JP2018506985A - 細胞内へのボツリヌス神経毒素の特異的取り込みを強化するための方法 - Google Patents
細胞内へのボツリヌス神経毒素の特異的取り込みを強化するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018506985A JP2018506985A JP2017546070A JP2017546070A JP2018506985A JP 2018506985 A JP2018506985 A JP 2018506985A JP 2017546070 A JP2017546070 A JP 2017546070A JP 2017546070 A JP2017546070 A JP 2017546070A JP 2018506985 A JP2018506985 A JP 2018506985A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- neurotoxin
- cell
- cells
- neurotoxin polypeptide
- bont
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims description 189
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 title description 10
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 claims abstract description 298
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 298
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 claims abstract description 278
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 171
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 167
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 167
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 116
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 claims abstract description 32
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 claims abstract description 23
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 295
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 35
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004183 Synaptosomal-Associated Protein 25 Human genes 0.000 claims description 30
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 8
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 claims description 4
- ATCJTYORYKLVIA-SRXJVYAUSA-N vamp regimen Chemical group O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1.C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C(C45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C=O)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 ATCJTYORYKLVIA-SRXJVYAUSA-N 0.000 claims description 4
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002215 Synaptobrevin Human genes 0.000 claims description 3
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 claims description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 171
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 49
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 29
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 28
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 28
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 19
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 18
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 15
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 101000584505 Homo sapiens Synaptic vesicle glycoprotein 2A Proteins 0.000 description 13
- 102100030701 Synaptic vesicle glycoprotein 2A Human genes 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 9
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 9
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 7
- DZANYXOTJVLAEE-UHFFFAOYSA-N 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Chemical compound FC1=C(OP(O)(O)=O)C(F)=CC2=C1OC(=O)C=C2C DZANYXOTJVLAEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 5
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 4
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- LEZNRPFLOGYEIO-QSEDPUOVSA-N ganglioside GT1b Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@]4(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C4)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 LEZNRPFLOGYEIO-QSEDPUOVSA-N 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000000063 presynaptic terminal Anatomy 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 2
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000007900 neurotoxin activity Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 description 1
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000904196 Homo sapiens Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Proteins 0.000 description 1
- 101000584515 Homo sapiens Synaptic vesicle glycoprotein 2B Proteins 0.000 description 1
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 102100024019 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Human genes 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000004659 Presynaptic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010003717 Presynaptic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100030700 Synaptic vesicle glycoprotein 2B Human genes 0.000 description 1
- 108010055170 Synaptotagmin I Proteins 0.000 description 1
- 108010055445 Synaptotagmin II Proteins 0.000 description 1
- 102100036417 Synaptotagmin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100036151 Synaptotagmin-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 208000003217 Tetany Diseases 0.000 description 1
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 241000902900 cellular organisms Species 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 231100001102 clostridial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CWLDKTAXQZEVQN-CUEXFKMESA-L disodium;(5r)-5-acetamido-2-[6-[3-acetamido-2-[4-[(5r)-5-acetamido-2-carboxylato-4-hydroxy-6-[(1s,2s)-1,2,3-trihydroxypropyl]oxan-2-yl]oxy-6-[4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(e,2s,3r)-3-hydroxy-2-(octadecanoylamino)icos-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-5-hydroxy- Chemical compound [Na+].[Na+].OC1C(O)C(OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCCCC)OC(CO)C1OC1C(O)C(OC2(OC([C@H](NC(C)=O)C(O)C2)[C@@H](O)[C@@H](O)CO)C([O-])=O)C(OC2C(C(OC3C(C(O)C(OC4(OC([C@H](NC(C)=O)C(O)C4)[C@@H](O)[C@@H](O)CO)C([O-])=O)C(CO)O3)O)C(O)C(CO)O2)NC(C)=O)C(CO)O1 CWLDKTAXQZEVQN-CUEXFKMESA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 108010024001 incobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000021966 synaptic vesicle transport Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 229940018272 xeomin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5058—Neurological cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
- A47L—DOMESTIC WASHING OR CLEANING; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
- A47L9/00—Details or accessories of suction cleaners, e.g. mechanical means for controlling the suction or for effecting pulsating action; Storing devices specially adapted to suction cleaners or parts thereof; Carrying-vehicles specially adapted for suction cleaners
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09J—ADHESIVES; NON-MECHANICAL ASPECTS OF ADHESIVE PROCESSES IN GENERAL; ADHESIVE PROCESSES NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE; USE OF MATERIALS AS ADHESIVES
- C09J7/00—Adhesives in the form of films or foils
- C09J7/40—Adhesives in the form of films or foils characterised by release liners
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B5/00—Optical elements other than lenses
- G02B5/30—Polarising elements
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02F—OPTICAL DEVICES OR ARRANGEMENTS FOR THE CONTROL OF LIGHT BY MODIFICATION OF THE OPTICAL PROPERTIES OF THE MEDIA OF THE ELEMENTS INVOLVED THEREIN; NON-LINEAR OPTICS; FREQUENCY-CHANGING OF LIGHT; OPTICAL LOGIC ELEMENTS; OPTICAL ANALOGUE/DIGITAL CONVERTERS
- G02F1/00—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics
- G02F1/01—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the intensity, phase, polarisation or colour
- G02F1/13—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the intensity, phase, polarisation or colour based on liquid crystals, e.g. single liquid crystal display cells
- G02F1/133—Constructional arrangements; Operation of liquid crystal cells; Circuit arrangements
- G02F1/1333—Constructional arrangements; Manufacturing methods
- G02F1/1335—Structural association of cells with optical devices, e.g. polarisers or reflectors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B38/00—Ancillary operations in connection with laminating processes
- B32B38/10—Removing layers, or parts of layers, mechanically or chemically
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B43/00—Operations specially adapted for layered products and not otherwise provided for, e.g. repairing; Apparatus therefor
- B32B43/006—Delaminating
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
- Y10T156/11—Methods of delaminating, per se; i.e., separating at bonding face
- Y10T156/1126—Using direct fluid current against work during delaminating
- Y10T156/1132—Using vacuum directly against work during delaminating
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
