JP2018515125A - 改変フォン・ヴィルブランド因子を製造するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、改変されたフォン・ヴィルブランド因子分子、それらの製造方法及びその使用を提供する。本発明はさらに、凝固障害を処理するための医薬組成物を提供する。

Description

発明の分野
本発明は、血液凝固障害の処置を改善するための製品及び方法に関する。

発明の背景
血液凝固因子の欠乏により引き起こされる様々な出血障害がある。最も一般的な障害は、それぞれ第VIII(FVIII)及び第IX血液凝固因子の欠乏により生じる血友病A及びBである。別の公知の出血障害はフォン・ヴィルブランド病（von Willebrand’s disease）(VWD)である。

血漿中で、FVIIIは大部分はフォン・ヴィルブランド因子(VWF)との非共有結合複合体として存在し、そしてその凝固機能は、第X因子の第Xa因子への第IXa因子依存性変換を加速することである。

古典的血友病又は血友病Ａは遺伝性の出血性障害である。これは染色体Ｘ連鎖性血液凝固第VIII因子欠損から生じ、そして10,000人あたり１人と２人との間の発生率でほとんど男性のみに影響を及ぼす。Ｘ染色体欠損は、それら自体血友病ではない女性キャリアにより伝達される。血友病Ａの臨床症状は増加した出血傾向である。

予防的処置を受けている重篤な血友病Ａ患者において、FVIIIは、約12〜14時間というFVIIIの短い血漿半減期のために週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与されなければならない。各ｉ．ｖ．投与は煩雑であり、痛みを伴い、そして特に大部分は家庭で患者自身により、又は血友病Ａと診断された児童の両親により行われるので、感染のリスクを伴う。

従って、このようなFVIIIを含有する医薬組成物がより少ない頻度で投与されなければならないように、FVIIIの半減期を増加させることは非常に望ましいだろう。

細胞受容体との相互作用を減少させることにより（特許文献１、特許文献２）、ポリマーをFVIIIに共有結合で結合することにより（特許文献３、特許文献４及び特許文献５）、FVIIIの封入により（特許文献６）、新しい金属結合部位の導入により（特許文献７）、ペプチド連結（特許文献８及び特許文献９）若しくはジスルフィド連結（特許文献１０）のいずれかによりＡ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合で結合することにより、又はＡ１ドメインをＡ２ドメインに共有結合で結合すること（特許文献１１）のいずれかにより、FVIIIの機能的半減期を延長させるための幾つかの試みがなされた。

FVIII又はVWFの機能的半減期を増強するための別のアプローチは、FVIIIのPEG化（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４）又はVWFのPEG化（特許文献１５）によるものである。ペグ化VWFの増加された半減期は、血漿中に存在するFVIIIの半減期も間接的に増強するだろう。また、FVIIIの融合タンパク質も記載されている（特許文献１６、特許文献１７及び特許文献１８）。

フォン・ビルブラント病（ＶＷＤ）の様々な形態において、欠失しているか、機能不全であるか又は減少した量でしか利用可能でないVWFは、哺乳動物の血漿中に存在するマルチマーの接着性糖タンパク質であり、多数の生理学的機能を有する。一次止血の間、VWFは、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンのような細胞外マトリックスの成分との間のメディエーターとして作用する。さらに、VWFは、プロコアグラント（procoagulant）F
VIIIのための担体及び安定化タンパク質として役立つ。VWFは、内皮細胞及び巨核球において2813アミノ酸の前駆体分子として合成される。野生型VWFのアミノ酸配列及びcDNA配列は、非特許文献１に開示される。前駆体ポリペプチドのプレ−プロ−VWFは、N末端２２残基のシグナルペプチド、続いて741残基のプロペプチド及び成熟血漿VWFにおいて見出される2050残基のポリペプチドからなる（非特許文献２）。小胞体におけるシグナルペプチドの切断後に、Ｃ末端ジスルフィド架橋が、VWFの２つのモノマー間に形成される。分泌経路を通るさらなる輸送の間に、12のＮ連結及び10のＯ連結炭水化物側鎖が付加される。より重要なことには、VWFダイマーは、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、そして741アミノ酸長のプロペプチドは、後期（late）ゴルジ体において酵素PACE／フューリンにより開裂される。

血漿中に分泌されると、プロテアーゼADAMTS13は、VWFのA1ドメイン内で高分子量VWFマルチマーを切断することができる。従って、血漿VWFは、500kDaの単一のダイマーから、10,000kDaを超える分子量の20まで又は20より多くのダイマーからなるマルチマーまでの全範囲からなる。VWF-HMWMは最も強い止血活性を有し、これはリストセチン補因子活性アッセイ（VWF:RCo）により測定され得る。VWF:RCo/VWF抗原の比が高くなるほど、高分子量マルチマーの相対的な量が高くなる。

血漿中で、FVIIIは高い親和性でVWFに結合し、これはそれを早期排出から保護し、従って、一次止血におけるその役割に加えてFVIIIを安定化するための重大な役割を果たし、FVIIIの血漿レベルを調節し、そして結果として、二次止血を制御する中心的因子でもある。VWFに結合した非活性化FVIIIの半減期は血漿中で約12〜14時間である。VWFが全く又はほとんど存在しない3型フォン・ヴィルブランド病において、FVIIIの半減期は約2〜6時間しかなく、このような患者ではFVIIIの減少した濃度に起因して軽度から中程度の血友病Aの症状を生じる。FVIIIに対するVWFの安定化効果はまた、CHO細胞におけるFVIIIの組み換え発現を補助するために使用されてきた(非特許文献３)。

VWF由来ポリペプチド、特にVWFフラグメントは、インビトロ及びインビボでFVIIIを安定化すると記載されている。特許文献１９は、特定のVWFフラグメント及びFVIIIタンパク質を含むキメラタンパク質に関する。特許文献２０及び特許文献２１は、VWFフラグメント及び血友病の処置におけるそれらの使用を記載する。特許文献２２は、特定のVWFフラグメント及び抗体Fc領域を含む融合ポリペプチドを開示する。特許文献２３は、同時発現するFVIII又はVWFの切断型形態（truncated forms）を含むVWFポリペプチドを含むタンパク質を組み換えα-2,3-シアリルトランスフェラーゼを用いて製造するための方法を記載する。非特許文献４は、D’D3ドメインを含有するVWFフラグメントが、マウスにおいて第VIII因子を安定化するために十分であるということを見出した。しかし、VWF D’D3-Fc融合タンパク質は、FVIII欠損マウスに輸液された場合に顕著に長期の残存を示したが、VWF
D’D3-Fc融合タンパク質は、同時輸液されたFVIIIの残存を延長しなかった。

糖タンパク質のシアリル化レベルに対する発酵温度の影響は、Trummerら(非特許文献５)により調べられ、エリスロポエチンについて30℃でシアリル化が40%減少し、そして33℃で20%減少することが見出された。

Ahnらもまた糖タンパク質のシアリル化レベルに対する発酵温度の影響を調べ、そしてエリスロポエチンについて(非特許文献６)アシアロ糖タンパク質のパーセンテージを37℃で2.4 %、そして32℃で2.1 %と発表した。

WO 03/093313A2 WO 02/060951A2 WO 94/15625 WO 97/11957 US 4970300 WO 99/55306 WO 97/03193 WO 97/40145 WO 03/087355 WO 02/103024A2 WO2006/108590 WO 2007/126808 WO 2006/053299 WO 2004/075923 WO 2006/071801 WO 2004/101740 WO2008/077616 WO 2009/156137 WO 2013/106787 A1 WO 2014/198699 A2 WO 2013/083858 A2 WO2011/060242A2 WO2013/093760 A2

Collins et al. 1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397 Fischer et al.、FEBS Lett. 351: 345-348、1994 Kaufman et al. 1989、Mol Cell Biol 9:1233-1242 Yee et al. (2014) Blood 124(3):445-452 Trummer et al Biotech. Bioeng. (2006) Vol. 94、No. 6、p. 1033-1044 Ahn et al. Biotech. Bioeng.(2008) Vol. 101、No. 6、p. 1234-1244

減少した投与頻度で、FVIII及びFVIII産物の半減期を増加させる方法の継続した必要性がある。

発明の要旨
VWFフラグメントのN-グリカンのシアリル化は、VWFフラグメントをコードする組み換えDNAでトランスフェクトされた哺乳動物細胞がより低い温度、例えば36℃未満で培養された場合に、有意に増加するということが本発明者らにより見出された。このようにして得られた産物は、改善された薬物動態及び延長された平均滞留時間(MRT)を示し、そして同時投与されたFVIIIの薬物動態を改善し、かつMRTを延長するためにも使用され得る。FVIIIのクリアランスは、そのN-グリカンの高度のシアリル化を特徴とする半減期延長VWF由来ポリペプチドの同時投与により有意に減少され得るということが本発明者らにより見出された。従ってこれらは、血液凝固障害を処置するために特に適している。特に、全N-グリカンの７５％より多くが平均して少なくとも１つのシアル酸を有するN-グリカンを含むFVIIIに結合することができるVWFフラグメントは、特に有用であることが示された。

上記の本発明の方法の別の利点は、得られたVWFフラグメントが、従来の方法で製造されたVWFフラグメントよりも高い比率のダイマーを有するということである。本発明者らは、ダイマーがモノマーよりもFVIIIに対して高い親和性を有するということを見出した。

本発明の特に好ましい実施態様において、VWF由来ポリペプチドは、半減期延長部分に接続され得、かつそのN-グリカンの高度のシアリル化を特徴とし、かつ２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する特に少量のN-グリカン、及びなおさらに好ましくは３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する特に少量のN-グリカンを含む、多価非シアリル化末端ガラクトース残基を有する特に少量のN-グリカンを有する。

従って、本発明は、以下の実施態様[１]〜[53]に関する:

［１］ 増加したシアリル化を有するN-グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法であって、(i)切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供すること、及び(ii)該細胞を36.0℃未満の温度で培養することを含み、ここで切断型VWFを含む該ポリペプチドは、好ましくは、全長VWFよりも長い循環平均滞留時間(MRT)を有する、上記方法。

［２］ 切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質のダイマーを製造する方法であって、(i)糖タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供すること、及び(ii)該細胞を36.0℃未満の温度で培養することを含む、上記方法。

［３］ 切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質の二量体化を増加させる方法であって、(i)糖タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供すること、及び(ii)該細胞を36.0℃未満の温度で培養することを含む、上記方法。

［４］ 細胞が、シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ及び／又はα-2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸をさらに含む、項目［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。

［５］ 工程(ii)の前に、細胞が37.0℃±1.0℃の温度で培養され、そして工程(ii)は、34.0℃±2.0℃の温度で細胞を培養することを含む、項目［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。

［６］ 増加したシアリル化を有するN-グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法であって、(i)切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含むポリペプチドをコードする核酸及びα-2,6-シアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸を含む細胞を提供すること、及び(ii)糖タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、上記方法。

［７］ 細胞がトランスフェクトされた哺乳動物細胞であり、そして工程(i)は、切断型VWFを含むポリペプチドをコードする核酸、及び場合によりシアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸を哺乳動物細胞に導入することを含む、項目［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。

［８］ 培地から糖タンパク質を回収する工程をさらに含む、項目［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。

［９］ 項目［１］〜［８］のいずれか１項において得られた糖タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにかけて、それにより高シアリル化を有する糖タンパク質を、低シアリル化を有する糖タンパク質から分離すること；及びイオン交換カラムから溶出された高シアリル化を有するフラクションを集めることをさらに含む、項目［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。

［10］ 項目［１］〜［９］のいずれか１項において得られた糖タンパク質を、シアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸ドナーとインビトロで接触させることをさらに含む、項目［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。

［11］ シアリルトランスフェラーゼが、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ、又はそれらの組み合わせである、項目[10]に記載の方法。

［12］ 糖タンパク質が、切断型VWFに融合された半減期延長異種ポリペプチドをさらに含む、項目［１］〜［11］のいずれか1項に記載の方法。

［13］ 半減期延長異種ポリペプチドが、アルブミン又は少なくとも100のアミノ酸長を有するそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及びその部分、例えばＦｃフラグメント、トランスフェリン及びそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、XTENとして知られる大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸反復（HAP）、プロリン−アラニン−セリン反復（PAS）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含むか又はそれらからなる、項目［12］に記載の方法。

［14］ 項目［１］〜［13］のいずれか1項において得られた糖タンパク質を、半減期延長部分と結合させることを含む、項目[1]〜[11]のいずれか1項に記載の方法。

［15］ 半減期延長部分が、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸(PSA)及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖からなる群より選択される、項目[14]に記載の方法。

［16］ 平均して、得られた糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも75%が、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、項目［１］〜［15］のいずれか1項に記載の方法。

［17］ 平均して、得られた糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも80%が、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、項目［１］〜［16］のいずれか1項に記載の方法。

［18］ 平均して、得られた糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも85%が、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、項目［１］〜［17］のいずれか1項に記載の方法。

［19］ 平均して、得られた糖タンパク質の少なくとも50％がダイマーとして存在する、項目［１］〜［18］のいずれか1項に記載の方法。

［20］ 項目［１］〜［19］のいずれか1項に記載の方法により得ることができる糖タンパク質。

［21］ 切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質であって、ここで該切断型VWFは第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そして該糖タンパク質はN-グリカンを含み、そして該N-グリカンの少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、上記糖タンパク質。

［22］ 切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質であって、ここで該切断型VWFは第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そして該糖タンパク質はN-グリカンを含み、ここで該N-グリカンの35%未満、好ましくは34%未満、好ましくは33%未満、好ましくは32%未満、好ましくは31%未満、好ましくは30%未満、好ましくは29%未満、好ましくは28%未満、好ましくは27%未満、好ましくは26%未満、好ましくは25%未満、好ましくは24%未満、好ましくは23%未満、好ましくは22%未満、好ましくは21%未満、好ましくは20%未満、好ましくは19%未満、好ましくは18%未満、好ましくは17%未満、好ましくは16%未満、好ましくは15%未満、好ましくは14%未満、好ましくは13%未満、好ましくは12%未満、好ましくは11%未満、好ましくは10%未満、好ましくは9%未満、好ましくは8%未満、好ましくは7%未満、好ましくは6%未満、そして好ましくは5%未満は、平均して、2つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を含む、上記糖タンパク質。

［23］ 項目[21]及び[22]に記載の糖タンパク質。

［24］ 切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質であって、ここで該切断型VWFは第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そして該糖タンパク質はN-グリカンを含み、ここで該N-グリカンの6%未満、好ましくは5%未満、好ましくは4%未満、好ましくは3%未満、好ましくは2%未満、そして好ましくは1%未満は、平均して、3つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を含む、上記糖タンパク質。

［25］ 項目[21]及び[24]又は項目[22]及び[24]又は項目[23]及び[24]に記載の糖タンパク質。

［26］ 該N-グリカンの少なくとも70%が、平均して、少なくとも１つのα-2,6-シアル酸部分又は１つのα-2,3-シアル酸部分を含む、項目[21]〜[25]に記載の糖タンパク質。

［27］ 切断型VWFが、(a)配列番号9のアミノ酸776〜805又は(b)配列番号9のアミノ酸776〜805に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目[20]〜[26]のいずれか1項に記載の糖タンパク質。

［28］ 切断型VWFは、(a)配列番号9のアミノ酸766〜864又は(b)配列番号9のアミノ酸766〜864に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目[20]〜[27]のいずれか１項に記載の糖タンパク質。

［29］ 切断型VWFは、(a)配列番号9のアミノ酸764〜1242、(b)配列番号9のアミノ酸764〜1242に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は(c) (a)若しくは(b)のフラグメントからなる、項目[20]〜[28]のいずれか1項に記載の糖タンパク質。

［30］ 切断型VWFに融合された半減期延長異種ポリペプチド、及び／又は糖タンパク質に結合された半減期延長部分をさらに含む、項目[20]〜[29]のいずれか1項に記載の糖タンパク質。

［31］ 半減期延長異種ポリペプチドが、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントを含むか又はそれらからなり、ここで該フラグメントの長さは少なくとも100アミノ酸である、項目[30]に記載の糖タンパク質。

［32］ 糖タンパク質に融合された異種ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域及びその部分、例えばＦｃフラグメント、トランスフェリン及びそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして知られる大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含むか又はそれらからなる、項目［30］に記載の糖タンパク質。

［33］ 糖タンパク質結合された半減期延長部分が、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸(PSA)、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖からなる群より選択される、項目［30］に記載の糖タンパク質。

［34］ 糖タンパク質がダイマーである、項目[20]〜[33]のいずれか1項に記載の糖タンパク質。

［35］ FVIIIに対するダイマー糖タンパク質の親和性は、該FVIIIに対するモノマー糖タンパク質の親和性よりも大きく、ここで該モノマー糖タンパク質は、ダイマー糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有する、項目[34]に記載のダイマー糖タンパク質。

［36］ 切断型VWFが、配列番号9に示されるアミノ酸配列と比較して1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有し、ここで該1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有する切断型VWFは、配列番号9と比較して該１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を除いて同じアミノ酸配列からなる切断型VWFよりも高いFVIIIに対する親和性を有する、項目[20]〜[35]のいずれか１項に記載の糖タンパク質。

