又は修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を維持する。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般化学構造と違う構造を有するが、天然アミノ酸に似た様式で機能する化合物を意味する。

非天然アミノ酸誘導体又はアナログのポリペプチド鎖への部位特異的態様での組込みを可能にする様々な公知の方法がある（例えば、国際公開第０２／０８６０７５号を参照）。

「保存的修飾変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、「保存的修飾変異体」は、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれら核酸、又は、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を意味する。遺伝コードの縮重のために、多くの機能的に同一の核酸が任意のあるタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。よって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく記載される対応コドンのいずれかに変化され得る。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的修飾変異体の１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載する。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧ（これは通常、メチオニンに対する唯一のコドンである）及びＴＧＧ（これは通常、トリプトファンに対する唯一のコドンである）を除く）は修飾されて機能的に同一の分子をもたらすことができることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される配列のそれぞれに潜在している。

アミノ酸配列に関しては、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸又は数パーセントのアミノ酸を変化、付加又は欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への置換、欠失又は付加は、その変化があるアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらす場合、「保存的修飾変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野においてよく知られている。そのような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子に追加され、及びそれらを排除しない。

下記８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984)を参照）。

本出願において、アミノ酸残基は、非修飾野生型ポリペプチド配列において１に数えられる一番左の残基からの相対位置に基づき番号づけられる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを称するのに交換可能に用いられる。それら３つの語は、天然アミノ酸ポリマー及び非天然由来アミノ酸ポリマーのみならず、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用する。本明細書で用いられる場合、その語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結している、完全長タンパク質を含む、任意の鎖長のアミノ酸鎖を包含する。

本明細書で用いられる「同一」又はパーセント「同一性」という語は、２つ以上のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列について記載する場合、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて或いは手動の整列及び目視検査によって測定して、比較ウィンドウ又は指定領域に亘り最大の一致となるように比較及び整列させたときに、同じであるか、又は特定の割合（％）の同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２つ以上の配列又は部分配列に言及する（例えば、ＮＲＧインテグリン結合を担うコアアミノ酸配列は、例えば配列番号１のような基準配列(reference sequence)に対して、少なくとも８０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する）。そのような配列は、「実質的に同一」とも言う。ポリヌクレオチド配列に関して、この定義は、試験配列の相補体にも言及する。好ましくは、同一性は、少なくとも約５０アミノ酸又はヌクレオチド長の領域にわたり、或いはより好ましくは、７５−１００アミノ酸又はヌクレオチド長の領域にわたり、同一性が存在する。

配列比較のために、通常１つの配列が基準配列となり、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び基準配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列座標(subsequence coordinates)を指定し、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いてもよく、或いは、別のパラメータを指定してもよい。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。核酸及びタンパク質の配列比較のために、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム、並びに以下に記載のデフォルトパラメータを用いる。

２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、以下に説明するように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して誘起された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは通常第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記において説明するように、２つの分子又はそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを用いてその配列を増幅させることができることである。

「抗体」は、ある検体（抗原）に特異的に結合し及びそれを認識する、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされているポリペプチド、又はその断片を意味する。認識されている免疫グロブリン遺伝子として、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、それらはそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。

本明細書で用いられる「有効量」の語は、ある物質が投与されて治療効果をもたらす量を意味する。その効果は、任意の検出可能な程度に、疾患／状態（例えば梗塞）及び関連する合併症の症状の予防、修正、又は阻害を含む。正確な量は、治療の目的に依存し、公知の技術を用いて当業者により確かめることができるであろう(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); 及びPickar, Dosage Calculations (1999)を参照)。

本明細書で用いられる「治療する(treat)」及び「予防する」の語は、絶対的な語であることは意図されていない。治療は、発症の任意の遅延、症状の向上、患者生存性の改善、梗塞体積の減少、頻度又は重篤性の低減等を意味することができる。従って、「治療(treatment)」の語は、予防を含み得る。治療の効果は、例えば、治療を受けていない対象又は対象のプール、同じ患者における未処置組織、又は治療前の同じ対象のような、対照と比較することができる。

「生体試料」は、例えばバイオプシーのような患者から、動物モデルのような動物から、或いは、例えば細胞株又は患者から摘出し及び観察のため培養で増殖させた細胞のような培養細胞から、得ることができる。生体試料は、結腸直腸組織のような組織、或いは、血液、血液分画、リンパ、唾液、尿、糞便等の体液を含む。