- Y10T156/11—Methods of delaminating, per se; i.e., separating at bonding face
- Y10T156/1168—Gripping and pulling work apart during delaminating
- Y10T156/1174—Using roller for delamination [e.g., roller pairs operating at differing speeds or directions, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
- Y10T156/11—Methods of delaminating, per se; i.e., separating at bonding face
- Y10T156/1168—Gripping and pulling work apart during delaminating
- Y10T156/1195—Delaminating from release surface
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
- Y10T156/19—Delaminating means
- Y10T156/1928—Differential fluid pressure delaminating means
- Y10T156/1944—Vacuum delaminating means [e.g., vacuum chamber, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
- Y10T156/19—Delaminating means
- Y10T156/195—Delaminating roller means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
- Y10T156/19—Delaminating means
- Y10T156/1994—Means for delaminating from release surface
Abstract
本発明は、細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化するための方法であって、神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることを含み、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含み、それによって細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化する、方法を提供する。加えて、本発明は、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を直接決定するための方法であって、ａ）神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることであって、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含むことと、ｂ）細胞を固定し、任意選択で、界面活性剤を用いて細胞を透過性にすることと、ｃ）細胞を、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する少なくとも１つの第１の捕捉抗体並びに神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉抗体と、捕捉抗体と基質との結合を可能にする条件下で接触させることと、ｄ）細胞を、第１の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第１の検出抗体と、第１の検出抗体と第１の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第１の検出複合体を形成すること、及び第２の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第２の検出抗体と、第２の検出抗体と第２の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第２の検出複合体を形成することと、ｅ）工程ｄ）の第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、ｆ）細胞中の神経毒素ポリペプチドによって切断された基質の量を、第２の検出複合体を用いて計算し、それによって、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定することと、を含む、方法に関する。【選択図】図１
Description
本発明は、細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化するための方法であって、神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることを含み、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含み、それによって細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化する、方法を提供する。加えて、本発明は、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を直接決定するための方法であって、ａ）神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることであって、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含むことと、ｂ）細胞を固定し、任意選択で、界面活性剤を用いて細胞を透過性にすることと、ｃ）細胞を、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する少なくとも１つの第１の捕捉抗体、並びに神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉抗体と、捕捉抗体と基質との結合を可能にする条件下で接触させることと、ｄ）細胞を、第１の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第１の検出抗体と、第１の検出抗体と第１の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第１の検出複合体を形成すること、及び第２の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第２の検出抗体と、第２の検出抗体と第２の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第２の検出複合体を形成することと、ｅ）工程ｄ）の第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、ｆ）細胞中の神経毒素ポリペプチドによって切断された基質の量を、第２の検出複合体を用いて計算し、それによって、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定することと、を含む、方法に関する。
クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）及びクロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）は、極めて強力な神経毒素、すなわち、それぞれボツリヌス毒素（Botulinum toxin、ＢｏＮＴ）及び破傷風毒素（Tetanus toxin、ＴｅＮＴ）を産生する。これらのクロストリジウム神経毒素（Clostridial neurotoxin、ＣＮＴ）は、神経細胞に特異的に結合し、神経伝達物質の放出を崩壊させる。それぞれの毒素は、不活性なプロセシングされていないおよそ１５０ｋＤａの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド架橋の形成、及び細菌性プロテアーゼによる限定的なタンパク質分解（ニッキング）を伴う。活性な神経毒素は、およそ５０ｋＤａのＮ末端軽鎖及びジスルフィド結合によって連結されるおよそ１００ｋＤａの重鎖という２つの鎖からなる。ＣＮＴは、構造的及び機能的に、３つのドメイン、すなわち、触媒性軽鎖、移行ドメイン（Ｎ末端側の半分）及び受容体結合ドメイン（Ｃ末端側の半分）を含む重鎖からなる；例えば、Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ １９９０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８，３９；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ １９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２，４１；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ １９９４，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１３，４９を参照されたい。ボツリヌス神経毒素は、１５０ｋＤａの神経毒素タンパク質及び関連する非毒性タンパク質を含む分子複合体として合成される。複合体の寸法は、クロストリジウム株及び異なる神経毒素血清型に基づいて異なり、３００ｋＤａから、５００ｋＤａを上回って、９００ｋＤａの範囲に及ぶ。これらの複合体中の非毒性タンパク質は、神経毒素を安定化させ、分解から保護する；Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ ２００４，Ｐａｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ４，Ｓ１９〜Ｓ２６を参照されたい。
クロストリジウム・ボツリナムは、Ａ〜Ｇで示される７つの抗原性が異なる血清型のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａ〜ＢｏＮＴ／Ｇ）を分泌する。すべての血清型は、クロストリジウム・テタニによって分泌される関連破傷風毒素（ＴｅＮＴ）とともに、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断することによってシナプス開口分泌を遮断するＺｎ2+エンドプロテアーゼである；Ｃｏｕｅｓｎｏｎ，２００６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５２，７５９を参照されたい。ＣＮＴは、ボツリヌス中毒及び破傷風において見られる弛緩性筋麻痺を引き起こす；Ｆｉｓｃｈｅｒ ２００７，ＰＮＡＳ １０４，１０４４７を参照されたい。最近では、新しいボツリヌス毒素型、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｈが特定されている；Ｂａｒａｓｈ ａｎｄ Ａｒｎｏｎ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１４），２０９（２）：１８３〜１９１及びＤｏｖｅｒ，Ｂａｒａｓｈ，Ｈｉｌｌ，Ｘｉｅ ａｎｄ Ａｒｎｏｎ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１４），２０９（２）：１９２〜２０２を参照されたい。
その毒作用にもかかわらず、ボツリヌス毒素複合体は、多数の疾患において治療薬として使用されている。ボツリヌス毒素血清型Ａは、斜視、眼瞼けいれん及び他の障害の治療のために、１９８９年に米国でヒトへの使用が承認された。それは、例えば、商品名ＢＯＴＯＸ（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．）又は商品名ＤＹＳＰＯＲＴ／ＲＥＬＯＸＩＮ（Ｉｐｓｅｎ，Ｌｔｄ）で、ボツリヌス毒素Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）タンパク質調製物として市販されている。改良された、複合体不含のボツリヌス毒素Ａ調製物は、商品名ＸＥＯＭＩＮ（Ｍｅｒｚ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧａＡ）で市販されている。治療適用のために、この調製物は、治療を受ける筋肉に直接注射される。生理学的ｐＨにおいて、毒素がタンパク質複合体から放出され、望ましい薬理学的作用が生じる。ボツリヌス毒素の作用は一時的なものでしかなく、このことが、治療効果を維持するためにはボツリヌス毒素を反復投与することが必要とされ得る理由である。
クロストリジウム神経毒素は、随意筋力を減弱させ、斜視、頚部ジストニアを含む限局性ジストニア及び良性特発性眼瞼けいれんに有効な治療法である。これらは、更に、片側顔面けいれん及び限局性痙直を軽減し、更には胃腸障害、多汗症、及び美容上のしわ矯正など、広範な他の適応症において有効であることが示されている；Ｊｏｓｔ ２００７，Ｄｒｕｇｓ ６７，６６９を参照されたい。
クロストリジウム神経毒素の製造過程の際には、この神経毒素の定性的及び定量的決定並びに生物学的に活性な神経毒素ポリペプチドの品質管理が、特に重要である。加えて、政府機関は、単純で信頼でき、かつ検証済みのボツリヌス毒素活性アッセイのみを承認している。現時点では、致死率試験であるマウス５０％致死量バイオアッセイが、依然として、製薬業者が調製物の効力を分析するために使用される「ゴールドスタンダード」となっている；Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１），ＪＡＭＡ ２８５，１０５９〜１０７０を参照されたい。しかしながら、近年では、動物試験の必要性並びにこの種の動物に基づくアッセイに関連するすべての不都合、費用、倫理上の懸念を減少させるため、代替的なアプローチを模索するために相当な努力がなされている。加えて、規制当局は、製薬企業がボツリヌス神経毒素の効力試験に３つの「Ｒ」の原則：「動物の使用数の削減、動物使用に伴う苦痛の削減、動物を用いない方法に置き換える（Reduce, Refine, Replace）」を適用するよう取り組んでいる；Ｓｔｒａｕｇｈａｎ，Ａｌｔｅｒｎ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．（２００６），３４，３０５〜３１３を参照されたい。結果として、生きた動物を使用する方法に対する合理的な代替方法を提供するために、細胞に基づく試験システムが開発された。それにもかかわらず、これまでのところ、神経毒素ポリペプチドに十分に感受性であることが示されている、神経毒素の生物学的活性の決定に利用可能な細胞試験システムは３つしかない。これらの細胞に基づく試験システムは、インビトロで分化した齧歯類の胚から単離した初代ニューロン（Ｐｅｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４０４，３８８〜３９２）、神経分化人工多能性幹細胞（Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２６，４２６〜３５）及びＳｉＭａ細胞系のサブクローン（国際公開第２０１０／１０５２３４号（Ａ１））の使用を含む。
しかしながら、初代ニューロンの単離は、動物の殺害を必要とし、労力を要し、時間がかかる。更に、異なる初代ニューロンを使用した試験システムは、大きなばらつきを示す。同様に、神経分化人工多能性幹細胞の生成は、難しく、時間がかかる。加えて、そのような細胞の保管は、非常に問題がある。腫瘍細胞系を使用したアッセイは、ＢｏＮＴに対する感受性が十分でないことが多い。更に、この腫瘍細胞系には複雑な分化プロトコルが必要であり、その結果、この細胞系を使用したアッセイには大きなばらつき及び／又は高い失敗率が生じる。
上記を踏まえると、神経毒素ポリペプチド活性の決定のための更なる試験システムが、非常に望ましい。
したがって、本発明の根底にある技術的問題は、前述の必要性に応じた手段及び方法の提供であると考えることができる。技術的問題は、特許請求の範囲及び本明細書において以下に特徴付けられる実施形態によって解決される。
第１の態様において、本発明は、細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化するための方法であって、
神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることを含み、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含み、それによって細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化する、方法に関する。好ましくは、本方法は、インビトロ法である。
神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることを含み、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含み、それによって細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化する、方法に関する。好ましくは、本方法は、インビトロ法である。
クロストリジウム神経毒素ポリペプチドは、シナプス終末内で神経伝達物質の放出を遮断するように作用する。神経毒素は、ニューロンの膜受容体に結合し、エンドソーム様コンパートメントに取り込まれ、ｐＨ依存性移行過程を介してエンドソーム膜に浸透することによって、ニューロン内に入る。一旦シナプスの細胞質内に入ると、クロストリジウム神経毒素は、シナプス小胞の融合に必要な対応するＳＮＡＲＥタンパク質基質を切断する。