［37］ FVIIIに対する糖タンパク質の親和性は参照ポリペプチドの親和性より高く、ここで該参照ポリペプチドのアミノ酸配列は、参照ポリペプチドの切断型VWFのアミノ酸配列が配列番号9に示されるアミノ酸配列と比較して該1つ又はそれ以上の置換を有していないことを除いて、該糖タンパク質のアミノ酸配列と同じである、項目[36]に記載の糖タンパク質。

［38］ 項目[20]〜[37]のいずれか1項において定義される糖タンパク質集団を含む組成物であって、ここで組成物中のモノマー糖タンパク質に対するダイマー糖タンパク質の比は1.0より大きく、好ましくは1.5より大きく、より好ましくは2.0より大きく、最も好ましくは2.5より大きい、上記組成物。

［39］ 項目[20]〜[37]のいずれか1項に記載の糖タンパク質及び薬学的に許容しうる添加物を含む医薬組成物。

［40］ 組成物中の糖タンパク質の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%はダイマーとして存在する、項目[39]に記載の医薬組成物。

［41］ 血液凝固障害の処置における使用のための、項目[20]〜[37]のいずれか1項において定義される糖タンパク質であって、該処置は、被験体に有効量の該糖タンパク質を投与することを含む上記使用のための糖タンパク質。

［42］ 処置が被験体に有効量のFVIIIを投与することをさらに含む、項目[41]に記載の使用のための糖タンパク質。

［43］ FVIII単独での処置と比較して、糖タンパク質の同時投与により、FVIIIの血漿MRTは増加し、かつ／又はFVIIIのクリアランスは減少する、項目［42］に記載の使用のための糖タンパク質。

［44］ FVIIIの投与頻度は、FVIII単独での処置と比較して減少される、項目[42]又は[43]に記載の使用のための糖タンパク質。

［45］ 糖タンパク質及び／又はFVIIIが静脈内投与される、項目[42]〜[44]のいずれか1項に記載の使用のための糖タンパク質。

［46］ 糖タンパク質及び／又はFVIIIが皮下投与される、項目[42]〜[44]のいずれか1項に記載の使用のための糖タンパク質。

［47］ 糖タンパク質及びFVIIIが別個に投与される、項目[42]〜[46]のいずれか1項に記載の使用のための糖タンパク質。

［48］ 第VIII因子の血漿MRTを増加させるための、項目[20]〜[37]のいずれか1項において定義される糖タンパク質の使用。

［49］ 投与されたFVIIIの循環からのクリアランスを減少させるための、項目[20]〜[37]のいずれか1項において定義される糖タンパク質の使用。

［50］ 第VIII因子が、血友病Aを有する被験体に外因的に投与される、項目[48]又は[49]に記載の使用。

［51］ 血液凝固障害の処置における同時の、別個の又は連続した使用のための、項目[20]〜[37]のいずれか1項において定義される糖タンパク質を含む医薬キット。

［52］ 血液凝固障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の項目[20]〜[37]のいずれか1項において定義される糖タンパク質を投与することを含む、上記方法。

［53］ 項目[20]〜[37]のいずれか1項に記載の糖タンパク質を同時投与することを含む、体外から投与されたFVIIIの循環半減期を延長する方法。

図1: 実施例8.1において測定されるように、ラットにおいてアルブミンとして定量化されたD’D3-FPダイマーの平均滞留時間及びクリアランス(平均)。 図2: 実施例8.1において測定されるように、ラットにおいてFVIIIとして定量化されたrVIII-SCの平均滞留時間及びクリアランス(平均)。 図3: 実施例8.2において測定されるように、ラットにおいてアルブミンとして定量化されたD’D3-FPダイマーの平均滞留時間及びクリアランス(平均)。 図4: 実施例8.2において測定されるように、ラットにおいてFVIII抗原として定量化された全長第VIII因子の平均滞留時間及びクリアランス(平均)。 図5: 図6〜25に示される糖構造に対する凡例。 図6: 中性N-グリカンを示すロットB-140526のプロフィール。 図7: モノ−シアロN-グリカンを示すロットB-140526のプロフィール。 図8: ジ−シアロN-グリカンを示すロットB-140526のプロフィール。 図9: トリ−シアロN-グリカンを示すロットB-140526のプロフィール。 図10: テトラ−シアロN-グリカンを示すロットB-140526のプロフィール。 図11: 中性N-グリカンを示すロットB-140616KSのプロフィール 図12: モノ−シアロN-グリカンを示すロットB-140616KSのプロフィール。 図13: ジ−シアロN-グリカンを示すロットB-140616KSのプロフィール。 図14: トリ−シアロN-グリカンを示すロットB-140616KSのプロフィール。 図15: テトラ−シアロN-グリカンを示すロットB-140616KSのプロフィール。 図16: 中性N-グリカンを示すロットB-140825のプロフィール。 図17: モノ−シアロN-グリカンを示すロットB-140825のプロフィール。 図18: ジ−シアロN-グリカンを示すロットB-140825のプロフィール。 図19: トリ−シアロN-グリカンを示すロットB-140825のプロフィール。 図20: テトラ−シアロN-グリカンを示すロットB-140825のプロフィール。 図21: 中性N-グリカンを示すロットB-140623KSのプロフィール。 図22: モノ−シアロN-グリカンを示すロットB-140623KSのプロフィール。 図23: ジ−シアロN-グリカンを示すロットB-140623KSのプロフィール。 図24: トリ−シアロN-グリカンを示すロットB-140623KSのプロフィール。 図25: テトラ−シアロN-グリカンを示すロットB-140623KSのプロフィール。 図26: 比較サンプルB140526の２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンの定量的測定。第一のカラムは、中性、モノ-シアロ、ジ-シアロ、トリ−シアロ及びテトラ−シアロN-グリカンについての合計100%になる全N-グリカンの定量的分布を示す。第二のカラムは、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性、モノ−シアロ及びジ−シアロN-グリカンのみが検出された。第三のカラムは、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性N-グリカンのみが検出された。 図27: 本発明に従うサンプルB140616KSの２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンの定量的測定。第一のカラムは、中性、モノ-シアロ、ジ-シアロ、トリ−シアロ及びテトラ−シアロN-グリカンについての合計100%になる全N-グリカンの定量的分布を示す。第二のカラムは、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性、モノ−シアロ及びジ−シアロN-グリカンのみが検出された。第三のカラムは、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性N-グリカンのみが検出された。 図28: 本発明に従うサンプルB140825の２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンの定量的測定。第一のカラムは、中性、モノ-シアロ、ジ-シアロ、トリ−シアロ及びテトラ−シアロN-グリカンについての合計100%になる全N-グリカンの定量的分布を示す。第二のカラムは、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性、モノ−シアロ及びジ−シアロN-グリカンのみが検出された。第三のカラムは、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性N-グリカンのみが検出された。 図29: 本発明に従うサンプルB140623KSの２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンの定量的測定。第一のカラムは、中性、モノ-シアロ、ジ-シアロ、トリ−シアロ及びテトラ−シアロN-グリカンについての合計100%になる全N-グリカンの定量的分布を示す。第二のカラムは、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、２つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性、モノ−シアロ及びジ−シアロN-グリカンのみが検出された。第三のカラムは、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンのパーセンテージ(全N-グリカン100%と比較して)を示す。このサンプルにおいて、３つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有する中性N-グリカンのみが検出された。

詳細な説明
第一の局面において、本発明は、シアリル化N-グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法に関し、該方法は、(i)切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供すること、及び(ii) 該細胞を36.0℃未満の温度で培養することを含む。好ましくは、製造された糖タンパク質のN-グリカンは、増加したシアリル化、及び／又は高度のシアリル化を有する。

第二の局面において、本発明は、シアリル化N-グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法に関し、該方法は、(i)切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含むポリペプチドをコードする核酸及びα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ及び／又はα-2,6-シアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸を含む細胞を提供すること、並びに(ii)糖タンパク質及びシアリルトランスフェラーゼの発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。好ましくは、産生された糖タンパク質のN-グリカンは、増加したシアリル化及び／又は高いシアリル化を有する。

用語「糖タンパク質」は、１つ又はそれ以上の共有結合で連結されたオリゴ糖鎖を含むタンパク質又はポリペプチドを指す。オリゴ糖鎖は、糖残基の単一の非分枝鎖から構成されていても、１回又はそれ以上分枝した糖残基の鎖から構成されていてもよい。

「N-連結グリカン」は、ポリペプチドのアスパラギン残基に共有結合で連結されたオリゴ糖である。このようなN-連結グリカン上の末端ガラクトースは、α-2,3-又はα-2,6-連結シアル酸の結合により(図5〜25に示されるように)修飾され得る。好ましくは、末端ガラクトースはD-ガラクトースである。N-グリカンは通常は分枝しており、そして例えば、２つ、３つ又は４つの末端ガラクトース残基が１つのN-グリカン中に存在し得るように二分岐、三分岐又は四分岐（tri- or tetra-antennary）型であってもよく、これらは様々な程度までシアリル化されても全くシアリル化されてなくても。「末端」は、N-グリカンの所定の枝において、本発明の糖タンパク質のペプチド鎖へのN-グリカンの結合点から最も遠い位置を指す。

用語「シアル酸」は、動物オリゴ糖の末端単糖として通常見られるノイラミン酸のN-又はO-置換誘導体を指す(概説については、Varkis (1992) Glycobiology vol. 2 no. 1 pp.
25-40を参照のこと)。最も一般的なシアル酸はN-アセチルノイラミン酸である。「増加したシアリル化」は、糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも75%が、平均して、少なく
とも１つのシアル酸部分を含むことを意味する。非限定的な例として、「少なくとも75%の増加したシアリル化」は、本発明の実施例６において測定されるように、すなわち、全N-グリカンを目的の所定の糖タンパク質から酵素により切断し、次いでシアル酸を有していない切断されたN-グリカン(「アシアロN-グリカン」)の量及び全ての切断されたN-グリカンの総量を決定することにより決定される。次いで「少なくとも75%のシアリル化」は、25%のアシアロN-グリカンの量に相当するか又は全ての切断されたN-グリカンの総量より少ない。

減少したシアリル化を有する糖タンパク質はアシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)に結合し、次いで受容体がエンドサイトーシスを媒介した後に、最終的に分解されるので、所定の治療用糖タンパク質を循環中により長く維持するために、増加したシアリル化は重要である。

ASGP-Rは肝実質細胞によってのみ発現され、細胞あたり100,000〜500,000の結合部位を含有する。これらの受容体は、毛細血管に面している類洞細胞膜上に無作為に分布している。それらの主な機能は、アシアロ糖タンパク質の認識、結合及びエンドサイトーシスにより血漿糖タンパク質ホメオスタシスを維持することである(Stokmaier et al (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry、7254-7264)。

ヒトASGP-Rは、H1及びH2と示される２つの相同なサブユニットからなり、これらはそれぞれ2〜5:1の推定比で非共有結合ヘテロオリゴマー複合体を形成する。このASGP-R複合体は、非シアリル化末端D-ガラクトース及びN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を有する糖構造を露出する糖タンパク質に結合する。ASGP-Rに対する糖構造の結合親和性は、リガンドの価数に強く依存することが見出された。一方で、単一D-ガラクトース残基の親和性は、ミリモル範囲しかなく、二分岐、三分岐及び四分岐脱シアル化グリカンは、それぞれ10^-6、5x10^-9及び10^-9 Mの解離定数で結合する。

従って、本発明の特に好ましい実施態様において、そのN-グリカンの高度のシアリル化を特徴とする本発明の糖タンパク質は、特に少量の、2つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基、及びなおより好ましくは特に少量の、3つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を有するN-グリカンを含む、多価非シアリル化末端ガラクトース残基を有する特に少量のN-グリカンを有する。

第一の工程において、本発明の方法は、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供する工程を含む。

切断型VWF
本明細書で使用される用語「フォン・ヴィルブランド因子」(VWF)は、天然に存在する(天然)VWFを含むが、１つ又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換されている天然に存在するVWFのFVIII結合活性を少なくとも保持するその変異体、例えば配列変異体も含む。FVIII結合活性は、実施例11に記載されるFVIII-VWF結合アッセイにより決定される。

本発明に従って好ましいVWFは、配列番号９に示されるアミノ酸配列により表されるヒトVWFである。配列番号９をコードするcDNAは配列番号８で示される。

ヒト天然VWFをコードする遺伝子は、9 kb mRNAに転写され、これが310,000 Daの推定分子量を有する2813アミノ酸のプレプロポリペプチド（pre-propolypeptide）に翻訳される。プレプロポリペプチドは、N末端22アミノ酸シグナルペプチド、続いて741アミノ酸プロポリペプチド(配列番号９のアミノ酸23〜763)及び成熟サブユニット(配列番号９のアミノ酸764〜2813)を含有する。741アミノ酸プロポリペプチドのN末端からの切断は、2050アミノ酸からなる成熟VWFを生じる。ヒト天然VWFプレプロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号９に示す。別の指示がなければ、VWF分子が配列番号９の全ての残基を含むのではない場合でも、本出願におけるVWF残基のアミノ酸番号付けは配列番号９を指す。

天然VWFのプロポリペプチドは多数のドメインを含む。様々なドメインアノテーションを文献に見ることができる(例えば、Zhou et al. (2012) Blood 120(2): 449-458を参照のこと)。VWFの天然プレプロポリペプチドの以下のドメインアノテーションが本出願において適用される:
D1-D2-D’-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
配列番号９に関して、D’ドメインは、アミノ酸764〜865からなり;そしてD3ドメインはアミノ酸866〜1242からなる。

特徴「切断型（truncated）」は、ポリペプチドが成熟VWFのアミノ酸配列全体(配列番号９のアミノ酸764〜2813)を含むのではないということを意味する。典型的には、切断型VWFは、配列番号９のアミノ酸764〜2813全てを含むのではなく、そのフラグメントだけ含む。切断型VWFはまた、VWFフラグメントと呼ばれても、複数形でVWFフラグメントと呼ばれてもよい。

典型的には、切断型VWFは第VIII因子に結合することができる。好ましくは、切断型VWFは、ヒト天然第VIII因子の成熟形態に結合することができる。別の実施態様において、切断型VWFは、配列番号10のアミノ酸配列からなる単鎖第VIII因子に結合することができる。切断型VWFの第VIII因子への結合は、実施例11に記載されるように、FVIII-VWF結合アッセイにより決定することができる。

本発明の切断型VWFは、好ましくは配列番号９のアミノ酸776〜805に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものであり、かつFVIIIに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型VWFは、配列番号９のアミノ酸776〜805に対して、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものであり、かつFVIIIに結合することができる。最も好ましくは、切断型VWFは配列番号９のアミノ酸776〜805を含むかこれらからなる。本明細書において別の指示がなければ、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号９のアミノ酸776〜805）の全長にわたって決定される。

本発明の切断型VWFは、好ましくは、配列番号９のアミノ酸766〜864に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつFVIIIに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型VWFは、配列番号９のアミノ酸766〜864に対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつFVIIIに結合することができる。最も好ましくは、切断型VWFは、配列番号９のアミノ酸766〜864を含むか又はこれらからなるものである。

別の好ましい実施態様において、切断型VWFは、(a)配列番号９のアミノ酸764〜1242に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は(b)そのフラグメントからなるが、ただし、切断型VWFはなおFVIIIに結合することができる。より好ましくは、切断型VWFは、(a)配列番号９のアミノ酸764〜1242に対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は(b)そのフラグメントからなるが、ただし、切断型VWFは、なおFVIIIに結合することができる。最も好ましくは、切断型VWFは、(a)配列番号９のアミノ酸764〜1242、又は(b)そのフラグメントからなるが、ただし、切断型VWFは、なおFVIIIに結合することができる。

以下により詳細に記載されるように、本発明の方法は、切断型VWFを含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供することを含む。核酸は、それ自体公知の技術により適切な宿主細胞に導入される。

好ましい実施態様において、宿主細胞中の核酸は、(a)配列番号９のアミノ酸1〜1242に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は(b)そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型成熟VWFはなおFVIIIに結合することができる。より好ましくは、核酸は、(a)配列番号９のアミノ酸1〜1242に対して、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸、又は(b)そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型VWFはなおFVIIIに結合することができる。もっとも好ましくは、核酸は、(a)配列番号９のアミノ酸1〜1242、又は(b)又はそのフラグメントをコードするが、ただし、切断型VWFはなおFVIIIに結合することができる。特に、最終的に産生された糖タンパク質がダイマーである場合、たとえ糖タンパク質における切断型VWFがVWF(例えば配列番号９)のアミノ酸1〜763を含まなくても、核酸はVWF(例えば配列番号９)のアミノ酸1〜763をコードする配列を含む。