１．閉塞した血管の再疎通のためのＡＤＡＭＴＳ１３の使用
梗塞（例えば、脳梗塞）を有する対象において閉塞した血管の再疎通のための方法を本明細書において提供する。本明細書に記載するように、本発明者は、ＡＤＡＭＴＳ１３(A Disintegrin-like And Metalloprotease with Thrombospondin type I motif No. 13)が、不十分な血液供給のせいで組織が壊死するプロセスである梗塞を有する対象において、血流を回復し（即ち、再疎通）、及び梗塞サイズを低減できることを見出した。ＡＤＡＭＴＳ１３は、用量依存的にその効果を都合よく発揮し、それら効果は、血管閉塞の長時間後でさえみられる。

本発明の方法は、特定の投薬量及び梗塞検出後の特定の時間範囲で、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を対象に投与する工程を含む。

本発明の方法は、血管閉塞により生じた任意の梗塞を治療するのに適している。そのような梗塞として、限定はされないが、心筋梗塞、脳梗塞、肺梗塞、脾梗塞、肢梗塞(limb infarction)、骨梗塞、精巣梗塞、及び眼梗塞(eye infarction)が挙げられる。

例示的な実施形態において、本発明の方法は、脳梗塞を有する対象における閉塞した血管の再疎通のためのものである。「脳梗塞」は、脳組織の死をもたらす脳に血液を供給する血管の閉塞により生じる虚血性脳卒中の種類を意味する。脳梗塞の症状は、冒された脳の部分により決定される。例えば、一次運動野における梗塞は、対側片麻痺を生じ得る。脳幹梗塞は、ワレンベルグ（Wallenberg）症候群、ウェーバー（Weber）症候群、ミヤール・ギュブレル（Millard-Gubler）症候群、及びベネディクト（Benedikt）症候群を含む脳幹症候群を生じる。

閉塞した血管の再疎通は、任意の適切な技術を用いて測定できる。例えば、対照ベースライン値（例えば、閉塞した血管も梗塞も有しない対照個体の血流量）と比較した血流量の割合（％）として測定できる。例えば、フレームツーフレーム解析（frame-to-frame analysis）を用いるビデオ毛細血管顕微鏡(videocapillary microscoping)、又はドップラー流速計技術を使用して、血流量を測定することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Stucker et al. Microvascular Research 52(2): 188-192 (1996)を参照。ある実施形態において、本発明の方法は、対照ベースライン値（例えば、閉塞した血管も梗塞も有しない対照個体の血流量）と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％まで血流量を増加させる。

特定の動作原理に束縛されることなく、ＡＤＡＭＴＳ１３による閉塞した血管の再疎通は梗塞体積を低減させると考えられる。ある実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与されていない対照の梗塞体積の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％、対象における梗塞体積を減らす。

本発明の方法の特徴を下記にてより詳細に説明する。
Ａ．ＡＤＡＭＴＳ１３
本明細書において提供される本発明の方法は、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を、梗塞（例えば脳梗塞）を有する個体に投与する工程を含む。ＡＤＡＭＴＳ１３(A Disintegrin-like And Metalloprotease with Thrombospondin type I motif No. 13）は、主に肝臓によって生成される１９０ｋＤａのグリコシル化タンパク質である。ＡＤＡＭＴＳ１３は、１６０５位のチロシンと１６０６位のメチオニンとの間でＶＷＦを切断し、ＶＷＦ多重体を、それ自体他のペプチダーゼによりさらに分解されるより小さな単位に分解する血漿メタロプロテアーゼである。

本明細書で用いられる「ＡＤＡＭＴＳ１３」は、ＡＤＡＭＴＳ１３の生物活性誘導体を含む。ここで用いられる「生物活性誘導体」の語は、特にその能力において、ＡＤＡＭＴＳ１３と実質的に同じ生物学的機能を有する任意のポリペプチドを意味する。生物活性誘導体のポリペプチド配列は、その不在、存在及び／又は置換がポリペプチドの生物活性に実質的な負の影響を何ら及ぼさない、１つ以上のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を含んでいてよい。そのポリペプチドの生物活性は、例えば、内皮又は内皮下層への血小板接着の低減又は遅延、フローチャンバーでの血小板凝集の低減又は遅延、血小板ストリング(platelet strings)の形成の低減又は遅延、血栓形成の低減又は遅延、血栓成長の低減又は遅延、血管閉塞の低減又は遅延、ＶＷＦのタンパク質分解性の切断、及び／又は本出願の実施例に記載されているものに類似する実験系における梗塞体積の低減によって、測定することができる。