より具体的には、クロストリジウム神経毒素は、シナプス前神経終末からの神経伝達物質の分泌を特異的に阻害するという点を特徴とする。末梢ニューロンに対する選択性は、ＳＶ２及びＧＴ１ｂなど、異なる受容体の認識によって媒介される。例えば、シナプス前神経終末へのＢｏＮＴ／Ａの特異的な取り込みは、高親和性受容体と低親和性受容体との組み合せを含む、厳密に制御された複数工程の過程である。ガングリオシドＧＴ１ｂへの結合により、最初の結合工程が媒介され、これによって、ＢｏＮＴ／Ａが細胞表面上に集結する。一旦膜に結合されると、原形質膜内での横方向移動により、ＢｏＮＴ／Ａと、ＳＶ２又はＦＧＦＲ３などの追加の（タンパク質）受容体との分子間相互作用が促進される。ＢｏＮＴ／Ａの受容体は、受容体結合ドメインのＣ末端内に結合ポケットを有するガングリオシドＧＴ１ｂである。ＡＰＲ受容体モデルによると、シナプス前膜で微小ドメイン中に集束したシナプス前受容体アレイ（array of presynaptic receptor、ＡＰＲ）が、ＢｏＮＴ／Ａを含む神経毒素の特異的取り込みを担う。最初の結合工程を媒介し、ＢｏＮＴ／Ａを細胞表面上に集結させるのが、ガングリオシドＧＴ１ｂへの結合である。一旦膜に結合されると、原形質膜内での横方向移動により、ＢｏＮＴ／Ａと、シナプス小胞（Synaptic Vesicle、ＳＶ）糖タンパク質２の３つのアイソフォームであり、シナプス小胞がシナプス前膜に融合した後に外側の原形質膜上に曝露されるＳＶ２Ａ（ＥＮＳＧ０００００１５９１６４）、Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１８５５１８）及びＣ（ＥＮＳＧ０００００１２２０１２）を含むタンパク質受容体との分子間相互作用が促進される。ＢｏＮＴ／Ａは、ＳＶ２の第４の管腔ドメイン（luminal domain、ＬＤ４）を特異的に認識する。ＳＶ２と相互作用するＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインにおける特異的な配列は、依然として特定されていない。グリコシル化ＳＶ２Ａ、Ｂ及びＣはまた、ＢｏＮＴ／Ｆの受容体として特定されており、グリコシル化ＳＶ２Ａ及びＢは、ＢｏＮＴ／Ｅの受容体として特定されている。ＢｏＮＴ／Ｄは、一方の部位がＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ及びＧにおいて既に特定されている位置にあり、もう一方の部位がＴｅＮＴの第２のガングリオシド結合ポケットに似ている、２つのガングリオシド結合部位を介してニューロンに進入することが報告された。最近では、ＢｏＮＴ／Ｄはまた、ＳＶ２（３つすべてのアイソフォーム）を使用して海馬ニューロンに進入することが示されているが、ＢｏＮＴ／Ｄは、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅとは異なる機序を通じてＳＶ２に結合した。ＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂはまた、中枢神経へのＴｅＮＴの結合及び進入を媒介することが報告されている；Ｊａｃｋｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１３ Ｍａｙ；９（５）：ｅ１００３３６９及びそこに引用される参考文献を参照されたい。
神経毒素の生理学的作用は、受容体の結合及び神経毒素の軽鎖の移行に続くＳＮＡＲＥ複合体のタンパク質の切断に基づく。クロストリジウム神経毒素の生物学的活性の決定は、この神経毒素タンパク質の特徴付けにおける重要な側面であり、とりわけ、クロストリジウム神経毒素を含有する生成物のクリアランスのために、規制当局によって必要とされている。クロストリジウム神経毒素の生物学的活性の測定のための信頼できる試験は、したがって、クロストリジウム神経毒素を含有する生成物の研究、開発及び販売の基盤となる。更に、細胞に基づく試験システムは、倫理上の理由から、これまでの主要な動物試験に置き換わるであろう。そのような細胞に基づく試験システムを確立するために、神経細胞又は細胞系のクロストリジウム神経毒素に対する十分に高い感受性は、必須である。
有利なことに、クロストリジウム神経毒素中毒を受けやすい細胞内へのクロストリジウム神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みは、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つによって増加し得ることが、本発明者らによって発見された。同時に、神経毒素ポリペプチド又はその分解産物の非特異的取り込みは、これらの手段によって低減され得る。具体的には、前述の神経毒素又はその分解産物の非特異的な細胞内取り込みは、細胞を神経毒素とともにインキュベートする期間を短縮することによって、減少する。細胞のＫ+媒介型脱分極は、神経毒素の特異的取り込みを刺激する。更に、神経毒素中毒時の細胞の撹拌により、神経細胞膜に隣接する生体相の濃度に影響を及ぼし、それによって、細胞内への神経毒素の非特異的取り込みを低減させること及び特異的取り込みを増加させることができる。対応するデータは、以下の実施例に示されている。更に、図１は、細胞に基づくアッセイの３つの実施例の比較を示し、ここで、負荷試料は、基準アッセイであるマウス５０％致死量バイオアッセイに匹敵する減衰動態を示す。
したがって、本発明の方法の一態様において、神経毒素ポリペプチド又はその分解産物の非特異的な細胞内取り込みが、低減される。
本発明はまた、ボツリヌス神経毒素の安定な保管の効果として、例えば分解によって損傷した分子に対する選択性を含む。神経伝達物質の放出は、Ｋ+媒介型脱分極によって誘発されるため、それに続く小胞体の再取り込みの増加は、ＧＴ１ｂなどの受容体及び／又はＳＶ２タンパク質ファミリーのメンバーとの結合による特異的取り込みを含む。損傷した分子は、受容体に対して減弱した結合を呈し得るか、又は結合を示さない可能性がある。同じことが、振盪などの物理的影響にも当てはまる。損傷した分子の安定性の低い結合は、振盪によって更に低減されるであろう。
細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化するために、神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする期間及び条件下でインキュベートする。そのような期間及び細胞培養条件は、当該技術分野において既知である。本発明の方法において、細胞培養条件は、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含む。本発明の方法はまた、前述の工程のうちの２つ、例えば、工程（ｉ）及び（ｉｉ）、工程（ｉ）及び（ｉｉｉ）、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は３つすべての工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでもよい。細胞培養条件が、次の工程のそれぞれ、すなわち、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程を含むことが好ましい。
通常は、当該技術分野において神経毒素活性アッセイで使用される細胞培養培地は、約５ｍＭのＫ+を含有する。ニューロンは、通常、培地から細胞内にＫ+イオンを能動的に輸送し、サイトゾルから原形質膜を通じて細胞の外側にＮａ+イオンを能動的に輸送することによって、イオン勾配を確立させる。その結果が膜電位であり、これは、細胞によって厳密に制御され、細胞間の通信を含む複数の異なる細胞過程の基礎となる。原形質膜の特定のイオンの透過性の急激な変化又は膜の片側でのイオン組成の急速な変化が、脱分極と呼ばれる膜電位の変化をもたらす。細胞のＫ+媒介型脱分極は、細胞培養培地中の増加したＫ+濃度、例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ又は５５ｍＭの追加のＫ+濃度で、行われ得る。本発明の方法におけるＫ+の最終濃度は、約１５ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ又は６０ｍＭのＫ+であり得る。Ｋ+媒介型脱分極の期間は、少なくとも約３０分間、１時間、１時間半、２時間、２時間半、３時間又はそれ以上である。
細胞のＫ+媒介型脱分極及び／又は神経毒素ポリペプチド曝露は、ガングリオシドＧＴ１ｂの存在下で行われ得る。ＧＴ１ｂは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０μＭ、好ましくは約１５μＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約２０μＭの濃度で使用され得る。
当該技術分野において使用される神経毒素ポリペプチド曝露時間は、通常、約４時間〜約９６時間であり、約７２時間であることが多い。短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間は、少なくとも２４時間かつ９６時間未満、好ましくは少なくとも４８時間、少なくとも６０時間かつ最大７２時間の、神経毒素ポリペプチドでの細胞の中毒化である。
神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌は、当該技術分野において既知の手段及び方法、例えば、磁気撹拌子、回転式スピナーフラスコ又は振盪器を用いて細胞を振盪させることによって、行われ得る。細胞の撹拌は、組織フラスコからの細胞の剥離を回避する、適切な細胞培養培地流動速度で行われる。培地の好適な平均流動速度は、例えば、約２５ｃｍ／分〜約３００ｃｍ／分である。
前述した細胞Ｋ+媒介型脱分極はまた、ＧＴ１ｂ及び神経毒素ポリペプチドの存在下で行われ得、続いて、神経毒素ポリペプチド曝露が、撹拌しながら、更なる期間、例えば、約２４時間、３６時間、４８時間、６０時間又は７２時間行われてもよい。
神経毒素ポリペプチドなしでのインキュベーションの時間が、神経毒素ポリペプチド曝露に先行することも想定される。例えば、神経毒素ポリペプチドなしでのインキュベーション時間は、約６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４又は６０時間、好ましくは約１６〜約４８時間であり得る。
本発明の方法の更に好ましい実施形態は、以下の実施例から誘導することができる。
本明細書で言及される「神経毒素ポリペプチド」又は簡略的に「神経毒素」若しくは「毒素」という用語は、クロストリジウム神経毒素、すなわち、クロストリジウム・ボツリナム神経毒素及びクロストリジウム・テタニ神経毒素、具体的にはボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）及び破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を指す。より具体的には、この用語は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ（Ｂａｒａｓｈ ａｎｄ Ａｒｎｏｎ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１４），２０９（２）：１８３〜１９１）及び破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）、並びにこれらのサブタイプを含む。例えば、ＢｏＮＴ／Ａのサブタイプには、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５が含まれる。ＢｏＮＴ／Ｂのサブタイプには、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ３、ＢｏＮＴ／Ｂ４、ＢｏＮＴ／Ｂ５、ＢｏＮＴ／Ｂ６、ＢｏＮＴ／Ｂ７及びＢｏＮＴ／Ｂ８が包含される。ＢｏＮＴ／Ｃのサブタイプには、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃｌ１及びＢｏＮＴ／Ｃｌ２が含まれる。ＢｏＮＴ／Ｄ−Ｃサブタイプもまた包含される。ＢｏＮＴ／Ｅのサブタイプには、ＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２、ＢｏＮＴ／Ｅ３、ＢｏＮＴ／Ｅ４、ＢｏＮＴ／Ｅ５、ＢｏＮＴ／Ｅ６、ＢｏＮＴ／Ｅ７、ＢｏＮＴ／Ｅ８及びＢｏＮＴ／Ｅ９が含まれる。更に、ＢｏＮＴ／Ｆのサブタイプには、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３、ＢｏＮＴ／Ｆ４、ＢｏＮＴ／Ｆ５、ＢｏＮＴ／Ｆ６及びＢｏＮＴ／Ｆ７が含まれる。更なるサブタイプは、例えば、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００７ Ｆｅｂ；１８９（３）：８１８〜３２．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｎｏｖ １７．）に記載されており、この開示の内容は、参照により本明細書に援用される。神経毒素ポリペプチド、特にその軽鎖及び重鎖は、上記のボツリヌス神経毒素又はサブタイプの抗原的に異なる血清型のうちのいずれか１つから誘導可能である。ある態様において、神経毒素ポリペプチドの軽鎖及び重鎖は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ又はＴｅＮＴからなる群から選択される神経毒素の軽鎖及び重鎖である。別の態様において、神経毒素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１（ＢｏＮＴ／Ａ）、配列番号３（ＢｏＮＴ／Ｂ）、配列番号５（ＢｏＮＴ／Ｃ１）、配列番号７（ＢｏＮＴ／Ｄ）、配列番号９（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１１（ＢｏＮＴ／Ｆ）、配列番号１３（ＢｏＮＴ／Ｇ）又は配列番号１５（ＴｅＮＴ）に示される核酸配列を含む。更に、ある態様において、配列番号２（ＢｏＮＴ／Ａ）、配列番号４（ＢｏＮＴ／Ｂ）、配列番号６（ＢｏＮＴ／Ｃ１）、配列番号８（ＢｏＮＴ／Ｄ）、配列番号１０（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１２（ＢｏＮＴ／Ｆ）、配列番号１４（ＢｏＮＴ／Ｇ）又は配列番号１６（ＴｅＮＴ）のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが包含される。更に、本発明の方法のある態様において、配列番号２（ＢｏＮＴ／Ａ）、配列番号４（ＢｏＮＴ／Ｂ）、配列番号６（ＢｏＮＴ／Ｃ１）、配列番号８（ＢｏＮＴ／Ｄ）、配列番号１０（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１２（ＢｏＮＴ／Ｆ）、配列番号１４（ＢｏＮＴ／Ｇ）及び配列番号１６（ＴｅＮＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、神経毒素ポリペプチドが包含される。また、例えばＤｏｖｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０９（２）：１９２〜２０２に示されている、最近説明されたＢｏＮＴ／Ｈの対応する核酸配列及びアミノ酸配列も包含される。
別の態様において、前述のポリヌクレオチドは、前述のポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体である。変異体は、前述のクロストリジウム神経毒素アイソフォーム又はサブタイプなど、天然の神経毒素ポリヌクレオチド又はポリペプチドであり得る。例えば、ボツリヌス神経毒素のそれぞれの血清型には、それらのアミノ酸配列及びこれらのタンパク質をコードする核酸も多少異なる、天然のボツリヌス神経毒素変異体が存在し得ることが、当業者に認識されている。
変異体はまた、非天然の神経毒素ポリペプチドであってもよい。本明細書に使用されるとき、クロストリジウム神経毒素の「非天然の変異体」という用語は、ヒトによる操作を用いて生成されたクロストリジウム神経毒素を意味し、遺伝子操作若しくは組み換え方法によって、例えば無作為な変異生成又は合理的設計を用いて生成されたクロストリジウム神経毒素、内部若しくは外部タンパク質分解酵素などの酵素の活性によって修飾されたクロストリジウム神経毒素の酵素修飾変異体、又は化学合成によって生成されたクロストリジウム神経毒素が含まれるがこれらに限定されない。「遺伝子操作」とは、クロストリジウム神経毒素をコードする遺伝子又はＤＮＡ若しくはｍＲＮＡなどのそれぞれの核酸を修飾することによって、任意の血清型／サブタイプの天然のクロストリジウム神経毒素を修飾するための、当該技術分野において既知の方法を指す。神経毒素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は神経毒素ポリペプチドの遺伝子操作のための組み換え方法は、当該技術分野において十分に説明されている；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。
更に、本明細書において言及される天然又は非天然の変異体ポリヌクレオチドは、別の態様では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３若しくは１５のいずれか１つに示される核酸配列又はＤｏｖｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０９（２）：１９２〜２０２に示されるＢｏＮＴ／Ｈの核酸配列に少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列変異体、あるいは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４若しくは１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又はＤｏｖｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０９（２）：１９２〜２０２に示されるＢｏＮＴ／Ｈのアミノ酸配列に少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列変異体を含むものとする。本明細書に使用される「同一」という用語は、２つの核酸配列間又は２つのアミノ酸配列間における同一なアミノ酸の数を決定することによって特徴付けられる配列同一性を指し、ここで、これらの配列は、最上位の一致が得られるようにアライメントされる。これは、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５，４０３）などのコンピュータプログラムにおいて体系化されている公開済みの技法又は方法を使用して計算することができる。同一性パーセントの値は、一態様において、例えば、神経毒素ポリペプチドの軽鎖若しくは重鎖又はその両方のアミノ酸配列全体にわたって、計算される。様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムは、当業者が異なる配列を比較するのに利用可能である。この文脈において、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、又はＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムにより、特に信頼性の高い結果が得られる。配列アライメントを行うために、ＰｉｌｅＵｐプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ １９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５，１５１）又はＧＣＧソフトウェアパケット（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ １９９１，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）の一部であるＧａｐ及びＢｅｓｔＦｉｔプログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ １９７０，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８；４４３；Ｓｍｉｔｈ １９８１，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ ２，４８２）を使用することができる。上述の配列同一性の値は、本発明の別の態様において、ＧＡＰプログラムを次の設定：ギャップ重み：５０、長さ重み：３、平均一致：１０．０００及び平均不一致：０．０００で配列領域全体にわたって使用して、パーセント（％）で決定されるが、これらの設定は、別途示されない限り、配列アライメントの標準設定として常に使用するものとする。ある態様では、前述の変異体ポリヌクレオチドのそれぞれは、それぞれの神経毒素ポリペプチド、すなわち、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ又は破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）の本明細書に定義される生物学的特性のうちの１つ以上を保持し、別の態様ではそのすべてを保持する、ポリペプチドをコードする。プロセシングされていない前駆体はいくらかの生物学的機能を発揮し得るか、又は部分的に活性であり得ることが想定できるとはいっても、完全な生物学的活性は、タンパク質分解活性化の後にのみ維持されることを、当業者であれば理解するであろう。クロストリジウム神経毒素の生物学的活性を評価するためのインビボアッセイには、マウス５０％致死量アッセイ並びにＰｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｅａｒｃｅ １９９４，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２８：６９〜７７）及びＤｒｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ ２００５，Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．２０：１６１７〜１６１９，Ｋｅｌｌｅｒ ２００６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３９：６２９〜６３７）によって説明されているエキソビボマウス片側横隔膜アッセイが含まれる。生物学的活性は、一般に、マウス単位（ＭＵ）で表現される。本明細書に使用されるとき、１ＭＵは、腹腔内注射の後に、指定されたマウス集団の５０％を殺滅させる神経毒素成分の量、すなわち、マウス腹腔内５０％致死量である。更なる態様において、変異体ポリヌクレオチドは、改善又は改変された生物学的特性を有する神経毒素をコードし得、例えば、それらは、酵素認識が改善された切断部位を含み得る、及び／又は受容体結合、内部移行、エンドソーム膜を越えてサイトゾル内への移行若しくはＳＮＡＲＥタンパク質ファミリーの対応する基質の内部タンパク質分解切断（endoproteolytic cleavage）が改善され得る。
