JP2018511652A - Prpf31遺伝子における変異により引き起こされる遺伝性網膜変性に対する遺伝子増強療法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年3月6日出願の米国特許出願第62/129,638号、および2015年4月14日出願の同第62/147,307号の利益を主張する。前述の特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ASCIIのコピーは、2016年3月7日に作成され、00633−0192WO1.txtと命名され、サイズは154KBである。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与される助成金番号EY020902の下に、政府により支援されて行われた。政府は本発明における一定の権利を有する。
実施例
序
スプライセオソームは、新生RNAからイントロンを除去するために必要な、遍在する動的リボ核タンパク質高分子である1。常染色体の優性の網膜色素変性(RP)の原因となる変異は、U4/U6.U5トリ−snRNP2に見出されるタンパク質(PRPF3、PRPF4、PRPF6、PRPF8、PRPF31、およびSNRNP200)をコードする6種の遺伝子中で同定された。全体として、これらの遺伝子における変異は、優性のRPの2番目に多い一般的な原因である3〜5。RPは進行性の後期発症性の失明により定義され、遺伝性の網膜変性の最も一般的な形態であり、世界中で約1:3500の個体が罹患する6。それは遺伝的に不均一であり、メンデル遺伝の3通り全ての様式を示す7。罹患組織は、神経網膜、網膜色素上皮(RPE)、および脈絡膜を含む4。スプライセオソームの成分は、あらゆる細胞型で普遍的に発現するので、これらのスプライシング因子における変異が、非症候性RPのみを引き起こす理由は明らかでない。さらに、これらの変異によって罹患した網膜に特異的な細胞型(単数または複数)は未だ同定されていない。
動物
動物による研究は、the Massachusetts Eye and Ear Infirmaryのthe Institutional Animal Care and Use Committeesおよびthe Universite Pierre et Marie Curie−Parisからのthe Charles Darwin Animal Experimentation Ethics COmmitteeにより承認されたプロトコルの下で実施された。同数の雄および雌マウスを以下の実験の各々で使用した。
日齢9〜10日の動物からのRPE細胞を記載したようにして単離した13。簡単に説明すると、眼杯を2mg/mlのヒアルロニダーゼ(Sigma)で消化して、神経網膜を眼杯から丁寧に剥離した。1mg/mlのトリプシン(Invitrogen)で消化した後、RPEをBruch膜から剥離して5mmのカバーガラス上に播種した。細胞を、10%FBSを添加したDMEM中において37℃、5%CO2でコンフルエントになるまで5〜10日間増殖させた。
腹腔の常在マクロファージを以前に記載したようにして単離した21。安楽死させたマウスを解剖台にピンで留めて、水平なフローフード中で毛皮を70%エタノールを使用して湿らせた。ピンセットおよび鋏を使用して、皮膚を腹腔壁から注意深く分離した。5mLの滅菌PBSを腹部の空洞に注入して、20〜30秒間臍を揉むかまたは全身を揺すった。PBSを腹部空洞からゆっくりと集めて、2から3匹の異なる動物からの試料をプールした。細胞を10分間300gでスピンにかけて、10%FBSを添加した1mLのRPMI中に再懸濁させた。細胞を96ウェルのプレートに1ウェル当たり100,000〜200,000細胞で播種して、2時間接着するに任せた。プレートを振盪して、滅菌PBSを使用してウェルを1回すすいだ。細胞を培地中で2〜3日の間37℃、5%CO2に保った。
3種のshRNAをヒトPRPF31またはマウスPrpf31に設計して、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有するpCAG−mir30ベクター中にクローニングした。これらのshRNAの配列は以下の通りである。ヒトshRNA1−5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCAGATGAGCTCTTAGCTGATTAGTGAAGCCACAGATGTAATCAGCTAAGAGCTCATCTGCCTGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号27)、ヒトshRNA2−5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGAACCCAACCTGTCCATCATTATTAGTGAAGCCACAGATGTAATAATGATGGACAGGTTGGGTGTGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号28)、およびヒトshRNA3−5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCTGAGTTCCTCAAGGTCAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTGACCTTGAGGAACTCAGCCTGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