「ＡＤＡＭＴＳ１３」及び「生物活性誘導体」の語はそれぞれ、天然ポリペプチド及び組換えＤＮＡ技術により得られたポリペプチドを含む。例えば組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（「ｒ−ｈｕ−ＡＤＡＭＴＳ１３」）等の組換えＡＤＡＭＴＳ１３（「ｒＡＤＡＭＴＳ１３」、は、当業界で公知の任意の方法により作成できる。１つの具体的な例は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を作成する方法に関して、国際公開第０２／４２４４１号に開示されている。これは、（ｉ）遺伝子操作、例えばＲＮＡの逆転写及び／又はＤＮＡの増幅等による、組換えＤＮＡの作成、（ｉｉ）トランスフェクションにより、即ち、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより、原核細胞又は真核細胞に組換えＤＮＡを導入する、（ｉｉｉ）前記形質転換細胞を、例えば、連続又はバッチ式の方法で培養する、（ｉｖ）例えば、構成的に又は誘導により、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる、及び（ｖｉ）例えば、陰イオン交換クロマトグラフィ又はアフィニティクロマトグラフィにより、実質的に精製された組換えＡＤＡＭＴＳ１３を得るために、（ｖ）例えば、培養液から、又は形質転換細胞を採取することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３を単離する。「生物活性誘導体」の語は、例えば、哺乳類、特にヒト、の循環系中のＡＤＡＭＴＳ１３の半減期のような、生物学的／薬理学的特性を改善するために、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）と組み合わせたＡＤＡＭＴＳ１３（又はその生物活性誘導体）のような、キメラ分子も含む。Ｉｇは、随意的に変異されたＦｃ受容体に結合する部位を有していてもよい。

ｒＡＤＡＭＴＳ１３は、薬理学的に有効なＡＤＡＭＴＳ１３分子を生成することにより特徴づけられる適切な原核又は真核宿主系における発現により作成することができる。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、及びＨｅｐＧ２のような、哺乳類細胞である。本発明に従いＡＤＡＭＴＳ１３を作成又は単離するのに用いられる試薬又は条件に特定の制限はなく、当業界で公知の又は市販されている任意の系を用いることができる。本発明の１つの実施形態では、ｒＡＤＡＭＴＳ１３は、最新技術に記載されている方法により得られる。ある実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３はヒトＡＤＡＭＴＳ１３である。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３はブタのＡＤＡＭＴＳ１３である。

多種多様なベクターをｒＡＤＡＭＴＳ１３の調製に用いることができ、原核生物及び真核生物発現ベクターから選択することができる。原核生物での発現のためのベクターの例示として、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤ等のプラスミドが挙げられ、それら原核生物発現ベクターで用いられるプロモーターとして、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ等が挙げられる。真核生物発現のためのベクターの例示として：（ｉ）酵母での発現のための、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴのようなベクター（ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１等のプロモーターを用いる）；（ｉｉ）昆虫細胞での発現のための、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ等のようなベクター（ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ等のプロモーターを用いる）；並びに（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現のための、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ等のようなベクター、及びワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス等のウイルス系由来のベクター（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ−ａｃｔｉｎ等のプロモーターを用いる）が挙げられる。

Ｂ．医薬組成物
梗塞を有する対象における血管の再疎通に有用な医薬組成物もここに提供する。そのような組成物は、有効量のＡＤＡＭＴＳ１３又はその生物活性誘導体を含む。

医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含んでいてよい。また、医薬組成物は、例えば治療される患者／対象によるＡＤＡＭＴＳ１３の生成又は分泌を促進する薬剤、ＡＤＡＭＴＳ１３の分解を阻害し、それによりその半減期を延長させる薬剤（或いは、ＡＤＡＭＴＳ１３のグリコシル化した変異体）、（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３に結合し、それにより活性化立体配座変化を誘導することにより）ＡＤＡＭＴＳ１３の活性を増強する薬剤、或いは循環からのＡＤＡＭＴＳ１３のクリアランスを阻害し、それにより血漿濃度を高める薬剤等の、１つ以上の追加の活性成分を含んでいてもよい。

本発明の組成物は、重症の疾患状態、すなわち、生命にかかわる又は潜在的に生命にかかわるような状況において使用できることに留意すべきである。そのような場合、副作用（例えば、出血、免疫系への作用）がないことから、実質的に過剰量の本発明の医薬組成物を投与することが可能であり、そうすることを治療する医師が望ましいと感じるであろう。