非天然のクロストリジウム神経毒素変異体の非限定的な例としては、保存的クロストリジウム神経毒素変異体が挙げられる。本明細書に使用されるとき、「保存的クロストリジウム神経毒素変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸が、本明細書の他の箇所に記載される基準クロストリジウム神経毒素配列、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４若しくは１６又はＤｏｖｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０９（２）：１９２〜２０２に示されるＢｏＮＴ／Ｈのアミノ酸配列に由来する元のアミノ酸のものに類似の少なくとも１つの特性を有する別のアミノ酸又はアミノ酸類似体によって置換されている、クロストリジウム神経毒素を意味する。この変異体は、基準配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。変異体は、基準クロストリジウム神経毒素配列と同等又はそれよりも改善された特性を有するであろう。特性の例としては、類似の寸法、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能力、水素結合能力、物理化学特性など又はこれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、特性は、本明細書の他の箇所に定義される生物学的特性、すなわち、（ａ）受容体結合、（ｂ）内部移行、（ｃ）エンドソーム膜を越えてサイトゾル内への移行及び／又は（ｄ）シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質の内部タンパク質分解切断である。保存的クロストリジウム神経毒素変異体は、保存的クロストリジウム神経毒素変異体の基礎となる基準クロストリジウム神経毒素と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明の任意の態様において、基準クロストリジウム神経毒素の代わりに用いられる。本明細書に記載されるクロストリジウム神経毒素は、典型的に、天然のアミノ酸残基を含有するが、一部の事例においては、非天然のアミノ酸残基もまた存在してもよい。したがって、特定のアミノ酸又はペプチドの構造を模倣する非アミノ酸化学構造体を含み得るいわゆる「ペプチド模倣体」及び「ペプチド類似体」もまた、本発明の文脈内で使用され得る。そのような模倣体又は類似体は、一般に、類似した物理的特徴、例えば寸法、電荷又は疎水性並びにそれらの天然のペプチド対応物において見られる適切な空間配向を呈するとして特徴付けられる。ペプチド模倣体化合物の具体的な例は、アミノ酸のうちの１つ以上の間のアミド結合が、当該技術分野において周知のように、例えば、炭素−炭素結合又は他の非アミド結合で置き換えられた化合物である；例えば、Ｓａｗｙｅｒ，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｐ．３７８〜４２２，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．１９９５を参照されたい。
本明細書に使用される神経毒素ポリペプチド変異体は、更に、化学的に修飾された神経毒素ポリペプチドを包含する。本明細書に使用される「化学修飾」とは、一般に、任意の血清型又はサブタイプの天然又は組み換えのクロストリジウム神経毒素を、化学反応などの手段によって修飾するための当該技術分野において既知の方法を指し、これは、特に、クロストリジウム神経毒素のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は翻訳後修飾を指す。化学的に修飾された神経毒素ポリペプチドは、ピルビン酸化（pyruvation）、リン酸化、硫酸化（sulfatation）、脂質化、ペグ化、グリコシル化及び／又はアミノ酸若しくは例えば約２〜約５００個のアミノ酸を含むポリペプチドの化学付加によって修飾されたものであってもよい。例えば、ヒアルロン酸又はポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール又はこれらの混合物を神経毒素ポリペプチドに組み込むことによって、クロストリジウム神経毒素又は化学修飾若しくは遺伝子操作によってクロストリジウム毒素から誘導された毒素を、安定化することができる。
本発明の方法において使用することができるクロストリジウム神経毒素の別の非天然の変異体は、ハイブリッドクロストリジウム神経毒素である。一態様において、ハイブリッドクロストリジウム神経毒素は、クロストリジウム神経毒素の重鎖及び軽鎖の組み合せを含み、ここで、軽鎖及び重鎖は、同じ血清型又はサブタイプのものではない。
そのような化学的、酵素的又は遺伝子的に修飾された、クロストリジウム神経毒素の変異体を作製する方法、並びにそのような変異体が、本明細書において言及される（ａ）受容体結合、（ｂ）内部移行、（ｃ）エンドソーム膜を越えてサイトゾル内への移行及び／又は（ｄ）シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質の内部タンパク質分解切断などの生物学的特性を維持するかどうかを特定するための方法は、当業者に周知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（同書）を参照されたい。
本明細書に使用される「神経毒素ポリペプチドの生物学的活性」という用語は、神経毒素ポリペプチドに特徴的な生物学的特性、すなわち、（ａ）受容体結合、（ｂ）内部移行、（ｃ）エンドソーム膜を越えてサイトゾル内への移行及び／又は（ｄ）シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質の内部タンパク質分解切断を意味する。本明細書に使用される神経毒素ポリペプチドは、上述の特性ａ）〜ｄ）のうちの少なくとも１つ、好ましくは、シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質の内部タンパク質分解切断、又はａ）〜ｄ）に列挙された２つ又は３つ又は４つすべての生物学的特性を呈することが、想定される。神経毒素ポリペプチドの生物学的特性を決定するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、更に、本明細書の他の箇所にも記載されている；例えば、Ｐｅｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４０４，３８８〜３９２；Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２６，４２６〜３５を参照されたい。
ＳＮＡＰ−２５は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１及びＢｏＮＴ／Ｅの既知の基質であり、これらによって切断される。ＶＡＭＰ／シナプトブレビンは、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＴｅＮＴの基質であり、これらによって切断され、一方でシンタキシンは、ＢｏＮＴ／Ｃ１の基質であり、これによって切断される。前述の基質並びに対応する核酸及びアミノ酸の配列は、当該技術分野において周知である；例えば、国際公開第２０１４／２０７１０９号を参照されたい。
本明細書に使用されるとき、「細胞」という用語は、例えばＢｏＮＴ／Ａなどの神経毒素による神経毒素中毒を受けやすい任意の真核生物細胞又は神経毒素を取り込むことができる任意の真核生物細胞を指す。本開示の態様は、部分的に、樹立細胞系に由来する細胞を含む。「細胞」という用語は、様々な生物、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、アカゲザル、霊長類及びヒト細胞に由来する細胞、様々な細胞種、例えば、神経細胞及び非神経細胞に由来する細胞を包含し、異種細胞集団、組織又は生物から単離され得るか、又はその一部であり得る。本明細書に使用されるとき、「樹立細胞系」という用語は、「不死細胞系」又は「形質転換細胞系」と同義であり、ある生物、組織、又は器官源に由来する細胞集団から無限の増殖（indefinite propagation）のために選択された細胞の細胞培養物を指す。定義として、樹立細胞系は、初代細胞の細胞培養物は除外する。本明細書に使用されるとき、「初代細胞」とは、新たな組織又は器官から直接採取した細胞であり、無限に増殖する能力は有さない。例えば、初代神経細胞を、本発明の方法において使用することができる。樹立細胞系は、異種細胞集団又は一様な細胞集団を含み得る。単一の細胞に由来する樹立細胞系は、クローン細胞系と称される。樹立細胞系は、ＢｏＮＴ／Ａなどの神経毒素がＳＮＡＰ−２５などの基質をタンパク質分解切断する（proteolytically cleave）全体的な細胞機序を細胞が経るのに必要なすべての構成要素を細胞が内在的に発現するものであり得、この機序には、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ａ受容体との結合など、神経毒素と神経毒素受容体との結合、神経毒素／受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質内への神経毒素軽鎖の移行及び神経毒素基質のタンパク質分解切断が包含される。あるいは、樹立細胞系は、その細胞に、ＢｏＮＴ／Ａなどの神経毒素がＳＮＡＰ−２５などの基質をタンパク質分解切断する全体的な細胞機序を細胞が経るのに必要な少なくとも１つの構成要素が、外因性源から導入されているものであってもよく、この機序には、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ａ受容体との結合など、神経毒素と受容体との結合、神経毒素／受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質内への神経毒素軽鎖の移行及び神経毒素基質のタンパク質分解切断が包含される。遺伝子操作された細胞系とも称される、そのような樹立細胞系に由来する細胞は、例えば、外因性ＦＧＦＲ２、外因性ＦＧＦＲ３、外因性ＳＶ２、ＳＮＡＰ−２５などの外因性神経毒素基質又はこれらの組み合せを発現し得る。
本明細書に使用される「細胞培養」は、広義として、動物又はヒトから細胞を取り出すこと、並びに好適な人工環境におけるそれらのその後の増殖を指す。細胞は、組織から直接取り出し、培養の前に酵素的若しくは機械的手段によって脱凝集させてもよく、又は細胞は、既に樹立されている細胞系若しくは細胞株から誘導してもよい。初代培養物は、細胞を組織から単離し、適切な条件下において、利用可能な基質のすべてを占有するまで、すなわち、コンフルエンスに達するまで増殖させた後の培養物の段階を指す。この段階において、細胞は、継代培養、すなわち、増殖を継続するためにより多くの空間を提供するようにそれらを新たな増殖培地とともに新たな容器に移すことによって継代させる必要がある。正常な細胞は、通常、増殖能力を失うまでに限られた回数しか分裂せず、これは、老化として知られている遺伝的に決定されている事象であり、これらの細胞系は、有限として知られている。しかしながら、一部の細胞系は、形質転換と称される過程を通じて不死となり、これは、自発的に起こり得るか、又は化学的若しくはウイルスにより誘発され得る。有限細胞系（finite cell line）が形質転換を受け、無限に分裂する能力を獲得すると、それは、連続細胞系（continuous cell line）となる。培養条件は、各細胞種で広範に変動するが、細胞が培養される人工環境は、常に、次のものを含む好適な容器からなる：必須の栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン類、ミネラル類）、増殖因子、ホルモン、ガス（Ｏ2、ＣＯ2）、制御された物理化学的環境（ｐＨ、浸透圧、温度）などを提供する基質又は培地。ほとんどの細胞は、足場依存性（anchorage-dependent）であり、固体又は半固体の基質に付着した状態で培養しなければならないが（付着培養若しくは単層培養）、その他の細胞は、培養培地中に浮遊した状態で増殖させることができる（懸濁培養）。
本明細書に示される「神経毒素中毒を受けやすい細胞」という用語は、神経毒素ポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）が神経毒素基質（例えば、ＢｏＮＴ／Ａの基質ＳＮＡＰ−２５）を切断する全体的な細胞機序を経ることができる細胞を意味し、この機序は、神経毒素ポリペプチドとその対応する受容体との結合（例えば、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ａ受容体との結合）、神経毒素／受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質内への神経毒素軽鎖の移行及び神経毒素基質のタンパク質分解切断を包含する。したがって、本明細書に使用される「神経毒素中毒を受けやすい細胞」は、神経毒素感受性細胞を意味する。前述の用語は、細胞又は細胞系、例えば、単離された初代細胞若しくはその細胞系又は樹立細胞系の細胞若しくは樹立細胞系、例えば、本明細書の他の箇所に定義される、神経芽腫細胞又は神経芽腫細胞系など神経細胞に分化することができる腫瘍細胞又は腫瘍細胞系を含む。例えば、神経芽腫細胞系は、ＤＳＭＺ（ＡＣＣ １６４）から市販されているＳｉＭａ細胞系であり得る。細胞系ＳｉＭａの特定のクローンは、更に、国際公開第２０１０／１０５２３４号に開示されている。本発明の方法において使用することができる他の神経芽腫細胞系は、ＡＴＣＣ又はＤＳＭＺから、次のＡＴＣＣ又はＤＳＭＺ番号で入手することができる：ＣＲＬ−２２６３で細胞系Ｎ１Ｅ−１１５、ＣＣＬ−１３１で細胞系Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＣＲＬ−２２６６で細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＣＲＬ−１７２１で細胞系ＰＣ１２、ＡＣＣ １５７（ＤＳＭＺ）で細胞系ＭＨＨ−ＮＢ−１１及びＣＲＬ−２２７１で細胞系ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）。神経毒素中毒を受けやすい他の腫瘍細胞は、Ｐ−１９細胞（マウス胚性癌腫細胞系）（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ ３１６）である。一部の態様において、例えば、活性アッセイのために、これらの細胞を神経細胞に分化させることが必要な場合がある。そのような分化方法は、文献において十分に説明されている。神経毒素中毒を受けやすい細胞には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来のニューロン、好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来のニューロンが、更に包含される；例えば、Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）（同書）を参照されたい。そのようなヒトｉＰＳ由来のニューロンはまた、例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓから市販されている。ｉＰＳ細胞を生成する方法は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９ Ｍａｙ ８；３２４（５９２８）：７９７〜８０１．Ｅｐｕｂ ２００９）、国際公開第２０１１／０５６９７１号及び国際公開第２０１１／０２５８５２号に記載されている。一部の態様において、好適な方法、例えば、国際公開第２０１２／１３５６２１号並びに米国特許出願第２０１０／０２７９４０３号及び同第２０１０／０２１６１８１号に記載されるものを用いて、ｉＰＳをニューロンに分化させる。