号29);マウスshRNA1−5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCAGTCAAGAGCATTGCCAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTGGCAATGCTCTTGACTGAATGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号30)、マウスshRNA2−5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGACCTGTCTGGCTTCTCTTCTACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTAGAAGAGAAGCCAGACAGGGTGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号31)、およびマウスshRNA3−5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCCGAGTTCCTCAAGGTCAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTGACCTTGAGGAACTCGGCCTGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号32)。本発明者らは、緑色蛍光タンパク質に対するshRNAをこのベクター中に非標的対照としてクローニングした(5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCTCCGAACGTGTATCACGTTTAGTGAAGCCACAGATGTAAACGTGATACACGTTCGGAGATTGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号33))。shRNAを含有するベクターをPstIで線状化して、Amaxa電気穿孔法キットV(Amaxa)を使用して、別々のARPE−19(ヒトRPE細胞系列、ATCC)またはJ774A.1(マウスマクロファージ細胞系列、ATCC)培養物にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を6ウェルプレートおよび2mLの培養培地(1:1DMEM:10%FBS添加F−12)に移した。トランスフェクトされた細胞を、終夜37℃、5%CO2で増殖させた。トランスフェクション後24時間に、1μg/ml(ARPE−19)から1.25(J774A.1)μg/mlのピューロマイシン(Sigma)を添加して、安定な細胞系列を選択した。培地およびピューロマイシンを2日毎に10日間更新した。選択後、4種のARPE−19および4種のJ774A.1ノックダウン系列をコンフルエントになるまで増殖させた。ノックダウンの有効度を決定するために、安定な系列に、ARPE−19細胞中のV5でタグを付けたPRPF31、またはGateway Destinationベクター(Invitrogen)中にクローニングされたV5でタグを付けたPrpf31のいずれかを一過性にトランスフェクトした。ウェスタンブロットを実施して、Odyssey赤外撮像装置(Li−Cor)を使用してV5でタグを付けたPRPF31を定量した。細胞生存能力アッセイは、Cell Titer−Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を製造業者の推奨に従って使用して実施した。簡単に説明すると、ARPE−19細胞を、96ウェルの細胞培養プレート(Corning、カタログ番号3904)に1,000細胞/ウェルの密度で播種した。10%FBSを添加したDMEM中で、細胞を37℃、5%CO2で3日間増殖させた。この期間の後、細胞の生存能力をルミネッセンスにより測定し、スチューデントt−検定を使用して統計的有意性を決定した。
光受容体外側セグメントを屠殺場から得られた新鮮なブタの眼から単離し、以前に記載したインビトロ食作用アッセイ13のために、FITC染料(Invitrogen)を用いて共有結合で標識した。コンフルエントに培養されたRPE細胞を、1細胞当たり約10FITC−POSでチャレンジし1.5時間置いた。1mM MgCl2および0.2mM CaCl2を添加したPBSで3回洗浄して、非特異的に結合したPOSを徹底的に除去した。内在化したPOSを測定するために、一部のウェルをトリパンブルーと10分間インキュベートして、表面に結合したFITC標識されたPOSの蛍光を以前に記載したように26消光した。細胞を氷冷メタノールで固定して、核をHoechst33258(Invitrogen)またはDAPI(Euromedex)で対比染色した。細胞を、Nikon Ti2またはLeica DM6000蛍光顕微鏡を20×で使用して撮像した。RPE初代培養について、FITC/DAPI比を、全ての視野で、1細胞当たりのPOSの数に対応して計算した。FITC−POSを1細胞基準で100細胞について計算して、ARPE−19について3個のウェルで平均を決定した。腹腔マクロファージについて、FITC−POSおよびDAPI標識された核を蛍光プレートの読みにより定量した(Infinite M1000、Magellan6ソフトウェア、Tecan)。結合比は、内部移行ウェル(トリパンブルー処理した)で得られた結果を全食作用(未処理)ウェルから差し引くことにより計算した。これを、3から6回の独立のアッセイについて実施して、有意性をスチューデントt−検定(P<0.05)を使用して決定した。