ある実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３又はその生物活性誘導体は、例えば治療される患者／対象によるＡＤＡＭＴＳ１３の生成又は分泌を促進する薬剤、ＡＤＡＭＴＳ１３の分解を阻害し、それによりその半減期を延長させる薬剤、（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３に結合し、それにより活性化立体配座変化を誘導することにより）ＡＤＡＭＴＳ１３の活性を増強する薬剤、或いは循環からのＡＤＡＭＴＳ１３のクリアランスを阻害し、それにより血漿濃度を高める薬剤等の、１つ以上の追加の活性成分と共に投与される。共投与され得る別の成分として、血液希釈剤（例えば、アスピリン）、抗血小板薬、及びプラスミンを活性化してフィブリンを分解する血栓溶解性セリンプロテアーゼである組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）が挙げられる。

Ｃ．投与の用量及び時間
梗塞を有する対象に投与される医薬組成物は、閉塞した血管を再疎通するのに有効な量のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む。梗塞（例えば脳梗塞）を有する閉塞した血管を再疎通するのに有効な量は、例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。ある実施形態では、医薬組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，６００、１，７５０、２，０００、３０００、３５００、５０００、６０００、７０００、８０００、又は１０，０００Ｕ／ｋｇ体重の用量で、対象に投与される。

ある実施形態において、対象に投与されるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の量は、対照（例えば、投与前の対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３の量）と比較した、対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の量の増加として計算される。ある実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルを、その対象における投与前のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０倍に増加させる量で対象に投与される。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルを、投与前のその対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルより、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％増加させる量で対象に投与される。

用量は、ＡＤＡＭＴＳ１３が、予防的に（例えば、反復投与で）投与されるか、或いは梗塞の悪影響を迅速に低減するために医学的緊急事態に対応して投与されるかによって決定してもよい。

投与経路は、特別な制限はなく、例えば、皮下、動脈内、又は静脈内であってよい。ＡＤＡＭＴＳ１３の経口投与も可能である。

ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、予防及び／又は治療目的のために、哺乳類、特にヒト、に投与することができる。ある実施形態において、本発明は、出血の可能性を高めたり末梢免疫系を無効にしたりすることなく、血管閉塞の悪影響を低減するのに使用することができる。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、例えば血管閉塞のリスクを有する対象に、予防的に投与される。そのような場合、予防的処置は通常、例えば最初の梗塞事象後の所定の期間のような、長期間にわたり低用量で繰り返される。

本発明に従い治療され得る対象の例示として、その重篤性は問わず、心臓発作、肺梗塞、又は脳卒中（例えば、脳梗塞）のような、梗塞を経験した対象が挙げられる。周辺組織への血液の損失により生じる組織損傷を低減するために、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を梗塞後すぐに投与できれば、これは特にそうである。例えば病気又は血圧関連状態、外科的手術、或いは他の薬物治療の結果として、梗塞を経験するリクスのある対象にＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を投与してもよい。

ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の治療的投与は、例えば再発を防ぐために、梗塞の最初の徴候が見られた時点で又は診断のすぐ後に、開始することができる。その後の期間、追加投与（boosting doses）を続けてもよい。慢性的に病に冒された対象において、長期間の治療を提供することができる。ある実施形態において、医薬組成物は、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に対象に投与される。脳梗塞に関する症状は、組織損傷の領域により決定される。梗塞が一次運動野にある場合、対側片麻痺が生じると言われている。脳幹に局在性がある場合、ワレンベルグ症候群、ウェーバー症候群、ミヤール・ギュブレル症候群、ベネディクト症候群、又はその他のような脳幹症候群が典型的である。梗塞は、体の反対側における感覚の衰弱及び損失をもたらすであろう。頭部の身体診察は、反対側での異常な瞳孔拡張、対光反応、及び眼球運動損失を示すであろう。梗塞が左脳で生じた場合、言語が不明瞭になるであろう。反射も悪化し得る。本明細書に提供する実施例で説明するように、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、血管閉塞の長時間後でさえ、再疎通させ及び梗塞体積を低減することができる。ある実施形態では、再疎通は、対照（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与されていない対象）と比較したときに、梗塞体積の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％の減少をもたらす。

本組成物及び方法を、以下の実施例においてさらに説明するが、それらに限定されない。

Ａ．材料及び方法
マウス
全ての動物試験は、地元の倫理法及び倫理委員会（P081-2014 KU Leuven, Leuven, Belgium; act no. 87-848)、並びに実験動物の世話及び使用のガイドランに従い実施した。実験は、混合型のＣ５７ＢＬ／６Ｊ及び１２９Ｘ１／ＳｖＪバックグラウンド^７７である８〜１２週令の雄及び雌のＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯ及びＷＴマウス、並びに８〜１２週令の雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した（ジャクソン研究所）。