本明細書に使用される「分化」、「分化すること」又は「分化した」という用語は、特化していないか又は比較的特化していない細胞が、比較的特化した状態となる過程を指す。細胞の個体発生の文脈において、「分化した」という形容詞は、相対的な用語である。したがって、「分化した細胞」とは、ある特定の発達経路を、比較されている細胞よりも先に進んでいる細胞である。分化した細胞は、例えば、最終分化した細胞、すなわち、生物の様々な組織及び器官における特化した機能を行う完全に特化した細胞であってもよく、これは、有糸分裂後であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。例えば、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ニューロンは、ヒトｉＰＳ細胞から最終分化しており、神経細胞の特徴及び機能を呈する。別の実施例では、分化した細胞はまた、分化系統内における前駆細胞であってもよく、この前駆細胞は、更に増殖及び／又は分化することができる。同様に、細胞は、ある特定の発達経路を、比較されている細胞よりも先に進んでいる場合に、「比較的より特化している」ことになる。このため、ここで、比較されている細胞は、「特化していない」又は「比較的特化していない」と見なされる。比較的より特化している細胞は、１つ以上の確認できる表現型の特徴、例えば、特定の細胞成分若しくは生成物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、特定の細胞マーカー若しくは他の基質の存在、不在若しくは発現レベル、ある特定の生化学的経路の活性、形態学的外観、増殖能力及び／若しくは動態、分化能並びに／又は分化シグナルに対する応答などが、特化していないか又は比較的特化していない細胞とは異なり得、ここで、そのような特徴は、比較的より特化した細胞が、前述の発達経路を先に進んでいることを示す。細胞を神経細胞に分化させるための細胞培養条件は、本明細書に引用されている文献から明らかなように、当該技術分野において周知である。
更に、神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートするための細胞培養条件は、当該技術分野において十分に説明されており、本明細書に引用される刊行物から導くこともできる。
本明細書に使用される「神経毒素ポリペプチドの特異的取り込み」という用語は、神経毒素ポリペプチドが、その特異的神経細胞膜受容体、例えば、ＢｏＮＴ／ＢについてはＳＶ２、ガングリオシド、ＧＤ１ａ、シナプトタグミンＩＩ又はＢｏＮＴ／Ｄ／−ＣについてはシナプトタグミンＩに結合し、エンドソーム様コンパートメントに取り込まれ、ｐＨ依存性の移行過程を介してエンドソーム膜に浸透することによって、ニューロンに進入する過程を意味する。したがって、上述の用語は、ａ）神経毒素ポリペプチドの受容体結合、（ｂ）神経毒素ポリペプチドの内部移行、及び（ｃ）エンドソーム膜を越えてサイトゾル内への神経毒素ポリペプチドの移行を包含する。当業者に理解されるように、神経毒素感受性細胞は、好ましくは、まず神経毒素を取り込み、次いで上記に列挙された全体的な細胞機序を経る。本明細書に示される「神経毒素ポリペプチドの特異的でない取り込み又は非特異的取り込み」という表現は、神経毒素ポリペプチド又はその分解産物が、特異的でない神経細胞膜受容体への結合によって、又は非特異的機序により細胞内に進入することによって、例えば、ピノサイトーシス事象における偶発的な共輸送によって、ニューロン内に進入する過程を意味する。本明細書に使用される神経毒素感受性細胞は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ピコモル（ｐＭ）、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約９ｐＭ、約８ｐＭ、約７ｐＭ、約６ｐＭ、約５ｐＭ、約４ｐＭ、約３ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約０．５ｐＭ若しくは約０．１ｐＭ又は示された値のうちの１つよりも少ない神経毒素ポリペプチドを取り込み得る。１００ｐＭを上回るＥＣ５０値が、文献において報告されている。定義として、神経毒素中毒を受けやすい細胞は、少なくとも１つの神経毒素受容体及び少なくとも１つの神経毒素基質を発現するか、又は発現するように操作されていなければならない。神経毒素の受容体及び基質は、当該技術分野において説明されており、本明細書の他の箇所に記載されている。したがって、この細胞は、好ましくは、本明細書に定義される生物学的に活性又は成熟した神経毒素ポリペプチドの影響を受けやすい。好ましくは、本明細書に使用される神経毒素感受性細胞は、例えば、約１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．９ｐＭ以下、約０．８ｐＭ以下、約０．７ｐＭ以下、約０．６ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．４ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下又は更には約０．１ｐＭ以下で神経毒素中毒を受けやすい。当該技術分野において既知のように、「半数効果濃度（half maximal effective concentration、ＥＣ５０）」は、ある程度の指定曝露時間の後に、ベースラインと最大値との中間の応答を誘発する薬物、抗体又は毒性物質の濃度を指す。これは、薬物の効力の尺度として広く使用されている。段階的な用量反応曲線のＥＣ５０は、したがって、その最大の効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。量的な用量反応曲線のＥＣ５０は、曝露期間の後に、集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。神経毒素中毒を受けやすい及び／又は神経毒素の取り込み能力を有する細胞又は細胞系、すなわち、本明細書に定義される神経毒素感受性細胞を特定するための方法は、当該技術分野において既知である；例えば、米国出願第２０１２／０１２２１２８号（Ａ１）を参照されたい。神経毒素ポリペプチドの生物学的活性は、ある態様において、前述の生物学的特性のすべてに起因して生じる。神経毒素の生物学的活性の決定に使用することができる、神経毒素に対して十分に高い感受性を有する細胞に基づくアッセイは、本明細書の他の箇所に示されるように、これまでにごくわずかしか先行技術において説明されていない。
本明細書に用いられる「強化する」という用語は、細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間及び（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌を使用しないクロストリジウム神経毒素中毒と比較して、改善されるか又は増加されることを意味する。細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みは、好ましくは、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間及び（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌を含まない細胞培養条件を使用する方法と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は更には少なくとも１０倍増加する。一般に、当該技術分野において説明されている方法は、最終濃度約５ｍＭのＫ+、約７２時間の神経毒素ポリペプチド曝露時間を使用し、細胞の撹拌は行わない。上述の手段（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）は、細胞内への神経毒素の特異的取り込みを改善するだけでなく、細胞内への示された神経毒素又はその分解産物の非特異的取り込みの低減ももたらすことが、本発明者らによって発見された。細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的でない取り込みは、好ましくは、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌を含まない細胞培養条件を使用する方法と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は更には少なくとも１０倍低減される。細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的又は非特異的取り込みを測定するための手段及び方法は、文献中及び本明細書に十分に記載されており、以下の実施例において更に示される。例えば、神経細胞培養物におけるＳＮＡＰ−２５タンパク質分解に対するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ及びＢｏＮＴ／Ｅ神経毒素曝露の効果は、神経毒素移行の指標として使用することができる。同じことが、神経細胞におけるシンタキシンタンパク質分解に対するＢｏＮＴ／Ｃ神経毒素曝露並びにＶＡＭＰタンパク質分解に対するＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｄ及びＢｏＮＴ／Ｇ神経毒素曝露にも当てはまる。
本発明の方法の更なる態様において、本発明の前述の方法に続いて、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性の決定を行う。
以下の実施例に示されるように、細胞に基づく効力アッセイは、有利なことに、細胞内へのクロストリジウム神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを、細胞のＫ+媒介型脱分極、短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間及び／又は神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌を用いて増加させることによって、改善され得る。同時に、細胞内へのこの示された神経毒素又はその分解産物の非特異的取り込みの減少が、観察され得る。
軽鎖アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｅｎｄｏｐｅｐ−ＭＳ、ＦＲＥＴ、ＨＰＬＣ−ＵＰＬＣ、ＤＡＲＥＴあるいは、例えばＳＨ−ＳＹ５Ｙ若しくはＮｅｕｒｏ２ａ細胞、胚性ニワトリニューロン、脊髄若しくは後根神経節由来の初代ニューロン（Ｐｅｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４０４，３８８〜３９２）、ウエスタンブロットの読み取り値に基づく胚性幹細胞由来のニューロン（Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２６，４２６−３５）又は分化したヒト神経芽腫ＳｉＭａ細胞を使用した、細胞に基づくアッセイなど、神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するためのいくつかのアッセイが、当該技術分野において説明されている；例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２）．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（１１）を参照されたい。
第２の態様において、本発明は、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を直接決定するための方法であって、
ａ）神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることであって、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含むことと、
ｂ）細胞を固定し、任意選択で、界面活性剤を用いて細胞を透過性にすることと、
ｃ）細胞を、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する少なくとも１つの第１の捕捉抗体並びに神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉抗体と、捕捉抗体と基質との結合を可能にする条件下で接触させることと、
ｄ）細胞を、第１の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第１の検出抗体と、第１の検出抗体と第１の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第１の検出複合体を形成すること、及び第２の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第２の検出抗体と、第２の検出抗体と第２の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第２の検出複合体を形成することと、
ｅ）工程ｄ）の第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、
ｆ）細胞中の神経毒素ポリペプチドによって切断された基質の量を、第２の検出複合体を用いて計算し、それによって、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定することと、を含む、方法を提供する。
ａ）神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることであって、インキュベーションが、（ｉ）細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌工程のうちの少なくとも１つを含むことと、
ｂ）細胞を固定し、任意選択で、界面活性剤を用いて細胞を透過性にすることと、
ｃ）細胞を、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する少なくとも１つの第１の捕捉抗体並びに神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉抗体と、捕捉抗体と基質との結合を可能にする条件下で接触させることと、
ｄ）細胞を、第１の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第１の検出抗体と、第１の検出抗体と第１の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第１の検出複合体を形成すること、及び第２の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第２の検出抗体と、第２の検出抗体と第２の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第２の検出複合体を形成することと、
ｅ）工程ｄ）の第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、
ｆ）細胞中の神経毒素ポリペプチドによって切断された基質の量を、第２の検出複合体を用いて計算し、それによって、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定することと、を含む、方法を提供する。
好ましくは、本方法は、インビトロ法である。本発明のこの方法は、細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性の直接的な決定を可能にする。これは、当該技術分野において説明されている方法にあるような、細胞の溶解、並びに切断された神経毒素基質の細胞溶解物からの単離又は濃縮が、もはや必要ではないことを意味する。例えば、当該技術分野のウエスタンブロット分析に基づくアッセイでは、神経毒素基質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおけるそれぞれの試料の成分を分離及び濃縮によって、濃縮される。当該技術分野において説明されているＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡでは、神経毒素基質の濃縮は、細胞溶解物を添加したマイクロタイタープレートにおいて切断された神経毒素基質に特異的に結合する抗体を使用して行われる。切断された神経毒素基質は、前述の抗体との結合によって溶解物から単離され、これにより、切断されたクロストリジウム神経毒素基質の濃縮物が得られる。
対照的に、切断された神経毒素基質、例えば、ＳＮＡＰ−２５は、本発明の方法では、細胞において直接的に検出することができる。そのため、本明細書の他の箇所により詳細に定義される神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートする。インキュベーションは、本明細書の他の箇所に記載されるように、細胞のＫ+媒介型脱分極、短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間及び／又は神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌を含む。これらの手段により、神経毒素の特異的な細胞内取り込みを強化し、同時に、細胞内への神経毒素又はその分解産物の非特異的取り込みを低減させる。次の工程において、細胞を、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒドなどの固定剤又は示された固定剤の混合物の添加によって、固定する。任意選択で、細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、サポニン、ジギトニン又はｎ−オクチル−β−グルコピラノシドといった少なくとも１つの界面活性剤を使用することによって透過性にしてもよい。界面活性剤は、ＰＢＳなどの適切な緩衝液中に含まれていてもよい。続いて、細胞を、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する少なくとも１つの第１の捕捉抗体、並びに神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉抗体と、捕捉抗体と基質との結合を可能にする条件下で接触させる。本明細書において、第１の捕捉抗体は、未切断基質及び神経毒素により切断された神経毒素基質の両方に存在する適切なエピトープに特異的に結合することによって、細胞中の神経毒素基質の全含量又は量を決定することができる。第２の捕捉抗体は、例えば、神経毒素基質における神経毒素により切断された部位に特異的に結合することによって、切断された神経毒素基質にのみ存在するエピトープを認識し、それに特異的に結合する。あるいは、細胞を、これらの第１及び第２の捕捉抗体の混合物と接触させてもよい、すなわち、細胞を、上述の条件下で、少なくとも１つの第１の捕捉抗体及び少なくとも１つの第２の捕捉抗体と同時に接触させる。次の工程において、細胞を、第１の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第１の検出抗体と、第１の検出抗体と第１の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第１の検出複合体を形成する。続く工程において、細胞を、第２の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第２の検出抗体と、第２の検出抗体と第２の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第２の検出複合体を形成する。あるいは、細胞を、これらの第１及び第２の検出抗体の混合物と接触させてもよい、すなわち、細胞を、上述の条件下で、少なくとも１つの第１の検出抗体及び少なくとも１つの第２の検出抗体と同時に接触させる。あるいは、細胞を透過性にした後に、それらを、前述の条件下で、第１及び第２の捕捉抗体と第１及び第２の検出抗体との混合物と同時に接触させてもよい。次の工程において、第１及び第２の検出複合体の量を決定する。最後に、細胞中の神経毒素ポリペプチドによって切断された基質の量を、第２の検出複合体を用いて計算する。それによって、神経毒素ポリペプチドの生物学的活性が、細胞において直接決定される。