他の実施態様において、切断型VWFは、それぞれが配列番号9を参照する以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むかそれからなる:
776-805; 766-805; 764-805; 776-810; 766-810; 764-810; 776-815; 766-815; 764-815;776-820; 766-820; 764-820; 776-825; 766-825; 764-825; 776-830; 766-830; 764-830;776-835; 766-835; 764-835; 776-840; 766-840; 764-840; 776-845; 766-845; 764-845;776-850; 766-850; 764-850; 776-855; 766-855; 764-855; 776-860; 766-860; 764-860;776-864; 766-864; 764-864; 776-865; 766-865; 764-865; 776-870; 766-870; 764-870;776-875; 766-875; 764-875; 776-880; 766-880; 764-880; 776-885; 766-885; 764-885;776-890; 766-890; 764-890; 776-895; 766-895; 764-895; 776-900; 766-900; 764-900;776-905; 766-905; 764-905; 776-910; 766-910; 764-910; 776-915; 766-915; 764-915;776-920; 766-920; 764-920; 776-925; 766-925; 764-925; 776-930; 766-930; 764-930;776-935; 766-935; 764-935; 776-940; 766-940; 764-940; 776-945; 766-945; 764-945;776-950; 766-950; 764-950; 776-955; 766-955; 764-955; 776-960; 766-960; 764-960;776-965; 766-965; 764-965; 776-970; 766-970; 764-970; 776-975; 766-975; 764-975;776-980; 766-980; 764-980; 776-985; 766-985; 764-985; 776-990; 766-990; 764-990;776-995; 766-995; 764-995; 776-1000; 766-1000; 764-1000; 776-1005; 766-1005; 764-1005;
776-1010; 766-1010; 764-1010; 776-1015; 766-1015; 764-1015; 776-1020; 766-1020; 764-1020;
776-1025; 766-1025; 764-1025; 776-1030; 766-1030; 764-1030; 776-1035; 766-1035; 764-1035;
776-1040; 766-1040; 764-1040; 776-1045; 766-1045; 764-1045; 776-1050; 766-1050; 764-1050;
776-1055; 766-1055; 764-1055; 776-1060; 766-1060; 764-1060; 776-1065; 766-1065; 764-1065;
776-1070; 766-1070; 764-1070; 776-1075; 766-1075; 764-1075; 776-1080; 766-1080; 764-1080;
776-1085; 766-1085; 764-1085; 776-1090; 766-1090; 764-1090; 776-1095; 766-1095; 764-1095;
776-1100; 766-1100; 764-1100; 776-1105; 766-1105; 764-1105; 776-1110; 766-1110; 764-1110;
776-1115; 766-1115; 764-1115; 776-1120; 766-1120; 764-1120; 776-1125; 766-1125; 764-1125;
776-1130; 766-1130; 764-1130; 776-1135; 766-1135; 764-1135; 776-1140; 766-1140; 764-1140;
776-1145; 766-1145; 764-1145; 776-1150; 766-1150; 764-1150; 776-1155; 766-1155; 764-1155;
776-1160; 766-1160; 764-1160; 776-1165; 766-1165; 764-1165; 776-1170; 766-1170; 764-1170;
776-1175; 766-1175; 764-1175; 776-1180; 766-1180; 764-1180; 776-1185; 766-1185; 764-1185;
776-1190; 766-1190; 764-1190; 776-1195; 766-1195; 764-1195; 776-1200; 766-1200; 764-1200;
776-1205; 766-1205; 764-1205; 776-1210; 766-1210; 764-1210; 776-1215; 766-1215; 764-1215;
776-1220; 766-1220; 764-1220; 776-1225; 766-1225; 764-1225; 776-1230; 766-1230; 764-1230;
776-1235; 766-1235; 764-1235; 776-1240; 766-1240; 764-1240; 776-1242; 766-1242; 764-1242;
764-1464; 764-1250; 764-1041; 764-828; 764-865; 764-1045; 764-1035; 764-1128; 764-1198;
764-1268; 764-1261; 764-1264; 764-1459; 764-1463; 764-1464; 764-1683; 764-1873; 764-1482;
764-1479; 764-1672;及び764-1874。

特定の実施態様において、切断型VWFは、成熟野生型VWFと比較して内部欠失を有する。例えば、A1、A2、A3、D4、C1、C2、C3、C4、C5、C6ドメイン又はそれらの組み合わせが欠失され得、そしてD’ドメイン、D3ドメイン及びCKドメインが保持される。さらなる実施態様において、切断型VWFは、血小板糖タンパク質Ibα(GPIbα)、コラーゲン及び／又はインテグリンαIIbβIII(C1ドメイン内のRGDS配列)についての結合部位を含まない。他の実施態様において、切断型VWFは、VWFの中央A2ドメインに位置するADAMTS13についての切断部位(Tyr1605-Met1606)を含まない。さらに別の実施態様において、切断型VWFはGPIbαについての結合部位を含まず、かつ／又はコラーゲンについての結合部位を含まず、かつ／又はインテグリンαIIbβIIIについての結合部位を含まず、かつ／又はVWFの中央A2ドメインに位置するADAMTS13についての切断部位(Tyr1605-Met1606)を含まない。

他の実施態様において、切断型VWFは、前の段落において列挙されるアミノ酸配列のうちの１つに対して、少なくとも90%、又は少なくとも91%、又は少なくとも92%、又は少なくとも93%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかそれからなるものであり、ただし切断型VWFはFVIIIに結合することができる。

糖タンパク質は、糖タンパク質の２つのモノマーが共有結合で連結されている場合、本発明において「ダイマー」と称される。好ましくは、２つのモノマーサブユニットは、少なくとも１つのジスルフィド架橋により、例えば１つ、２つ、３つ又は４つのジスルフィド架橋を介して共有結合により連結される。少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、好ましくは糖タンパク質の切断型VWF部分内に位置する。一実施態様において、これらのシステイン残基は、Cys-1142、Cys-1222、Cys-1225、若しくはCys-1227又はそれらの組み合わせである。

本発明の糖タンパク質がダイマーである場合、切断型VWFは、好ましくは配列番号4のアミノ酸764〜1099、アミノ酸764〜1142、アミノ酸764〜1222、アミノ酸764〜1225、又はアミノ酸764〜1227に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのポリペプチドを含むか又はそれからなるものであり、かつFVIIIに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型VWFは、配列番号4のアミノ酸764〜1099、アミノ酸764〜1142、アミノ酸764〜1222、アミノ酸764〜1225、又はアミノ酸764〜1227に対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつFVIIIに結合することができる。最も好ましくは、切断型VWFは、配列番号９のアミノ酸764〜1099、アミノ酸764〜1142、アミノ酸764〜1222、アミノ酸764〜1225、又はアミノ酸764〜1227を含むか又はそれらからなる。

切断型VWFは、WO 2013/106787A1、WO 2014/198699A2、WO 2011/060242A2又はWO 2013/093760 A2（その開示は参照により本明細書に加入される）において開示されるVWFフラグメントのいずれか１つであってもよい。

ポリペプチドのさらなる成分
切断型VWFに加えて、糖タンパク質は、半減期延長部分をさらに含み得る。半減期延長部分は、切断型VWFに融合された異種アミノ酸配列であり得る。あるいは、半減期延長部分は、ペプチド結合と異なる共有結合により切断型VWFを含むポリペプチドに化学的に結合され得る。

本発明の特定の実施態様において、糖タンパク質の半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール(PEG化)、グリコシル化PEG、ヒドロキシルエチルデンプン(HES化)、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー又はヒアルロン酸のような半減期延長部分の結合により延長される。別の実施態様において、糖タンパク質は、アルブミンのようなHLEPに化学リンカーを介して結合される。この結合技術の原理は、Conjuchem LLCにより例となる方法で記載されている(例えば、米国特許第7,256,253号)。

他の実施態様において、半減期延長部分は半減期増強タンパク質(HLEP)である。好ましくは、HLEPはアルブミン又はそのフラグメントである。アルブミンのN末端は、切断型VWFのC末端に融合され得る。あるいは、アルブミンのC末端は、切断型VWFのN末端に融合され得る。１つ又はそれ以上のHLEPは、VWFのN末端又はC末端部分に融合され得るが、ただしそれらは切断型VWFのFVIIIへの結合能を妨げず、消失もしない。

一実施態様において、ポリペプチドは以下の構造を有する:
tVWF - L1 - H、[式1]
式中、tVWFは切断型VWFであり、L1は化学結合又はリンカー配列であり、そしてHはHLEPである。

L1は、化学結合、又は互いに等しくても異なっていてもよい１つ若しくはそれ以上のアミノ酸、例えば1〜50、1〜30、1〜20、1〜15、1〜10、1〜5若しくは1〜3(例えば、1、2又は3つ)のアミノ酸からなるリンカー配列であり得る。通常は、リンカー配列は野生型VWFにおける対応する位置には存在しない。L1に存在する適切なアミノ酸の例としてはGly及びSerが挙げられる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、そして切断不可リンカーでも切断可能リンカーでもよい。切断不可リンカーは、WO2007/090584において例示されるように交互のグリシン及びセリンから構成されていてもよい。本発明の別の実施態様において、切断型VWFとアルブミン部分との間のペプチドリンカーはペプチド配列からなり、これがヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然の環境におけるこのようなペプチド配列は、この配列に対する天然の耐性を仮定することができるように、タンパク質表面の近くに位置し、そして免疫系に対してアクセス可能である。例はWO2007/090584に示される。切断可能なリンカー配列は、例えばWO2013/120939 A1に記載される。

好ましいHLEP配列は以下に記載される。それぞれのHLEPの正確な「N末端アミノ酸」への融合、又はそれぞれのHLEPの「N末端部分」への融合が本発明により同様に包含され、これはHLEPの１つ又はそれ以上のアミノ酸のN末端欠失を含む。ポリペプチドは、１つより多くのHLEP配列、例えば、2つ又は３つのHLEP配列を含み得る。これらの多数のHLEP配列は、例えば連続的な繰り返しとして縦一列にVWFのC末端部分に融合され得る。

本発明の別の実施態様において、本発明の複合体の半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール(PEG化)、グリコシル化PEG、ヒドロキシルエチルデンプン(HES化)、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー又はヒアルロン酸のような半減期延長部分の結合により延長される。別の実施態様において、本発明の糖タンパク質は、アルブミンのようなHLEPに化学リンカーを介して結合される。この結合技術の原理は、Conjuchem LLCにより例となる方法で記載されている(例えば、米国特許第7,256,253号を参照のこと)。

半減期増強ポリペプチド(HLEP)
好ましくは、半減期延長部分は半減期延長ポリペプチド(HLEP)であり、より好ましくはHLEPは、アルブミン又はそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及びその部分、例えばFcフラグメント、大きい流体力学的体積を有する溶媒和されたランダム鎖（例えばXTEN
(Schellenberger et al. 2009；Nature Biotechnol. 27:1186-1190)、ホモアミノ酸反復（HAP）又はプロリン−アラニン−セリン反復（PAS））、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（CTP）、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される。

本明細書で使用される「半減期増強ポリペプチド」は、好ましくは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンGの定常領域及びそのフラグメント、生理条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、さらには免疫グロブリン定常領域の部分に結合することができる領域及びポリペプチドからなる群より選択される。これは、本明細書に記載される全長半減期増強タンパク質(例えば、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー又は免疫グロブリンGの定常領域)でも、凝固因子の治療活性又は生物学的活性を安定化又は延長することができるその1つ又はそれ以上のフラグメントでもよい。このようなフラグメントは、HLEPフラグメントがHLEPを含まないそれぞれのポリペプチドと比較して少なくとも25%の機能的半減期延長をもたらす限り、10若しくはそれ以上のアミノ酸長のフラグメントであってもよく、又はHLEP配列からの少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約50、少なくとも約100、若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいてもよく、又はそれぞれのHLEPの特定のドメインの一部若しくは全てを含んでいてもよい。

糖タンパク質のHLEP部分は、野生型HLEPの変異体であってもよい。用語「変異体（variants）」は、保存的又は非保存的のいずれかの、挿入、欠失及び置換を含み、ここでこのような変化は切断型VWFのFVIII結合活性を実質的に変更しない。

特に、本発明の提案された切断型VWF HLEP融合構築物は、HLEP及びHLEPのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含み得る。HLEPは、いずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物HLEPとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケが挙げられる。

HELPとしてのアルブミン
用語「ヒト血清アルブミン」(HSA)及び「ヒトアルブミン」(HA)及び「アルブミン」(ALB)は、本出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広義であり、かつヒト血清アルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)、さらには他の種由来のアルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)を包含する。

本明細書で使用される「アルブミン」は、集合的に、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの1つ若しくはそれ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンフラグメント若しくは変異体を指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミン若しくはそのフラグメント、特に本明細書において配列番号11で示されるヒトアルブミンの成熟形態又は他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはそのフラグメント、又はこれらの分子若しくはそのフラグメントのアナログ若しくは変異体を指す。

特に、本発明の提案された切断型VWF融合構築物は、ヒトアルブミン及びヒトアルブミンのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含み得る。一般的に言えば、アルブミンフラグメント又は変異体は、少なくとも10、好ましくは少なくとも40、最も好ましくは70より多いアミノ酸長である。

本発明の好ましい実施態様は、FcRn受容体への増強された結合を有するアルブミン変異体を含む。このようなアルブミン変異体は、野生型アルブミンとの切断型VWF融合物と比較して、切断型VWFアルブミン変異体融合タンパク質のより長い血漿半減期をもたらし得る。

本発明の提案されたVWF融合構築物のアルブミン部分は、HAの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン又はそれらの保存的改変を含み得る。

HLEPとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンG(IgG)定常領域(Fc)は、治療的タンパク質の半減期を増加させることが当該分野で公知である(Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160)。重鎖のIgG定常領域は3つのドメイン(CH1〜CH3)及びヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、いずれかの哺乳動物由来、又はそれぞれサブクラスIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4由来であり得る。抗原結合ドメインを含まないIgG及びIgGフラグメントもまた、HLEPとして使用され得る。治療的ポリペプチド部分は、好ましくは、切断可能であってもよい抗体又はペプチドリンカーのヒンジ領域を介してIgG又はIgGフラグメントに接続される。いくつかの特許及び特許出願は、治療的タンパク質のインビボ半減期を増強するために免疫グロブリン定常領域に治療的タンパク質を融合させることを記載する。US 2004/0087778及びWO 2005/001025は、Fcドメイン又は免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部の、ペプチドの半減期を増加させる生物学的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載し、これは他の方法ではインビボで急速に排出される。Fc-IFN-β融合タンパク質は、増強された生物学的活性、延長された循環半減期及びより大きな溶解度を達成したと記載された(WO 2006/000448)。長い血清半減期及び増加したインビボ効力を有するFc-EPOタンパク質が開示され(WO 2005/063808)、さらに全て半減期増強特性を有する、G-CSF(WO 2003/076567)、グルカゴン様ペプチド-1(WO 2005/000892)、凝固因子(WO 2004/101740)及びインターロイキン-10(米国特許第6,403,077号)とのFc融合物も開示された。

本発明に従って使用することができる様々なHLEPは、WO 2013/120939 A1において詳細に記載される。

核酸
発現させようとするポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の方法に従って製造され得る。VWFのcDNA配列(配列番号８)に基いて、上述の切断型VWF構築物をコードする組み換えDNAを設計し生成することができる。

たとえ宿主細胞により分泌される糖タンパク質がVWFのアミノ酸1〜763を含んでいなくても、糖タンパク質の細胞内前駆体をコードする核酸(例えば、DNA)が配列番号９のアミノ酸23〜763に対して、又は好ましくはアミノ酸1〜763に対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。最も好ましくは、糖タンパク質の細胞内前駆体をコードする核酸(例えば、DNA)は、配列番号９のアミノ酸23〜763、又は配列番号９のアミノ酸1〜763をコードするヌクレオチド配列を含む。

DNAが正確な方向で発現プラスミド中に挿入されたオープンリーディングフレーム全体を含有する構築物が、タンパク質発現のために使用され得る。典型的な発現ベクターは、プラスミド保有細胞において挿入された核酸に対応する大量のmRNAの合成を方向づけるプロモーターを含有する。これらはまた、宿主生物内でのそれらの自律増殖を可能にする複製起点配列、及び合成されたmRNAが翻訳される効率を増加させる配列を含み得る。安定な長期ベクターは、例えば、ウイルス(例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のOriP配列)の調節エレメントを使用することにより自由に複製する実体として維持され得る。ゲノムDNA中にベクターを組み込まれた細胞株もまた製造され得、そしてこの方法では、遺伝子産物は連続して産生される。

典型的に、提供しようとする細胞は、切断型VWFを含むポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物宿主細胞に導入することにより得られる。

宿主細胞
細胞培養しやすく、かつ糖タンパク質を発現しやすいいずれかの宿主細胞が、本発明に従って利用され得る。特定の実施態様において、宿主細胞は哺乳動物である。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、BALB/cマウス骨髄腫株(NSO/ 1、ECACC番号: 85110503)；ヒト網膜芽細胞（retinoblasts）(PER.C6 (CruCell、Leiden、The Netherlands))；SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651)；ヒト胚性腎臓株(懸濁培養用にサブクローニングされた293又は293細胞、Graham et al.、J. Gen Virol.、36:59、1977)；ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞 +/-DHFR (CHO、Urlaub and Chasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、77:4216、1980)；マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol. Reprod.、23:243 251、1980)；サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1 587)；ヒト子宮頸癌細胞(HeLa、ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34)；水牛ラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞(HepG2、HB 8065)；マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather et al.、Annals NY. Acad. Sci.、383:44-68、1982)；MRC 5細胞；PS4細胞；ヒト羊膜細胞(CAP)；及びヒト肝細胞腫株(Hep G2)が挙げられる。好ましくは、細胞株は、齧歯動物細胞株、特にハムスター細胞株、例えばCHO又はBHKである。

目的の糖タンパク質の発現を達成するために十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するために適した方法は、当該分野で公知である。例えば、Gething et al.、Nature、293:620-625、1981；Mantei et al.、Nature、281:40-46、1979；Levinson et al. EP 117,060；及びEP 117,058を参照のこと。哺乳動物細胞については、遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入する方法としては、Graham及びvan der Erbのリン酸カルシウム沈降法(Virology、52:456-457、1978)又はHawley-Nelsonのlipofectamine^TM(Gibco BRL)法(Focus 15:73、1993)が挙げられる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的局面は、米国特許第4,399,216号においてAxelにより記載されている。遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入するための様々な技術については、Keown et al.、Methods in Enzymology、1989、Keown et al.、Methods in Enzymology、185:527-537、1990、及びMansour et al.、Nature、336:348-352、1988を参照のこと。

細胞の培養
第二の工程において、本発明の第一の局面の方法は、細胞を36.0℃未満の温度で培養することを含む。第二の局面の方法において、この方法は、糖タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。

宿主細胞株を培養するために選択された基礎培地は、本発明には重大ではなく、哺乳動物細胞を培養するために適している当該分野で公知のいずれか１つ、又はそれらの組み合わせであり得る。ダルベッコ変法イーグル培地、ハムF-12培地、イーグル最少必須培地及びRPMI-1640培地などのような培地は市販されている。組み換えインスリンのような増殖因子の添加は任意である。一実施態様において、培地は、完全にいずれのタンパク質も含まないか、又は少なくとも組み換え産生されたいずれのタンパク質も含まないという意味で「無タンパク質」である。ヒト血清アルブミンは、糖タンパク質の製造のための無血清培地サプリメントとして使用され得る。好ましくは、培地は、組織培養に適しており、かつ合成又は植物性起源のものであるセリンプロテアーゼ阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤を含有する。

一般に、本発明は、糖タンパク質の発現に適しているいずれかの細胞培養方法とともに使用され得る。例えば、細胞はバッチで又は流加培養法で増殖され得、この場合、培養は糖タンパク質の十分な発現の後に終了され、その後発現した糖タンパク質が採取される。あるいは、細胞は連続培養（例えば、灌流培養）で増殖され得、この場合、培養は終了されず、新しい栄養分及び他の成分が定期的に又は連続して培養に加えられ、その間発現された糖タンパク質は定期的又は連続的に採取される。後者の実施態様は、方法が本明細書以下に記載されるように温度シフトを含む場合に好ましい。培養は、バッチ、流加培養又は連続培養のようないずれの従来の型の培養でもよいが、好ましくは連続的である。適切な連続培養としては灌流培養が挙げられる。

細胞は、実施者により選択されたいずれかの都合のよい体積で増殖され得る。例えば、細胞は、数ミリリットルから数リットルまでの体積の範囲に及ぶ小規模反応容器で増殖され得る。あるいは、細胞は、およそ少なくとも1リットルから10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000リットル若しくはそれ以上の体積、又はその間のいずれかの体積の範囲に及ぶ大規模商業省バイオリアクターで増殖され得る。培養は、典型的にはバイオリアクターで行われ、これは通常は1(一)から10000(一万)リットルの容量、例えば5、10、50、100、1000、2500、5000又は8000リットルのステンレス鋼、ガラス又はプラスチックの容器である。容器は、通常は硬質であるが、可撓性プラスチックバッグを、特により小さい体積のために使用することができる。これらは一般的に「使い捨て」型のものである。

CHO及びBHK細胞のような哺乳動物細胞は、一般的には懸濁培養として培養される。すなわち、細胞は固体支持体に接着するのではなく、培地中に懸濁される。あるいは細胞は、担体上に、特にマイクロキャリア上に固定化される。Cytoline^(R)、Cytopore^(R) または Cytodex^(R)のような多孔性担体が特に適しているかもしれない。

高いシアリル化を得るために、細胞(例えば、CHO細胞)を、好ましくは減少した温度で、例えば36℃未満で培養する。「減少した温度」は、それぞれの細胞株についての最適温度又は通常の温度よりも低い温度を指す。大部分の哺乳動物細胞について、通常温度は37℃である。従って、本発明によれば、細胞(例えば、CHO細胞)は、30.0〜36.0℃、30.5〜35.5℃、31.0〜35.0℃、31.5〜34.5℃、32.0〜34.0℃、又は32.5〜33.5℃の減少した温度で培養されることが好ましい。好ましくは、細胞は、30.0℃±1.0℃、31.0℃±1.0℃、32.0℃±1.0℃、33.0℃±1.0℃、34.0℃±1.0℃、又は35.0℃±1.0℃の減少した温度で培養される。

減少した温度は、発現させようとする糖タンパク質のシアリル化を増加させるために十分な時間維持される。好ましくは、減少した温度は、少なくとも1時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、又は少なくとも144時間維持される。他の実施態様において、減少した温度は、1時間〜8週間、6時間〜6週間、12時間〜5週間、18時間〜4週間、24時間〜3週間、48時間〜14日間、72時間〜10日間、又は3〜7日間維持される。

これを達成するために、培養は培養の過程の間に1又はそれ以上の温度シフトにかけられ得る。培養温度をシフトする場合、その温度シフトは比較的緩やかであり得る。例えば、それは温度変化を完了するまでに数時間又は数日かかるかもしれない。あるいは、温度シフトは、比較的急激であってもよい。温度は、培養プロセスの間に徐々に増加又は減少され得る。あるいは、温度は、培養プロセスの間に不連続な量だけ増加又は減少され得る。後に続く温度は又は温度範囲は、最初又は前の温度又は温度範囲より低くてもより高くてもよい。当業者には当然のことながら、多数の別個の温度シフトがこの実施態様に包含される。例えば、温度は1回(より高いか又はより低い温度又は温度範囲のいずれかへ)シフトされ得、細胞は、この温度又は温度範囲に特定の期間維持され、その後、温度は再び新しい温度又は温度範囲へとシフトされ得、これは以前の温度又は温度範囲よりも高いか又はより低い温度又は温度範囲のいずれかであり得る。各個別のシフトのあとの培養温度は一定でも、特定の温度範囲内に維持されてもよい。

典型的には、細胞(例えば、CHO細胞)は、最初に「通常」温度37.0℃±1.0℃で、標的細胞密度が達成されるまで培養される。次いで、初期培養期間の後に減少した温度まで温度シフトが行われる。減少した温度での培養期間の後に、通常温度への温度シフトを行っても行わなくてもよい。好ましくは、細胞(例えば、CHO細胞)は、最初に37.0℃±1.0℃で数日間培養され、続いて減少した温度31.0〜35.0℃で製造される。

本開示に基いて、当業者は、それぞれの細胞株の特定の必要及び実施者の特定の製造要件に従って、細胞を増殖するための温度を選択することができる。

特定の実施態様において、バッチ及び流加培養バイオリアクターは、発現された糖タンパク質が十分に高い力価に達すると終了される。さらに又はあるいは、バッチ及び流加培養バイオリアクターは、実施者の必要により決定して、最大十分に高い密度に達すれば、終了され得る。例えば、培養は、細胞が最大生存細胞密度の1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は99パーセントに達すると終了され得る。さらに又はあるいは、バッチ及び流加培養バイオリアクターは、乳酸塩及びアンモニウムのような代謝廃棄物の過剰な蓄積の前に終了され得る。

特定の場合、後の製造段階の間に、欠乏したか又は細胞により代謝された栄養分又は他の培地成分を細胞培養物に補充することが有利であり得る。非限定的な例として、細胞培養に、ホルモン類及び／若しくは他の増殖因子、無機イオン(例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェート)、緩衝液、ビタミン類、ヌクレオシド又はヌクレオチド、微量元素(通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物)、アミノ酸、脂質、又はグルコース若しくは他のエネルギー源を補充することが有利であり得る。このような補充成分は、全て細胞培養物に一度に加えられてもよく、又は一連の添加により細胞培養物に供給されてもよく、又は灌流培養の間に新鮮な培地と一緒に供給されてもよい。

バッチ及び流加培養バイオリアクターの代わりに、本発明は、本発明の糖タンパク質を発現する細胞が連続灌流バイオリアクターで培養される場合にも実施され得る。

当業者は、細胞培養の特定の特徴を最適化するために特定の細胞培養条件を調整することができ、これらの細胞培養条件としては、限定されないが、増殖速度、細胞生存率、細胞培養の最終細胞密度、ラクテート及びアンモニウムのような有害な代謝副生成物の最終濃度、発現された糖タンパク質の力価、オリゴ糖側鎖の程度及び組成又はこれら若しくは実施者により重要とみなされた他の条件のいずれかの組み合わせが挙げられる。

発現された糖タンパク質の単離
一般に、本発明に従って発現された糖タンパク質を単離及び／又は精製することが典型的に望ましいだろう。特定の実施態様において、発現された糖タンパク質は、培地中に分泌され、従って細胞及び他の固形物は、例えば精製プロセスにおける第一の工程として遠心分離又はろ過により除去され得る。

発現された糖タンパク質は、標準的な方法により単離及び精製され得、これらの標準的な方法としては、限定されないが、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー)、ゲルろ過、遠心分離、若しくは吸収率較差溶解度（differential solubility）、エタノール沈降及び／又はタンパク質の精製に利用可能ないずれかの他の技術(例えば、Scopes、Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition、Springer-Verlag、New York、1987; Higgins、S. J. and Hames、B. D. (eds.)、Protein Expression: A Practical Approach、Oxford Univ Press、1999;及びDeutscher、M. P.、Simon、M. I.、Abelson、J. N. (eds.)、Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series、Vol. 182)、Academic Press、1997を参照のこと、これらは各々参照により本明細書に加入される)が挙げられる。特に免疫親和性クロマトグラフィーについて、糖タンパク質は、その糖タンパク質に対するようにされて固定支持体に固定された抗体を含むアフィニティカラムにそれを結合することにより単離され得る。あるいは、インフルエンザコート配列、ポリ-ヒスチジン、又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼのような親和性タグが、適切なアフィニティカラム上の通過による容易な精製を可能にするために標準的組み換え技術により糖タンパク質に結合され得る。フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、ロイペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤は、精製プロセスの間に糖タンパク質の分解を減少又は排除するためにいずれか又は全ての段階で加えられ得る。プロテアーゼ阻害剤は、発現された糖タンパク質を単離及び精製するために細胞を溶解しなければならない場合に特に有利である。さらに、又はあるいは、グリコシダーゼ阻害剤は、共有結合で結合されたオリゴ糖鎖の酵素的トリミングを減少又は排除するためにいずれか又は全ての段階で添加され得る。好ましい精製方法は、本出願の実施例５に記載される。

本発明に従って発現された糖タンパク質は、伝統的な細胞培養条件下で増殖された場合よりも多くのシアリル化を有する。従って、精製工程で有効であり得る本発明の１つの実用に役立つ利益は、本発明の特定の方法に従って増殖された糖タンパク質上の追加及び／又は変更されたシアル酸残基が、より伝統的な方法に従って増殖された糖タンパク質について可能であるよりも、より容易に、又はより高い純度まで糖タンパク質を精製するために実施者により使用され得る独特の生化学的特性をそれに付与し得ることである。例えば、糖タンパク質は、シアル酸残基の負電荷を利用して、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製又は大いに濃縮され得る。それにより、高いシアリル化を有する糖タンパク質のさらなる濃縮が達成され得る。

さらなる実施態様において、本発明の方法により得られた糖タンパク質のシアリル化は、インビトロで糖タンパク質をシアリルトランスフェラーゼと接触させることによりさらに増加され得る。シアリルトランスフェラーゼは、典型的に哺乳動物シアリルトランスフェラーゼであり、好ましくは、ヒトシアリルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼは、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ及び／又はα-2,6-シアリルトランスフェラーゼであり得る。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼはヒトα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ(Genbank NP_775479-ST3GAL1)及び／又はヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼである。最も好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、Genbank NP_003023-ST6GAL1)により同定されるヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼである。シアリル基、又はシアル酸ドナーがインビトロ反応においてさらに存在する。適切なドナーとしては、例えば、シチジン-5’-モノホスホ-N-アセチルノイラミン酸(CMP-NANA)、Rocheカタログ番号05 974 003 103が挙げられる。インビトロシアリル化のために適したキットは、Roche(カタログ番号07 012 250 103)から入手可能である。

当業者には当然のことながら、的確な精製技術は、精製しようとする糖タンパク質の特徴、糖タンパク質が発現される細胞の特徴、及び／又は細胞が増殖された培地の組成によって変化する。

上述のように、本発明は、第二の局面において、増加したシアリル化を有するN-グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法に関し、該方法は、(i)切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含むポリペプチドをコードする核酸、及びα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ及び／又はα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα-2,6-シアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸を含む細胞を提供すること、並びに(ii)糖タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。

α-2,3-シアリルトランスフェラーゼは、好ましくは、ヒトα-2,3-シアリルトランスフェラーゼである。ヒトα-2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードするcDNA配列は配列番号12に示され、そしてそれに基づいて、当業者はα-2,3-シアリルトランスフェラーゼのコード配列を含有する適切な発現ベクターを設計することができる。

α-2,6-シアリルトランスフェラーゼは、好ましくはヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼである。ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼをコードするcDNA配列を配列番号7に示し、そしてそれに基づいて、当業者は、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼのコード配列を含有する適切な発現ベクターを設計することができる。

トランスフェクトされた細胞は、公知の培養方法に従って糖タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され得る。

糖タンパク質は、確立された精製技術を使用して回収及び／又は単離され得る。

本発明の第一の局面の方法に関連して本明細書の上に記載された実施態様は、変更すべきところは変更して、第二の局面の方法に適用される。

本発明の糖タンパク質
第三の局面において、本発明は、本明細書において記載される方法により得ることができる糖タンパク質に関する。

第四の局面において、本発明は、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質に関し、ここで該切断型VWFは第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そして該糖タンパク質はN-グリカンを含み、そして該N-グリカンの少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。好ましい実施態様において、該N-グリカンの少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。本発明者らは、高度にシアリル化されたVWFフラグメントを含むポリペプチドは、延長された半減期自体を有するだけでなく、同時投与されたFVIIIの半減期も延長することができるということを実証した。換言すれば、本発明の糖タンパク質の投与は、同時投与されたFVIIIの延長された半減期及び／又は減少したクリアランスをもたらす。

第五の局面において、本発明は、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質に関し、ここで該切断型VWFは、第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そして該糖タンパク質はN-グリカンを含み、糖タンパク質のN-グリカンのシアリル基の少なくとも50%は、α-2,6-連結シアリル基である。一般に、末端シアリル基は、α-2,3-又はα-2,6-連結を介してガラクトース基に結合され得る。一実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンは、α-2,6-連結シアリル基をα-2,3-連結シアリル基よりも多く含む。好ましくは、N-グリカンのシアリル基の少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%は、α-2,6-連結シアリル基である。これらの実施態様は、例えば、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼを哺乳動物細胞において同時発現させることにより得ることができる。

第六の局面において、本発明は、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含む糖タンパク質に関し、ここで該切断型VWFは第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そして該糖タンパク質はN-グリカンを含み、ここで糖タンパク質のN-グリカンのシアリル基の少なくとも50%は、α-2,3-連結シアリル基である。一般に、末端シアリル基は、α-2,3-又はα-2,6-連結を介してガラクトース基に結合され得る。一実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンは、α-2,6-連結シアリル基よりもα-2,3-連結シアリル基を多く含む。好ましくは、N-グリカンのシアリル基の少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%は、α-2,3-連結シアリル基である。これらの実施態様は、例えば、ヒトα-2,3-シアリルトランスフェラーゼを哺乳動物細胞において同時発現させることにより得ることができる。

本発明の糖タンパク質の好ましいアミノ酸配列は、既に本明細書の上に記載された。本発明の第一の局面に関連する上記の実施態様は、変更すべきところは変更して、第三、第四、第五、及び第六の局面に適用される。

本明細書で使用される「本発明の糖タンパク質」は、第三、第四、第五又は第六の局面に従う糖タンパク質を指す。本発明の糖タンパク質は、N-グリカンの増加したシアリル化、及び特に増加したα-2,6-シアリル化又は増加したα-2,3-シアリル化を有する。

一実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。別の実施態様において、本発明の糖タンパク質内の切断型VWFのN-グリカンの少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。