ＭＣＡの血栓性閉塞
純酸素中の５％イソフランでマウスを深く麻酔し、定位固定フレームに置き、その後、外科的処置及び局所脳血流量（ｒＣＢＦ）のモニタリングのために２％イソフランで麻酔を維持した。麻酔の間、直腸プローブ及びマウスの下においたサーモスタット制御の温熱パッド(TC-1000 Temperature controller, CWE Inc., Ardmore, USA)により、マウスの体温を３７℃に維持した。少し変更を加えて、以前説明したように、ＭＣＡにおける閉塞性血栓の形成により脳卒中を誘発した(Karatas et al., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 31: 1452-1460 (2011)を参照)。右目と鼻の間の皮膚切開により、側頭筋を切り取り、頭頂骨で小開頭を行い、右ＭＣＡを露出させる。２０％ＦｅＣｌ_３(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)を染み込ませたワットマン濾紙の小片をＭＣＡ上の無傷の硬膜の表面に置いた（図１）。閾値ＭＣＡ傷害のため、０．５ｘ０．５ｍｍの濾紙を用いた。強い傷害のために、濾紙の直径は０．５ｘ１．５ｍｍであった。４分後、濾紙を取り除き、適用部位のＭＣＡを食塩水で洗浄し、残りのＦｅＣｌ_３を除去した。

ＭＣＡ領域における局所脳血流量（ｒＣＢＦ）は、レーザードップラーフローモニタリング(moorVMS-LDF1; Moor Instruments; Devon, UK)により決定した。ＰｏｗｅｒＬａｂ８／３５データ収集装置(ADInstruments; Oxford, UK)を用いてｒＣＢＦの変化を記録し、ＬａｂＣｈａｒｔソフトウェア(v8.0.5; ADInstruments; Oxford, UK)を用いて計算した。ベースラインｒＣＢＦ（１００％）を設定するため、ＭＣＡ閉塞の誘発前１０分間ｒＣＢＦを連続して測定した。実験に応じて、閉塞後最大２時間まで、ＭＣＡの血栓性閉塞後ｒＣＢＦをモニターした。閉塞までの時間は、最初のＦｅＣｌ_３の適用とｒＣＢＦがベースラインの２５％未満に落ちる時点との間の時間として定義された。再疎通は、（６０秒にわたり）平均したｒＣＢＦのベースラインの２５％超への回復として定義された。

梗塞体積の測定
記載されているように脳梗塞体積を決定した(De Meyer et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 30, 1949-1951 (2010))。ＭＣＡの閉塞の２４時間後にマウスを安楽死させた。脳を迅速に摘出し、マウス用ブレインスライスマトリクスを用いて、２ｍｍ厚の冠状断面に切った。スライスを、ＰＢＳ中の２％２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド(Sigma-Aldrich)で染色して、健康な組織及び染色されない梗塞を可視化した。処置条件を知らない実験者が、切断面を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア(National Institutes of Health, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij/)を用いて面積測定により梗塞領域（白）を解析した。

急性虚血性脳卒中患者からの血栓の染色
４％ホルマリンで血栓を一晩固定し、パラフィン中に包埋し、その後５μｍ厚のスライスに切った。各血栓の連続スライスを再水和させ、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E; Sigma-Aldrich (St. Louis; MO; USA))、マルチウス・スカーレット・ブルー（Martius Scarlet blue）（ＭＳＢ）、又は抗ＶＷＦ抗体（ウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体(Dako A0082)、ヘマトキシリンで対比染色される)のいずれかで染色した。

統計解析
全てのデータを平均±その平均の標準誤差として表した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ(Version 6.Oc)を用いて統計解析を実施した。アンペアードスチューデントＴ検定（unpaired Student’s T-test）を用いて最初の閉塞／再疎通までの時間を解析した。スチューデントＴ検定、又はボンフェロニー多重比較検定（Bonferroni’s multiple comparison test）と共に一元配置ＡＮＯＶＡ（one-way ANOVA）を、梗塞病変の統計的比較のため、及び適用できる場合ｒＣＢＦを比較するために用いた。