以下において、本発明の方法をより詳細に説明する。細胞培養のために、神経細胞、ＳｉＭａ細胞又はｉＰＳ由来のニューロンなど、本明細書に定義される神経毒素中毒を受けやすい細胞を、まず、９６ウェルのマイクロタイタープレートに播種する。ＳｉＭａ細胞を、例えば、国際公開第２０１０／１０５２３４号に開示されている手順に従って神経細胞表現型に分化させ、ｉＰＳ由来のニューロンを、例えば、国際公開第２０１２／１３５６２１号に記載されるアッセイに従って神経細胞表現型に分化させる。次いで、これらの細胞を、ＢｏＮＴ／Ａなどの神経毒素ポリペプチドとともに、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートする。インキュベーションは、本明細書の他の箇所に記載されるように、細胞のＫ+媒介型脱分極、短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間、及び／又は神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌を含む。
続く工程において、細胞を、ＥＬＩＳＡアッセイの前にマイクロタイタープレートに固定する。細胞を固定するために、例えば、氷冷メタノール（−２０℃）を、−２０℃で２０分間、細胞に添加してもよい。
ＥＬＩＳＡアッセイを行うために、細胞をまず洗浄する。洗浄緩衝液として、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用してもよい。その後で、内在性プロテアーゼを、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．６％Ｈ2Ｏ2などのクエンチ緩衝液によってクエンチし、続いてもう１回洗浄工程を行う。続く工程では、マイクロタイタープレートにおける未結合の結合部位を、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の２％ＢＳＡなどの適切なブロッキング緩衝液でブロッキングする。次いで、適切な界面活性剤を用いて細胞を透過性にする。透過化緩衝液として、例えば１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いてもよい。透過化は、細胞に形成された孔を通じた抗体の拡散を可能にする。続いて、細胞を、上述のように洗浄緩衝液で洗浄する。
次の工程において、透過性にした細胞を、例えば、２つの異なる抗体の混合物とともにインキュベートする。この混合物は、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する第１の捕捉抗体と、神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する第２の捕捉抗体とを含む。第１及び第２の捕捉抗体はまた、続けて適用されてもよい。例えば、第１の捕捉抗体は、未切断ＳＮＡＰ−２５及び神経毒素により切断されたＳＮＡＰ−２５の両方に特異的に結合することができ、それによって、細胞中のＳＮＡＰ−２５の全量又は含量の定量を可能にする。更に、この第１の捕捉抗体を、評価の際に、細胞中の切断されたＳＮＡＰ−２５の量の正規化に使用することができる。第２の捕捉抗体は、神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合し、したがって、ＢｏＮＴ／Ａにより切断されたＳＮＡＰ−２５など、切断された神経毒素基質の決定及び検出が可能となる。
本発明の方法における、続いての全神経毒素基質及び神経毒素により切断された神経毒素基質の検出は、マイクロタイタープレート又は細胞培養皿で、すなわち、細胞内で直接的に行うことができる。そのため、有利なことに、本発明の方法では、当該技術分野において説明されている方法のように細胞抽出物を調製すること、並びに細胞溶解物から神経毒素基質を単離及び／又は濃縮することが必要ない。続いて、それぞれの抗原に結合していない余分な抗体を除去するために、細胞を洗浄する。続く工程において、透過性となった細胞を、少なくとも１つの第１の検出抗体及び少なくとも１つの第２の検出抗体と接触させる。これらの抗体は、混合物として、すなわち同時に、又は続けて適用されてもよい。第１の検出抗体は、第１の捕捉抗体に特異的に結合する。それによって、第１の検出複合体が形成される。第１の検出抗体は、第１の捕捉抗体が由来する種を対象とし得る。例えば、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ）を、未切断基質ＳＮＡＰ−２５及びＢｏＮＴ／Ａにより切断された基質ＳＮＡＰ−２５に特異的に結合する第１の捕捉抗体として使用する場合、抗ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を、第１の検出抗体として使用することができる。第２の検出抗体は、第２の捕捉抗体に特異的に結合する。それによって、第２の検出複合体が形成される。第２の検出抗体は、第２の捕捉抗体が由来する種を対象とし得る。例えば、国際公開第２０１４／２０７１０９号に記載されるマウスモノクローナル（ｍＡｂ）２０−２−５を、ＢｏＮＴ／Ａにより切断されたＳＮＡＰ−２５に特異的に結合する第２の捕捉抗体として使用する場合、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体を、第２の検出抗体として使用することができる。第１の検出抗体及び第２の検出抗体が、本発明の方法に使用されるそれぞれの第１及び第２の捕捉抗体の特異的検出を可能にするために、異なる酵素とコンジュゲートされることは、当業者には明らかである。例えば、本明細書の他の箇所に記載されるＨＲＰに基づく検出は、ＢｏＮＴ／Ａにより切断されたＳＮＡＰ−２５に使用することができ、アルカリホスファターゼに基づく検出は、全（ＢｏＮＴ／Ａにより切断された及び未切断の）ＳＮＡＰ−２５に使用することができる。続いて、細胞を再度洗浄する。続く工程において、蛍光性ＨＲＰ基質を、細胞に添加する。ＨＲＰ基質として、例えば、Ａｍｐｌｅｘ ＵｌｔｒａＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することができ、これは、５４０ｎｍで励起され、６００ｎｍで放出する。ＨＲＰ基質とのインキュベーションは、西洋ワサビペルオキシダーゼにより基質が十分に変換されるのに十分な時間、行われる。ＨＲＰ基質とのインキュベーションに続いて、例えば、ＡＰ基質ＤｉＦＭＵＰ（６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート、励起３６０ｎｍ、放出４５０ｎｍ）を、ＨＲＰ基質に添加してもよく、細胞を、これら２つの基質の混合物とともにインキュベートする。このＡＰ基質とのインキュベーションは、アルカリホスファターゼによる基質の十分な変換を可能にする時間、行われる。当該技術分野において既知のように、基質は、検出限界の定義に従って、測定されるシグナルが、ブランクの平均値に加えて平均値の３標準偏差と少なくとも同程度の高さになるように十分な量で変換される必要がある。検出限界は、文献に記載のように決定することができる；例えば、Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｐｒｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００８，２９（付録１）：Ｓ４９〜Ｓ５２を参照されたい。アルカリホスファターゼの最適なｐＨは、アルカリ性の領域にあるため、対応する基質緩衝液は、強アルカリ性である。アルカリホスファターゼ基質をＨＲＰ基質に添加すると、西洋ワサビペルオキシダーゼの反応が、アルカリ性ｐＨによって停止され、アルカリホスファターゼがＤｉＦＭＵＰを変換する。変換されたＨＲＰ基質は、アルカリ性ｐＨによる影響を受けない。最後に、２つの基質の蛍光を、次のように測定する：
Ａｍｐｌｅｘ ＵｌｔｒａＲｅｄ：励起５４０ｎｍ、放出６００ｎｍ
ＤｉＦＭＵＰ：励起３６０ｎｍ、放出４５０ｎｍ
Ａｍｐｌｅｘ ＵｌｔｒａＲｅｄ：励起５４０ｎｍ、放出６００ｎｍ
ＤｉＦＭＵＰ：励起３６０ｎｍ、放出４５０ｎｍ
当業者には理解されるように、これらの蛍光性基質のみが、使用される基質の励起／放出波長が異なる本発明の方法における第１及び第２の捕捉抗体の検出に適している。この場合にのみ、各抗体、すなわち、全神経毒素基質（未切断ＳＮＡＰ−２５及び神経毒素により切断されたＳＮＡＰ−２５など）並びに切断された神経毒素基質（神経毒素により切断されたＳＮＡＰ−２５など）の特異的な検出が可能となる。これによって、各ウェル又は細胞培養皿において同時に神経毒素基質の全含量及び切断された神経毒素基質の含量を定量することが可能となる。これを踏まえると、有利なことに、本発明の方法を自動化することが可能である。本発明の他の箇所に記載されるように、本発明の方法に選択される蛍光性基質は、それぞれの基質の特異的な検出を可能にするために、励起／放出スペクトル間の十分なシフトを呈することが想定される。この要件は、例えば、ＨＲＰ基質Ａｍｐｌｅｘ及びその誘導体並びにＡＰ基質ＤｉＦＭＵＰに関して満たされる。最適な事例では、使用される蛍光性基質の励起／放出スペクトル間に重複は存在しないが、使用される蛍光性基質の励起スペクトルのピーク領域の最大３０％の重複が、耐容できることが経験されている。本発明の方法に関する更なる詳細は、例えば、国際公開第２０１４／２０７１０９に記載されている。
当業者によって更に理解されるように、本発明の方法は、細胞中の神経毒素ポリペプチドによって切断された神経毒素基質を直接検出及び定量し、それによって細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定することを可能にする。有利なことに、本発明の方法は、当該技術分野において既知の方法に必要とされる、細胞溶解物又は抽出物の調製並びに細胞溶解物／抽出物からの切断された神経毒素基質の単離又は濃縮を必要としない。その結果として、試料材料を削減することができる。更に、本発明の方法により、試料中の全神経毒素基質の量及び切断された神経毒素基質の量を同時に決定することができるため、試料調製及び試料の数を低減することができる。当該技術分野において説明されているアッセイでは、試料は、両方の抗原、すなわち、全神経毒素基質及び切断された神経毒素基質を互いに別個に検出するために、再分割する必要がある。本発明の方法により、試料の再分割は不必要になる。それによって、試料の再分割により生じる不均質性を回避することができ、試料材料を削減することができる。更に、抗原は、当該技術分野において説明されているアッセイでは、分解される可能性があり、これにより、切断された神経毒素基質の偽検出が生じ得る。これは、当該技術分野において説明されているアッセイでは、細胞を界面活性剤含有細胞溶解緩衝液とともにインキュベートするが、この緩衝液は神経毒素ポリペプチド又は他の内在性プロテアーゼを不活性化することはできず、その結果、より長く試料を保管した時に神経毒素基質の分解が生じるためである。より強い溶解緩衝液は、先行技術において説明されているＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡには使用することができず、これは、このアッセイでは細胞溶解物の使用が必要なためである。これは、上述の抗原の凝集が、細胞培養皿又はマイクロタイタープレートのプラスチック表面への抗原の非特異的な吸着をもたらし得、これが、次に適切な抗体による抗原の検出を妨害するためである。抗原の検出のための抗体も溶解物と接触するため、抗体もまた凝集し得る。この事例では、抗原の信頼性のある正確な検出は、もはや不可能である。本発明者らは、当該技術分野において説明されている神経毒素活性の生物学的活性の検出にウエスタンブロットアッセイを使用することによって、このような分解反応を経験している。−２０℃で溶解物をより長く保管すると、新しい溶解試料と比較して、全ＳＮＡＰ−２５の検出シグナルは、大幅に低減されたことがわかり、切断された神経毒素基質ＳＮＡＰ−２５と未切断の神経毒素基質ＳＮＡＰ−２５との比は、凍結の際の分解過程に起因して、シフトした。神経毒素基質の分解及び／又は試料の不安定さは、細胞培養皿に細胞を直接固定することによって回避することができるが、これは、神経毒素基質と神経毒素又は他の内在性プロテアーゼの両方が、細胞培養皿での凝集によって即座に不活性化されるためであることが、本発明者らによって見出されている。これは、例えば、メタノール又は当該技術分野において既知の他の固定薬若しくは固定剤、例えばエタノール、アセトン、ホルムアルデヒド若しくはこれらの混合物又は本明細書に記載される他の固定剤による細胞の固定によって、達成することができる。この固定方法を用いた、例えば親ＳｉＭａ細胞（ヒト神経芽腫細胞、ＤＳＭＺ番号：ＡＣＣ １６４）及びｉＰＳ由来のニューロン（Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２６，４２６〜３５）の安定性の分析では、新しい細胞培養皿と７日間冷蔵庫で保管したものとの間にいずれの相違も見られなかった。
本発明の方法において第１の捕捉抗体として使用することができる、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する好適な抗体には、例えば、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ）、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体ＰＡ５−１９７０８（Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体ＰＡ５−１９７０１（Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）又はウサギモノクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体ａｂ１０８９９０（Ａｂｃａｍ）が包含される。
本発明の方法において第２の捕捉抗体として用いることができる神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する適切な抗体には、例えば、マウスモノクローナル抗体クローン２０−２−５（国際公開第２０１４／２０７１０９号）、欧州特許第１４１９９２８２．６号に記載されるマウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体ＭＣ−６０５３（クローン４Ｆ３−２Ｃ１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＡＢ４７３３（Ａｂｎｏｖａ）、ｏｒｂ２６６３３（Ｂｉｏｒｂｙｔ）又はＧＷＢ−Ｔ００２７９（Ｇｅｎｗａｙ）が含まれる。
第１及び第２の検出抗体として使用することができる好適な検出抗体は、当該技術分野において既知である。例えば、第１の検出抗体は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体又は蛍光色素にコンジュゲートした抗体であり得る。第２の検出抗体として、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体、グルコースオキシダーゼコンジュゲート抗体、チロシナーゼコンジュゲート抗体又はβ−ガラクトシダーゼ抗体を使用することができる。好ましくは、第１及び第２の検出抗体は、本発明の方法に使用されるとき、互いに異なる。
本明細書に使用されるとき、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」又は「その（the）」は、文脈により別途明確に示されない限り、単数形及び複数形の両方の参照物を含む。例として、「１つの細胞」は、１つ又は１つを上回る細胞を指す。
本明細書に使用されるとき、示された項目、数字、割合又は用語の値を修飾する場合の「約」という用語は、示された項目、数字、割合又は用語の値のプラス又はマイナス１０パーセント、９パーセント、８パーセント、７パーセント、６パーセント、５パーセント、４パーセント、３パーセント、２パーセント、１パーセント又は０パーセントの範囲を指す。プラス又はマイナス１０パーセントの範囲が好ましい。
本明細書に使用される「含むこと（comprising）」、「含む（comprise）」及び「から構成される（comprised of）」という用語は、「含むこと（including）」、「含む（include）」又は「含有すること（containing）」、「含有する（contain）」と同義であり、包括的又は拡張可能であり、追加の引用されていない項目、要素又は方法の工程を除外するものではない。「含む」という用語が、「からなる」という用語を含むことは、明らかである。より具体的には、本明細書に使用される「含む」という用語は、特許請求の範囲が、すべての列挙された要素又は方法の工程を包含するが、追加の言及されていない要素又は方法の工程も含み得ることを意味する。例えば、工程ａ）、ｂ）及びｃ）を含む方法は、その狭義において、工程ａ）、ｂ）及びｃ）からなる方法を包含する。「からなる」という語句は、組成物（又はデバイス又は方法）が、列挙された要素（又は工程）だけを有することを意味する。対照的に、「含む」という用語は、工程ａ）、ｂ）及びｃ）に加えて、更なる工程、例えば、工程ｄ）及びｅ）を含む方法も包含し得る。
「１〜５マイクロモルの濃度で」など、数値範囲が本明細書において使用される場合、この範囲には、１〜５マイクロモルだけでなく、１及び５マイクロモルの間の任意の数値、例えば、２、３及び４マイクロモルも含まれる。
本明細書に使用される「インビトロ」という用語は、動物又はヒトの身体の外部又はその外側を示す。本明細書に使用される「インビトロ」という用語は、「エキソビボ」を含むと理解すべきである。「エキソビボ」という用語は、典型的に、動物又はヒトの体から取り出され、体外、例えば、培養容器において維持又は増殖させた、組織又は細胞を指す。本明細書に使用される「インビボ」という用語は、動物又はヒトの体の内部又はその中を示す。
本発明の方法の更なる態様において、細胞のＫ+媒介型脱分極は、約２０ｍＭ〜約５５ｍＭの追加のＫ+濃度で、少なくとも２時間行われる。
通常、当該技術分野において使用される細胞培養培地は、５ｍＭのＫ+を含有する。したがって、本発明の方法におけるＫ+の最終濃度は、好ましくは、約２５ｍＭ〜約６０ｍＭのＫ+である。
本発明の方法のなおも更なる態様において、細胞のＫ+媒介型脱分極及び／又は神経毒素ポリペプチド曝露は、ＧＴ１ｂの存在下で行われる。
本発明の方法の別の態様において、ＧＴ１ｂは、１５〜５０μＭ、好ましくは２０μＭの濃度で使用される。
本発明の方法の更なる態様において、短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間は、少なくとも２４時間かつ９６時間未満、好ましくは少なくとも４８時間かつ最大７２時間の、神経毒素ポリペプチドへの細胞の曝露である。