マウスは、光照射開始の2時間前(−2)、光照射開始時(0)、ならびに光照射開始後2、4、および8時間に(+2、+4、+8)安楽死させて、電子顕微鏡またはパラフィン包埋のいずれかのために、前に記載したように13、15処理した。電子顕微鏡のためには、全ての試薬を、Electron Microscopy Sciencesから購入した。マウスを、2%グルタルアルデヒド+2%パラホルムアルデヒドで灌流して、眼杯を、0.2Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を添加した灌流緩衝液に移した。60から80ナノメートルの超薄切片を、クエン酸鉛/酢酸ウラニルで染色して、視神経から200nM離れた初期ファゴソームを計数した。初期ファゴソームは、以下の基準:1)それがRPEの細胞原形質内に含有されていること、および2)視認できる層状構造を有すること、に合致する場合に計数する。光顕微鏡のためには、眼杯をホルムアルデヒド/エタノール/酢酸中で固定して、Ottix Plus溶媒代用品(DiaPath)を使用してパラフィン包埋した。5マイクロメートルの切片に切り、SafeSolv溶媒代用品を使用してパラフィンを除去した。切片を再水和して、色素を漂白するために、照明下で10分間1×SSC中5%H2O2でインキュベートした。1×TBS中の10%BSA使用して非特異的シグナル伝達を遮断した後、抗ロドプシン抗体(Millipore)および抗マウスIgG−AlexaFluor488(Invitrogen)を用いて切片を染色した。核はDAPIで染色して、(標準的手順に従って調製した)Mowiolを用いてスライドにマウントした。像のスタックは、60×油浸対物レンズを備えたOlympus FV1000倒立共焦点顕微鏡で、4倍ズームおよび0.41μmステップサイズ走査で得て、Adobe Photoshop CS6ソフトウェアを使用して処理した。少なくとも100μmの連続した網膜/RPEの領域が10回走査のスタックで計数された。各実験シリーズにおいて、ファゴソームの数は、網膜の長さに対して正規化して平均した。有意性は、スチューデントのt−検定を使用して(P<0.05)、全ての実験についてN=2〜5で決定した。
本発明者らは、記載したようにして14インビボにおける網膜の接着アッセイを実施した。簡単に説明すると、水晶体および角膜を眼杯から取り外して、直ちにカルシウムおよびマグネシウムを添加したHanks生理食塩水緩衝液中で検死解剖する。視神経に放射状の切断を行い、神経網膜を平板化された眼杯から丁寧に剥離した。神経網膜試料を、50mM Tris−HCl(pH7.5)、2mM EDTA、150mM NaCl、1%トリトンX−100、0.1%SDS、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)および1mM PMSFを添加した1%Nonidet P−40中で溶解した。清澄化した上清からのタンパク質を、Bradfordアッセイを使用して定量し、等濃度をRPE65(AbcamまたはMillipore)およびベータ−アクチン(AbcamまたはSigma)に対してイムノブロットした。メラニン色素を、不溶性の神経網膜のペレットから20%DMSO、2N NaOHを用いて抽出した。試料および市販のメラニン標準(Sigma)を、吸光度を490nMで測定することにより定量した。異なった組織収率を説明するために、各試料で色素の存在量をタンパク質濃度に対して正規化した。イムノブロットのバンドを、ImageJソフトウェアv1.46rを使用して、全てのブロットに対して参照として共通の試料を使用して定量し、次にシグナルを平均した。有意性は、スチューデントのt−検定を使用して(P<0.05)、全ての実験についてN=3〜6で決定した。
凍結切片のために、眼杯を2%パラホルムアルデヒド中で固定して、30%スクロース中で終夜4℃でインキュベートした。眼杯をO.C.T.Compound(Sakura)中に包埋して、10μmの切片を切った。切片を個々に、αvインテグリン(BD Biosciences)、β5インテグリン(Santa Cruz Biotechnology)、MerTK(FabGennix)、Mfg−E8およびGas6(R & D Systems)、FAKクローン2A7(Millipore)、およびタンパク質S(Sigma)に対する一次抗体とインキュベートし、続いてIgG−AlexaFluor488(Invitrogen)とインキュベートした。核は、DAPIで染色して、Fluoromount(Electron Microscopy Sciences)を用いてマウントした。画像は、油浸60×対物レンズを使用するNikon Eclipse Ti倒立蛍光顕微鏡を用いて撮った。画像をNIS−Elements ARソフトウェア(Nikon)で処理した。
RPEの食作用はPrpf変異マウスで低下する
Prpf変異マウスの本発明者らの独自のキャラクタリゼーションで、電子顕微鏡により、1から2歳の変異体における形態学的変化が確認された8。ここで、本発明者らは、機能的変化が観察された形態学的変化に先行するかどうかを決定することを企てた。RPEは培養中に食作用活性を維持するので、本発明者らは、日齢9〜10日のPrpf3T494M/T494M、Prpf8H2309P/H2309P、Prpf31+/−マウスおよびそれらの対応する同腹子対照から独立の初代RPE培養を確立した。培養物がコンフルエントになったら、本発明者らは、1.5時間のインキュベーション後にFITC標識されたブタPOSを使用して食作用を測定した。図1A(パネル1〜3)は、Prpf変異マウスおよびそれらの同腹子対照からのRPE細胞のPOS結合/取り込みを例示して、変異マウスによる食作用における定性的欠損を示す初代培養の代表的画像を示す。3種全ての変異体モデルにおいて、食作用における37〜48%の減少が観察された(N=3〜5、P<0.05)(図1B)。POSのカバーガラスへの非特異的結合を数えるために、本発明者らは、細胞を含有しないカバーガラス上で食作用のアッセイが実施される陰性対照を実験した。本発明者らは、POSのカバーガラスへのいかなる非特異的接着も観察しなかった(データ掲載せず)。
光照射開始後2時間でピークになり、その日の残りには比較的不活性にとどまる13強い日周的な、同期されたリズムに従って、脱落したPOSのRPEによる食作用が生じる。本発明者らは、光サイクルを通して5つの時点で、インビボにおける食作用を、電子顕微鏡(図2A、Prpf3およびPrpf8変異体)または免疫蛍光(図2B、Prpf31変異体)のいずれか(両方共、RPEの食作用のリズムを推定する認められた技法13、15)を使用して、測定した。Prpf3およびPrpf8の対照および変異マウスについて、本発明者らは、電子顕微鏡写真で層状の構造(図2A、挿入された矢じりは層状の構造を示す)を含有する初期のファゴソームを計数した。食作用の周期性は、パラフィン包埋およびロドプシンに対する染色を使用して、Prpf31+/−マウスで決定して、本発明者らは、RPE細胞層に存在するファゴソーム(図2B、矢じり)を計数した。本発明者らは、光照射開始後2時間に全ての対照マウスで食作用のバーストを観察して、網膜の切片の100μm当たり22〜26個のファゴソームを確認した(図2C、+2時点)。対照的に、変異マウスは、同じピーク時点で10〜14個のファゴソームを示しただけであった。光照射の他の間:暗サイクルでは、食作用レベルは対照マウスでは比較的低いままであり(「ピークオフ時間」、2〜12個のファゴソーム/100μm網膜)、これらのレベルは、変異マウスでは一般的に上昇した(6〜14個のファゴソーム/100μm網膜)。これらの結果は、変異マウスの3種全てのタイプにおいて食作用のピーク強度における低下を示し、ピーク時が広がってそれがPrpf3およびPrpf8変異体ではより長く持続して、Prpf31変異体ではより早く始まる。さらに、Prpf8変異体は、ピークオフ時点で(+8時間)、WT対照と比較して有意により多くのファゴソームを有する。
RPE頂点の微絨毛とPOSの末端の先端との間の接着は、同期されたリズムに従って、最大強度は光照射開始後3.5時間に、食作用のピークのわずかに後に起こることが知られている4,15。接着は、安楽死の直後に平坦化された眼杯から網膜を剥離し、次に網膜に移されたRPE65などのRPEメラニン含有率および頂点のRPEタンパク質マーカーの両者を定量することにより、決定することができる。この方法を使用して、本発明者らは、Prpf変異マウスおよび同腹子対照で、光照射開始後3.5および8.5時間に(それぞれ、ピーク時およびピークオフの接着)接着を推定した。RPE接着は、先ず標準的メラニン定量の手順14、次にメラニン生成を確認するためにRPE65の存在についてウェスタンブロットを使用して定量した。本発明者らは、ピーク時におけるPrpf3T494M/T494Mのメラニン含有率が56±16%減少すること(N=6、p<0.05、変動は標準偏差に等しい)およびピークオフ時点における(図3A)接着に有意の変化はないことを認めた。ウェスタンブロット分析により、ピーク接着における30±2%減少でこの観察を確認した(図3B)。Prpf8H2309P/H2309Pマウスにおけるメラニン定量は、接着が、ピーク時点で61±28%、およびピークオフ時点で51±16%と有意に減少することを示した(両時点共、N=6、P<0.05)(図3A)。しかしながら、ウェスタンブロット分析では、ピーク時点においてのみ有意の36±11%減少が確認された(図3B)。Prpf31+/−マウスでは、15±1%の減少がピーク時点で観察されて(図3A)、イムノブロット分析によって確認された(両方のパネルについて、N=3〜7、P<0.05)(図3B、14±1%)。
RPE細胞は高度に分極しており、それらの機能はこの極性に依存する24。RPEで発現された多くのタンパク質の特異的局在は重要であり、局在における不規則性は、RPまたはベスト病などの網膜ジストロフィーの原因となり得る25、26。3種全てのPrpf変異体マウスモデルにおける食作用および接着の両方の日周的なリズムの乱れがあると仮定し、本発明者らは、これらのプロセスにとって重要であることが知られているタンパク質の局在を特徴づけることを企てた。タンパク質の局在は、Prpf3およびPrpf8変異マウスについては凍結切片(図4)、およびPrpf31変異マウスについてはパラフィン切片でアッセイした(図5)。