別の実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンの25%未満、20%未満、15%未満、又は12%、又はさらに10%未満、又は8%未満、又は6%未満、又は5%未満、又は4%未満、又は3%未満、又は2%未満、又はさらに1%未満はアシアロ-N-グリカンであり、すなわちそれらはシアル酸基のないN-グリカンである。別の実施態様において、本発明の糖タンパク質内の切断型VWFのN-グリカンの25%未満、20%未満、15%未満、又は12%未満、又は10%未満、又は8%未満、又は6%未満、又は5%未満、又は4%未満、又は3%未満、又は2%未満又はさらに1%未満はアシアロ-N-グリカンであり、すなわちそれらはシアル酸基を有していない。

別の実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%はモノシアロ-N-グリカンであり、すなわちそれらは、１つのシアル酸基を有するN-グリカンである。別の実施態様において、本発明の糖タンパク質内の切断型VWFのN-グリカンの少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%は、モノシアロ-N-グリカンである。非限定的な例として、モノシアリル化N-グリカンの量は、実施例6及び実施例12において詳述されるように決定され得る。

さらに別の実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも15%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%はジシアロ-N-グリカンであり、すなわり、それらは２つのシアル酸基を有するN-グリカンである。さらに別の実施態様において、本発明の糖タンパク質内の切断型VWFのN-グリカンの少なくとも15%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%はジシアロ-N-グリカンである。非限定的な例として、ジシアリル化N-グリカンの量は、実施例６及び実施例12において詳述されるように決定され得る。

さらに別の実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも5%、又は少なくとも10%はトリシアロ-N-グリカンであり、すなわちそれらは３つのシアル酸基を有するN-グリカンである。さらに別の実施態様において、本発明の糖タンパク質内の切断型VWFのN-グリカンの少なくとも5%、or 少なくとも10%はトリシアロ-N-グリカンである。非限定的な例として、トリシアリル化N-グリカンの量は、実施例６及び実施例12において詳述されるように決定され得る。

別の実施態様において、本発明の糖タンパク質のN-グリカンの少なくとも20%、又は少なくとも30%、又は少なくとも40%は、2つ又はそれ以上のシアル酸基を含む。別の実施態様において、本発明の糖タンパク質内の切断型VWFのN-グリカンの少なくとも20%、又は少なくとも30%、又は少なくとも40%は、2つ又はそれ以上のシアル酸基を含む。

本発明の他の好ましい実施態様は、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含み、ここで該切断型VWFは第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そしてここで該糖タンパク質はN-グリカンを含み、ここで該N-グリカンの35%未満、好ましくは34%未満、好ましくは33%未満、好ましくは32%未満、好ましくは31%未満、好ましくは30%未満、好ましくは29%未満、好ましくは28%未満、好ましくは27%未満、好ましくは26%未満、好ましくは25%未満、好ましくは24%未満、好ましくは23%未満、好ましくは22%未満、好ましくは21%未満、好ましくは20%未満、好ましくは19%未満、好ましくは18%未満、好ましくは17%未満、好ましくは16%未満、好ましくは15%未満、好ましくは14%未満、好ましくは13%未満、好ましくは12%未満、好ましくは11%未満、好ましくは10%未満、好ましくは9%未満、好ましくは8%未満、好ましくは7%未満、好ましくは6%未満、そして好ましくは5%未満は、平均して、2つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を含む。

本発明のなお他のさらにより好ましいは、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)を含み、ここで該切断型VWFは第VIII因子(FVIII)に結合することができ、そしてここで該切断型VWFはN-グリカンを含み、ここで該N-グリカンの6%未満、好ましくは5%未満、好ましくは4%未満、好ましくは3%未満、好ましくは2%未満、そして好ましくは1%未満は、平均して、3つ又はそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を含む。

上記の実施態様は互いに組み合わせられ得る。上述のN-グリカンのいずれのパーセンテージ、又はシアリル化の程度のいずれの表示も、平均パーセンテージ又は程度として理解されるべきであり、すなわち、それらは単一の分子ではなく分子の集団を指す。糖タンパク質の集団内の個々の糖タンパク質分子のグリコシル化又はシアリル化はいくらかの不均一性を示すということは明らかである。

本発明に従って得られた糖タンパク質は、ダイマーの高い比率を有するということがさらに見出された。従って、本発明の糖タンパク質は、好ましくはダイマーとして存在する。一実施態様において、糖タンパク質の少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%又は約100%はダイマーとして存在する。別の実施態様において、本発明の糖タンパク質の比ダイマー：モノマーは、少なくとも1.5、好ましくは少なくとも2、より好ましくは少なくとも2.5又は少なくとも3である。本発明の方法により得られるダイマー形成は、ダイマーが第VIIIに対して改善された親和性を有するので有益である。本発明の糖タンパク質のダイマー含有量、及びダイマー対モノマーの比は、実施例５に記載されるように決定され得る。

別の好ましい実施態様において、本発明の糖タンパク質は、異種ポリペプチド、例えば上で定義されたHLEPを含む。最も好ましくは、HLEPはヒト血清アルブミンである(配列番号11を参照のこと)。上記の実施態様は、変更すべきところは変更してここで適用される。

本発明の糖タンパク質は、好ましくは第VIII因子に結合することができる（上を参照のこと)。一実施態様において、本発明の糖タンパク質の第VIII因子に対する親和性は、ヒト天然VWFの同じ第VIII因子に対する親和性よりも高い。第VIII因子親和性は、ヒト天然第VIII因子、又は配列番号10により特徴づけられる第VIII因子を参照し得る。

高い比率のダイマーを有する本発明に従う糖タンパク質の調製物は、第VIII因子に対する増加した親和性を有することが見出された。第VIII因子に対するこのような増加した親和性は、本発明の糖タンパク質による第VIII因子の増強された安定化をもたらす。増加したダイマー比率の代わりに、又は増加したダイマー比率と組み合わせて、第VIII因子に対する親和性を増加させる第VIII因子結合ドメイン内の変異を有する本発明に従う糖タンパク質もまた本発明の好ましい実施態様である。適切な変異は、例えばWO 2013/120939 A1に開示される。

本発明の別の局面は、血液凝固障害の処置のおける使用のための、本明細書において定義される糖タンパク質である。処置は、患者に有効量の糖タンパク質を投与することを含む。処置は、FVIIIを投与することをさらに含む。

本発明の別の局面は、本発明の糖タンパク質、及び薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を含む医薬組成物である。

本発明の別の局面は、(i)本明細書の上で定義された糖タンパク質、及び(ii)第VIII因子を含む医薬キットである。好ましくは、糖タンパク質及びFVIIIは、別個の組成物に含有される。

本発明の別の局面は、血液凝固障害の処置における同時の、別個の又は連続した使用のための、(i)本明細書の上で定義された糖タンパク質、及び(ii)第VIII因子を含む医薬キットである。

本発明の別の局面は、第VIII因子の終末相半減期若しくは平均滞留時間(MRT)を増加させるため又はクリアランスを減少させるための、本明細書において上で定義されたポリペプチドの使用である。薬物動態データの評価のために、線形薬物動態モデル(中央コンパートメントを介した化合物排出)を適用した。従って、本明細書で使用されるいずれの薬物動態パラメーターも、別の指示がなければ、線形薬物動態モデル(中央コンパートメントを介した化合物排出)に基づく。

特定の時点ｔでの「半減期」T1/2(t)は、ｔの時点に存在する血漿濃度C(t)を半分にするためにかかる時間、すなわちC[t + T1/2(t)] = C(t)/2である。「終末相半減期」は、ｔが無限になる傾向を有するときのT1/2(t)の限界である。曲線下面積(AUC)は、クリアランス効果を評価するために決定され得る。クリアランスの減少はより高いAUC値、そして半減期の増加をもたらす。

本明細書で使用される用語「MRT」は、薬物分子が体内に留まる平均時間を意味する。一定クリアランスを用いる線形薬物動態系において、MRTは、1次モーメント曲線下面積(AUMC)をAUCで割ったものとして計算され得る。1次モーメント曲線は、時間にその時点の血漿濃度を掛けたものである。一次モーメント曲線は、時間にその時点での血漿濃度を掛けたものである。

投与されたFVIIIのMRTは、有効量の本発明の糖タンパク質が同時投与される場合、i)FVIII単独の投与と比較して、又はii)完全に脱シアリル化されたN-グリカン構造以外は本発明の糖タンパク質と同じタンパク質配列を有する参照タンパク質の投与と比較して、又はiii)そのN-グリカンの35%より多くが2つ若しくはそれ以上の非シアリル化末端N-グリカンを含み、かつそのN-グリカンの６％より多くが3つ若しくはそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を含む事以外は本発明の糖タンパク質と同じタンパク質配列を有する参照タンパク質の投与と比較して、少なくとも25%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも100%、最も好ましくは少なくとも125%増加する。

減少した温度で培養することを含む本発明の方法に従って製造された糖タンパク質のMRTは、37℃で培養された同じアミノ酸配列を有する参照糖タンパク質よりも大きい。本発明の方法に従って製造された糖タンパク質の（又は本発明のいずれかの糖タンパク質の）MRTの参照糖タンパク質と比較した増加は、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも100%である。

本明細書で使用される用語「クリアランス」は、血漿から薬物が除去される速度を指す。具体的には、これは薬物の現在の排出速度をその現在の血漿濃度で割ったものである。単回静脈内投与後の線形薬物動態系において、クリアランスは、クリアランスが一定であるという条件で、血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)に対する用量の比として計算することができる。クリアランスが低いほど、血漿から薬物が除去されるまでに長くかかる。

投与されたFVIIIのクリアランスは、有効量の本発明の糖タンパク質が同時投与された場合、i)FVIII単独での投与と比較して、又はii)完全に脱シアリル化されたN-グリカン構造以外は本発明の糖タンパク質と同じタンパク質配列を有する参照タンパク質の投与と比較して、又はiii)そのN-グリカンの35%より多くが2つ若しくはそれ以上の非シアリル化末端N-グリカンを含み、かつそのN-グリカンの6％より多くが3つ若しくはそれ以上の非シアリル化末端ガラクトース残基を含む事以外は本発明の糖タンパク質と同じタンパク質配列を有する参照タンパク質の投与と比較して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも60%減少する。

減少した温度で培養することを含む本発明の方法に従って製造された糖タンパク質のクリアランスは、37℃で培養された同じアミノ酸配列を有する参照糖タンパク質のクリアランスより低い。本発明の方法に従って製造された糖タンパク質（又は本発明のいずれかの糖タンパク質）のクリアランスの減少は、参照糖タンパク質と比較して、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも60%である。

本発明はさらに、被験体に有効量の本明細書の上で定義された糖タンパク質を投与することを含む、インビボで第VIII因子のMRT若しくは半減期を増加させる方法、又はクリアランスを減少させる方法に関する。

本発明のさらなる局面は、それを必要とする患者に有効量の本明細書の上で定義された糖タンパク質を投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法に関する。

さらなる局面は、血友病Aの処置におけるFVIIIの投与頻度を減少させるための、本明細書の上で定義された糖タンパク質の使用である。FVIIIの静脈内又は皮下投与の頻度は、週に2回まで減少され得る。あるいは、FVIIIの静脈内又は皮下投与の頻度は、週に1回まで、又はさらに低く、例えば10日に1回又は14日に1回まで減少され得る。FVIIIは、週に2回、5日ごと、週に1回、10日ごと、2週間ごと、3週間ごと、4週間ごと、若しくは月に1回、又は前述の値のいずれか２つの間の範囲、例えば4日ごとから毎月、10日ごとから2週間ごと、若しくは週に2〜３回などで投与され得る。

別の局面は、血友病Aの処置において投与しようとするFVIIIの用量を減少させるための、本明細書の上で定義される糖タンパク質の使用である。

凝固障害の処置
本発明の糖タンパク質は、血友病Aを含む凝固障害を処置するために有用である。用語「血友病A」は、機能的凝固FVIIIの欠乏を指し、これは通常は遺伝性である。

疾患の処置は、いずれかの臨床病期であるか又は顕性化した疾患のいずれかの形態を有すると既に診断された患者の処置；疾患の症状若しくは徴候の開始若しくは発展若しくは増悪若しくは悪化を遅延させること；並びに／又は疾患の重症度を防止及び／若しくは低減させることを包含する。

本発明の糖タンパク質が投与される「被験体」又は「患者」は、好ましくはヒトである。特定の局面において、ヒトは小児患者である。他の局面において、ヒトは成人患者である。

本発明の糖タンパク質及び、場合により１つ又はそれ以上のさらなる治療剤、例えば以下に記載される第二の治療剤を含む組成物が本明細書に記載される。組成物は、典型的には薬学的に許容しうる担体を含む無菌医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者にそれを投与する所望の方法に依存して）任意の適切な形態であり得る。

本発明の糖タンパク質は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋内、髄腔内、局所（topically）又は局所（locally）のような様々な経路により患者に投与され得る。いずれかの所定の症例における投与に最も適切な経路は、特定の糖タンパク質、被験体、並びに疾患の性質及び重篤度並びに被験体の身体状態に依存する。典型的には、本発明の糖タンパク質は静脈内投与される。

糖タンパク質及びFVIIIは、好ましくは静脈内又は皮下投与される。

第一の実施態様において、糖タンパク質及びFVIIIの両方が静脈内投与される。第二の実施態様において、糖タンパク質及びFVIIIの両方が皮下投与される。

別の実施態様において、FVIIIは静脈内投与され、そして糖タンパク質は異なる経路を介して投与される。さらなる実施態様において、糖タンパク質は皮下投与され、そしてFVIIIは異なる経路を介して投与される。例えば、糖タンパク質は、皮下投与され得、そしてFVIIIは静脈内投与され得る。

さらなる実施態様において、FVIIIは皮下投与され、そして糖タンパク質は異なる経路を介して投与される。さらなる実施態様において、糖タンパク質は静脈内投与され、そしてFVIIIは異なる経路を介して投与される。例えば、糖タンパク質は、静脈内投与され得、そしてFVIIIは皮下投与され得る。

用語「第VIII因子」及び「FVIII」は、本明細書において交換可能に使用され、そして血漿由来のFVIII及び組み換えFVIIIの両方を包含する。組み換えFVIIIは、限定することなく、全長FVIII、さらには二本鎖Bドメイン欠失又は切断変異体、さらには単鎖Bドメイン欠失又は切断変異体、例えばWO 2004/067566に記載されるもの及びBドメインの外側に変異を有するがFVIIIの生物学的活性を有する他のFVIII変異体を包含する。

有効な投薬量、投薬の総数、及び本発明の糖タンパク質を用いた処置の長さの決定は、当業者の能力の十分範囲内であり、かつ標準的な用量増大研究を使用して決定され得る。

医薬組成物
本明細書に記載される方法において適した本発明の糖タンパク質の治療用製剤は、当該分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は安定剤(これらは全て本明細書で「担体」と呼ばれる)、すなわち、緩衝化剤、安定剤、保存料、等張化剤（isotonifiers）、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及び他の種種雑多な添加物と、所望の程度の純度を有する糖タンパク質を混合物ことにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての貯蔵のために調製され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences、16th edition
(Osol、ed. 1980)を参照のこと。このような添加物は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。

緩衝化剤は、生理条件に近い範囲にpHを維持するために役立つ。これらは約2 mM〜約50 mMの範囲に及ぶ濃度で存在し得る。適切な緩衝化剤としては、有機及び無機の両方のその酸及び塩、例えばクエン酸緩衝液(例えば、クエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物など)、コハク酸緩衝液(例えば、コハク酸-コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸-水酸化ナトリウム混合物、コハク酸-コハク酸二ナトリウム混合物など)、酒石酸緩衝液(例えば、酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム混合物、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物など)、フマル酸緩衝液(例えば、フマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物など)、グルコン酸緩衝液(例えば、グルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-グルコン酸カリウム混合物など)、シュウ酸緩衝液(例えば、シュウ酸-シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸-水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸-シュウ酸カリウム混合物など)、乳酸緩衝液(例えば、乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-乳酸カリウム混合物など)及び酢酸緩衝液(例えば、酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物など)が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びTrisのようなトリメチルアミン塩が使用され得る。

保存料は微生物増殖を妨害するために添加され得、そして0.2%〜1% (質量/体積)の範囲に及ぶ量で添加され得る。適切な保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム(例えば、塩化物、臭化物、及びヨウ化物)、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び3-ペンタノールが挙げられる。「安定剤」としても知られる等張化剤は、液体組成物の等張性を確実にするために加えられ得、そしてこれらとしては多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。安定剤は、増量剤から、治療剤を可溶化するか又は変性もしくは容器壁への付着を防止する添加剤に及ぶ機能を有し得る広義の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール(上で列挙された)；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖又は糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、（イノシトールのようなシクリトール類を含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド(例えば、１０残基又はそれ以下のペプチド)；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン 単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖、例えばラクトース、マルトース、スクロース及び三糖、例えばラフィノース；及び多糖、例えばデキストランであり得る。安定剤は、活性タンパク質１質量部あたり0.1〜10,000質量部の範囲で存在し得る。

非イオン性界面活性剤（surfactants）又は界面活性剤（detergents）(「湿潤剤」としても知られる)は、治療剤の可溶化を促進するため、さらには撹拌誘導凝集に対して治療用タンパク質を保護するために加えられ得、これはまた、タンパク質の変性を引き起こすことなく圧力を加えられたせん断面に製剤が曝露されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート(20、80など)、ポリオキサマー(184、188など)、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(TWEEN(R)-20、TWEEN(R)-80など)が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約0.05 mg/ml〜約1.0 mg/mlの範囲、又は約0.07 mg/ml〜約0.2 mg/mlの範囲で存在し得る。

さらなる様々な賦形剤としては、増量剤(例えば、デンプン)、キレート剤(例えば、EDTA)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE)、及び共溶媒が挙げられる。

本明細書における製剤は、本発明のポリペプチドに加えて第二の治療剤も含んでいてもよい。適切な第二の治療剤の例は以下に示される。

投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重篤度、及び本発明の糖タンパク質に対する患者の感受性を含む、多数の臨床因子に依存して月に1回から毎日まで変化し得る。特定の実施態様において、本発明の糖タンパク質は、週に2回、5日ごと、週に1回、10日ごと、2週間毎、3週間ごと、4週間ごと、又は月に1回、又は前述の値のいずれか２つの間の任意の範囲で、例えば、4週ごとから毎月、10日ごとから2週ごと、又は週に2回から3回などで投与される。

投与しようとする本発明の糖タンパク質の投薬量は、特定の糖タンパク質、被験体、並びに疾患の性質及び重篤度、被験体の身体状態、治療計画(例えば、第二の治療剤が使用されるかどうか)、及び選択された投与経路によって変わる；適切な投薬量は、当業者により容易に決定され得る。

本発明の糖タンパク質の最適な量及び個々の投薬の間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路、及び部位、並びに処置される特定の被験体の年齢及び状態により決定されること、そして医師が、使用されるべき適切な投薬量を最終的に決定するということは、当業者により認識されるだろう。この投薬は、必要なだけ頻繁に繰り返され得る。副作用が発生する場合、投薬の量及び／又は頻度が、通常の臨床診療に従って変更されるか又は減少され得る。

組み合わせ治療
好ましくは、本発明の糖タンパク質を用いて処置される患者は、凝固障害の従来の治療でも処置される。例えば、血友病に罹患している患者は、典型的には第VIII因子でも処置されている。

本発明によれば、本発明の糖タンパク質を用いて処置される患者は、血液凝固第VIII因子でも処置される。本発明の糖タンパク質及び第VIII因子は、同時に投与されても逐次的様式で投与されてもよく、両方の投与様式が用語「組み合わせ治療」及び「同時投与」により包含される。本発明の糖タンパク質及び第VIII因子は、混合物として、すなわち同じ組成物内で投与されても、別々に、すなわち別個の組成物として投与されてもよい。

本発明に従って使用される組成物中の第VIII因子の濃度は、典型的には10〜10,000 IU/mLの範囲である。異なる実施態様において、本発明の組成物中のFVIIIの濃度は、10〜8,000 IU/mL、若しくは10〜5,000 IU/mL、若しくは20〜3,000 IU/mL、若しくは50〜1,500 IU/mLの範囲、又は3,000 IU/mL、若しくは2,500 IU/mL、若しくは2,000 IU/mL、若しくは1,500 IU/mL、若しくは1,200 IU/mL、若しくは1,000 IU/mL、若しくは800 IU/mL、若しくは750 IU/mL、若しくは600 IU/mL、若しくは500 IU/mL、若しくは400 IU/mL、若しくは300 IU/mL、若しくは250 IU/mL、若しくは200 IU/mL、若しくは150 IU/mL、若しくは125 IU/mL、若しくは100 IU/mL、若しくは62.5 IU/mL、若しくは50 IU/mLである。

「国際単位」又は「IU」は、「IU」で較正された国際標準品に対して較正された標準を使用して一段階凝固アッセイ又は発色性基質FVIII活性アッセイのようなFVIII活性アッセイにより測定されたFVIIIの血液凝固活性（効力）の尺度の単位である。一段階凝固アッセイは、N Lee、Martin L、et al.、An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates、Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30、511 519 (1983)に記載されるように、当該分野で公知である。一段階アッセイの原理: この試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)-アッセイの改変バージョンとして行われる: リン脂質及び表面活性剤とともに血漿をインキュベートすることにより、内在凝固系の因子が活性化される。カルシウムイオンの添加が凝固カスケードを誘発する。測定可能なフィブリン血栓の形成までの時間が決定される。アッセイは、第VIII因子欠乏血漿の存在下で行われる。欠乏血漿の凝固能は、試験しようとするサンプル中に含まれる凝固第VIII因子により回復される。凝固時間の短縮は、サンプル中に存在する第VIII因子の量に比例する。凝固第VIII因子の活性は、国際単位で第VIIIの既知の活性を有する標準品との直接比較により定量化される。

別の標準的なアッセイは、発色性基質アッセイである。発色性基質アッセイは、市販で購入され得る、例えばcoamatic FVIII試験キット(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano、Italy)。発色性アッセイの原理: カルシウム及びリン脂質の存在下で、第X因子を第IXa因子により第Xa因子へと活性化させる。この反応は、補因子としての第VIIIa因子により刺激される。FVIIIaは、測定しようとするサンプル中のFVIII由来の反応混合物中の少量のトロンビンにより形成される。最適濃度のCa2+、リン脂質及び第IXa因子並びに過剰量の第X因子を使用する場合、第X因子の活性化は、第VIII因子の効力に比例する。活性化第X因子は、発色性基質S-2765から発色団pNAを放出する。従って、405 nmで測定されるpNAの放出は、形成されたFXaの量に比例し、従って、サンプルの第VIII因子活性にも比例する。

配列表に示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下の表にまとめる:

以下の実施例は、本発明を説明するが、本明細書の以下に記載される特定の実施態様に本発明を限定すると解釈されるべきではない。

実施例1: D’D3アルブミン融合タンパク質(D’D3-FP)の生成
VWFアミノ酸1〜1242、グリシン/セリンリンカーをコードするcDNA及びヒトアルブミンのcDNAからなるD’D3-FPの発現カセットを、カスタム遺伝子合成(Eurofins Genomics、Ebersberg、Germany)により製造した。隣接制限部位(EcoRI、NotI)を介して、発現カセットを、供給されたクローニングベクターから切除し、そしてEcoRI及びNotIを用いて線状化されたpIRESneo3ベクター(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ、USA)に挿入した。得られた発現プラスミドは、CMVプロモーター制御下で短いリンカーコード配列を介してアルブミンコード配列に融合された、VWFプロペプチド、D’及びD3(配列番号９のVWF アミノ酸1〜1242)をコードするヌクレオチド配列を含有していた。コード配列のヌクレオチド配列は配列番号1として示され、成熟D’D3-FPのアミノ酸配列は配列番号2として示される。

実施例2: チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞におけるプラスミドのトランスフェクション及びD’D3-FPダイマーの安定発現
上記の発現プラスミドは、XL10 Gold(Agilent Technologies)において増殖され、そして標準的プロトコル(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して精製された。

CHO K1細胞を、Lipofectamine 2000試薬(Invitrogen)を使用してトランスフェクトし、そして無血清培地(CD-CHO、Invitrogen)で500〜1000μg/mlジェネテシンの存在下で増殖させた。WO2007/144173に記載されるPACE/フューリン(pFu-797)をコードする発現プラスミドを、ポリペプチド切断効率を最大にするために同時トランスフェクトした。単細胞由来クローンを増殖させ、そしてアルブミン特異的酵素イムノアッセイ(以下を参照のこと)により定量されるそれらのD’D3-FP発現収率に従って選択した。D’D3-FP発酵について最終的に選択された細胞株をT2050-CL3と呼ぶ。

実施例3: α-2,6シアリルトランスフェラーゼの同時発現
実施例２に記載される細胞株生成プロセスの間に、非齧歯動物シアル酸の結合を支持するためのα-2,6シアリルトランスフェラーゼをコードする発現単位を保有するプラスミドを同時トランスフェクトすることができる。

ヒトα-2,6シアリルトランスフェラーゼのコード配列を、ネステッドPCR設定において第一PCRについてプライマーWe2556(配列番号3)及びWe 2558(配列番号4)、そして第二PCRについてWe2553(配列番号5)及びWe 2559 (配列番号6)を使用して、ヒト肝臓cDNAライブラリー(Ambion)から増幅した。第一PCRのために、Ambionヒト肝臓cDNAライブラリー2μLを、水34.5μL、10μl 5x PCR緩衝液Phusion GC (New England Biolabs)、10mM dNTP 1μl、We2556 (10 pmol) 1μL、We2558 (10 pmol) 1μl及びPhusion DNAポリメラーゼ 0.5μL(New England Biolabs)と混合し、そして最初の60秒98℃、a)98℃での変性15秒、b)64℃でのアニーリング30秒、及びc)72℃でのエロンゲーション2分の15サイクルのタッチダウンプロトコルを使用して増幅し、ここでアニーリング工程の温度は、1サイクルあたり0.3℃減少され、続いて、a)98℃での変性25秒、b)62℃でのアニーリング30秒、及びc)72℃でのエロンゲーション2分の25サイクル、続いて72℃で10分間の最終伸展工程を行い、その後、冷却し4℃に保持することにより反応を停める。ネステッドPCRのために、第一PCR反応混合物2μLを、水34.5μL、10μl 5x PCR緩衝液Phusion GC、10mM dNTP 1μl、We2553(10 pmol) 1μL、We2559 (10 pmol) 1μl及びPhusion DNAポリメラーゼ0.5μLと混合し、そして第一PCRについて記載されたようにタッチダウンプロトコルを使用して増幅した。ネステッドPCRは、NheI制限酵素切断部位をPCRフラグメントの5’末端に、そしてBamH1部位を3’末端に加える。このフラグメントを、NheI及びBamH1により切断し、そして同じ酵素により開かれた発現ベクターpIRESneo3にライゲーションした。次いで得られた発現ベクターを同時トランスフェクションに使用することができる。

実施例4: バイオリアクターにおけるD’D3-FPの製造
D’D3-FPの製造のための発酵プロセスは、細胞株T2050-CL3の解凍から開始し、続いて振盪フラスコで細胞を増殖させ、そして最終的にSartorius BioStat B-DCU 5Lバイオリアクター及びBioStat STR 50L単回使用バイオリアクターを使用して灌流モードで発酵プロセスを行った。それぞれBioSeps 10L又は200L(Applikon)を細胞保持デバイスとして使用した。細胞培養培地は、8 mM L−グルタミン及び1μM CuSO₄を含むPowerCHO3 (Lonza BESP1204)又は10 mM L−グルタミン及び1μM CuSO₄を含むProCHO5 (Lonza BESP1072)のいずれかであった。

振盪フラスコでのシードトレインを、37℃、7.5% CO₂で160 rpmの振盪スピードにて行った。

5Lバイオリアクターに2.5x10⁵細胞/mLの標的VCDを播種した。細胞を8 mM L-グルタミン及び1μM CuSO₄を含むPowerCHO3中で+37.0℃の温度で、pH 7.00、及び30%酸素飽和にて培養した。+34.0℃まで温度シフト(評価された範囲+31℃〜+35℃)を、+37℃で実行されたバイオリアクターからの最初の収穫物が収穫された後に行った。pHを、酸として散布されたCO₂及び塩基としてNaHCO₃を使用して制御した。オーバーレイ空気流量を0.5 L/分に設定した。リングスパージャーを散布ユニットとして使用した。撹拌速度は150rpmで2倍ピッチ羽根撹拌機をダウンプル様式で用いた。

50Lバイオリアクターに、3.0x10⁵細胞/mLの標的VCDを播種した。細胞を、10 mM L-グルタミン及び1μM CuSO₄を含むProCHO5培地で+37.0℃の温度で、pH 6.90、及び30%酸素飽和度にて培養した。+34.0℃への温度シフトを、最初の１回又は２回の採取の後に行った。上記のとおりのPH制御、オーバーレイ空気流量を2 L/分に設定した。マイクロスパージャーを散布ユニットとして使用した。撹拌速度は90 rpmで2倍ピッチ羽根撹拌機をダウンプル様式で用いた。

バイオリアクター中のVCDが≧1.0x10⁶細胞/mLであった場合に灌流を開始した。灌流速度を1.0体積/体積/日に設定した。BioSepをバックフラッシュ様式で5(10)分のランタイム、そして10秒のバックフラッシュを7(30)Wの電源入力で用いて操作した(括弧内の数字は50Lバイオリアクターを指す)。灌流液及び流出液（bleed)をインラインでろ過し、そして48時間にわたって+2〜+8℃でバッグに集めた。VCDを、能動流出（active bleeding）により濁度プローブを使用して2 g/Lグルコースを目標にパラメーターとしてグルコース消費を使用して制御した。採取物及び流出液をインラインでろ過し、使い捨てフィルター及び使い捨てバッグからなる採取システムを2日ごとに交換した。

以下に記載されるPK分析のための材料を準備するため、D’D3アルブミン融合タンパク質採取物を、アフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。

実施例5: アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用したD’D3-FPダイマーの精製
バイオリアクターからの無細胞採取物を、30 kDメンブレン(例えば、Pall Centramate OS030T12)を用いてTFFシステム(例えば、Pall Centramate 500 S)を使用して３０倍濃縮した。その濃縮物を、NaCl及びEDTAを用いて最終濃度0.75 M NaCl及び5 mM EDTAまでスパイクし、そして終夜、20 mM Tris緩衝液pH 7.4で予め平衡化したCaptureSelectヒトアルブミンカラム(Life Technologies)にロードした。カラムを平衡緩衝液で洗浄した後、D’D3-FPを溶出緩衝液(20 mM Tris、2 M MgCl₂、pH 7.4)で溶出した。次いで溶出液を１０倍濃縮し、そして50 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.4に対して30 kDカットオフを有するウルトラ遠心式フィルター(例えば、Amicon. UFC903024)を使用して透析した。D’D3-FPダイマーをモノマー部分から分離するために、その材料を、50 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.4で予め平衡化されたSuperdex 200 pgカラム(GE Healthcareコード: 17-1069-01)にロードし、そしてD’D3-FPダイマーを含有するピークフラクションをプールした。ダイマー及びモノマーピークフラクションについての曲線下面積を使用して、ダイマー対モノマー比を計算した。

実施例6: 総シアリル化アッセイ
材料及び方法:
酢酸はSigma-Aldrich(製品338826)からのものであった。アセトニトリルはBurdick and
Jackson(製品LC015)からのものであった。2-アミノベンズアミド(2-AB)はAldrich(製品A89804)からのものであった。水酸化アンモニウムはSigma-Aldrich(製品338818)からのものであった。炭酸水素アンモニウムはFluka(製品09830)からのものであった。ジメチルスルホキシドはSigma製品(D2650)からのものであった。ジチオスレイトール(DTT)はSigma(製品646563)からのものであった。ギ酸はThermo(製品28905)からのものであった。N-グリコシダーゼF(PNGase 250U)はRoche(製品11 365 193 00)からのものであった。シアノ水素化ホウ素ナトリウムはAldrich(製品156159)からのものであった。Oasis HLB 3cc 60 mg SPEカートリッジは、Waters(部品番号:WAT094226)からのものであった。50KDa Amicon Ultra 4遠心限外濾過膜はMillipore(カタログ番号UFC805008)からのものであった。Zeba Spin 7K MWCOカラム2mLはThermo(番号89889)であった。

PNGase F酵素グリカン放出:
D’D3-FP約700μを、約70 mM炭酸水素アンモニウム中、pH 8.5 60℃にて30分間DTTで還元した。還元したサンプルを室温まで冷却し、そしてヨードアセトアミドでRTで暗所にて30分間アルキル化した。アルキル化サンプルを2mL Zeba Spin 7K MWCOカラムを使用して50mM炭酸水素アンモニウムpH 8.6に緩衝液を交換した。緩衝液を交換したサンプルに、PNGase 40Uを加え、そしてサンプルを37℃で14時間インキュベートした。PNGaseをさらに40U加え、そしてサンプルをさらに6時間37℃でインキュベートした。PNGase消化サンプルを、50KDa Amicon Ultra 4限外濾過膜を通して遠心分離した。ろ液をCentriVapで乾燥した。

放出されたN-グリカンの2-AB標識:
2-AB標識試薬を製造するために、2-アミノベンズアミド23 mgをDMSO 350μLに溶解し、そして150μL氷酢酸を加えた。得られた溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム32 mgを加え、そして溶解するまで十分に混合した。

2-AB試薬50μLを、乾燥したサンプルに加え、そして暗所で65℃にて3.5時間インキュベートした。

Waters Oasis HLB 3cc 60 mg SPEカートリッジを、3 mL 95%アセトニトリル、3mL 35%アセトニトリル、次いで3 mL 95%アセトニトリルを用いて調整した。2-AB標識サンプルを、95%体積/体積アセトニトリル1.95 mLを加えることにより希釈し、そして直ぐにHLBカートリッジ上にロードし、重力下で流出させた。サンプルを重力下で95%体積/体積アセトニトリル3x 3mLで洗浄し、そして35%体積/体積アセトニトリル3mLで溶出した。溶出液をCentrivapで乾燥した。乾燥した2-AB誘導体化サンプルを、Milli Q水35μLを加えることにより溶解し、そしてボルテックス混合した。溶解後に、アセトニトリル85μLを加え、そして短時間混合した。サンプルを分析のためのHPLCバイアルに移した。

2-ABグリカン分析:
高速液体クロマトグラフィーを、RSバイナリポンプ、オートサンプラー、RSカラムコンパートメント及びRS蛍光検出器からなるThermo Dionex Ultimate 3000システムで行った。2-ABグリカン誘導体の分離を、Dionex GlycanPac AXH-1、1.9 μm、2.1 x 150 mm カラム(製品番号082472)を使用して達成した。移動相Aは100%アセトニトリルからなり、移動相Bは5M水酸化アンモニウム溶液でpH 4.0に調整された50mMギ酸からなるものであった。カラムを50℃に維持し、そして流量は0.200 mL/分であった。カラムを15% Bで平衡化した。サンプル6μLを注入した後、移動相組成を線形的に50分かけて40% Bに変化させ、次いで10分かけて80% Bに、次いで0.1分かけて95% Bに変化させ、次いで95% Bで4.9分間維持し、次いで0.1分かけて15% Bに戻した。カラムを15% Bで14.9分間再平衡化した。蛍光検出を、励起波長320 nm及び発光波長420 nmで行った。

結果:

37℃から33℃へ(例えば、ロットB-140825)又は34℃へ(例えば、ロットB-140623KS)の温度シフト後に採取された採取物から精製されたD’D3-FPタンパク質は、改善されたシアリル化パターンを示し、アシアロ及びモノシアロ構造の減少した量が検出されたが、特にジ−シアロ及びトリ−シアロ構造は増加した。アシアロ構造の減少した含有量は、D’D3-FPタンパク質の半減期自体の上に、同時投与されたFVIIIにもポジティブな効果を有していた(実施例8を参照のこと）。

さらなる有益な効果が、温度シフトの結果として見出され、D’D3-FPダイマーの比率は、より低い温度でモノマーに対して増加し、ここでダイマーはFVIIIへのその増加した結合に起因して好ましい構造である。

表4に示されるように、シアリル化の程度に対する温度シフトの効果は、全長VWFに関して観察されなかった。詳細には、全長野生型VWFアルブミン融合物(「rVWF-FP」)が実施例４に記載されるものと同様のバイオリアクター条件下で発現された場合、及び温度が33.5
℃に減少された場合に、37℃の標準的な温度での発現と比較して、アシアロ構造の含有量を減少させることができなかった。精製はUS 2014/0072561 A1に記載されるように行われた。

37℃で採取されたロットのシアリル化度は、名目の値100に正規化された。33.5℃で採取されたロットについて決定されたシアリル化度は、37℃で採取されたロットより低かった。

実施例7: D’D3-FP抗原濃度の決定
ヒトアルブミンを、その性能が当業者に知られているELISAにより決定した。手短には、マイクロプレートを、緩衝液A[Sigma C3041]で2μg/mLに希釈された１ウェルあたり100μLの捕捉抗体(ヤギ抗ヒトアルブミン-IgG、カタログ番号A80-129A、Bethyl Laboratories、Inc.)とともに16時間周囲温度でインキュベートした。プレートを３回緩衝液B(Sigma P3563)で洗浄した後、マイクロプレートを１ウェルあたり200μLのブロッキング溶液(カタログ番号110500、Candor Biosience GmbH)で1.5時間周囲温度にてブロッキングした。プレートを再び３回緩衝液B(Sigma P3563)で洗浄した後、LowCross緩衝液(カタログ番号100500、Candor Biosience GmbH,)での試験サンプルの段階希釈、さらにはNタンパク質標準SL(OQIM13、Siemens Healthcare 50-0.78 ng/mL)のLowCross緩衝液(１ウェルあたりの体積: 100μL)の段階希釈を、１時間+37℃でインキュベートした。緩衝液Bでの４回の洗浄工程の後、検出抗体(ヤギ-抗ヒトアルブミン-IgGペルオキシーぜ標識、カタログ番号A80-129P、Bethyl Laboratories、Inc.)-Dのブロッキング溶液中での1:40.000希釈100μLを各ウェルに加え、そして45分間+37℃でインキュベートした。緩衝液Bでの３回の洗浄工程の後、基質溶液(1:10 (体積/体積) TMB OUVF : TMB緩衝液OUVG、Siemens Healthcare)100μLを１ウェルあたり加え、そして20分間周囲温度で暗所にてインキュベートした。100μL停止液(OSFA、Siemens Healthcare)を加えて、適切なマイクロプレートリーダーで450 nm波長での読み取りのためにサンプルを準備した。次いで試験サンプルの濃度を、参照としてNタンパク質標準SLを用いて標準曲線を使用して計算した。

実施例8: PK分析
目的
我々は、半減期が延長されたフォン・ヴィルブランド因子(VWF)フラグメントD’D3-FPダイマー及びFVIIIの薬物動態(PK)に対するシアリル化の影響を特徴づけることを目指した。これらの研究の１つの目的は、ラットにおいて、D’D3-FPダイマーのそのPKに対するシアリル化の影響、及びさらに掃除投与されるFVIIIのPKに対するシアリル化の影響を決定することであった(実施例8.1)。第二の実施例は、ラットにおける全長FVIII産物Advate^(R)に対する効果を含む(実施例8.2)。ロット番号(上の表２を参照のこと)及びD’D3-FPダイマーシアリル化の程度（%）を各調整物について示す。

実施例8.1: ラットにおける高度にシアリル化されたD’D3-FPダイマーの同時投与によるFVIIIの薬物動態の延長
材料及び方法
動物: 230〜300 gの体重範囲の雌性Crl:CD (スプラーグドーリー)ラットはCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育された。社内では、動物は標準的な飼育条件、すなわち21〜22℃で12時間/12時間明暗サイクルに維持された。動物には自由に標準的ラット食餌(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)を与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は、独国動物保護法及び欧州連合規則を遵守していた。

検査評価: 試験品を、総体積3 mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈内（i.v.）投与した。全てのD’D3-FPダイマー調製物を、ヒトアルブミン値に基いて1000μg/kgの用量レベルで投与し、そして約30分間+37℃でインキュベートした後に200 IU/kg rVIII-単鎖 (rVIII-単鎖、発色活性)と同時投与した。rVIII-SCのみを投与された動物は対照として役立った(表５)。

血液サンプルを、静脈内ボーラス注射の5分、2、4、8、24、32、48及び72時間後に交互サンプリングスキームを使用して短時間麻酔下で後眼窩で採取した。PKプロフィールを、群あたりラットの２つのコホートから取った(時点あたりn=3、群あたりn=6)。血液サンプルを、クエン酸ナトリウム(2部クエン酸ナトリウム3.13% + 8部血液)を使用して抗凝固剤処置し、処理して血漿とし、そして-20℃でFVIII抗原及び／又はアルブミンの測定のために保存した。

D’D3-FPダイマー曝露を、ヒトアルブミンに特異的なイムノアッセイを使用してタンパク質のアルブミン部分の測定により決定し（実施例７）、そしてFVIII:Ag血漿レベルを、Stago、S.A.S.、FranceからのFVIII Asserachrom ELISA試験キットを用いて検出した。

結果
D’D3-FPダイマーを、そのアルブミン成分を介して定量化し、そして測定を72 h p.a.まで行い、そして全ての測定されたデータはアッセイの検出限界より十分に高かった。平均滞留時間(MRT)及びクリアランス(CL)を非コンパートメント法により見積もり、そしてデータを図1に示す。40.6%シアリル化を有するD’D3-FPダイマーと同時投与されたrVIII-
SC(B-140526)は、83.6%及び89.8%シアリル化を有するD’D3-FPダイマー調製物(それぞれB-140616KS及びB-140623KS)と同時投与された場合より短いMRT及びより高いクリアランスを有していた。

この所見と一致して、ELISAによりFVIII:Agとして定量化された同時投与されたFVIII(200 IU/kg 発色FVIII活性)の薬物動態プロフィールは適宜改変された。48時間及び72時間での全ての血漿レベルが測定できたわけではなく、いくつかの値は57 mIU/mLの検出限界より低かったということを述べておかねばならない。明らかに、rVIII-SC単独は最も短いMRT及び最も高いクリアランスを有し、これは概して、D’D3-FPダイマーが同時投与された場合に延長された(図2)。 それら自体でより長い曝露を有していたD’D3-FPダイマーはFVIII PKプロフィールも延長した。従って、シアリル化＞80%を有するD’D3-FPダイマーと比較して、40.6%シアリル化を有するD’D3-FPダイマー(B-140526)のMRTはより短く、そしてクリアランスはより高かった。

従って、FVIII:Agの薬物動態プロフィールは、D’D3-FPダイマーのシアリル化に依存しており、すなわち、最も短いPKは40.6%シアリル化で観察され、そして最も長いPKは＞80%シアリル化で観察された。

D’D3-FPダイマーのPK特徴の評価はより詳細に行われ、すなわち、非コンパートメントモデルにおいて最大濃度(C_max)及び終末相半減期(t1/2)をさらに計算し、x倍増加も計算した(表6)。

89.8%と40.6%との間のシアリル化は、D’D3-FPダイマーのクリアランスに2倍より多く影響した(経時的アルブミン濃度を測定することにより決定して、89.8% D’D3-FPダイマーについて0.91 mL/kg/時及び40.6% D’D3-FPダイマーについて2.06 mL/kg/時)。これは、平均滞留時間の40%より多い増加(MRT、すなわち56.9時間から81.5時間)及び終末相半減期の30%より多い増加(すなわち、44.0時間から58.6時間)に関連する。

MRT及びクリアランスについてのグラフに示されるように、D’D3-FPダイマーほど明らかではないが、これは同時投与されたFVIIIのPK特徴に置き換えられる(表6、FVIII:Ag): クリアランスは30%より多く減少し(3.93 mL/kg/時から2.95 mL/kg/時)、MRTは19%増加し(16.5時間から19.6時間)、そしてう終末相半減期は15%増加した(11.4時間から13.1時間)。

それとともに、経時的曝露の増加は、単独で投与されたrVIII-SCのPK特徴の増加倍率に見られるように、シアリル化のパーセンテージに依存してD’D3-FPダイマーにより示される。40.6%シアリル化はFVIII PKを1.5〜1.9倍延長したが、89.8%シアリル化を有する最適化されたD’D3-FPダイマーは、FVIII PKを2.0〜2.2倍延長し、そして83.6%シアリル化は中間の値になる。従って、この効果は、40.6%〜89.8%の調べた範囲内でシアリル化の程度と相関する。

実施例8.2: ラットにおける高度にシアリル化されたD’D3-FPダイマーの同時投与による全長FVIIIに薬物動態の延長
材料及び方法
動物: 220〜300 gの体重範囲の雌性Crl:CD (スプラーグドーリー)ラットはCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育された。社内では、動物は標準的な飼育条件、すなわち21〜22℃で12時間/12時間明暗サイクルに維持された。動物には自由に標準的ラット食餌(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)を与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は、独国動物保護法及び欧州連合規則を遵守していた。

検査評価: 試験品を、体積3 mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与した。全てのD’D3-FPダイマー調製物を、ヒトアルブミン値に基いて1000μg/kgの用量レベルで投与し、そして約30分間+37℃でインキュベートした後に200 IU/kg Advate^(R) (名目上の発色活性)と同時投与した。Advate^(R)のみを投与された動物は対照として役立った(表７)。

血液サンプルを、静脈内ボーラス注射の5分、2、4、8、24、32、48及び72時間後に交互サンプリングスキームを使用して短時間麻酔下で後眼窩で採取した。PKプロフィールを、群あたりラットの２つのコホートから取った(時点あたりn=3、群あたりn=6)。血液サンプルを、クエン酸ナトリウム(2部クエン酸ナトリウム3.13% + 8部血液)を使用して抗凝固剤処置し、処理して血漿とし、そして-20℃でFVIII抗原及び／又はアルブミンの測定のために保存した。

D’D3-FPダイマー曝露を、ヒトアルブミンに特異的なイムノアッセイを使用してタンパク質のアルブミン部分の測定により決定し（実施例７）、そしてFVIII:Ag血漿レベルを、Stago、S.A.S.、FranceからのFVIII Asserachrom ELISA試験キットを用いて検出した。

結果
D’D3-FPダイマーを、そのアルブミン成分を介して定量化し、そして測定を72 h p.a.まで行い、そして測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった。平均滞留時間(MRT)及びクリアランス(CL)を非コンパートメント法により見積もり、そしてデータを図３に示す。40.6%シアリル化を有するD’D3-FPダイマーと同時投与されたAdvate^(R)の群におけるD’D3-FPダイマーのPK特徴は、87.3%シアリル化を有するD’D3-FPダイマー調製物と同時投与された場合より短いMRT及びより高いクリアランスを有していた。

この観察と一致して、ELISAによりFVIII:Agとして定量化された、同時投与されたFVIIIの薬物動態プロフィール(200 IU/kg名目上発色FVIII活性)は、適宜改変された。サンプルを、Advate^(R)処置群で4〜8 h p.a.まで、そしてD’D3-FPダイマー同時処置群で24〜32 h
p.a.まで測定することができ、その後、値はアッセイの検出限界117 mIU/mLより低かったということを述べておかねばならない。明らかに、Advate^(R)単独は最も短いMRT及び最も高いクリアランスを有し、これは概して、D’D3-FPダイマーが同時投与された場合に延長された(図４)。それら自体でより長い曝露を有していたD’D3-FPダイマーはFVIII PKプロフィールも延長した。従って、シアリル化＞85%を有するD’D3-FPダイマーと比較して、40.6%シアリル化を有するD’D3-FPダイマーのMRTはより短く、そしてクリアランスはより高かった。従って、FVIII:Agの薬物動態は、D’D3-FPダイマーのシアリル化に依存しており、すなわち、最も短いPKは、40.6%シアリル化で観察され、そして最も長いPKは＞85%シアリル化で観察された。

D’D3-FPダイマーのPK特徴の評価をより詳細に行い、すなわち、非コンパートメントモデルで最大濃度(C_max)及び終末相半減期(t1/2)をさらに計算し、単独で投与されたAdvate^(R)に対するｘ倍増加も計算した(表8)。

87.3%と40.6%との間のシアリル化は、D’D3-FPダイマーのクリアランスに1.5倍より多くの影響を及ぼした(アルブミン濃度を経時的に測定することにより決定して、87.3% D’D3-FPダイマーについて1.32 mL/kg/時及び40.6% D’D3-FPダイマーについて2.17 mL/kg/時)。これは、平均滞留時間(MRT、+14%、すなわち54.4時間から62.0時間)及び終末相半減期(t1/2、+4%、すなわち、42.2時間から44.0時間)に対するわずかな効果と関連している。

MRT及びクリアランスについてグラフに示されるように、D’D3-FPダイマーほど大部分は明確ではなかったが、これは同時投与されたFVIIIのPK特徴に置き換えられる(表8、FVIII:Ag): クリアランスは20%より多く減少し(12.99 mL/kg/時から10.66 mL/kg/時)、MRTは12%増加し(10.2時間から11.4時間)そして終末相は11%増加する(8.9時間から9.9時間)。

それとともに、全長FVIII製品Advate^(R)についても、経時的な曝露の増加は、単独で投与されたAdvate^(R)のPK特徴の増加倍率でも示されるように、シアリル化のパーセンテージに依存してD’D3-FPダイマーにより生じる。40.6%シアリル化はFVIII PKを2.3〜2.9倍増加させるが、87.3%シアリル化を有する最適化されたD’D3-FPダイマーはFVIII PKを2.8〜3.2倍延長する。

PK研究結果からの結論
これらの研究は、D’D3-FPダイマー及びFVIIIの同時投与が、様々なFVIII産物を使用してFVIII:Ag血漿曝露を延長することを実証する。この延長は、D’D3-FPダイマーのシアリル化の状態に依存し: 概して、より良好なシアリル化は、FVIII血漿曝露をさらに最適化する。詳細には、40.9%のシアリル化を有するD’D3-FPダイマーは、83.6〜89.8%の範囲のシアリル化を有するD’D3-FPよりもFVIII:Ag血漿曝露に関して劣っていた。

ラットにおいて(ヒト血友病A患者と対照的に)、ヒト及び内在性FVIIIはD’D3-FPダイマー結合部位と競合するので、ヒト血友病患者におけるFVIIIに対する効果はなおより強いと期待され得る。

実施例9: D’D3-FPのインビトロシアリル化
D’D3-FPダイマーを、35 mM酢酸ナトリウム/35 mM Tris緩衝液pH 7.0に対して透析した。110μl中タンパク質約600μgに、ドナー基質として水100μl中に溶解された0.75 mg CMP-NANA (Roche カタログ番号05974003103)及び10.5μl ST6GAL-1 (水中60μg、Roche カタログ番号07012250103)を加えた。この混合物を37℃で6時間インキュベートし、そして-15℃〜-25℃で凍結することにより反応を停止させた。この手順は製造者の推奨に従った。次いでD’D3-FPダイマーを、SEC Superdex 200pg(GE Healthcare、コード90-1002-10)を使用するクロマトグラフィーにより試薬から精製した。シアリル化を上記のように決定し、そして結果を表9に示す。

出発物質のシアリル化度は、100の名目値に正規化された。インビトロシアリル化後のシアリル化度は、出発物質よりも実質的に高かった。

実施例10: 高度にシアリル化されたVWFフラグメントを濃縮するためのアニオン交換クロマトグラフィー
実施例５に従って製造されたD’D3-FPを、アシアロN-グリカン構造の含有量を減らすためにアニオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに精製した。従って、D’D3-FP溶液を、20 mM Tris x HCl pH 7.4緩衝液を使用して、D’D3-FPのカラムへの結合を完了させるために十分低い伝導度まで希釈し(一般に5 mS/cm未満)、そして20 mM Tris x HCl、20 mM NaCl pH 7.4を含有する平衡緩衝液を使用して平衡化されたPoros XQ樹脂で充填されたクロマトグラフィーカラム(充填高さ約20 cm)にロードした。平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、平衡化緩衝液から溶出緩衝液(20 mM Tris x HCl、500 mM NaCl pH 7.4)の均一な線形グラジエントを使用してD’D3-FPを溶出した。D’D3-FPを含有する溶出ピークを、同様の体積の約１０のフラクションへと分画し、そして増加した量のアシアロN-グリカン構造を有するD’D3-FPを含有する初期ピークフラクションを廃棄し、そして望ましいレベルより低い(例えば、20 %又はそれ以下)のアシアロN-グリカン構造を含有する後のピークフラクションをプールした。

あるいは、D’D3-FPの精製ランを行ったが、D’D3-FP溶出液ピークのプールが、15%未満(又は10%未満)のアシアロN-グリカン構造を有するD’D3-FPを含有するフラクションだけに行われることが異なっていた。

記載されるように、対応するフラクションをプールすることにより、アシアロN-グリカン構造の所望の最大含有量を有する適切なD’D3-FP調製物を製造することができる。

線形グラジエントを溶出に使用して得られた結果に基づいて、より多くの量のアシアロN-グリカン構造を有する第一のフラクションを除去して、15%未満のアシアロN-グリカン構造含有量を有するD’D3-FP溶出液を生じることを可能にする、様々な濃度のNaClを含有する緩衝液を用いる段階グラジエントが誘導され得る。

実施例11: VWFフラグメントダイマー及びモノマーに対するFVIII親和性の決定
D’D3-FPモノマー及びダイマーを上記のように単離し、そしてこれらの調製物に対するFVIIIの親和性を、Biacore機器(T200、GE Healthcare)による表面プラズモン共鳴により評価した。

抗アルブミン抗体(MA1-20124、Thermo Scientific)を、そのN末端を介して活性化CM 3チップにNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)及びEDC(エタノールアミン塩酸塩)（両方ともGE Healthcareからのアミンカップリングキット(BR1000-50)に含まれる）により共有結合でカップリングした。固定化のために、抗体3μg/mLを酢酸ナトリウム緩衝液(10 mM、pH 5.0)で希釈し、そして抗体溶液を７分かけて流量10μL/分でチップ上に流した。固定化手順後に、未カップリングデキストランフィラメントを、エタノールアミン溶液(1M、pH 8.3)をチップ上に５分間流すことにより(流量10μL/分で)飽和させた。フローセルを飽和させる目的は、検体のチップへの非特異的結合を最少にすることであった。参照フローセルを、上と同じ手順を使用することにより空のフローセルをエタノールアミンで飽和させることにより設定した。

それぞれダイマー及びモノマーD’D3-FPタンパク質を、D’D3-FPタンパク質(5μg/mL)をチップ上に3分間流すことにより(流量10μL/分)固定して抗アルブミン抗体に共有結合でカップリングした。ダイマーD’D3-FPの捕捉された質量は335 RUであり、モノマーD’D3-FPについては147 RUであり、モノマー及びダイマーD’D3-FPの両方にFVIIIの１つの結合部位と推測された。

FVIIIについての結合曲線を作成するために、各D’D3-FPタンパク質調製物を、ランニングバッファ(HBS-P+: 0.1M HEPES、1.5M NaCl及び0.5%体積/体積 界面活性剤P20、pH 7.4;製品コードBR100671、GE Healthcare)で0.25 nM、0.5 nM、1 nM、3nM及び4 nMの濃度に希釈した。シングルサイクルカイネティクスを行うことにより、上昇する濃度の各希釈したサンプルをチップ上に２分間(流量30μL/分)流し、続いてランニングバッファHBS-P+を用いて１０分の解離時間であった。全ての測定を２回行った。測定手順のための温度を+25℃に調整した。

結合パラメーターを、BiaEvaluationソフトウェアを使用して計算した。曲線フィッティング法は、ラングミュア式に基づくものであった。計算のための入力データは、検体FVIII(rVIII-単鎖)のモル質量170kDaであり、最大RU及び傾きのような他のパラメーターは、フィッティングされた結合及び解離曲線から自動的に抽出された。BiaEvaluationソフトウェアの出力は、結合速度定数及び解離速度定数であり、これらから親和性定数が計算された。結果を表１０に示す。

結合速度定数は、モノマーD’D3-FPに対してrVIII-単鎖についてわずかに増加したが、rVIII-単鎖のD’D3-FPダイマーに対する解離速度定数は、モノマーに対するものより３倍遅かった。解離速度定数及び結合速度定数の商は、rVIII-単鎖のD’D3-FPに対する親和性を示す。それ故、ダイマーD’D3-FPは、D’D3-FPモノマーと比較してFVIIIに対する増加した親和性を示す。

PNGase Fにより放出されたN-グリカンを、フルオロフォア 2-アミノベンズアミド(AB)で標識し、そして正確な質量及び保持時間の情報を使用して標識されたN-グリカンの同時の定量的測定及び同定を可能にするインラインLC-蛍光-高分解能MS検出を使用する分析の前に精製した。混合モードHILIC/RP LC-カラムの使用は、電荷及び構造に基づく放出されたAB標識N-グリカンの分離を可能にし、これは末端ガラクトース及び非シアリル化残基の数に従って異なる構造の定量的結果を可能にした。曲線下面積を使用して蛍光定量の標準偏差は、平均して参照サンプル(n=5)を使用して0.5%未満であることが見出された。分離されたAB標識N-グリカンにおける非シアリル化末端ガラクトース残基の存在は、放出されたAB-標識N-グリカンをβ1-4-ガラクトシダーゼで処理し、そしてそれらを同じLC-FLD-MS法を使用して再注入し、そしてシフトしたピークを分析することにより確認された。

以下の方法を適用した:
PNGase F酵素グリカン放出:
精製されたタンパク質約700μgを、炭酸水素アンモニウム、pH 8.5中DTTで60℃にて３０分還元した。還元されたサンプルを室温まで冷却し、そしてヨードアセトアミドを用いてRTで暗所にて30分間アルキル化した。アルキル化されたサンプルを、2mL Zeba Spin 7K MWCOカラムを使用して50mM炭酸水素アンモニウムpH 8.6に緩衝液交換した。緩衝液を交換したサンプルに、PNGase 40Uを加え、そしてサンプルを37℃で14時間インキュベートした。PNGaseをさらに40U加え、そしてサンプルをさらに6時間37℃でインキュベートした。PNGaseで消化したサンプルを50KDa Amicon Ultra 4限外濾過膜を通して遠心分離した。ろ液をCentriVapで乾燥した。

放出されたN-グリカンの2-AB標識:
2-AB標識試薬を、製造者の指示に従って製造した。2-AB試薬50μLを乾燥したサンプルに加え、そして暗所で65℃にて3.5時間インキュベートした。

Waters Oasis HLB 3cc 60 mg SPEカートリッジを、3 mL 95%アセトニトリル、3mL 35%アセトニトリル、次いで3 mL 95%アセトニトリルで調整した。2-AB標識サンプルを、95%体積/体積アセトニトリル1.95 mLを加えることにより希釈し、そして直ぐにHLBカートリッジにロードし、そして重力下で流し出した。サンプルを重力下で3x 3mL of 95%体積/体積アセトニトリルで洗浄しそして35%体積/体積アセトニトリル3mLで溶出した。乾燥した2-AB誘導体化サンプルを、Milli Q水35μLを加えてボルテックス混合することにより溶解した。溶解後に、アセトニトリル85μLを加え、そして短時間混合した。サンプルを分析のためにHPLCバイアルに移した。

2-ABグリカン分析:
高速液体クロマトグラフィーを、RS Binary Pump、オートサンプラー、RSカラムコンパートメント及びRS蛍光検出器からなるThermo Dionex Ultimate 3000システムで行った。2-ABグリカン誘導体の分離は、Dionex GlycanPac AXH-1、1.9 μm、2.1 x 150 mmカラム(製品番号082472)を使用して達成された。移動相Aは100%アセトニトリルからなり、移動相Bは5M水酸化アンモニウム溶液でpH 4.0に調整された50mMギ酸からなるものであった。カラムを50℃に維持し、そして流量は0.200 mL/分であった。蛍光検出を励起波長320 nm及び発光波長420 nmで行った。

LC-FLDシステムを、高分解能直交式TOF-MS(MaXis、Bruker-Daltonik、Bremen、Germany)に連結した。トランスファーキャピラリを-4500 Vの電圧に維持した(正イオン極性モード)。ネブライザーを、標準的ESI噴霧器(Bruker、Bremen、Germany)を使用して0.8 barに設定し、乾燥ガス温度180℃に、そして乾燥ガス流量を7 L/分に設定した。イオントランスファーを、質量範囲全体にわたって分解能R > 50,000を維持しながら最高感度についてm/z 200-3000の範囲に最適化した。TOF-MS質量キャリブレーションを、100倍希釈のESチューニングミックス(Agilent Technologies、Waldbronn,Germany)を4 ul/分で直接注入有することによりLC-MS実験前に行った。

本発明の糖タンパク質がダイマーである場合、切断型VWFは、好ましくは配列番号9のアミノ酸764〜1099、アミノ酸764〜1142、アミノ酸764〜1222、アミノ酸764〜1225、又はアミノ酸764〜1227に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのポリペプチドを含むか又はそれからなるものであり、かつFVIIIに結合するこ
とができる。好ましい実施態様において、切断型VWFは、配列番号9のアミノ酸764〜1099
、アミノ酸764〜1142、アミノ酸764〜1222、アミノ酸764〜1225、又はアミノ酸764〜1227に対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつFVIIIに結合することができる。最も好ましくは、切断型VWFは、配列番号９のアミノ酸764〜1099、アミノ酸764〜1142、アミノ酸764〜1222、アミノ酸764〜1225、又はアミノ酸764〜1227を含むか又はそれらからなる。

HLEPとしてのアルブミン
用語「ヒト血清アルブミン」(HSA)及び「ヒトアルブミン」(HA)及び「アルブミン」(ALB)は、本出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広義であり、かつヒト血清アルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)、さらには他の種由来のアルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)を包含する。

実施例7: D’D3-FP抗原濃度の決定
ヒトアルブミンを、その性能が当業者に知られているELISAにより決定した。手短には
、マイクロプレートを、緩衝液A[Sigma C3041]で2μg/mLに希釈された１ウェルあたり100μLの捕捉抗体(ヤギ抗ヒトアルブミン-IgG、カタログ番号A80-129A、Bethyl Laboratories、Inc.)とともに16時間周囲温度でインキュベートした。プレートを３回緩衝液B(Sigma P3563)で洗浄した後、マイクロプレートを１ウェルあたり200μLのブロッキング溶液(カタログ番号110500、Candor Biosience GmbH)で1.5時間周囲温度にてブロッキングした。プレートを再び３回緩衝液B(Sigma P3563)で洗浄した後、LowCross緩衝液(カタログ番号100500、Candor Biosience GmbH,)での試験サンプルの段階希釈、さらにはNタンパク質標準SL(OQIM13、Siemens Healthcare 50-0.78 ng/mL)のLowCross緩衝液(１ウェルあたりの体積: 100μL)の段階希釈を、１時間+37℃でインキュベートした。緩衝液Bでの４回の洗浄工程の後、検出抗体(ヤギ-抗ヒトアルブミン-IgGペルオキシーぜ標識、カタログ番号A80-129P、Bethyl Laboratories、Inc.)-Dのブロッキング溶液中での1:40,000希釈100μLを各ウェルに加え、そして45分間+37℃でインキュベートした。緩衝液Bでの３回の洗浄工程の後、基質溶液(1:10 (体積/体積) TMB OUVF : TMB緩衝液OUVG、Siemens Healthcare)100μLを１ウェルあたり加え、そして20分間周囲温度で暗所にてインキュベートした。100μL停止液(OSFA、Siemens Healthcare)を加えて、適切なマイクロプレートリーダーで450 nm波長での読み取りのためにサンプルを準備した。次いで試験サンプルの濃度を、参照としてNタンパク質標準SLを用いて標準曲線を使用して計算した。

Claims (21)

1. 増加したシアリル化を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供すること、及び（ｉｉ）該細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む、上記方法。
2. 切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む糖タンパク質のダイマーを製造するか、又は該糖タンパク質の二量体化を増加するための方法であって、（ｉ）糖タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供すること、及び（ｉｉ）該細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む、上記方法。
3. 細胞が、シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 工程（ｉｉ）の前に、細胞を３７．０℃±１．０℃の温度で培養し、そして工程（ｉｉ）は、細胞を３４．０℃±２．０℃の温度で培養することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 増加したシアリル化を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸及びα−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸を含む細胞を提供すること、並びに（ｉｉ）糖タンパク質及びα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、上記方法。
6. （ｉ）請求項１〜５のいずれか１項において得られた糖タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにかけて、それにより高シアリル化を有する糖タンパク質を、低シアリル化を有する糖タンパク質から分離すること；及びイオン交換カラムから溶出された高シアリル化を有するフラクションを集めること；又は（ｉｉ）請求項１〜５のいずれか１項において得られた糖タンパク質を、シアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸ドナーとインビトロで接触させることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 平均して、得られた糖タンパク質の少なくとも７５％が、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 平均して、得られた糖タンパク質の少なくとも５０％がダイマーとして存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により得ることができる糖タンパク質。
10. 切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む糖タンパク質であって、ここで該切断型ＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができ、そして該糖タンパク質はＮ−グリカンを含み、
    ｉ） 該Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含み、かつ／又は
    ｉｉ） 該Ｎ−グリカンの３５％未満は、平均して、２つ若しくはそれ以上の末端かつ非シアリル化ガラクトース残基を含み、かつ／又は
    ｉｉｉ） 該Ｎ−グリカンの６％未満は、平均して、３つ若しくはそれ以上末端かつ非シアリル化ガラクトース残基を含む、
    上記糖タンパク質。
11. Ｎ−グリカンの少なくとも７０％は、平均して、少なくとも１つのα−２，６−シアル酸部分又は少なくとも１つのα−２，３−シアル酸部分を含む、請求項１０に記載の糖タンパク質。
12. 切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号９のアミノ酸７７６〜８０５、又は（ｂ）配列番号９のアミノ酸７７６〜８０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の糖タンパク質。
13. 切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号９のアミノ酸７６４〜１２４２、（ｂ）配列番号９のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｃ） （ａ）若しくは（ｂ）のフラグメントからなる、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の糖タンパク質。
14. 切断型ＶＷＦに融合された半減期延長異種ポリペプチド、及び／又は糖タンパク質に結合された半減期延長部分をさらに含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の糖タンパク質。
15. 糖タンパク質がダイマーである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の糖タンパク質。
16. ＦＶＩＩＩに対するダイマー糖タンパク質の親和性は、該ＦＶＩＩＩに対するモノマー糖タンパク質の親和性より大きく、ここで該モノマー糖タンパク質は、ダイマー糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載のダイマー糖タンパク質。
17. 請求項９〜１６のいずれか１項に記載の糖タンパク質及び薬学的に許容しうる添加物を含む、医薬組成物。
18. 組成物中の糖タンパク質の少なくとも５０％はダイマーとして存在する、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 血液凝固障害の処置における使用のための、請求項９〜１６のいずれか１項において定義される糖タンパク質であって、該処置は、有効量の該糖タンパク質及び有効量のＦＶＩＩＩを被験体に投与することを含み、ここで糖タンパク質は、静脈内又は皮下に投与され、そしてＦＶＩＩＩは静脈内又は皮下に投与される、上記糖タンパク質。
20. 糖タンパク質の同時投与により、ＦＶＩＩＩ単独を用いた処置と比較して、ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）は増加され、かつ／若しくはＦＶＩＩＩのクリアランスは減少され；かつ／又はここで、ＦＶＩＩＩの投与頻度は、ＦＶＩＩＩ単独を用いた処置と比較して減少される、請求項１９に記載の使用のための糖タンパク質。
21. 血液凝固障害の処置における同時の、別個の又は連続した使用のための、（ｉ）ＦＶＩＩＩ、及び（ｉｉ）請求項９〜１６のいずれか１項において定義される糖タンパク質を含む医薬キット。