本発明の方法の更なる態様において、神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌は、磁気撹拌子若しくは回転式スピナーフラスコ又は細胞の振盪により達成される。細胞の撹拌は、適切な細胞培養培地流動速度、好ましくは、約２５ｃｍ／分〜約３００ｃｍ／分、より好ましくは約２５ｃｍ／分〜約１５０ｃｍ／分の平均（mean）（又は平均（average））培地流動速度で行われる。
本発明の方法の更なる態様において、細胞のＫ+媒介型脱分極は、少なくとも約２０ｍＭ〜約５５ｍＭの追加のＫ+濃度で、少なくとも２時間、２０μＭのＧＴ１ｂ及び神経毒素ポリペプチドの存在下において行われ、続いて、神経毒素ポリペプチド曝露が、撹拌しながら更に７０時間行われる。
本発明の方法の更なる態様において、神経毒素ポリペプチドなしのインキュベーション時間が、神経毒素ポリペプチド曝露に先行する。
本発明の方法の更なる態様において、神経毒素ポリペプチドなしのインキュベーション時間は、１６〜４８時間である。
本発明の方法の更なる態様において、本方法は、蛍光法である。
本発明の方法の更なる態様において、神経毒素ポリペプチドは、本明細書の他の箇所に定義されるように、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ若しくはＴｅＮＴ又はこれらのサブタイプである。
本発明の方法の更なる態様において、基質は、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、ＳＮＡＰ−２５又はシンタキシンである。
本発明の方法の更なる態様において、細胞は、初代神経細胞、神経芽腫細胞、Ｐ１９細胞など神経細胞に分化することができる腫瘍細胞又は人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）由来のニューロンからなる群から選択される、神経細胞又は神経分化細胞である。
本発明の方法の更に好ましい実施形態は、以下の実施例から誘導することができる。
本発明は、これより、以下の実施例によって例証されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を制限すると見なされるべきではない。
実施例１：二重蛍光細胞に基づくＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＬＩＳＡ
細胞の固定
１．培地／毒素溶液を除去する。１００μＬ／ウェルの氷冷メタノール（−２０℃）を添加し、−２０℃で２０分間インキュベートする。
備考：後続の工程はすべて、室温で行う。
１．培地／毒素溶液を除去する。１００μＬ／ウェルの氷冷メタノール（−２０℃）を添加し、−２０℃で２０分間インキュベートする。
備考：後続の工程はすべて、室温で行う。
細胞固定後：
１．メタノール溶液を除去し、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ緩衝液を添加する。より長く保管する場合（＞１日）、３００μＬ／／ウェルのＰＢＳ緩衝液を添加し、プレートをパラフィルムで封止すべきである。プレートは、冷蔵庫で保管すべきである。
１．メタノール溶液を除去し、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ緩衝液を添加する。より長く保管する場合（＞１日）、３００μＬ／／ウェルのＰＢＳ緩衝液を添加し、プレートをパラフィルムで封止すべきである。プレートは、冷蔵庫で保管すべきである。
２．ＰＢＳ緩衝液を除去し、細胞を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。各工程は、緩徐に振盪させながら１分間行うべきである。
３．ＰＢＳ緩衝液を除去し、１００μＬ／ウェルのクエンチ緩衝液を添加し、緩徐に振盪させながら２０分間インキュベートする。
４．クエンチ緩衝液を除去し、細胞を、緩徐に振盪させながら、３分間、３００μＬ／ウェルのＰＢＳ緩衝液で１回洗浄する。
５．ＰＢＳ緩衝液を除去し、２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、緩徐に振盪させながら１時間インキュベートする。
６．ブロッキング緩衝液を除去し、１００μＬの一次抗体混合物（ブロッキング緩衝液中の抗体希釈物）を各ウェルに添加する。緩徐に振盪させながら一晩（１６〜１８時間）インキュベートする。細胞を、２つの一次抗体：ＢｏＮＴ／Ａにより切断されたＳＮＡＰ−２５に特異的なマウス抗体及びＳＮＡＰ−２５を認識するポリクローナルウサギ抗体（正規化のためにＳＮＡＰ−２５の全量を決定するための抗体）とともに、同時にインキュベートする。
７．一次抗体混合物を除去し、細胞を、２００μＬのＰＢＳ緩衝液で４回洗浄する。各工程は、緩徐に振盪させながら３分間行うべきである。
８．ＰＢＳ緩衝液を除去し、１００μＬの二次抗体混合物：ＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体及びＡＰコンジュゲート抗ウサギ二次抗体（ブロッキング緩衝液中の抗体希釈物）を各ウェルに添加し、緩徐に振盪させながら２．５〜３時間インキュベートする。
９．二次抗体混合物を除去し、細胞を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、続いて３００μＬ／ウェルのＨＥＰＥＳ緩衝液での洗浄工程を１回行う。各洗浄工程は、緩徐に振盪させながら３分間行うべきである。
１０．ＨＥＰＥＳ緩衝液をプレートから除去し、西洋ワサビペルオキシダーゼに対する蛍光性基質（ＨＲＰ基質）７５μＬを各ウェルに添加する。緩徐に振盪させながら５０分間インキュベートする。プレートを直射日光から保護する。
１１．アルカリホスファターゼに対する蛍光性基質（ＡＰ基質）７５μＬを各ウェルに添加し、緩徐に振盪させながら更に５０分間インキュベートする。プレートを直射日光から保護する。
１２．蛍光プレートリーダを使用してプレートを読み取る：
励起５４０ｎｍ、放出６００ｎｍ。
励起３６０ｎｍ、放出４５０ｎｍ。
励起５４０ｎｍ、放出６００ｎｍ。
励起３６０ｎｍ、放出４５０ｎｍ。
１３．計算
正規化のために、切断されたＳＮＡＰ−２５のＲＦＵ値（６００ｎｍでの蛍光）を、各ウェルにおいて全ＳＮＡＰ−２５（４５０ｎｍ）のＲＦＵに対して正規化する。図でＲＦＵをより良好に示すために、すべての値に、以下の式を用いて係数１０００を乗じる：
ＲＦＵ（６００ｎｍ）／ＲＦＵ（４５０ｎｍ）・１０００
続いて、得られたＲＦＵ値を、各標準物又は試料について平均する。
正規化のために、切断されたＳＮＡＰ−２５のＲＦＵ値（６００ｎｍでの蛍光）を、各ウェルにおいて全ＳＮＡＰ−２５（４５０ｎｍ）のＲＦＵに対して正規化する。図でＲＦＵをより良好に示すために、すべての値に、以下の式を用いて係数１０００を乗じる：
ＲＦＵ（６００ｎｍ）／ＲＦＵ（４５０ｎｍ）・１０００
続いて、得られたＲＦＵ値を、各標準物又は試料について平均する。
試薬の調製
ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ）：
リン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ５３６８）（ｐＨ７．４）
クエンチ緩衝液：
１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．６％Ｈ2Ｏ2
ブロッキング緩衝液：
１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の２％ＢＳＡ
ＨＥＰＥＳ緩衝液：
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
ＨＲＰ基質：
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
０．００７％のＨ2Ｏ2
１５０ｐＭ Ａｍｐｌｅｘ ＵｌｔｒａＲｅｄ
ＡＰ基質：
２５ｍＭ ジエタノールアミン（ｐＨ９．８）
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
１００μＬ Ｍ ＤｉＦＭＵＰ
ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ）：
リン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ５３６８）（ｐＨ７．４）
クエンチ緩衝液：
１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．６％Ｈ2Ｏ2
ブロッキング緩衝液：
１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の２％ＢＳＡ
ＨＥＰＥＳ緩衝液：
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
ＨＲＰ基質：
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
０．００７％のＨ2Ｏ2
１５０ｐＭ Ａｍｐｌｅｘ ＵｌｔｒａＲｅｄ
ＡＰ基質：
２５ｍＭ ジエタノールアミン（ｐＨ９．８）
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
１００μＬ Ｍ ＤｉＦＭＵＰ
実施例２：細胞内へのクロストリジウム神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みの強化
ａ）ｉＣｅｌｌ（登録商標）ニューロンを解凍し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）ユーザマニュアルに従って、４つの異なる細胞バッチから９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後に、ユーザマニュアルに記載のように、培地を新しい維持培地と置き換えた。
ａ）ｉＣｅｌｌ（登録商標）ニューロンを解凍し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）ユーザマニュアルに従って、４つの異なる細胞バッチから９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後に、ユーザマニュアルに記載のように、培地を新しい維持培地と置き換えた。
更に７２時間のインキュベーション時間の後に、培地を除去し、様々な濃度のＢｏＮＴ／Ａ及び総濃度３０ｍＭのＫ+イオン（すなわち、そのような培地と比較して２５ｍＭの追加のＫ+）を含有する新しい培地と置き換えた。２時間後に、高Ｋ+培地を除去し、様々な濃度のＢｏＮＴ／Ａを含有する新たな培地を細胞に添加した。
更なる７０時間後に、培地を吸引し、細胞を固定し、ＥＬＩＳＡの読み取りを実施例１に記載のように行った。このプロトコルの結果を、図１に四角形で示す。
ｂ）ｉＣｅｌｌ（登録商標）ニューロンを解凍し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）ユーザマニュアルに従って、４つの異なる細胞バッチから９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後に、ユーザマニュアルに記載のように、培地を新しい維持培地と置き換えた。
更に７２時間のインキュベーション時間の後、培地を除去し、様々な濃度のＢｏＮＴ／Ａを含有する新しい培地と置き換えた。８時間後に、ＢｏＮＴ／Ａを含有する培地を除去し、ＢｏＮＴ／Ａを含まない新しい培地を細胞に添加した。
更なる６４時間後に、培地を吸引し、細胞を固定し、ＥＬＩＳＡの読み取りを実施例１に記載のように行った。このプロトコルの結果を、図１に三角形で示す。
ｃ）ｉＣｅｌｌ（登録商標）ニューロンを解凍し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）ユーザマニュアルに従って、４つの異なる細胞バッチから９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後に、ユーザマニュアルに記載のように、培地を新しい維持培地と置き換えた。
更に７２時間のインキュベーション時間の後、培地を除去し、様々な濃度のＢｏＮＴ／Ａを含有する新しい培地と置き換えた。細胞を、インキュベータのプレート振盪器に設置し、毒素曝露時間中に、３００ｃｍ／分の平均流動速度で振盪させた。
更なる７２時間後に、培地を吸引し、細胞を固定し、ＥＬＩＳＡの読み取りを実施例１に記載のように行った。このプロトコルの結果を、図１に円形で示す。
ｄ）ｉＣｅｌｌ（登録商標）ニューロンを解凍し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）ユーザマニュアルに従って、４つの異なる細胞バッチから９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後に、ユーザマニュアルに記載のように、培地を新しい維持培地と置き換えた。
更に７２時間のインキュベーション時間の後、培地を除去し、様々な濃度のＢｏＮＴ／Ａを含有する新しい培地と置き換えた。
更なる７２時間後に、培地を吸引し、細胞を固定し、ＥＬＩＳＡの読み取りを実施例１に記載のように行った。このプロトコルの結果を、図１に線形で示す。
結論：
まとめると、細胞のＫ+媒介型脱分極、短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間又は神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌により、マウス５０％致死量バイオアッセイと比較したときに、実施例１の細胞に基づくアッセイの同程度の安定性を示す動態が促進される。
まとめると、細胞のＫ+媒介型脱分極、短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間又は神経毒素ポリペプチド曝露中の細胞の撹拌により、マウス５０％致死量バイオアッセイと比較したときに、実施例１の細胞に基づくアッセイの同程度の安定性を示す動態が促進される。
Claims (15)
- 細胞内への神経毒素ポリペプチドの特異的取り込みを強化するための方法であって、
神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、前記神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることを含み、前記インキュベーションが、（ｉ）前記細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の前記細胞の撹拌工程のうちの少なくとも２つを含み、それによって前記細胞内への前記神経毒素ポリペプチドの前記特異的取り込みを強化する、方法。 - 続いて、前記細胞における前記神経毒素ポリペプチドの前記生物学的活性を決定することによる、請求項１に記載の方法。
- 細胞における神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を直接決定するための方法であって、
ａ）神経毒素中毒を受けやすい細胞を、神経毒素ポリペプチドとともに、前記神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能にする時間及び条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベーションが、（ｉ）前記細胞のＫ+媒介型脱分極工程、（ｉｉ）短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間の工程及び／又は（ｉｉｉ）神経毒素ポリペプチド曝露中の前記細胞の撹拌工程のうちの少なくとも２つを含むことと、
ｂ）前記細胞を固定し、任意選択で、界面活性剤を用いて前記細胞を透過性にすることと、
ｃ）前記細胞を、未切断基質及び神経毒素により切断された基質に特異的に結合する少なくとも１つの第１の捕捉抗体、並びに前記神経毒素により切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉抗体と、前記捕捉抗体と前記基質との結合を可能にする条件下で接触させることと、
ｄ）前記細胞を、前記第１の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第１の検出抗体と、前記第１の検出抗体と前記第１の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第１の検出複合体を形成すること、及び前記第２の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも１つの第２の検出抗体と、前記第２の検出抗体と前記第２の捕捉抗体との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって第２の検出複合体を形成することと、
ｅ）工程ｄ）の前記第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、
ｆ）前記細胞中の前記神経毒素ポリペプチドによって切断された基質の量を、前記第２の検出複合体を用いて計算し、それによって、前記細胞における前記神経毒素ポリペプチドの前記生物学的活性を決定することと、
を含む、方法。 - 前記細胞の前記Ｋ+媒介型脱分極が、約２０ｍＭ〜約５５ｍＭの追加のＫ+濃度で、少なくとも２時間行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記Ｋ+媒介型脱分極及び／又は前記神経毒素ポリペプチド曝露が、ＧＴ１ｂの存在下で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- ＧＴ１ｂが、１５〜５０μＭ、好ましくは２０μＭの濃度で使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記短縮された神経毒素ポリペプチド曝露時間が、少なくとも２４時間かつ９６時間未満、好ましくは、少なくとも４８時間かつ最大７２時間の、前記神経毒素ポリペプチドへの前記細胞の曝露である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 神経毒素ポリペプチド曝露中の前記細胞の撹拌が、磁気撹拌子、回転式スピナーフラスコを用いて、又は振盪器によって前記細胞を好ましくは約２５ｃｍ／分〜約３００ｃｍ／分の平均培地流動速度で振盪させることによって、行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記Ｋ+媒介型脱分極が、少なくとも約２０ｍＭ〜約５５ｍＭの追加のＫ+濃度で、少なくとも２時間、２０μＭのＧＴ１ｂ及び神経毒素ポリペプチドの存在下において行われ、続いて、神経毒素ポリペプチド曝露が、撹拌しながら更に７０時間行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 神経毒素ポリペプチドなしのインキュベーション時間が、前記神経毒素ポリペプチド曝露に先行する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記神経毒素ポリペプチドなしのインキュベーション時間が、１６〜４８時間である、請求項１０に記載の方法。