ここで、本発明者らは、RNAスプライシング因子Prpf3、8、および31における変異を有するマウス中のRPEの機能の最初のキャラクタリゼーションを報告する。本発明者らが以前報告したように、変異マウスでは、光受容体の変性はないが、むしろRPEにおける形態学的変化がある8。RNAスプライシング因子RPは後期発症疾患であるから、これらの結果は、驚くことではなく、これらのモデルにより、本発明者らは、疾患の発症に導く機構を検討することができる。本発明者らの結果は、マウスにおいて、およびヒトにおいても、同様な食作用の欠損が、PRPF31がノックダウンされたヒトARPE−19細胞で観察されることを考慮に入れれば、RPEが、これらの3種のRNAスプライシング因子の変異により罹患する主要な細胞型である可能性が高いことを示す。疾患の病原性の厳密な機構は未だ確認されていないが、これらのデータは、研究がRPEに集中されることを許容する。例えば、これらの障害に罹患する主要な細胞型としてのRPEの同定により、これらの検討をヒト細胞に拡大することが可能になるであろう。遺伝性の網膜疾患を有する患者のヒト由来の多分化能幹細胞(hiPSC)からRPE細胞を発生させることが現在では可能であるからである42〜45。
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実施例1に記載したように、網膜色素上皮(RPE)を、RNAスプライシング網膜色素変性(RP)の3種の変異体マウスモデルにおける病原性の部位と同定した。しかしながら、これらの結果は、ヒトRPEにおいて確認される必要があった。CRISPR/Cas9ゲノム編集技法の出現で、疾患のこれらの形態のためのヒト細胞系列モデルが開発された。本実施例は、ヒト細胞系列で初めてPRPF31をノックアウトするためのCRISPR/Cas9ゲノム編集の使用を提供し、およびRPE機能に対する効果をキャラクタライズする。
上の実施例2で記載したように、CRISPR/Cas9ゲノム編集を、正常hiPSCにおいてPRPF31をノックアウトするために使用した(Hou Z, Zhang Y, Propson NE, Howden SE, Chu LF, Sontheimer EJ, Thomson JA. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013;110:15644-9;Xue H, Wu J, Li S, Rao MS, Liu Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods Molecular Biology. 2014Peters DT, Cowan CA, Musunuru K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. Cambridge (MA) 2013; Ding Q, Regan SN, Xia Y, Oostrom LA, Cowan CA, Musunuru K. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 2013; 12: 393-4. PMCID: 3925309)。
上で記載したように、Prpf3T494M/T494M、Prpf8H2309P/H2309P、およびPrpf31+/−マウスからのRPE細胞の初代培養物は、POSに食作用を行う能力が有意に低下している(図1)。本発明者らは、hiPSCから誘導されたRPE細胞の食作用機能を、確立された技法を使用して推定するであろう(実施例1;Finnemann SC, Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez-Boulan E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alpha(v)beta5 integrin for binding but not for internalization. ProcNatlAcadSciUSA. 1997;94:12932-7;Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE, Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;22:593-60を参照されたい)。
RNAスプライシング因子RPに罹患した初代細胞と思われるRPE細胞の同定(実施例1を参照されたい)により、PRPF31における変異により引き起こされた疾患のために遺伝子増強療法を使用する機会が得られる。この目標を達成するために、本発明者らは、RPE細胞中でヒトPRPF31を発現するAAVベクターを開発して、培養されたRPE細胞において、および次にインビボにおけるPrpf31+/−マウスにおいて、AAV送達されたPRPF31の表現型を改良する能力を試験した。AAVは、RPE65LCAおよびコロイデレミアのための遺伝子療法の臨床試験、ならびに他の臨床試験および前臨床試験の成功に基づく、網膜の障害のための好ましい遺伝子送達ベクターである(Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN, Jr., Mingozzi F, Bennicelli J, Banfi S, Marshall KA, Testa F, Surace EM, Rossi S, Lyubarsky A, Arruda VR, Konkle B, Stone E, Sun J, Jacobs J, Dell’Osso L, Hertle R, Ma JX, Redmond TM, Zhu X, Hauck B, Zelenaia O, Shindler KS, Maguire MG, Wright JF, Volpe NJ, McDonnell JW, Auricchio A, High KA, Bennett J. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 2008;358:2240-8. PMCID: 2829748;Bainbridge JW, Smith AJ, Barker SS, Robbie S, Henderson R, Balaggan K, Viswanathan A, Holder GE, Stockman A, Tyler N, Petersen-Jones S, Bhattacharya SS, Thrasher AJ, Fitzke FW, Carter BJ, Rubin GS, Moore AT, Ali RR. Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 2008;358:2231-9;Cideciyan AV, Aleman TS, Boye SL, Schwartz SB, Kaushal S, Roman AJ, Pang JJ, Sumaroka A, Windsor EA, Wilson JM, Flotte TR, Fishman GA, Heon E, Stone EM, Byrne BJ, Jacobson SG, Hauswirth WW. Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proceedings National Academy Sciences USA. 2008;105:15112-7. PMCID: 2567501;Maguire AM, High KA, Auricchio A, Wright JF, Pierce EA, Testa F, Mingozzi F, Bennicelli JL, Ying GS, Rossi S, Fulton A, Marshall KA, Banfi S, Chung DC, Morgan JI, Hauck B, Zelenaia O, Zhu X, Raffini L, Coppieters F, De Baere E, Shindler KS, Volpe NJ, Surace EM, Acerra C, Lyubarsky A, Redmond TM, Stone E, Sun J, McDonnell JW, Leroy BP, Simonelli F, Bennett J. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber’s congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2009;374:1597-605;Jacobson SG, Cideciyan AV, Ratnakaram R, Heon E, Schwartz SB, Roman AJ, Peden MC, Aleman TS, Boye SL, Sumaroka A, Conlon TJ, Calcedo R, Pang JJ, Erger KE, Olivares MB, Mullins CL, Swider M, Kaushal S, Feuer WJ, Iannaccone A, Fishman GA, Stone EM, Byrne BJ, Hauswirth WW. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Archives Ophthalmology. 2012;130:9-24;Bennett J, Ashtari M, Wellman J, Marshall KA, Cyckowski LL, Chung DC, McCague S, Pierce EA, Chen Y, Bennicelli JL, Zhu X, Ying GS, Sun J, Wright JF, Auricchio A, Simonelli F, Shindler KS, Mingozzi F, High KA, Maguire AM. AAV2 gene therapy readministration in three adults with congenital blindness. Science translational medicine. 2012;4:120ra15;Bowles DE, McPhee SW, Li C, Gray SJ, Samulski JJ, Camp AS, Li J, Wang B, Monahan PE, Rabinowitz JE, Grieger JC, Govindasamy L, Agbandje-McKenna M, Xiao X, Samulski RJ. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2012;20:443-55. PMCID: 3277234;Maclachlan TK, Lukason M, Collins M, Munger R, Isenberger E, Rogers C, Malatos S, Dufresne E, Morris J, Calcedo R, Veres G, Scaria A, Andrews L, Wadsworth S. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 2011;19:326-34. PMCID: 3034852;Nathwani AC, Tuddenham EG, Rangarajan S, Rosales C, McIntosh J, Linch DC, Chowdary P, Riddell A, Pie AJ, Harrington C, O’Beirne J, Smith K, Pasi J, Glader B, Rustagi P, Ng CY, Kay MA, Zhou J, Spence Y, Morton CL, Allay J, Coleman J, Sleep S, Cunningham JM, Srivastava D, Basner-Tschakarjan E, Mingozzi F, High KA, Gray JT, Reiss UM, Nienhuis AW, Davidoff AM. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. New England Journal of Medicine. 2011;365:2357-65. PMCID: 3265081)。
上で記載したように、PRPF31における変異は、ハプロ不全により疾患を引き起こし、したがって優性のRPのこの形態は、遺伝子増強療法を用いる処置を受けやすいという十分な証拠がある(Wang et al., American Journal Medical Genetics A. 2003;121A:235-9;Xia et al., Molecular Vision. 2004;10:361-5;Abu-Safieh et al., MolVis. 2006;12:384-8;Rivolta et al., Human Mutation. 2006;27:644-53;Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006;47:4579-88;Rio et al., Human Mutation. 2009;30:1340-7)。この仮説と矛盾することなく、野生型対立遺伝子由来のPRPF31の発現のレベルは、PRPF31における変異を有する患者における疾患の重症度と相関する(Rio et al., Journal Clinical Investigation. 2008;118:1519-31;Venturini et al., PLoS genetics. 2012;8:e1003040;Rose et al., Scientific reports. 2016;6:19450)。この仮説を試験するために、本発明者らは、AAVにより媒介される遺伝子増強療法を使用して、培養されたRPE細胞における表現型を改良した。
プロモーター−CASI nts197〜1252
タグ−V5 nts1259〜1309
挿入−PRPF31 nts1319〜2818
ポリA配列−ウサギβ−グロビン nts2825〜3211
本発明をそれらの詳細な説明と関連して説明したが、前述の説明は、例示することが意図され、本発明の範囲を限定することは意図されず、本発明は、添付の請求項の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (16)
- ヒト対象において、PRPF31における変異により引き起こされる網膜色素変性を処置する方法であって、網膜色素上皮(RPE)細胞における発現を駆動するプロモーターと作動可能に連結した、ヒトPRPF31をコードする配列を含む治療的有効量のアデノ随伴ウイルスタイプ2(AAV2)ベクターを前記対象の眼に送達することを含む方法。
- 前記プロモーターが、CAG、CASI、RPE65またはVMD2プロモーターである、請求項1に記載の方法。
- 前記PRPF31配列がコドン最適化されている、請求項2に記載の方法。
- 前記ベクターが網膜下注射により送達される、請求項1〜3に記載の方法。
- ヒト対象の眼においてPRPF31の発現を増大させる方法であって、網膜色素上皮(RPE)細胞における発現を駆動するプロモーターと作動可能に連結した、ヒトPRPF31をコードする配列を含む治療的有効量のアデノ随伴ウイルスタイプ2(AAV2)ベクターを前記対象の眼に送達することを含む方法。
- 前記プロモーターがCAG、CASI、RPE65またはVMD2プロモーターである、請求項5に記載の方法。
- 前記PRPF31配列がコドン最適化されている、請求項5に記載の方法。
- 前記ベクターが網膜下注射により送達される、請求項5〜7に記載の方法。
- 網膜色素上皮(RPE)細胞における発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結した、ヒトPRPF31をコードする配列を含むアデノ随伴ウイルスタイプ2(AAV2)ベクター。
- 前記プロモーターがCAG、CASI、RPE65またはVMD2プロモーターである、請求項9に記載のベクター。
- 前記PRPF31配列がコドン最適化されている、請求項9に記載のベクター。
- 網膜下注射による送達のために製剤化された、請求項9〜11に記載のベクターを含む医薬組成物。
- ヒト対象の眼において、PRPF31における変異により引き起こされる網膜色素変性の処置に使用するための、請求項9〜11に記載のベクター。
- ヒト対象の眼において、PRPF31の発現を増大させることに使用するための、請求項9〜11に記載のベクター。
- ヒト対象の眼において、PRPF31における変異により引き起こされる網膜色素変性の処置に使用するための、請求項12に記載の医薬組成物。
- ヒト対象の眼において、PRPF31の発現を増大させることに使用するための、請求項12に記載の医薬組成物。
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