Ｂ．実施例１：ＡＤＡＭＴＳ１３の不在は、閉塞性血栓の形成を促進し、自然再疎通を損なう
血栓溶解におけるＡＤＡＭＴＳ１３の効果を調べるため、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウス及びその野生型（ＷＴ）同腹子の両方において血栓性脳卒中を誘発した。第１の実験の組において、（２０％ＦｅＣｌ_３を染み込ませた０．５ｘ０．５ｍｍ^２の濾紙を用いて）ＭＣＡに比較的小さな傷害を生じさせた。傷害を生じると、全てのＷＴマウスは、ＦｅＣｌ_３の適用後１０分以内にＭＣＡに閉塞性血栓を生じた（図２Ａ）。興味深いことに、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスもＭＣＡに閉塞性血栓を生じたが、ＷＴ動物と比較したときに、閉塞までの時間は有意に短かった（それぞれ、４．２分±０．５分対６．４分±０．５分、ｐ＜０．００５；図２Ａ）。これらデータは、ＡＤＡＭＴＳ１３が、おそらく傷害の部位で（ＵＬ−）ＶＷＦの切断により成長する血栓を不安定にすることにより、ＭＣＡでの血栓形成を遅延させることができることを示す。一旦形成されると、閉塞性血栓は、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯ及びＷＴマウスにおいて同程度まで、ＭＣＡの血流量を減らした(残りの血流量：それぞれ、ベースラインの１３．４±１．４％対１２．９±１．９％、ｐ＝０．８６）。

興味深いことに、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにおいてＭＣＡがより速く閉塞したのみならず、閾値傷害の後、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスでは閉塞血栓の自然溶解が損なわれた。図２Ｂは、ベースラインの２５％を超えるｒＣＢＦの回復に要する時間として定義される、最初の再疎通までの時間を示す。このモデルにおいて、ＷＴマウスの大部分は、閉塞後１分以内のベースラインの２５％を超える血流量の回復を以って、閉塞後迅速な自然再疎通を示した。一方、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスでは、自然再疎通は、有意に遅く生じたか、或いは５０分の実験時間枠内で再疎通は全く生じなかった。７９％のＷＴマウス（１４匹中１１匹）は、１分未満で自然再疎通を示したが、１５％（１３匹中２匹）のＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスしか同様の迅速な再疎通を示さなかった。さらに、ＷＴマウスとＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスとの間で、再疎通のパターンの明白な違いが観察された：最初の再疎通の後、ＷＴ型マウスの殆どにおいて安定な血流が再建された（図２Ｃ−Ｄ）が、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスでは、再疎通の後、しばしば新たな血栓形成及び再閉塞が生じた（図２Ｅ−Ｆ）。

総じて、これらの結果は、ＡＤＡＭＴＳ１３は動脈血栓安定性の決定因子であり、ＡＤＡＭＴＳ１３が血栓性事象の間の良好な血管開放を守るのを助けることを示す。

Ｃ．実施例２：組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにおける不完全なＭＣＡ再疎通を立て直す
上記のデータは、ＡＤＡＭＴＳ１３が血栓不安定化を促進し及び閉塞した血管の再疎通を向上させることができることを示唆する。この仮定をさらに調べるために、閾値ＦｅＣｌ_３誘発血栓性ＭＣＡ閉塞の５分後に、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３（３５００Ｕ／ｋｇ）の静脈注射でＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスを処置した。ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の閉塞後の血栓溶解活性促進に続き、レーザードップラーフローメトリーによりｒＣＢＦを測定した。最初の閉塞後のいくつかの時点で平均血流量を計算して、経時的なｒＣＢＦの変化を定量化した（図３Ａ）。予想通り、これらｒＣＢＦプロファイルは、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスと比較して、ＷＴマウスにおいてＭＣＡの血流のかなり良好な回復を示し、閉塞後３０分以降、統計学的に有意に至った。閉塞後５０分で、ｒＣＢＦは、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにおいて３３％±１０％までしか回復しなかったのに対して、ＷＴマウスでは７８％±１８％に回復した（ｐ＜０．０１）。興味深いことに、閉塞の５分後にＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにｒｈＡＤＡＭＴＳ１３を投与したとき、損なわれた再疎通を立て直すことができ、ＷＴマウスに類似するｒＣＢＦの効果的な回復をもたらした（図３Ａ）。これらデータは、外因性のＡＤＡＭＴＳ１３が、既存の血栓を不安定化することができ、それにより効果的な血栓溶解及び続く血管再疎通を促進することを示す。

Ｄ．実施例３：組換えＡＤＡＭＴＳ１３を介したＭＣＡの血流の回復は虚血性脳傷害に対してＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスを保護する
次に、血流回復における観察された違いが、虚血性脳傷害への生理的影響を有するか否かを特定するために試験を実施した。従って、閉塞の２４時間後にマウスの脳を分離し、ＴＴＣで切片を染色して脳梗塞を可視化した（図３Ｂ及び３Ｃ）。予測通り、ＷＴマウスにおいて梗塞は比較的小さく、或いは存在しなかった（４．１ｍｍ^３±１．６ｍｍ^３）。ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスの乏しいＭＣＡ再疎通と合致して、それらマウスでの梗塞は有意に大きかった（１１．９ｍｍ^３±１．９ｍｍ^３）。ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３を投与されたＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスにおいて、梗塞体積は、ＷＴマウスの値に類似する値まで有意に減少した（４．５ｍｍ^３±１．４ｍｍ^３）。従って、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の投与によるＭＣＡの血流の回復は、より大きな脳梗塞に発展することから脳を救う。

Ｅ．実施例４：組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、ＷＴマウスにおいて永続的な血栓性閉塞を不安定化させる
上記の実験で用いた閾値傷害は、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスとＷＴマウスとの間のＡＤＡＭＴＳ１３に関連する違いをより詳細に分析することを可能にした。しかしながら、我々の血栓性脳卒中モデルにおける最初の血栓形成は、続く血栓不安定化に影響を及ぼし得るＡＤＡＭＴＳ１３の有無により影響を受ける。より生理学的設定でｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の血栓溶解促進効果を試験するため、野生型Ｃ５７／Ｂｌ６ＪマウスのＭＣＡにおいて永続的な血栓性閉塞を誘発させた。これを達成するために、２０％ＦｅＣｌ_３を染み込ませたより大きな濾紙を用いて傷害の程度を調整した。結果として、ＭＣＡの損傷領域は有意に大きく、マウスＭＣＡの永続的な血栓性閉塞を生じさせた（図１）。このモデルにおいて、ＭＣＡ閉塞後少なくとも２時間の間に自然再疎通は全く観察されなかった。

このモデルを用いて、最初に、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３（３５００Ｕ／ｋｇ）が閉塞開始の５分後に投与されたときにＭＣＡの血流を向上させ得るか否かを決定するために試験を実施した。明らかに、この用量のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３は、注射後２５分以内に７５％超までｒＣＢＦを回復させることができた（閉塞の６０分後にベースライン値の７６．６％±１５．９％；図４Ａ）。ビヒクルの投与は、ｒＣＢＦに全く影響を及ぼさなかった（閉塞の６０分後にベースライン値の１６．９％±２．３％）。次に、より低い用量のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３を用いて、このモデルでの最小有効用量を決定した。図５Ａに示すように、用量依存的効果が見られた：１６００Ｕ／ｋｇは、閉塞の５分後に投与したときに、まだ有意にｒＣＢＦを改善した（閉塞の６０分後にベースライン値の５０．５％±１３．６％）が、８００Ｕ／ｋｇは、血流量の限られた改善を示したのみであった（閉塞の６０分後にベースライン値の３３％±６％）。４００Ｕ／ｋｇの用量のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３は効果がなく、マウスの大部分において、ｒＣＢＦは閉塞の６０分後にベースライン値の２５％超に回復しなかった（閉塞の６０分後にベースライン値の２３％±３．６％）。ｒＣＢＦのモニタリングの最後に、個々のマウスについて再灌流の評価(grade)を決定した（図４Ｂ）。より少ない用量のｒｈＡＤＡＭＴＳ１３（４００Ｕ／ｋｇ及び８００Ｕ／ｋｇ）はそれぞれ、５匹中１匹及び５匹中２匹のマウスにおいて、部分的な再灌流（ｒＣＢＦ：２５％〜５０％）を誘導したのみである。それぞれ５匹中２匹及び８匹中６匹のマウスにおいて５０％超までｒＣＢＦを回復できたのは、より高い用量の１６００Ｕ／ｋｇ及び３５００Ｕ／ｋｇのｒｈＡＤＭＡＴＳ１３のみであった。

重要なこととして、ＡＤＡＭＴＳ１３による血流回復の用量依存的効果と合致して、同様の用量依存的反応が閉塞の２４時間後の虚血性脳傷害において見られた（図４Ｃ及び４Ｄ）。実際に、４００Ｕ／ｋｇのｒｈＡＤＡＭＴＳの投与は、ビヒクル処置と比較して、梗塞サイズに影響を及ぼさなかった（それぞれ、１８．８ｍｍ^３±２．３ｍｍ^３対１７．３ｍｍ^２±２．２ｍｍ^３）が、より高い用量の投与は、脳梗塞体積を低減させた。この防護効果は、最も高い２つの用量（１６００Ｕ／ｋｇ及び３５００Ｕ／ｋｇ）で統計的に有意であり、それぞれ、９．４ｍｍ^３±１．６ｍｍ^３及び５．３ｍｍ^３±１．７ｍｍ^３の梗塞体積であった。

Ｆ．実施例５：ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３の遅い投与でも脳卒中の結果を改善する血栓溶解促進効果を発揮する
ＡＤＡＭＴＳ１３の血栓溶解能力が臨床的により現実的なより広い時間枠においても有効であるか否かを評価するために、ＭＣＡの安定閉塞の１時間後にｒｈＡＤＡＭＴＳ１３（３５００Ｕ／ｋｇ）を静脈注射した。この長時間の血栓性閉塞の後でさえ、ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３はまだ血栓を不安定化することができ、それによりＭＣＡの開放を部分的に回復した（図５Ａ）。この効果は早いｒｈＡＤＡＭＴＳ１３投与よりも弱かったが、ｒＣＢＦはｒｈＡＤＡＭＴＳ１３注射の６０分後にベールライン値の４３．９％±１１．７％まで回復した。再度、ビヒクルで処置した群において、ｒＣＢＦは注射の６０分後に１８．２％±１．７％のままであった。この血流の部分的回復は、虚血発作（ischemic insult）から脳を部分的に救済するのにまだ十分であった。ｒｈＡＤＡＭＴＳ１３で処置されたマウスの梗塞１時間後の梗塞サイズは実際に、ビヒクルを投与されたマウスと比較して有意に減少した（それぞれ、１１．３ｍｍ^３±１．６ｍｍ^３対１８．８ｍｍ^３±２．９ｍｍ^３）。

Claims

脳梗塞を有する対象において閉塞した血管を再疎通させる方法であって、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を前記対象に投与し、それにより閉塞した血管を再疎通させる工程を含み、前記医薬組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、又は２，０００Ｕ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、方法。
脳梗塞を有する対象において閉塞した血管を再疎通させる方法であって、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を前記対象に投与し、それにより閉塞した血管を再疎通させる工程を含み、前記医薬組成物は、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に前記対象に投与される、方法。
対象において閉塞した血管を再疎通させることにより、対象において脳梗塞を治療する方法であって、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を前記対象に投与し、それにより脳梗塞を治療する工程を含み、前記医薬組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、又は２，０００Ｕ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、方法。
対象において閉塞した血管を再疎通させることにより、対象において脳梗塞を治療する方法であって、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を前記対象に投与し、それにより脳梗塞を治療する工程を含み、前記医薬組成物は、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０、又は３００分以内に前記対象に投与される方法。
前記医薬組成物は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、又は２，０００Ｕ／ｋｇの用量で前記対象に投与され、かつ梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に前記対象に投与される、請求項１から４いずれか１項記載の方法。
脳梗塞を有する対象において閉塞した血管を再疎通させる方法であって、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を前記対象に投与し、それにより閉塞した血管を再疎通させる工程を含み、前記医薬組成物は、前記対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルを、投与前の前記対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０倍に増加させる量で前記対象に投与される、方法。
前記医薬組成物は、梗塞検出の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００分以内に前記対象に投与される、請求項６記載の方法。
前記対象における局所脳血流量は、脳梗塞を有しない対照と比較して、少なくとも２５％まで改善される、請求項１から７いずれか１項記載の方法。
局所脳血流量は、前記対照における局所脳血流量と比較して、少なくとも５０％まで改善される、請求項８記載の方法。
局所脳血流量は、前記対照における局所脳血流量と比較して、少なくとも７５％まで改善される、請求項８記載の方法。
単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質はグリコシル化されている、請求項１から１０いずれか１項記載の方法。
単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、１時間より長い血漿中半減期を有する、請求項１から１１いずれか１項記載の方法。
単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞により組換え技術で生成されたものである、請求項１から１２いずれか１項記載の方法。
単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＣＨＯ細胞により組換え技術で生成されたものである、請求項１から１２いずれか１項記載の方法。
前記医薬組成物は、複数回又は連続注入により投与される、請求項１から１４いずれか１項記載の方法。
前記投与は、前記医薬組成物を投与されていない対照における出血のレベルと比較して、出血のレベルを増加させない、請求項１から１５いずれか１項記載の方法。
前記投与は梗塞体積を減少させる、請求項１から１６いずれか１項記載の方法。
梗塞体積は、脳梗塞を有していない対照における梗塞体積と比較して、少なくとも５０％低減される、請求項１７記載の方法。
脳梗塞を経験した対象において、感覚運動機能の回復を改善する方法であって、治療有効量の単離ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む医薬組成物を前記対象に投与し、それにより感覚運動機能の回復を改善する工程を含み、前記対象における局所脳血流量は、脳梗塞を有しない対照における局所脳血流量と比較して、少なくとも２５％まで改善される、方法。