- 蛍光法である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記神経毒素ポリペプチドが、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ、ＴｅＮＴ又はこれらのサブタイプである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質が、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、ＳＮＡＰ−２５又はシンタキシンである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、初代神経細胞、神経芽腫細胞、Ｐ１９細胞など神経細胞に分化することができる腫瘍細胞又は人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）由来のニューロンからなる群から選択される、神経細胞又は神経分化細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15157549 | 2015-03-04 | ||
| EP15157549.5 | 2015-03-04 | ||
| PCT/EP2016/054552 WO2016139308A1 (en) | 2015-03-04 | 2016-03-03 | Methods for enhancing the specific uptake of botulinum neurotoxins into cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018506985A true JP2018506985A (ja) | 2018-03-15 |
| JP6670842B2 JP6670842B2 (ja) | 2020-03-25 |
Family
ID=52705963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017546070A Active JP6670842B2 (ja) | 2015-03-04 | 2016-03-03 | 細胞内へのボツリヌス神経毒素の特異的取り込みを強化するための方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10725025B2 (ja) |
| EP (1) | EP3265808B1 (ja) |
| JP (1) | JP6670842B2 (ja) |
| KR (1) | KR102418939B1 (ja) |
| CN (1) | CN108064310B (ja) |
| AU (1) | AU2016227655B2 (ja) |
| BR (1) | BR112017018962A2 (ja) |
| CA (1) | CA2978225C (ja) |
| ES (1) | ES2822905T3 (ja) |
| HK (1) | HK1249147A1 (ja) |
| IL (1) | IL254181B (ja) |
| MX (1) | MX2017011195A (ja) |
| RU (1) | RU2684404C2 (ja) |
| SG (1) | SG11201707157PA (ja) |
| TW (1) | TWI704156B (ja) |
| WO (1) | WO2016139308A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR122012027456A2 (pt) * | 2008-03-14 | 2015-07-14 | Allergan Inc | Composição farmacêutica compreendendo sorotipo de neurotoxina botulínica a |
| TWI704156B (zh) * | 2015-03-04 | 2020-09-11 | 德商曼茲法瑪股份有限公司 | 用於增進肉毒桿菌神經毒素進入細胞之特定攝取的方法 |
| WO2019077601A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Oorym Optics Ltd. | HIGH-EFFICIENCY COMPACT MOUNTED MOUNTING DISPLAY SYSTEM |
| US11707510B2 (en) * | 2018-02-16 | 2023-07-25 | Preclinics Discovery Gmbh | Nucleic acid-based botulinum neurotoxin for therapeutic use |
| CN111621525B (zh) * | 2020-06-18 | 2021-04-23 | 中赛干细胞基因工程有限公司 | Stx1b基因在促进人脂肪间充质干细胞生长和分化中的用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011500075A (ja) * | 2007-10-25 | 2011-01-06 | ネバライタ，リーナ | Ｇｄｎｆのスプライスバリアントおよびその用途 |
| JP2011526243A (ja) * | 2008-03-14 | 2011-10-06 | アラーガン、インコーポレイテッド | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清ａ型活性アッセイ |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100876060B1 (ko) * | 1999-08-25 | 2008-12-26 | 알러간, 인코포레이티드 | 활성화가능한 재조합 신경독 |
| US20080032931A1 (en) * | 1999-08-25 | 2008-02-07 | Steward Lance E | Activatable clostridial toxins |
| WO2010085473A1 (en) * | 2009-01-20 | 2010-07-29 | Trustees Of Tufts College | Methods for the delivery of toxins or enzymatically active portions thereof |
| CA2753208C (en) | 2009-02-20 | 2018-08-21 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods and compositions for the differentiation of stem cells |
| US8372642B2 (en) | 2009-02-27 | 2013-02-12 | Cellular Dynamics International, Inc. | Differentiation of pluripotent cells |
| KR20200146046A (ko) | 2009-03-13 | 2020-12-31 | 알러간, 인코포레이티드 | 면역 기반 보툴리눔 독소 혈청형 ａ 활성 검정에 유용한 세포 |
| WO2011025852A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Cellular Dynamics International, Inc. | Identifying genetic variation in affected tissues |
| CA2777710C (en) | 2009-11-04 | 2021-02-23 | Cellular Dynamics International, Inc. | Episomal reprogramming with chemicals |
| AU2010321219B2 (en) * | 2009-11-18 | 2015-04-30 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Assay for quantifying clostridial neurotoxin |
| WO2012135621A2 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-04 | Cellular Dynamics International. Inc | Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation |
| KR20150087321A (ko) * | 2012-11-21 | 2015-07-29 | 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아 | 보툴리눔 신경독소 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법 |
| WO2014207109A1 (en) * | 2013-06-28 | 2014-12-31 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Means and methods for the determination of the biological activity of neurotoxin polypeptides in cells |
| CA2968284C (en) * | 2014-11-21 | 2023-11-14 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Methods for the determination of the biological activities of neurotoxin polypeptides |
| WO2016097243A1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Means and methods for the determination of the biological activity of bont/e in cells |
| TWI704156B (zh) * | 2015-03-04 | 2020-09-11 | 德商曼茲法瑪股份有限公司 | 用於增進肉毒桿菌神經毒素進入細胞之特定攝取的方法 |
-
2016
- 2016-02-24 TW TW105105453A patent/TWI704156B/zh active
- 2016-03-03 SG SG11201707157PA patent/SG11201707157PA/en unknown
- 2016-03-03 KR KR1020177024406A patent/KR102418939B1/ko active IP Right Grant
- 2016-03-03 BR BR112017018962-3A patent/BR112017018962A2/pt active Search and Examination
- 2016-03-03 JP JP2017546070A patent/JP6670842B2/ja active Active
- 2016-03-03 CN CN201680013526.0A patent/CN108064310B/zh active Active
- 2016-03-03 ES ES16707785T patent/ES2822905T3/es active Active
- 2016-03-03 WO PCT/EP2016/054552 patent/WO2016139308A1/en active Application Filing
- 2016-03-03 US US15/554,338 patent/US10725025B2/en active Active
- 2016-03-03 AU AU2016227655A patent/AU2016227655B2/en active Active
- 2016-03-03 MX MX2017011195A patent/MX2017011195A/es unknown
- 2016-03-03 RU RU2017130580A patent/RU2684404C2/ru active
- 2016-03-03 EP EP16707785.8A patent/EP3265808B1/en active Active
- 2016-03-03 CA CA2978225A patent/CA2978225C/en active Active
-
2017
- 2017-08-28 IL IL254181A patent/IL254181B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-07-09 HK HK18108842.3A patent/HK1249147A1/zh unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011500075A (ja) * | 2007-10-25 | 2011-01-06 | ネバライタ，リーナ | Ｇｄｎｆのスプライスバリアントおよびその用途 |
| JP2011526243A (ja) * | 2008-03-14 | 2011-10-06 | アラーガン、インコーポレイテッド | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清ａ型活性アッセイ |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CURR. TOP. MICROBIOL. IMMUNOL., 2013, 364, PP.257-285, JPN6018049356 * |
| J. BIOL. CHEM., 2011, 286(30), PP.26828-26837, JPN6018049350 * |
| TOXICOL. SCI., 2012, 126(2), PP.426-435, JPN6018049353 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017130580A3 (ja) | 2019-04-05 |
| AU2016227655A1 (en) | 2017-09-14 |
| CN108064310B (zh) | 2021-06-11 |
| AU2016227655B2 (en) | 2021-08-19 |
| CN108064310A (zh) | 2018-05-22 |
| EP3265808A1 (en) | 2018-01-10 |
| TW201639875A (zh) | 2016-11-16 |
| SG11201707157PA (en) | 2017-09-28 |
| KR20170121194A (ko) | 2017-11-01 |
| HK1249147A1 (zh) | 2018-10-26 |
| WO2016139308A1 (en) | 2016-09-09 |
| BR112017018962A2 (pt) | 2018-04-24 |
| MX2017011195A (es) | 2017-11-09 |
| TWI704156B (zh) | 2020-09-11 |
| US10725025B2 (en) | 2020-07-28 |
| US20180238861A1 (en) | 2018-08-23 |
| KR102418939B1 (ko) | 2022-07-07 |
| ES2822905T3 (es) | 2021-05-05 |
| JP6670842B2 (ja) | 2020-03-25 |
| RU2684404C2 (ru) | 2019-04-09 |
| CA2978225C (en) | 2022-09-13 |
| IL254181A0 (en) | 2017-10-31 |
| EP3265808B1 (en) | 2020-08-26 |
| CA2978225A1 (en) | 2016-09-09 |
| IL254181B (en) | 2020-03-31 |
| RU2017130580A (ru) | 2019-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6670842B2 (ja) | 細胞内へのボツリヌス神経毒素の特異的取り込みを強化するための方法 | |
| JP2019537567A (ja) | 細胞性ｖａｍｐ切断アッセイ | |
| JP6772138B2 (ja) | 細胞内のＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を決定するための手段及び方法 | |
| US9310386B2 (en) | In vitro assay for quantifying clostridial neurotoxin activity | |
| EP3221699B1 (en) | Methods for the determination of the biological activities of neurotoxin polypeptides | |
| JP6549599B2 (ja) | ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系におけるボツリヌス神経毒に対する細胞の感度を標準化し且つ増加させるためのガングリオシド | |
| RU2807994C2 (ru) | Анализ расщепления клеточного vamp |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180215 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20181130 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181218 |
|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20190121 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190121 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190318 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20190806 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191205 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20191213 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200218 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200302 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6670842 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |