JP2018505151A - アペリン受容体により媒介される疾患の処置における代謝的に安定なアペリン類似体 - Google Patents

Abstract

本発明は、代謝的に安定なアペリン類似体、並びにアペリン受容体により媒介される疾患、特に心血管疾患（心不全、高血圧症、肺高血圧症、腎不全）及び不適切なバソプレッシン分泌（ＳＩＡＤＨ）の予防又は治療のためのそれらの使用に関する。

Description

発明の分野：
本発明は、代謝的に安定なアペリン類似体並びにアペリン受容体により媒介される疾患、特に心血管疾患（心不全、腎不全、高血圧症、肺高血圧症）及び抗利尿ホルモン不適切分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）の予防又は治療のためのその使用に関する。

発明の背景：
アンジオテンシンＩＩＩに特異的な受容体を探して、本発明者らは以前に、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーから７回膜貫通ドメインを有するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードする遺伝子を単離した（１）。この受容体のアミノ酸配列は、ラットアンジオテンシン受容体１型（ＡＴ１受容体）のアミノ酸配列と３１％同一であり、O'Dowdらにより以前にクローニングされたヒトオーファン受容体ＡＰＪのアミノ酸配列と９０％同一であった（２）。ヒトＡＰＪ受容体の内因性リガンドは、Tatemotoらにより発見され（３）、アペリンと名付けられた。アペリンは、アミノ酸７７個のより大きな前駆体、プレプロアペリンから生成するアミノ酸３６個のペプチド（アペリン３６）である。哺乳類でのプレプロアペリンのアミノ酸配列アライメントにより、アペリン−１７又はＫ１７Ｆとして公知のＣ末端アミノ酸１７個の厳密な保存が実証された。アペリンのいくつかの分子形態：インビボ型アペリン３６、Ｋ１７Ｆ及びピログルタミル形態のアペリン１３（ｐＥ１３Ｆ）が同定されている（４〜８）。

本発明者らは、ラットアペリン受容体がアデニル酸シクラーゼと負のカップリングを行い、Ｋ１７Ｆの作用下でインターナリゼーションしたことを実証した（９）。本発明者らは、また、成ラット脳においてアペリン受容体ｍＲＮＡが神経内分泌の制御、摂食の調節及び体液のホメオスタシスに関与する脳構造に発現されたことを示した（１）。本発明者らは、これらの構造にアペリン作動性ニューロンが存在することを免疫組織化学により示した（１０）。本発明者らは、続いて、アペリン及びその受容体が室傍核（ＰＶＮ）及び視索上核（ＳＯＮ）の大細胞性バソプレッシン作動性ニューロンにおいてアルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ）と共局在したことを示した（４、１１、１２）。これらのニューロンは、下垂体後葉に投射し、そこでこれらは、血流中にＡＶＰを放出する。続いて、ＡＶＰは、腎臓レベルで、集合管に位置するＡＶＰ受容体２型（Ｖ２受容体）に作用することにより、水チャネルであるアクアポリン−２を活性化し、頂端膜へのこれらの挿入を促進し、利尿減少を招く（抗利尿効果）。次に、本発明者らは、バソプレッシン作動性ニューロンの過活動を示している（乳汁産生を最適化するために体の水分含量を維持することが可能な）泌乳ラットにおいて、Ｋ１７Ｆの中枢注射がこれらのニューロンの位相電気活動を減少させ、血流中へのＡＶＰの分泌減少及び水利尿の増加を招くことを示した（４）。これらのデータは、アペリンがＡＶＰの抗利尿効果の天然阻害剤であり得ると示唆している。

ラット及びヒト腎臓においてアペリン受容体及びプレプロアペリンのｍＲＮＡ転写物、並びにアペリンペプチドが検出されたので、アペリンの水利尿効果は、中枢作用に加えて、おそらく腎臓作用を伴う（５、１３）。アペリン受容体ｍＲＮＡは、全ての腎臓部位に、髄質の外層の内帯に最も豊富に検出されている（１４）。糸球体からも高レベルの発現が検出され、全てのネフロンセグメントにおいて、特にバソプレッシンＶ２受容体を発現する集合管において、中等度の発現が観察された。この局在に一致して、泌乳ラットにおける漸増する用量のアペリンの静脈内（ｉｖ）注射は、用量依存的に利尿を増加させる（１４）。そのうえ、本発明者らは、この効果が集合管の頂端膜でのアクアポリン−２の挿入減少によることを示した（１５）。これは、Ｖ２受容体を介してＡＶＰが誘導するｃＡＭＰ産生に及ぼすアペリンの阻害効果が原因である。したがって、アペリン及びＡＶＰは、血漿溶質濃度の変化に対抗するように水排出量を調整することにより、平均基礎レベルの数パーセントよりも大きい浸透圧変化を防止することもできる。

そのうえ、血流中へのＡＶＰの分泌を増加させ、大細胞性ＡＶＰニューロンのニューロンＡＶＰ含量の減少をもたらすラットの２４時間脱水は、対応する血漿中アペリン濃度を減少させ、これらのニューロン中のアペリン含量の蓄積を増加させる。これは、脱水の間にアペリン及びＡＶＰが逆の様式で調節され、それにより血流中へのＡＶＰ分泌を最適化し、利尿を減少させて腎臓レベルで追加的な水喪失を回避していることを示す（４、１６）。それらは、また、ヒトにおける血漿アペリンレベルが、浸透圧刺激及び血液量刺激によりＡＶＰと反対方向に調節されることも最初に示し、これは、ＡＶＰのようにアペリンが、げっ歯類だけでなくヒトにおいても体液ホメオスタシスの維持に関与し得ることを示唆している（１７）。最近になって、本発明者らは、抗利尿ホルモン不適切分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）又は慢性心不全を有する低ナトリウム血症患者を含む研究から、血漿での異常なアペリン／ＡＶＰバランスがこれらの患者から観察された水代謝障害の原因となり得ることを観察した（１８）。

アペリンは、心血管系にも存在する。アペリン受容体ｍＲＮＡは、心筋及び血管内皮から検出されている（７）。ラットにおけるアペリンの全身注射は、一酸化窒素産生（１９）を介して血圧（ＢＰ）を減少させることが示された（９、１９）。最終的に、アペリン受容体欠損マウスは、アンジオテンシンＩＩの血管収縮応答の増加を示し、アペリン受容体及びＡＴ１受容体の両方に関してホモ接合性の二重変異型マウスのベースラインＢＰは、ＡＴ１受容体欠損マウスと比べて有意に上昇した（２０）。これは、アペリンがインビボで降圧効果を発揮し、アンジオテンシンＩＩの昇圧作用に対して対抗制御的な役割を果たすことを実証している。他方、げっ歯類心臓において、アペリンは、陽性変力効果により心筋の収縮力を増加させる一方で、心負荷を減少させる（２１、２２）。加えて、アペリンの免疫反応性における増加が、心不全の初期段階に患者の血漿から観察されているのに対して、その後のより重篤な段階では減少が観察される（２３）。そのうえ、ラット肥大心及び心不全においてアペリン受容体ｍＲＮＡが減少していることが示された（２４）。最終的に、アペリン遺伝子欠損マウスは、加齢及び圧過負荷に関連する心収縮障害及び進行性心不全を発生することが示された（２５）。したがって、アペリン系の下方調節は、心機能の低下と同時に起こり、アペリンが心機能に対する保護剤であり得るという可能性が生じている。まとめると、これらのデータは、アペリンが体液ホメオスタシス及び心血管機能の維持に主要な役割を果たすことを実証している。

血液循環中のアペリンの半減期は約１分であるので、本発明は、アペリン／アペリン受容体経路を活性化する、強力で安定な新薬を設計、合成及び検査することを目指すものである。そのような化合物は、水利尿及び心筋収縮性を増加させる一方で血管抵抗を減少させることにより、特定の心血管疾患（心不全、腎不全、高血圧症、肺高血圧症）及び抗利尿ホルモン不適切分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）における、特に心不全患者における、アペリン受容体により媒介される疾患を処置するための潜在的に新しい治療剤となる。

心不全は、先進国における大きな増え続ける健康上の重荷である。ヨーロッパにおいて、ヨーロッパ心臓病学会（ＥＳＣ）は、人口が９億人を超える諸国を代表し、心不全を有する患者は少なくとも１５００万人いる（２６）。米国において、心不全は、５，８００，０００人近くを冒している（２７）。心不全の発生率は、６５歳を過ぎると１，０００人あたり１０人に近づく（２８）。米国において、心不全は、年間２８０，０００人の死亡を引き起こし、２０１０年の心不全の直接及び間接的推定費用は、３９２億ドルである（２７）。西側諸国における心不全の増え続ける重荷は、２つの大きな要因：１）高齢化集団は心不全の発生率がより高いこと、及び２）急性心筋梗塞（ＭＩ）から生存したより多くの患者が心不全の発生を招くことを反映している。処置の選択肢は、根本原因及び生活習慣の変化を処置することを含めた、心不全の種類、原因、症状及び重症度に依存する。いくつかの投薬が心不全のために処方され、大部分の患者は、１つを超える薬物を施される。投薬は、血管を拡張するか（例えばアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤又はＡＴ１受容体ブロッカー）、心臓のポンプ作用を強化するか（例えばジゴキシン）、又は体内の水及びナトリウムを減少させて心臓の作業負荷を低下させる（例えば利尿薬）ために処方され得る。しかし、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴ１受容体ブロッカー及びβアドレナリン作動性受容体ブロッカーだけが、大規模臨床試験で心不全患者における罹患率及び死亡率を減少させることが証明されている（２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５）。内科治療で得られた進歩にかかわらず、心不全の死亡率は高いままであり：心不全を有すると診断された人々のほぼ５０％が５年以内に死亡する（３６、３７）。心不全の新しい薬理学的処置が、患者のケアを改善するために活発に研究されている。血液循環中のアペリンの半減期は、分の範囲であるので、本発明の全般的な目的は、アペリン受容体により媒介される疾患、特に心血管疾患（心不全、腎不全、高血圧症、肺高血圧症）、多発性嚢胞腎疾患、低ナトリウム血症及びＳＩＡＤＨの処置に有用な治療剤として、代謝的に安定なアペリン類似体（アペリン受容体アゴニスト）を使用するという治療的関心を実証することである。

発明の概要
本発明は、次式（Ｉ）：
リシン−フェニルアラニン−Ｘａａ１−アルギニン−Ｘａａ２−アルギニン−プロリン−アルギニン−Ｘａａ３−セリン−Ｘａａ４−リシン−Ｘａａ５−プロリン−Ｘａａ６−プロリン−Ｘａａ７（Ｉ）
で示されるペプチド
［その際：
− フルオロカーボン基、アセチル基、又はアシル基−Ｃ（Ｏ）Ｒが、該ペプチドと直接又はＰＥＧ、リシン及びアルギニンからなる群より選択されるスペーサーを経由して、式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも１つのリシンのアルファ−アミノ基又はイプシロン−アミノ基のいずれかで連結しており、スペーサーがリシンである場合、フルオロカーボン基又はアセチル基又はアシル基は、該スペーサーのアルファ−アミノ基又はイプシロン−アミノ基のいずれかで直接連結しており、式中、
Ｘａａ１は、アルギニン（Ｒ）又はＤ−異性体アルギニン（Ｒ_Ｄ）であり、
Ｘａａ２は、グルタミン（Ｑ）又はＤ−異性体グルタミン（Ｑ_Ｄ）であり、
Ｘａａ３は、ロイシン（Ｌ）又はＤ−異性体ロイシン（Ｌ_Ｄ）であり、
Ｘａａ４は、ヒスチジン（Ｈ）又はα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）であり、
Ｘａａ５は、アラニン（Ａ）又はＤ−異性体アラニン（Ａ_Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であり、
Ｘａａ６は、メチオニン（Ｍ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、
Ｘａａ７は、フェニルアラニン（Ｆ）又は４−Ｂｒフェニルアラニン（Ｆ）であり、
Ｒは、Ｃ７−３０アルキルである］
を有するアペリン類似体を提供する。

該アペリン類似体は、有利には、代謝的に安定である。

好ましい実施態様では、Ｘａａ１は、Ｄ−異性体アルギニン（Ｒ_Ｄ）であり、Ｘａａ２は、Ｄ−異性体グルタミンであり（Ｑ_Ｄ）、Ｘａａ３は、Ｄ−異性体ロイシン（Ｌ_Ｄ）であり、Ｘａａ４は、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）であり、Ｘａａ５は、Ｄ−異性体アラニン（Ａ_Ｄ）であり、Ｘａａ６は、ノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、Ｘａａ７は、４−Ｂｒフェニルアラニン（４ＢｒＦ）である。

好ましい実施態様では、アペリン類似体は、（ｉ）アセチル−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ−Ａｒｇ）−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｇｌｎ）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｌｅｕ）−Ｓｅｒ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ−Ｐｒｏ−（４−Ｂｒ）Ｐｈｅ（本明細書においてＰ９２化合物と呼ばれる）又は（ｉｉ）ＮＨ２末端にフルオロカーボン基を有する、配列番号：１（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）で示されるアミノ酸配列（本明細書においてＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ化合物と呼ばれる）又はｉｉｉ）フルオロカーボン基が最初のリシン残基のＮＨ２αで連結しているＫＦＲ_ＤＲＱ_ＤＲＰＲＬ_ＤＳＡｉｂＫＡ_ＤＰＮｌｅＰ（４−Ｂｒ）Ｆ）（フルオロ−Ｐ９２化合物）又は（ｉｖ）アシル基が最初のリシン残基のＮＨ２αで連結しているＫＦＲ_ＤＲＱ_ＤＲＰＲＬ_ＤＳＡｉｂＫＡ_ＤＰＮｌｅＰ（４−Ｂｒ）Ｆ）（リポ−Ｐ９２化合物）を含む又はそれからなる。

本発明は、さらに、本発明のアペリン類似体を薬学的に許容し得る担体と一緒に含む医薬組成物、及びアペリン受容体により媒介される疾患、特に心血管疾患（心不全、腎不全、高血圧症、肺高血圧症、多発性嚢胞腎疾患、低ナトリウム血症及びＳＩＡＤＨを治療又は予防するための、本発明によるアペリン類似体又は医薬組成物の使用に関する。

発明の詳細な説明：
アペリンは迅速に代謝されるので（血液循環中のＫ１７Ｆの半減期：４０秒、個人的なデータ）、アペリン／アペリン受容体経路を活性化する代謝的に安定なアペリン類似体が、心不全を有する患者でのアペリンシグナル伝達を増加させる治療潜在性を決定するために必要とされる。この目的で、本発明者らは、アペリン１３（ｐＥ１３Ｆ）及びアペリン１７（Ｋ１７Ｆ：配列番号：１：ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）の構造活性相関研究を行った。本発明者らは、代謝的に安定なアペリン類似体（Ｐ９２化合物及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ化合物）を得たが、それらのうち最も強力なのは化合物Ｐ９２であった。この化合物は、［１２５Ｉ］ｐＥ１３Ｆを用いた競合放射性リガンド結合アッセイ法により決定された０．２±０．０６nMというＫｉをラットアペリン受容体に対して示した。ＡＴ１受容体に対するその選択性は、アペリン受容体と比較して１００倍である。この化合物は、フォルスコリンにより誘導されるｃＡＭＰ産生阻害に対して、及びアペリン受容体のインターナリゼーションに向けて全アゴニストとして挙動する。絶水マウスにおける漸増する用量のＰ９２の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注射は、Ｋ１７Ｆのｉ．ｃ．ｖ．注射により誘導されるよりも高い効力で血漿ＡＶＰレベルに用量依存的減少を誘導した。そのうえ、Ｐ９２は、ノルアドレナリンを用いて予備狭窄させた大動脈輪又はアンジオテンシンＩＩにより予備収縮させた糸球体細動脈の血管弛緩を、Ｋ１７Ｆにより誘導される血管弛緩に類似して誘導した。麻酔された正常血圧ラットにＰ９２を漸増する用量で静脈内経路により注射すると、動脈圧（ＢＰ）が用量依存的に減少する。分離された潅流ラット心臓に適用されたＰ９２は、心収縮性を増加させる。さらに、本発明の化合物（Ｐ９２化合物及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ化合物）は、血漿中で半減期の安定性の増加を示す。

このように、本発明者らは、アペリン受容体により媒介される疾患を処置するための新しい標的治療を発見した。本発明は、心血管疾患（心不全、高血圧症）及び抗利尿ホルモン不適切分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を処置するために特に有利である。

定義：
本明細書にわたり、いくつかの用語が採用され、以下の段落で定義される。

本明細書に使用される用語「アペリン」は、アペリン受容体の内因性リガンドであって、アミノ酸７７個のプレプロペプチドとして合成され、このプレプロペプチドが、アペリン−３６、アペリン−１７（Ｋ１７Ｆ）及びピログルタミル型アペリン−１３（ｐＥ１３Ｆ）と表示されるＣ末端断片にプロセシングされる。

アペリンは、心内膜内皮細胞及び血管内皮細胞に発現され、一方でアペリン受容体は、広く分布し、オートクリン及びパラクリン心血管系効果を可能にする。アペリンは、陽性変力効果を媒介し、バソプレッシンの放出を中枢的に阻害し、利尿を促進する。アペリン／アペリン受容体軸は、血管新生促進性であり、内皮ＮＯを活性化して血管拡張を導く。アペリンの喪失は、ＭＩ（心筋梗塞）後機能不全、心不全（ＨＦ）及び肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を悪化させる。アペリンペプチドは、血管幹細胞及び心幹細胞を刺激することによって組織損傷修復作用を促進する。アペリン受容体における遺伝的変異は、拡張型心筋症におけるＨＦ進行を改変し、アペリン／アペリン受容体系は、ヒトＨＦ及びＰＡＨにおいて損なわれる。アペリン投与は、心係数を増加させ、ＨＦを有する患者に低血圧なしに末梢血管抵抗を低下させた。ＰＡＨは、顕著な炎症及び血管リモデリングに関連し、治療が限られている血管疾患の定型の例である。アペリンペプチドは、ＰＡＨを含めた病的状態の炎症性血管疾患に主要な役割を果たす。しかし、ネイティブなアペリンペプチドの短い半減期（１〜２分）のせいで、目下の治療応用は実現可能ではなく、それにより、その商業的応用は損なわれる。

用語「ＡＰＪ受容体」又は「アペリン受容体」は、O'Dowdらによりヒトゲノムライブラリーから本来同定され（２）、続いてマウス（３８）及びラット（（１）、本発明者らの研究所）にクローニングされた、アペリンに対する受容体を意味する。

本明細書に使用される用語「アミノ酸」は、キラルなアミノ酸についてのＤ及びＬ立体異性体としての天然又は非天然アミノ酸を表す。これは、アミノ酸と、例えばペプチド構造として存在する場合の対応するアミノ酸残基との両方を表すことが理解されている。天然及び非天然アミノ酸は、当技術分野において周知である。通常の天然アミノ酸には、非限定的に、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）が含まれる。非通常で非天然のアミノ酸には、非限定的に、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アリルグリシン（アリルＧｌｙ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｇｕ））、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、ホモリシン（ｈＬｙｓ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びペンタフルオロフェニルアラニンが含まれる。

アミノ酸は、典型的には、その側鎖に応じて、極性、疎水性、酸性、塩基性及び芳香族を含めた１つ以上の種類に分類される。極性アミノ酸の例には、ヒドロキシル、スルフヒドリル、及びアミドなどの側鎖官能基を有する極性アミノ酸、並びに酸性及び塩基性アミノ酸が含まれる。極性アミノ酸には、非限定的に、アスパラギン、システイン、グルタミン、ヒスチジン、セレノシステイン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。疎水性又は非極性アミノ酸の例には、非限定的に、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、プロリン、メチオニン及びフェニルアラニンなどの非極性脂肪族側鎖を有する残基が含まれる。塩基性アミノ酸残基の例には、アミノ基又はグアニジノ基などの塩基性側鎖を有する塩基性アミノ酸残基が含まれる。塩基性アミノ酸残基には、非限定的に、アルギニン、ホモリシン及びリシンが含まれる。酸性アミノ酸残基の例には、カルボキシル基などの酸性側鎖官能基を有する産生アミノ酸残基が含まれる。酸性アミノ酸残基には、非限定的に、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。芳香族アミノ酸には、芳香族側鎖基を有する芳香族アミノ酸が含まれる。芳香族アミノ酸の例には、非限定的に、ビフェニルアラニン、ヒスチジン、２−ナフチルアラニン（napthylalananine）、ペンタフルオロフェニルアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。一部のアミノ酸は、１つを超える群に分類されることが留意されており、例えば、ヒスチジン、トリプトファン及びチロシンは、極性アミノ酸及び芳香族アミノ酸の両方として分類される。アミノ酸は、さらに、非荷電アミノ酸又は荷電（正荷電若しくは負荷電）アミノ酸として分類され得る。正荷電アミノ酸の例には、非限定的に、リシン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負荷電アミノ酸の例には、非限定的に、グルタミン酸及びアスパラギン酸が含まれる。上記群のそれぞれに分類される追加的なアミノ酸は、当業者に公知である。

「等価のアミノ酸」は、認識可能な機能喪失なしに、本発明によるペプチド化合物中の別のアミノ酸の代わりに置換され得るアミノ酸を意味する。等価のアミノ酸は、当業者により認識されている。似ているアミノ酸の置換は、例えば、本明細書記載のサイズ、電荷、親水性及び疎水性に関する、側鎖置換基の相対類似性に基づき行われる。「又はその等価のアミノ酸」という語句は、個別のアミノ酸の列挙に続いて使用される場合、列挙に含まれる個別のアミノ酸の１つ以上の等価物を意味する。

本明細書に使用される「アペリン類似体」は、配列番号：１のペプチドの生物学的活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す化合物を表す。アペリン類似体は、例えば、実験によりアペリン／アペリン受容体経路を活性化可能なことで特徴付けられ得る（実施例参照）。

本明細書に使用される「代謝的に安定な」アペリン類似体は、Ｋ１７Ｆよりも優れた半減期を有するアペリンを表す（Ｐ９２化合物及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ化合物について実施例に記載された試験を参照されたい）。好ましくは、「代謝的に安定な」アペリン類似体は、Ｐ９２化合物及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ化合物について実施例に記載された試験で測定された場合、Ｋ１７Ｆの半減期よりも２倍長い、又は少なくとも２０分若しくは１時間を超える半減期を有するアペリン類似体を表す。

参照ペプチドに「実質的に相同な」ペプチドは、１つ以上の保存的置換により参照配列から派生し得る。好ましくは、これらの相同ペプチドは、２つのシステイン残基を含まないことにより、環化が防止されている。１つ以上のアミノ酸残基が生物学的に類似な残基により置き換えられる場合、又はアミノ酸の８０％超が同一である、若しくは約９０％超、好ましくは約９５％が類似である（機能的に同一である）場合、２つのアミノ酸配列は、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似、同一又は相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアップ（pileup）プログラム、又は当技術分野において公知のプログラムのいずれか（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を使用してアライメントにより同定される。例えばNeedleを使用し、ギャップ開始ペナルティー１０及びギャップ伸長ペナルティー０．５でＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、Needleman-Wunschアライメントアルゴリズムに基づく対でのグローバルアライメントを行って、２つの配列の全長に沿ってそれらの最適なアライメント（ギャップを含む）を見つけることにより、同一パーセンテージが計算され得る。

本明細書に使用される用語「保存的置換」は、類似の性質（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを非限定的に含めた、ペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能を変化させない、別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えを意味する。類似の性質を有するアミノ酸は、当技術分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリシンは、親水性−塩基性アミノ酸であり、互換的であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン又はバリンにより置き換えられ得る。相互に置換できる中性親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン及びトレオニンが含まれる。

「置換された」又は「改変された」により、本発明は、天然アミノ酸から変化又は改変されたアミノ酸を含む。

組成物、担体、希釈剤及び試薬を表すときの、本明細書に使用される用語「薬学的に許容し得る」及びその文法的変形は、互換的に使用され、それらの物質が、悪心、めまい、胃の不調などの望ましくない生理効果の産生なしに哺乳類に、又は哺乳類上に投与することが可能なことを表す。

用語「患者」又は「対象」は、雄、雌、成体及び子供を含めた、ヒト又は非ヒト哺乳類、好ましくはマウス、ネコ、イヌ、サル、ウマ、家畜（すなわちウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛）を表す。

本明細書に使用される用語「処置」又は「治療」は、治療的処置及び／又は予防的処置を含む。より詳細には、治療的処置は、症状の緩和、寛解及び／又は消失、低減及び／又は安定化（例えば、より進んだ段階に進行しないこと）、並びに特定障害の症状の進行遅延のいずれかを表す。予防的処置は、発症を食い止めること、発生リスクを低下させること、発生率を低下させること、発症を遅延させること、発生を低下させること、並びに特定の障害の発症までの時間を延ばすことのいずれかを表す。

アペリン類似体
本発明は、アペリン／アペリン受容体経路を活性化する；及び／又はアペリン受容体により媒介される疾患、特に心血管疾患（心不全、腎不全、高血圧症）、多発性嚢胞腎疾患、低ナトリウム血症及び不適切なバソプレッシン分泌（ＳＩＡＤＨ）を処置する能力を有する、アペリンＫ１７Ｆアイソフォームから誘導された新規なアペリン類似体に関する。

一態様では、本発明は、次式（Ｉ）：
リシン−フェニルアラニン−Ｘａａ１−アルギニン−Ｘａａ２−アルギニン−プロリン−アルギニン−Ｘａａ３−セリン−Ｘａａ４−リシン−Ｘａａ５−プロリン−Ｘａａ６−プロリン−Ｘａａ７ （Ｉ）
で示されるペプチド
［その際：
− フルオロカーボン基、アセチル基、又はアシル基ＲＣ（Ｏ）−は、該ペプチドと直接又はＰＥＧ、リシン及びアルギニンからなる群より選択されるスペーサーを経由して、式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも１つのリシンのアルファ−アミノ基又はイプシロン−アミノ基のいずれかで連結しており、スペーサーがリシンである場合、フルオロカーボン基又はアセチル基又はアシル基は、該スペーサーのアルファ−アミノ基又はイプシロン−アミノ基のいずれかで直接連結しており、式中、
Ｘａａ１は、アルギニン（Ｒ）又はＤ−異性体アルギニン（Ｒ_Ｄ）であり、
Ｘａａ２は、グルタミン（Ｑ）又はＤ−異性体グルタミン（Ｑ_Ｄ）であり、
Ｘａａ３は、ロイシン（Ｌ）又はＤ−異性体ロイシン（Ｌ_Ｄ）であり、
Ｘａａ４は、ヒスチジン（Ｈ）又はα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）であり、
Ｘａａ５は、アラニン（Ａ）又はＤ−異性体アラニン（Ａ_Ｄ）又はグリシンであり、
Ｘａａ６は、メチオニン（Ｍ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、
Ｘａａ７は、フェニルアラニン（Ｆ）又は４−Ｂｒフェニルアラニン（Ｆ）であり、
Ｒは、Ｃ７−３０アルキルである］
を有するアペリン類似体を提供する。

該アペリン類似体は、有利には代謝的に安定である。

本明細書に使用される用語《フルオロカーボン》には、パーフルオロカーボン（全ての水素がフッ素により置き換わっている）又はハイドロフルオロカーボン（Ｃ−Ｈ結合及びＣ−Ｆ結合の両方を含有する）のいずれかが含まれる。

フルオロカーボン基は、パーフルオロカーボン又は混合フルオロカーボン／炭化水素基由来の１つ以上の鎖を含む場合があり、飽和又は不飽和の場合があり、各鎖は、炭素原子３〜３０個を有する。フルオロカーボン基は、共有結合を経由してペプチドに、例えば、式Ｉで示されるペプチドのリシンのＮＨ２基を介して連結される。ペプチドへのカップリングは、式Ｉで示されるペプチドのリシンに本来存在する−ＮＨ_２又はスペーサーへの連結のための官能基を経由して達成され得る。そのような連結の例にはアミド、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテル（thiother）及びオキシム結合が含まれる。

場合により、フルオロカーボン基からのペプチドの切断を許すように、切断可能なスペーサーエレメント（ペプチド又は非ペプチド性）が組み入れられ得る。スペーサーは、また、分子の合成を助けるために、並びにその安定性及び／又は溶解性を改善するために組み入れられる場合がある。スペーサーの例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、タンパク質分解酵素により切断され得るリシン又はアルギニンなどのアミノ酸が含まれる。

したがって、本発明によるアペリン類似体のフルオロカーボン基は、化学構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｌ）−［式中、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０であり、適宜の（Ｌ）は、ペプチドへの共有結合の結果として生じる官能基である］を有する。例えば、該官能基は、リシンの−ＮＨ２とアミド結合を形成しているカルボニル基である。関連するさらなる特定の実施態様では、ｍ＝５〜１５である。他の特定の実施態様では、ｍ＝５〜１５であり、ｙ＝１〜４である。

上式の特定の実施態様では、フルオロカーボン基は、式Ａ

で示されるパーフルオロウンデカン酸、又は代替的に式（Ｂ）

で示される２Ｈ，２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−パーフルオロウンデカン酸、又は式（Ｃ）

で示されるヘプタデカフルオロ−ペンタデカン酸の連結に起因する。

他の特定の実施態様では、本発明によるアペリン類似体のアシル基は、以下の構造：
ＣＨ３−ＣｙＨｘ−Ｃ（Ｏ）−［式中、ｙ＝７〜３０、ｘ＝２ｙである］を有する。関連するさらなる特定の実施態様では、ｙ＝１０〜２０である。例えば、ｙ＝１４である。

フルオロカーボン基又はＲＣ（Ｏ）−アシル基は、ペプチドのＮ末端部分に直接、又はリシンを経由してアルファ−アミノ基若しくはイプシロン−アミノ基のいずれかで連結している可能性がある。

一部の実施態様では、Ｘａａ１は、Ｄ−異性体アルギニン（Ｒ_Ｄ）であり、Ｘａａ２は、Ｄ−異性体グルタミン（Ｑ_Ｄ）であり、Ｘａａ３は、Ｄ−異性体ロイシン（Ｌ_Ｄ）であり、Ｘａａ４は、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）であり、Ｘａａ５は、Ｄ−異性体アラニン（Ａ_Ｄ）であり、Ｘａａ６は、ノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、Ｘａａ７は、４−Ｂｒフェニルアラニン（４−ＢｒＦ）である。

特別な実施態様では、本発明は：
ｉ）アセチル−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ−Ａｒｇ）−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｇｌｎ）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｌｅｕ）−Ｓｅｒ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ−Ｐｒｏ−（４−Ｂｒ）Ｐｈｅ（Ｐ９２化合物）、
ｉｉ）フルオロカーボン基がＮＨ２α末端に連結した、配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）のペプチド（ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ化合物）、
ｉｉｉ）フルオロカーボン基が最初のリシン残基のＮＨ２εに連結した、配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）のペプチド（ＪＦＭ Ｖ−０２２０Ｂ化合物）、
ｉｖ）フルオロカーボン基がリンカーＬリシンのリシン残基のεＮＨ２に連結した、配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）のペプチド（ＪＦＭ Ｖ−０２１０／１化合物）、
ｖ）フルオロカーボン基が最初のリシン残基のＮＨ２αに連結した、配列番号：２のアミノ酸配列（ＫＦＲ_ＤＲＱ_ＤＲＰＲＬ_ＤＳＡｉｂＫＡ_ＤＰＮｌｅＰ（４−Ｂｒ）Ｆ）のペプチド（フルオロ−Ｐ９２化合物）、
ｖｉ）アシル基が最初のリシン残基のＮＨ２αに連結した、配列番号：２のアミノ酸配列（ＫＦＲ_ＤＲＱ_ＤＲＰＲＬ_ＤＳＡｉｂＫＡ_ＤＰＮｌｅＰ（４−Ｂｒ）Ｆ）のペプチド（リポ−Ｐ９２化合物）、
ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｉｖ）の配列と実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは（ｉ）〜（ｉｖ）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列のペプチドを有するアペリン類似体、
ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｖ）のペプチドと比較して少なくとも１つの又は２つのアミノ酸保存的置換を有するペプチドを有するアペリン類似体
からなる群より選択されるアペリン類似体を提供する。

好ましい実施態様では、アペリン類似体は、（ｉ）アセチル−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ−Ａｒｇ）−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｇｌｎ）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｌｅｕ）−Ｓｅｒ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ−Ｐｒｏ−（４−Ｂｒ）Ｐｈｅ（本明細書においてＰ９２化合物と呼ばれる）又は（ｉｉ）ＮＨ２末端にフルオロカーボン基を有する配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）（本明細書においてＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ化合物と呼ばれる）又は（ｉｉｉ）フルオロカーボン基が最初のリシン残基のＮＨ２αに連結した、ＫＦＲ_ＤＲＱ_ＤＲＰＲＬ_ＤＳＡｉｂＫＡ_ＤＰＮｌｅＰ（４−Ｂｒ）Ｆ）（フルオロ−Ｐ９２化合物）又は（ｉｖ）アシル基が最初のリシン残基のＮＨ２αに連結した、ＫＦＲ_ＤＲＱ_ＤＲＰＲＬ_ＤＳＡｉｂＫＡ_ＤＰＮｌｅＰ（４−Ｂｒ）Ｆ）（リポ−Ｐ９２化合物）を含む、又はそれからなる。

特別な実施態様では、本発明は：
ｉ）アシル基ＲＣ（Ｏ）−がＮＨ２α末端に連結した、配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）のペプチド（ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ａ化合物）、
ｉｉ）アシル基ＲＣ（Ｏ）−が最初のリシン残基のＮＨ２εに連結した、配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）のペプチド（ＪＦＭ Ｖ−０２２０Ａ化合物）
ｉｉｉ）アシル基ＲＣ（Ｏ）−がリンカーＬリシンのリシン残基のεＮＨ２に連結した、配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）のペプチド（ＪＦＭ Ｖ−０２１０／２化合物）
ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の配列に実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは（ｉ）〜（ｉｉｉ）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列のペプチドを有するアペリン類似体、
ｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のペプチドと比較して、少なくとも１つ又は２つのアミノ酸保存的置換を有するペプチドを有するアペリン類似体
からなる群より選択されるアペリン類似体を提供する。

好ましくは、本発明によるアペリン類似体は、（ｉ）アペリン／アペリン受容体経路を活性化する、及び／又は代謝的に安定なアペリン受容体アゴニストである能力を有する。

当業者は、アペリン類似体が生物学的に活性かどうかを容易に決定することができる。例えば、アペリン／アペリン受容体経路を活性化する能力は、フォルスコリンにより誘導されるｃＡＭＰ産生の阻害、ＥＲＫリン酸化、及びアペリン受容体のインターナリゼーションを評価することにより決定することができる（例えば、実施例記載のように）。ＡＰＪ受容体に対するアペリン類似体のアゴニスト活性は、当技術分野において周知の任意の方法により決定され得る。例えば、本発明の化合物は、アペリン受容体の機能を推進することができるので、アゴニストは、ＡＰＪ受容体の天然アゴニスト（すなわちアペリン）及びその受容体を競合結合試験及び生物学的活性に関連する試験（下記参照）に使用することによりスクリーニングすることができる。

さらに、アペリン類似体がアペリン受容体アゴニストであるかどうかを決定するための方法は、Iturriozら（３９）に記載されている。米国特許出願公開第２００５／０１１２７０１号も、ＡＰＪ受容体を含むアンジオテンシン受容体様−１（ＡＰＪ受容体）に対するリガンドの同定のための試験システムを記載した。米国特許出願公開第６，４９２，３２４号に別の方法も記載されている。

このように、本発明に関連して、保存的置換は、当技術において類似の性質を有する別のアミノ酸の代わりの１つのアミノ酸の置換として認識されていることを理解すべきである。

本発明によると、第２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴ Ｐなどの適切な配列アライメントアルゴリズム及びデフォルトのパラメータを使用して決定される（４０）。

代謝的に安定なアペリン類似体の合成は、実施例（材料及び方法）に記載されている。

医薬組成物
本発明の別の態様は、対象への投与のために調製された医薬組成物であって、上記のような本発明の代謝的に安定なアペリン類似体の１つ以上の治療有効量を含む医薬組成物を含む。代謝的に安定なアペリン類似体の治療有効量は、投与経路、対象である哺乳類のタイプ及び処置されようとする対象の身体的な特徴に依存する。考慮できる具体的な要因には、疾患の重症度及び時期、体重、食事及び同時の投薬が含まれる。開示された化合物の治療有効量を決定するためのこれらの要因の関係は、当業者により理解されている。

より詳細には、本発明は、本発明の代謝的に安定なアペリン類似体を薬学的に許容し得る担体と一緒に含む医薬組成物に関する。

化合物は、薬学的に許容し得る担体と共に製剤化される。

本明細書記載の代謝的に安定なアペリン類似体のいずれかを、薬学的に許容し得るビヒクル又は賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成させてもよい。薬学的ビヒクル又は賦形剤は、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、無菌水、食塩水、及び生理的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含めた、ヒトへの組成物の投与のための標準的なビヒクル又は賦形剤である。組成物は、また、筋肉内、皮下、又はエアロゾル形態で投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順により投与される。薬学的賦形剤には、選択された分子に加えて、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存料、表面活性剤などが含まれる。これらの薬学的に許容し得る賦形剤又はビヒクルの一部の説明は、the American Pharmaceutical Association及びthe Pharmaceutical Society of Great Britainにより刊行されたThe Handbook of Pharmaceutical Excipientsから見出され得る。Remington: the Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)は、水溶液、凍結乾燥製剤又は他の乾燥製剤の形態の、本発明の化合物の薬学的送達に適した組成物及び製剤を記載している。医薬組成物は、また、降圧剤、抗炎症剤などの１つ以上の追加的な活性成分を含むことができる。

一般に、ビヒクルの性質は、採用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの医薬的及び生理的に許容される液体を含む注射用液を含有する。

固形経口製剤、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、カプレット剤、ジェルキャップ（gelcap）、丸剤及び錠剤（それぞれ、即時放出製剤、持続放出（timed release）製剤及び徐放製剤を含む）において、適切なビヒクル及び賦形剤には、非限定的に、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、流動促進剤、崩壊剤などが含まれる。錠剤及びカプセル剤は、投与が容易であるので、これらは、固形医薬賦形剤が明白に採用される最も有利な経口投薬ユニット剤形に相当する。所望であれば、錠剤は、標準技法により糖衣、ゼラチンコーティング、フィルムコーティング又は腸溶コーティングされ得る。

好ましくは、これらの組成物は、経口、鼻腔内、舌下、眼内、経皮、非経口、直腸、膣又は吹送手段による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤、無菌非経口液剤若しくは懸濁剤、定量エアロゾル若しくは液体スプレー、ドロップ、アンプル、自己注入装置、又は坐剤などのユニット投薬形態である。

生物学的に中性の担体に加えて、投与されるべき医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、保存料、及びｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム又はモノラウリン酸ソルビタンなどの、少量の無毒性補助物質を含有する可能性がある。

特定の実施態様では、組成物は、気道へのそれらの例えば吸入による投与のために製剤化される。したがって、本発明の医薬組成物は、吸入に適切な溶液として製剤化され得る。

投薬は、抗感染効果が達成されるように当業者により選択され、使用される投与経路及び投薬形態に依存する。単回用量又は分割用量で対象に投与されるペプチドの合計１日用量は、例えば、１日約０．００１〜約１００mg/kg体重及び好ましくは０．０１〜１０mg/kg/日の量であり得る。投薬単位組成物は、まとめると１日用量になるように使用され得るような分割量を含有し得る。しかし、任意の特定の患者に特定の用量レベルが、体重、全身の健康状態、性別、食事、時間及び投与経路、吸収及び排泄速度、他の薬物との組み合わせ並びに処置される特定の疾患の重症度を含めた多様な要因に依存することが理解されている。

治療応用
上に定義される代謝的に安定なアペリン類似体及び本発明の医薬組成物は、アペリン受容体により媒介される疾患、特に心血管疾患（心不全、腎不全、高血圧症、肺高血圧症）、多発性嚢胞腎疾患、低ナトリウム血症及びＳＩＡＤＨを処置するために使用される。

特に、本発明の代謝的に安定なアペリン類似体は、対象における高血圧症を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少させる能力を有する。

本発明は、また、アペリン受容体により媒介される疾患の処置を必要とする患者における該処置の方法であって、該患者に本発明の代謝的に安定なアペリン類似体を投与することを含む方法を提供する。

様々な疾患の病態生理に果たすアペリンの役割は、（４１）に記載されている。

したがって、本発明の代謝的に安定なアペリン類似体は、中枢神経系の機能（バソプレッシンニューロンの活動及び全身バソプレッシン放出、飲水行動、摂食）、心血管機能（血圧、心筋収縮性）、免疫機能、消化管機能、代謝機能、生殖機能などのモジュレーションに適切であり、したがって、多様な疾患のための治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。

したがって、本発明は、哺乳類におけるアペリンにより媒介される疾患、状態又は障害を治療及び／又は予防するための方法であって、それを必要とする哺乳類に、本発明の代謝的に安定なアペリン類似体又はその医薬組成物の治療有効量を投与する段階を伴う方法に関する。

代謝的に安定なアペリン類似体の投与により治療又は予防できる疾患、状態及び／又は障害は、例えば：
− 心血管疾患：心不全、腎疾患（例えば腎不全、腎炎など）、高血圧症、肺高血圧症、硬変、動脈硬化症、肺気腫、肺水腫；脳卒中、脳虚血、敗血症における心筋障害
− 神経原性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症などの糖尿病性合併症）のような病理を含めた抗利尿ホルモン不適切分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）、敗血症性ショック、口渇トラブル；
− 代謝疾患：肥満、食欲不振、過食症、大食症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂血症；
− 老人性認知症、脳血管性認知症、家系性変性疾患（genealogical denaturation degenerative disease）（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）が原因の認知症、感染症（例えば、クロイツフェルトヤコブ病などの遅発性ウイルス感染）に起因する認知症、内分泌疾患、代謝疾患、又は中毒（例えば甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール依存症、様々な薬物、金属、若しくは有機化合物により起こる中毒）に関連する認知症、腫瘍（例えば脳腫瘍）により起こる認知症、及び外傷性疾患（例えば慢性硬膜下血腫）が原因の認知症などの様々なタイプの認知症、抑うつ、過活動児童症候群（小頭症）、意識障害、不安障害、統合失調症、恐怖症；
− サルコペニア：身体障害、生活の質の不良及び死亡などの有害転帰のリスクのある、骨格筋量及び骨格筋強度の進行性で全体的な減損により特徴付けられる症候群、
− 腎臓の嚢胞性遺伝障害である多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ又はＰＣＫＤ、多発性嚢胞腎症候群としても公知）［２種類のＰＫＤ：常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）及びより一般的でない常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患（ＡＲＰＫＤ）がある。ＰＫＤは、ＰＫＤ１又はＰＫＤ２のいずれかにおける機能喪失型変異により起こる］；
− １３５mEq/L未満の血清ナトリウムレベルと定義され、血清レベルが１２５mEq/Lを下回る場合に重症と見なされる低ナトリウム血症（うっ血性心不全、肝不全、腎不全、ＳＩＡＤＨ又は肺炎などの多くの内科的疾患は、低ナトリウム血症に関連する場合がある）
である。

代謝的に安定なアペリン類似体は、術後栄養状態改善剤として、又は変力剤、血管拡張薬又は水利尿薬として使用される。

好ましい実施態様では、対象は、心血管疾患及び／又はＳＩＡＤＨを患う。

さらに、本発明は、抗凝集剤の血小板処置を、それを必要とする対象において使用するための、代謝的に安定なアペリン類似体に関する。

本明細書に使用される用語「対象」は、任意の対象（好ましくはヒト）を表す。好ましくは、対象は、虚血状態に苦しむ又は虚血状態を有するリスクがある。

用語「虚血状態」は、血小板凝集により形成される血餅が原因の、少なくとも１つの器官又は組織における血液供給の制限に起因する任意の状態を表す。これらの状態は、典型的には、血餅による血管の閉塞に起因する。例えば虚血状態には、非限定的に、腎虚血、網膜虚血、脳虚血、脚虚血及び心筋虚血が含まれる。

本発明のアペリン類似体は、特に、非閉塞性血栓又は閉塞性血栓のいずれかの可能性がある血栓の形成を予防するために特に適切である。特に、代謝的に安定なアペリン類似体は、急性冠動脈閉塞などの動脈血栓形成を予防することが想定されている。本発明の代謝的に安定なアペリン類似体は、さらに、罹患した動脈の開存を維持するため、ＰＣＴＡ又はステントの留置後などに再狭窄を予防するため、狭窄した動脈内の血栓形成を予防するため、血管形成術、アテローム切除術又は動脈ステント留置後の過形成を予防するため、不安定狭心症を予防するため、及び一般的に血管系における閉塞性症候群を予防又は治療するための抗血栓処置方法において提供される。

したがって、本発明のアペリン類似体は、血栓症、並びに特定の静脈及び動脈血栓症の予防に有用であり得る。

本発明のアペリン類似体は、また、急性冠症候群を有する患者を、特に冠動脈におけるさらなるイベントを予防することにより、処置するために使用され得る。

本発明のアペリン類似体は、最終的に、血管損傷後の再狭窄を予防するために使用され得る。

本発明のアペリン類似体は、最終的に、低ナトリウム血症を患う患者を処置するために使用され得る。

本発明のアペリン類似体は、最終的に、多発性嚢胞腎疾患を患う患者を処置するために使用され得る。

本発明は、さらに、以下の図面及び実施例により例証される。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

ＣＨＯ細胞に安定発現されるラットアペリン受容体−ＥＧＦＰのインターナリゼーションに及ぼすＫ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６及びＰ９２の効果。 ２Ａ：ノルアドレナリン（ＮＡ）により予備収縮したラット大動脈輪に対する、２Ｂ：アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）により予備収縮したラット糸球体細動脈に対する、Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６及びＰ９２の血管弛緩効果。 ２Ａ：ノルアドレナリン（ＮＡ）により予備収縮したラット大動脈輪に対する、２Ｂ：アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）により予備収縮したラット糸球体細動脈に対する、Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６及びＰ９２の血管弛緩効果。 静脈内注射後に麻酔された正常血圧ラットにおける動脈圧に及ぼす２用量のＫ１７Ｆ及びＰ９２の降圧効果の動態（３Ａ及び３Ｂ）。 静脈内注射後に麻酔された正常血圧ラットにおける動脈圧に及ぼす２用量のＫ１７Ｆ及びＰ９２の降圧効果の動態（３Ａ及び３Ｂ）。 静脈内注射後の麻酔された正常血圧ラットにおける平均動脈圧（ＭＡＢＰ）に対するＫ１７Ｆ又はＰ９２の用量反応曲線。 麻酔された正常血圧ラットにおける３用量での静脈内注射後の動脈圧に及ぼすＪＦＭ Ｖ−１９６Ｂの降圧効果の動態。 覚醒している体水分正常マウス及び脱水症マウスにおける全身ＡＶＰ放出に及ぼすＫ１７Ｆ又はＰ９２の脳室内注射の効果。 単離された潅流ラット心臓調製物における心収縮性に及ぼすＫ１７Ｆ及びＰ９２の効果。 アルキル基ペプチド及びフルオロカーボン基ペプチドの化学構造。 ＣＨＯ細胞におけるラットアペリンＲ−ＥＧＦＰのインターナリゼーションに及ぼすｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６、Ｋ１７Ｆ、Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの効果。ｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６、Ｋ１７Ｆ、Ｐ９２、Ｋ１７Ｆ及びＪＦＭ Ｖ−０１９６ＢがアペリンＲのインターナリゼーションを誘導する能力を、異なる化合物の漸増する濃度（１００pM〜１０nM）で３７℃で２０分間処置されたラットアペリンＲ−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞において研究した。次に、細胞を固定し、共焦点顕微鏡法により分析した。画像は、少なくとも３回の独立する実験からのデータの代表である。 Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ及びアペリン類似体の血管弛緩効果。（Ａ）ＮＡ（３μM）により予備収縮したラット大動脈におけるｐＥ１３Ｆ（黒）、Ｐ２６（緑）、Ｋ１７Ｆ（青）、Ｐ９２（赤）及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ（紫）の累積濃度反応曲線。（Ｂ）Ｌ−ＮＡＭＥ（２０μM）の不在下又は存在下でのＡｎｇＩＩに対するラット糸球体細動脈の収縮応答に及ぼすＫ１７Ｆ、Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの効果。細動脈直径を基礎状態で測定し（対照）、次にＡｎｇＩＩが誘導する血管収縮細動脈へのＡｎｇＩＩ（１０nM）の添加１分後及び５００nM Ｋ１７Ｆ、Ｐ９２又はＪＦＭＶ−０１９６Ｂの添加１分後に測定した。データは、５〜８回の独立する実験の平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ及びアペリン類似体の血管弛緩効果。（Ａ）ＮＡ（３μM）により予備収縮したラット大動脈におけるｐＥ１３Ｆ（黒）、Ｐ２６（緑）、Ｋ１７Ｆ（青）、Ｐ９２（赤）及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ（紫）の累積濃度反応曲線。（Ｂ）Ｌ−ＮＡＭＥ（２０μM）の不在下又は存在下でのＡｎｇＩＩに対するラット糸球体細動脈の収縮応答に及ぼすＫ１７Ｆ、Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの効果。細動脈直径を基礎状態で測定し（対照）、次にＡｎｇＩＩが誘導する血管収縮細動脈へのＡｎｇＩＩ（１０nM）の添加１分後及び５００nM Ｋ１７Ｆ、Ｐ９２又はＪＦＭＶ−０１９６Ｂの添加１分後に測定した。データは、５〜８回の独立する実験の平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 水欠乏が誘導する全身ＡＶＰ放出に及ぼすマウスでのＫ１７Ｆ、Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂのｉ．ｃ．ｖ．注射の効果。２４時間水欠乏後に、マウスに、食塩水又は漸増する量のＪＦＭＶ−０１９６Ｂ（０．００１〜０．０３μg）又はＫ１７Ｆ（１μg）１０μlをｉ．ｃ．ｖ．で施し、このマウスに食塩水又はＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ（１μg）１０μlをｉ．ｃ．ｖ．で施した自由摂水マウスと比較した。注射の１分後に血漿ＡＶＰレベルをＲＩＡにより決定した。ヒストグラムは、状態の各セットについての動物７〜２０匹からの血漿ＡＶＰレベル（pg/ml）の平均±ＳＥＭを表す。データをGraphPad Prism（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）で解析した。一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）に続くBonferroni事後検定を用いて統計的比較を行った。＃＃＃体水分正常と比べてＰ＜０．００１；食塩水を与えられた絶水マウスと比べて＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。挿入図：意識のある絶水マウスでのＡＶＰ放出に及ぼすＪＦＭＶ−０１９６Ｂの用量反応のＳ字状曲線 フルオロ−Ｐ９２化合物の化学構造 リポ−Ｐ９２化合物の化学構造

実施例：１ 材料及び方法
Ｉ − 薬物及び放射性リガンド
１）Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ及びそれらの誘導体をそれぞれPolyPeptide Laboratories（Strasbourg, France）及びGL Biochem（Shangai, China）が合成した。^１２５Ｉ−ｐＥ１３Ｆ（Bolton Hunterによりリシン^８でヨウ素化されている）をPerkin Elmer（Wellesley, MA, USA）から購入した。
２）アペリン−１３から誘導されたアルキルペプチド及びパーフルオロアルキルペプチドの合成を、Pr M. Hibert、Dr. D. Bonnet及びDr. JF Margatheにより指揮されるTherapeutic Innovationの研究所で行った。

（ｉ）ピペリジン／ＤＭＦ；（ｉｉ）ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１４ＣＯ_２Ｈ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；（ｉｉｉ）ＣＦ_３（ＣＦ_２）_７（ＣＨ_２）_２ＣＯ_２Ｈ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；（ｉｖ）ＴＦＡ／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ／Ｍｅ_２Ｓ／Ｈ_２Ｏ／ＮＨ_４Ｉ

一般的方法
Applied Biosystem ABI 433A合成装置（Appelar, France）を使用してＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂（２７６mg、０．３７mmol/g）上での標準自動化ＳＰＰＳによりアペリン（６２−７７）配列を合成した。溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でカップリング試薬として２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、及びジイソプロピルエチルアミン（Huenig塩基）（ＤＩＰＥＡ）を使用して１０倍過剰のＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸誘導体のカップリングにより伸長を実施した。各カップリング段階の後に、ピペリジンによる処理に続く３０１nmのＵＶにより、Ｆｍｏｃの脱保護を行った。溶媒としてＤＭＦ中で、カップリング試薬としてＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、及びＤＩＰＥＡを使用して、５倍過剰のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨのいずれかをカップリングさせることにより、Ｌｙｓ（６１）を手作業で導入した。C18 Ascentis Express（２．７μm、４．６mm×７５mm）を用いて、直線勾配（７．５分かけて溶媒Ａ中に溶媒Ｂが５％から１００％、流速１．６mL・min^-1、検出２２０nm；溶媒Ａ：水／０．１％ ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ）を使用して分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離を行った。Waters XBridge RP-C18カラム（５μm、１９×１００mm）を用いて、直線勾配（溶媒Ａ中の溶媒Ｂ；溶媒Ａ：水／０．１％ ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ；流速２０mL.min^-1；２２０nmで検出）を使用して、半分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離を行った。精製された化合物は、下に示される保持時間（ｔ_Ｒ）で単一ピークで対称のピークとして溶出した（それにより純度≧９５％が確認された）。Bruker MicroTof質量分析計を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及び飛行時間型分析計（ＴＯＦ）を使用して、高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を取得した。

アルキルペプチド及びパーフルオロアルキルペプチドの合成のための一般的プロトコール
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｐ（６２−７７）−Wang樹脂（１）又はＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＦＲ（Ｐｂｆ）Ｒ（Ｐｂｆ）ＱＲ（Ｐｂｆ）ＰＲ（Ｐｂｆ）ＬＳ（ｔＢｕ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＧＰＭＰＦ−Wang樹脂（２）（１当量）をＤＭＦ中で膨潤させ、過剰な溶媒を濾過により除去した。ピペリジンのＤＭＦ溶液（２０%v/v-１mL）を添加し、この混合物を室温で１５分間振盪した。溶液を排出し、操作を１５分間繰り返した。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ及びＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。別のバイアルの中、ＤＩＰＥＡ（５当量）をヘキサデカン酸又は４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカン酸（２当量）、ＨＢＴＵ（２当量）、及びＨＯＢｔ（２当量）のＤＭＦ溶液（１mL）に添加した。この混合物を室温で１分間撹拌し、樹脂に添加した。この混合物を室温で９０分間撹拌した。溶液を排出し、この手順を９０分間繰り返した。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、及びジエチルエーテルで洗浄し、次に真空中で乾燥させた。乾燥した樹脂をＴＦＡ／フェノール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／Ｍｅ_２Ｓ／水／ＮＨ_４Ｉ、８１／５／５／２．５／２／３／１．５（試薬Ｈ、２mL）で処理し、この混合物を室温で３時間振盪した。溶液を収集し、ビーズをＴＦＡで洗浄した。溶液を真空中で蒸発させ、粗生成物を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。予期される生成物が凍結乾燥により産出した。

ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ａの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＦＲ（Ｐｂｆ）Ｒ（Ｐｂｆ）ＱＲ（Ｐｂｆ）ＰＲ（Ｐｂｆ）ＬＳ（ｔＢｕ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＧＰＭＰＦ−Wang樹脂（１５μmol）、ヘキサデカン酸（７．７mg、３０μmol）、ＨＢＴＵ（１１．３mg、３０μmol）、ＨＯＢｔ（４．６mg、３０μmol）、及びＤＩＰＥＡ（１３．１μL、７５μmol）を一般的な手順により反応させ、標題化合物が白色固体として産出した（７．５mg、１６％）。ｔ_Ｒ＝４．５０min。（純度＞９８％［２２０nm］）；Ｃ_１１２Ｈ_１９１Ｎ_３４Ｏ_２１Ｓ（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）についてのＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の計算値４７６．０９２８７；実測値４７６．０９３０８。

ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＦＲ（Ｐｂｆ）Ｒ（Ｐｂｆ）ＱＲ（Ｐｂｆ）ＰＲ（Ｐｂｆ）ＬＳ（ｔＢｕ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＧＰＭＰＦ−Wang樹脂（１５μmol）、４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカン酸（１４．８mg、３０μmol）、ＨＢＴＵ（１１．３mg、３０μmol）、ＨＯＢｔ（４．６mg、３０μmol）、及びＤＩＰＥＡ（１３．１μL、７５μmol）を一般的手順により反応させ、標題化合物が白色固体として産出した（２０．６mg、４９%）。ｔ_Ｒ＝４．０７min。（純度＞９８％［２２０nm］）；Ｃ_１０７Ｈ_１６４Ｆ_１７Ｎ_３４Ｏ_２１Ｓ（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）についてのＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の計算値５２３．２４５１９；実測値５２３．２４５０７。

ＪＦＭ Ｖ−０２２０Ａの合成
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＦＲ（Ｐｂｆ）Ｒ（Ｐｂｆ）ＱＲ（Ｐｂｆ）ＰＲ（Ｐｂｆ）ＬＳ（ｔＢｕ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＧＰＭＰＦ−Wang樹脂（１０μmol）、ヘキサデカン酸（５．１mg、２０μmol）、ＨＢＴＵ（７．５mg、２０μmol）、ＨＯＢｔ（３．１mg、２０μmol）、及びＤＩＰＥＡ（８．７μL、５０μmol）を一般的手順により反応させ、標題化合物が白色固体として産出した（１５．８mg、２５％）。ｔ_Ｒ＝４．５０min。（純度＞９８％［２２０nm］）；Ｃ_１１２Ｈ_１９１Ｎ_３４Ｏ_２１Ｓ（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）についてのＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の計算値４７６．０９２８７；実測値、４７６．０９０９６。

ＪＦＭ Ｖ−０２２０Ｂの合成
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＦＲ（Ｐｂｆ）Ｒ（Ｐｂｆ）ＱＲ（Ｐｂｆ）ＰＲ（Ｐｂｆ）ＬＳ（ｔＢｕ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＧＰＭＰＦ−Wang樹脂（１０μmol）、４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカン酸（９．８mg、２０μmol）、ＨＢＴＵ（７．５mg、２０μmol）、ＨＯＢｔ（３．１mg、２０μmol）、及びＤＩＰＥＡ（８．７μL、５０μmol）を一般的手順により反応させ、標題化合物が白色固体として産出した（１６．８mg、２５％）。ｔ_Ｒ＝４．０７min。（純度＞９８％［２２０nm］）；Ｃ_１０７Ｈ_１６４Ｆ_１７Ｎ_３４Ｏ_２１Ｓ（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）についてのＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の計算値５２３．２４５１９；実測値５２３．２４３４９。

ＩＩ − トランスフェクション及び安定細胞系の樹立
ＣＨＯ−Ｋ１（American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA）細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．５mM グルタミン、１００ユニット/mL ペニシリン及び１００μg/mL ストレプトマイシン（全てInvitrogen, Carlsbad, CA, USAから）を補充したＨａｍのＦ１２培地中で維持した。Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、細胞に野生型アペリン受容体−ＥＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトし、以前に記載されたように安定細胞系を樹立した（４２）。

ＩＩＩ − 細胞膜調製物及び放射性リガンド結合実験
野生型ラットアペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯからの粗膜調製物を、以前に記載されたように調製した（３９）。単独又は様々な濃度（１０^−１４M〜１０^−４M）のアペリン若しくはその類似体の存在下の結合緩衝液（５０mM Ｈｅｐｅｓ、５mM ＭｇＣｌ_２、１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中で、膜調製物（膜タンパク質総質量０．５〜３００μg/アッセイ）を２．１０^−１０M ^１２５Ｉ−ｐＥ１３Ｆ（PerkinElmer Life Sciences）と共に２０℃で６０分間インキュベートした。氷冷した結合緩衝液を添加することにより反応を停止させ、ガラスマイクロファイバーフィルター（Whatman GF/Cフィルター）を通して濾過した。放射能をWizard 1470 Wallacガンマカウンター（Perkin Elmer, Turku, Finland）で計数した。

ＩＶ − ｃＡＭＰアッセイ法
ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技法に基づくcAMP dynamic 2アッセイキット（Cisbio Bioassays, Codolet, France）を使用してｃＡＭＰを定量した。刺激緩衝液（ＨＢＳＳ、５mM Ｈｅｐｅｓ、０．１％ ＢＳＡ安定化剤、１mM ＩＢＭＸ、ｐＨ７．４）中で刺激を行った。簡潔には、ラットアペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞 ２，０００個／ウェルを３８４ウェルプレートに添加し、１０^−６M フォルスコリン（ＦＳＫ）及び漸増する濃度（１０^−１４〜１０^−４M）のアペリン又はその類似体を用いて室温で３０分間刺激した。次に、細胞を溶解させ、製造業者の説明書に従ってｃＡＭＰレベルを決定した。

Ｖ − インターナリゼーションアッセイ法
ラットアペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞を用いて、以前に記載されたようにインターナリゼーションアッセイを行った（４３）。簡潔には、細胞を１０^−６M アペリン又はその類似体で処理し、それらを３７℃で２０分間インキュベートすることにより、インターナリゼーションをトリガーした。次に、共焦点顕微鏡分析のために細胞をAquapolymount（Polysciences, Warrington, PA, USA）中に取り付けた（詳細については（４２）を参照されたい）。

ＶＩ − ＥＲＫ１／２リン酸化アッセイ法
Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ９２及びＰ２６がＥＲＫ１／２のリン酸化を誘導する能力を比較するために、野生型アペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞を、漸増する濃度のＫ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ９２及びＰ２６（１０^−１１〜１０^−５M）で１０分間処理した。次に、Alphascreen technologyによりＥＲＫ１／２のリン酸化をモニタリングした。

ＶＩＩ − マウス血漿中での安定性
３７℃のマウス血漿中でのＫ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６、Ｐ９２、ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ａ及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの安定性を決定した。各化合物について、原溶液（水中に１００μM）を血漿に希釈して最終インキュベーション濃度５μMにした。０．１％トリフルオロ酢酸を含有する氷冷アセトニトリル １容を添加することにより、それぞれｔ_０及び４時間で、３７℃でのインキュベーションを停止した。試料を１分間ボルテックス撹拌し、次に４℃で遠心分離した後、上清をＬＣ−ＭＳに注入した。Kinetex RP-C₁₈カラム（２．６μm、１００Å、５０×４．６mm）を用いて、直線勾配（溶媒Ａ中に溶媒Ｂ、溶媒Ａ：水／０．０５％ ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル；流速２mL.min^-1、３５８nmで検出）を使用して分析を行った。ｔ_０に対する残留被験化合物のパーセンテージを、クロマトグラムのピーク面積をモニタリングすることにより測定した。

ＶＩＩＩ − 動物
餌及び水を自由摂取させて１２時間の明暗サイクル下で雄性Sprague Dawleyラット（１３０〜１８０g ＢＷ）、雄性成Wistarラット（３００〜４００g）、及び雄性Swissマウス（１８〜２０g）を維持し、これらの動物をCharles River Laboratories（L’Arbresle, France）から入手した。実験動物の管理と使用のための最新の施設内ガイドラインに従って全ての動物実験を実施した。

ＩＸ − 糸球体細動脈の顕微解剖
以前に記載されたように、細動脈の顕微解剖のために雄性ラットの左腎を調製した（４４）。実体顕微鏡観察下で糸球体細動脈を単離した。輸入細動脈及び筋肉の輸出細動脈を糸球体と共に単離し、Helouら（４５）により以前に記載されたようにその形態及び腎皮質内部での局在により同定した。

Ｘ − 糸球体細動脈の直径の測定
これらの実験のために、糸球体に付属した輸入細動脈及び筋輸出細動脈を顕微解剖した。対照、１０^−９M ＡｎｇＩＩ及び１０^−９M ＡｎｇＩＩ＋５．１０^−７M Ｐ９２について３つの実験条件で１分間隔でデジタルカメラ（カメラNikon DXM1200を装着した顕微鏡LEICA DMRB）を用いて同じ細動脈の連続写真を記録した。細動脈の直径をAdobe Photoshop CSで測定した。糸球体の約１００μm上流の距離で直径を測定し、各細動脈について３つ組で行った。ステージのマイクロメーターを使用して較正を行った。統計解析のために各実験条件についての平均直径を使用した。輸入細動脈と筋肉の輸出細動脈との間の細動脈の直径の差を考慮して（４５）、細動脈直径の変動を、対象に対するパーセンテージで表現した。

ＸＩ − 大動脈輪の調製及び等尺性張力の記録
以前に記載されたように、ラット大動脈輪を用いて実験を行った（３９）。ラットに麻酔し（ペントバルビタールナトリウム、腹腔内経路により６０mg/kg）、胸部大動脈を慎重に切除し、以下（mmol/L）：１１８．３ ＮａＣｌ、４．７ ＫＣｌ、２．５ ＣａＣｌ_２、１．２ ＭｇＳＯ_４、１．２ ＫＨ_２ＰＯ_４、２５ ＮａＨＣＯ_３、０．０１６ ＥＤＴＡ及び１１．１ グルコースを含有する冷生理食塩水溶液（ＰＳＳ）中に入れた。大動脈から過剰の結合組織及び脂肪を取り除き、長さ約３〜４mmの輪に切断した。内皮の管腔表面の損傷を避けるよう特別な注意を払った。５％ ＣＯ_２、９５％ Ｏ_２の混合物を連続的に通気した，３７．４℃でｐＨ７．４のＰＳＳ ２０mLを満たしたジャケット型オルガンバス２０mL中に大動脈輪を懸濁した。大動脈輪の一端を組織ホルダーに接続し、他方を等尺性力変換器（EMKA Technologies, Paris, France）に接続した。輪を休止張力２ｇで１２０分間平衡化した。平衡化期間中に、輪を３０分ごとに洗浄した。次に、ＮＡ（３×１０⁻⁸mol/L）で予備収縮した輪における完全性又は内皮の不在をチェックするために、アセチルコリン（Ａｃｈ、１０^−４mol/L）に対する最初の弛緩を実行した。ベースライン張力までＰＳＳですすいだ後、輪を９０分間平衡化した。この平衡期間の終わりに、ＮＡ（３×１０^−６mol/L）を用いた予備収縮後に、Ｋ１７Ｆ（１０^−１２〜１０^−４M）、ｐＥ１３Ｆ（１０^−１２〜１０^−４M）、Ｐ２６（１０^−１２〜１０^−４M）又はＰ９２（１０^−１２〜１０^−４M）に対する累積濃度反応曲線を描いた。各濃度の薬物を、先行する濃度で最大効果となったときに添加した。将来の分析（Datanalyst v2.1, EMKA Technologies, Paris）のために、濃度反応曲線をIOX v2.4（EMKA Technologies, Paris）によりＰＣに継続的に記録した。

ＸＩＩ − 麻酔したWistarラットにおける血圧記録
Wistarラットを、１００mg/kg腹腔内（ｉ．ｐ．）イナクチン［５−エチル−２−（１ｃ−メチルプロピル）−２−チオバルビツール酸］（RBI, IL, USA）で麻酔した。アペリン断片（Ｋ１７Ｆ又はＰ９２）をＫｒｅｂｓ緩衝液（mM: ＮａＣｌ １１８．５、ＫＣＬ ４．７５、ＣａＣｌ２ １．４、ＮａＨＣＯ３ ２４、ＭｇＳＯ４ １．１９、ＫＨ２ＰＯ４ １．２１、グルコース １１）０．２ml中に溶解させた。結果として生じた溶液を、右大腿静脈に挿入されたカテーテルを介してラットに投与し、直後にKrebs緩衝液０．２ml単独に切り替えて静脈カテーテルを洗い流した。以前に記載されたように（４８）、平均動脈圧（ＭＢＰ）のモニタリングのために、以前に記載されたように、右大腿静脈に追加的なカテーテルを挿入した（４７）。Maclabシステム（Phymep, Paris, France）に連結したCOBE CDX III圧変換器（Phymep, Paris, France）に動脈カテーテルを接続した。血圧シグナルによりＨＲ測定をトリガーした。実験全体にわたりＢＰを連続的に記録した。動脈カテーテルが圧変換器に接続された１５分後に、各ラットは、アペリン断片のｉ．ｖ．注射を受けた。

各動物について、注射の直後１５分間のΔＭＢＰの曲線下面積（ＡＵＣ、ベースラインと平均ＢＰとの間の面積）を計算した。次に、各群についての平均ＡＵＣを計算した。独立Student ｔ検定を使用して、投与された物質（Ｋ１７Ｆ又はＰ９２、ｉ．ｖ．）に対して観察されたＢＰが統計的に有意な差を有するかどうかを判定した。

ＸＩＩＩ − マウスにおける脳室内注射及びＡＶＰのラジオイムノアッセイ
水を自由摂取させた覚醒マウス又は以前に記載されたように２４時間絶水した覚醒マウス（４）に、Ｋ１７Ｆ（１μg）及びＰ９２（０．０１μg〜１μg）をｉ．ｃ．ｖ．経路により投与した。注射の１分後に動物を屠殺し、０．３M ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）５０μlを含有する冷チューブ内に体幹血（trunk blood）（０．５〜１ml）を収集した。特異的バソプレッシン−［Ａｒｇ^８］ＲＩＡキット（Peninsula Laboratories International Inc, San Carlo, USA）を使用することにより、以前に記載されたように（４）、血漿０．２mlからＡＶＰ濃度を決定した。

ＸＩＶ − 単離された潅流ラット心調製物及び心筋収縮能の記録
ペントバルビタールナトリウム（５０mg/kg、腹腔内）で動物を麻酔した。ヘパリン（２００IU/kg）を大腿静脈内に投与した。心臓を手早く切除し、以下（mM）：ＮａＣｌ １１８．５、ＫＣｌ ４．７５、ＭｇＳＯ_４ １．１９、ＫＨ_２ＰＯ_４１．２、ＮａＨＣＯ_３ ２４、ＣａＣｌ_２ １．４及びグルコース １１を含有する氷冷Krebs-Henseleit溶液中で停止させた。次に、潅流装置に心臓を取り付け、蠕動ポンプ（Minipuls 3, model 172）を用いて一定流速６ml/minで上行大動脈を介して逆行性潅流を樹立した。ｐＨ７．４を保つために９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２を通気している３７℃のKrebs-Henseleit重炭酸緩衝液で心臓を潅流した。右房に挿入したサーモプローブにより温度を連続的にモニタリングした。心臓は洞調律で自発的に拍動する。国内食品ラップ製液体充填等容性バルーンを、左心耳を経由して左室内に導入し、膨張させて、８〜１０mmHgの前負荷を与えた。データ取得システム（Chart V5, Powerlab 16/30, ADInstruments, UK）を経由して左室圧を連続的にコンピューターに記録した。左室圧の最大上昇速度（ｄＰ／ｄｔｍａｘ）及び心拍数を左室圧から得た。２０分の平衡時間の後に、輸液ポンプ（Harvard Apparatus Pump 11）を用いて潅流液に速度１００μl/minで３０分間添加した薬物により心臓を処置した。

ＸＶ− データ及び統計解析
結合実験及びｃＡＭＰ実験からのデータをGraphPad Prism（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）で解析した。Studentの独立ｔ検定又はDunnetの事後検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて統計的比較を行った。Studentの独立ｔ検定又は加重平均に対する一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続くFisherの検定を使用して、カルシウム測定についての統計的な差を評価した。

大動脈の等尺性張力の記録値を、平均±ｓｅｍとして示す。一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｅ_ｍａｘ及びｐＤ_２の比較）又は繰り返し測定についてのＡＮＯＶＡに続くFisherの制約付き最小有意性（濃度−反応曲線の比較）を使用して、結果の有意性を評価した。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。

実施例：２ 結果
１ − ＣＨＯ細胞に安定発現されたラットアペリン受容体−ＥＧＦＰに対するＫ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ及びアペリン類似体の親和性
ｐＥ１３Ｆをインビボ酵素分解から保護するために、本発明者らは、ｐＥ１３Ｆの各アミノ酸をそのＤ−異性体又は合成アミノ酸により置き換える。本発明者らは、最初に、ｐＥ１３Ｆのどのアミノ酸がアペリン受容体への改変ペプチドの結合に影響せずに置き換えることができるかを決定する。アペリン受容体についてのＤ−スキャニング実験からのＫｉ値は、ｐＥ１３Ｆについて０．６±０．１nMであり、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｒｇ^２）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｒｇ^４）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｌｅｕ^５）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｓｅｒ^６）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｈｉｓ^７）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｌｙｓ^８）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｌａ^９）及びｐＥ１３（Ｄ−Ｐｈｅ^１３）についてそれぞれ３７．５±１１．３nM、４０．２±９．０nM、３．４±０，４nM、２３．３±４．７nM、４．１±２．０nM、１２．２±４．６nM、４．３±１．８nM、８．６±２．７nMであった。本発明者らは、また、Ａｃ−Ｒ１２Ｆについて１．４±０．７nM、ｐＥ１３Ｆ（Ａｉｂ^７）について２．６±２．３nM、ｐＥ１３Ｆ（Ｎｌｅ^１１）について０．８±０．２nM及びｐＥ１３（４Ｂｒ−Ｐｈｅ^１３）について０．０６±０．０２nMという、アペリン受容体に対するＫｉ値を得た。ｐＥ１３ＦにおけるｐＧｌｕの欠失並びにＮ−アセチルＡｒｇ^２、Ｄ−Ｌｅｕ^５、Ａｉｂ^７、Ｄ−Ａｌａ^９、Ｎｌｅ^１１及び４Ｂｒ−Ｐｈｅ^１３の付加の組み合わせは、化合物Ｐ２６を提供し、この化合物は、Ｋｉ値２．１±０．４nMを示した（表２）。

表１にＫ１７Ｆでの置換の組み合わせについてのＫｉを示した。置換Ｄ−Ｌｅｕ^９、Ａｉｂ^１１、Ｄ−Ａｌａ^１３、Ｎｌｅ^１５及び４Ｂｒ−Ｐｈｅ^１７と一緒のＬｙｓ^１のアセチル化は、親和性０．１１±０．１４nMを有する化合物Ｐ９６を産生した。５位での置換、Ｄ−Ｇｌｎ^５を加えることで、化合物Ｐ９５（０．０３nM）の親和性がＫ１７Ｆと比較してなお１０倍改善する。最終的に、Ｐ９５に行われた全ての変化に加えて本発明者らが３位にＤ−Ａｒｇを導入した化合物Ｐ９２は、Ｋ１７Ｆに類似する親和性０．２１±０．１３nMを示した。

最終的に、Ｋ１７Ｆ並びに類似体Ｐ２６及びＰ９２についてのＫｉ値は、それぞれ０．３±０．１nM、２．１±０．４nM、０．２±０．０６nMであった（表２）。

２ − ラットアペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞におけるフォルスコリン誘導ｃＡＭＰ産生の阻害に及ぼす効果
ラットアペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞を、漸増する濃度のＫ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ及びそれらの類似体（１０^−１４〜１０^−６M）の存在下で１０^−６M フォルスコリンと共にインキュベーションすることで、ｐＥ１３Ｆ及びＫ１７ＦについてそれぞれＩＣ_５０値１．０±０．２nM及び０．３±０．２nM、並びにｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｒｇ^２）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｒｇ^４）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｌｅｕ^５）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｓｅｒ^６）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｈｉｓ^７）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｌｙｓ^８）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｌａ^９）及びｐＥ１３（Ｄ−Ｐｈｅ^１３）についてそれぞれＩＣ５０値９２７±３１２nM、４１９±５８nM、２５±９．６nM、３５０±１８０nM、３１７±１４３nM、７６±１０nM、４３±１２nM、１０９±２７nMを有して、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰ産生の濃度依存性阻害を生じた。本発明者らは、また、Ａｃ−Ｒ１２Ｆについて２．４±１．４nM、ｐＥ１３Ｆ（Ａｉｂ^７）について１．２±０．６nM、ｐＥ１３Ｆ（Ｎｌｅ^１１）について１．０±０．５nM及びｐＥ１３（４Ｂｒ−Ｐｈｅ^１３）について０．１±０．０５nMのＩＣ_５０値を得た。Ｋ１７Ｆ類似体Ｐ９２、Ｐ９５、Ｐ９６の方は、Ｋ１７Ｆに類似した阻害効力を示した（表１）。最終的に、類似体Ｐ２６及びＰ９２についてのＩＣ_５０値は、それぞれ４．４±０．９nM及び０．２±０．０６nMであった（表２）。

３ − ＣＨＯ細胞に安定発現されるラットアペリン受容体−ＥＧＦＰのインターナリゼーションに及ぼす効果
本発明者らは、また、ｐＥ１３Ｆ又はＫ１７Ｆ及びそれらの類似体がラットアペリン受容体を安定発現しているＣＨＯ細胞におけるラットアペリン受容体−ＥＧＦＰのインターナリゼーションを誘導する能力を検討した。組換えアペリン受容体をそのＣ末端部分でＥＧＦＰによりタグ付けしたので、本発明者らは、形質膜区画から小型の細胞質蛍光小胞への蛍光の再分布を追従することにより、アペリン受容体のインターナリゼーションを視覚化することができた。アペリン受容体−ＥＧＦＰを安定トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、それぞれ１．７及び０．２６nMのＥＣ５０値を有する漸増する濃度のｐＥ１３Ｆ又はＫ１７Ｆと共に２０分間インキュベートすることで、形質膜での蛍光消失及び多数の細胞内蛍光小胞の出現により示されるように、アペリン受容体の進行性で顕著なエンドサイトーシスが生じた（表３、図１）。対照的に、ラットアペリン−受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞を１μM ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｒｇ^２）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｒｇ^４）及びｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｌｙｓ_８）と共にインキュベートすることは、アペリン受容体のインターナリゼーションを誘導しなかった。実際に、ＣＨＯ細胞は、細胞内蛍光小胞なしに形質膜レベルで強いアペリン受容体−ＥＧＦＰ蛍光を示した。対照的に、類似体ＡｃＲ１２Ｆ、ｐＥ１３Ｆ（Ａｉｂ^７）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ｌｙｓ^８）、ｐＥ１３Ｆ（Ｄ−Ａｌａ^９）、ｐＥ１３Ｆ（Ｎｌｅ^１１）、ｐＥ１３（４Ｂｒ−Ｐｈｅ^１３）は、アペリン受容体のインターナリゼーションの強力な誘導物質である。同様に、Ｐ２６、Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂは、それぞれ２．１１±１．１４、０．３８±０．１１及び０．４１±０．１６nMのＥＣ_５０値でアペリンＲのインターナリゼーションを誘導することができた（表２、７、図１、９）。ｐＥ１３Ｆ及びＫ１７Ｆと比較した類似体Ｐ２６及びＰ９２により誘導されるインターナリゼーションの定量により、効率の順序：Ｋ１７Ｆ＝Ｐ９２＞ｐＥ１３Ｆ＝Ｐ２６が示された。

４ − ラットアペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化に及ぼすＫ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ９２及びＰ２６の効果
Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ９２及びＰ２６に対するＥＲＫ１／２リン酸化の用量反応曲線は、Ｋ１７Ｆ及びペプチド９２についてそれぞれ等価のＥＣ_５０値４．０８±１．１７nM及び３．４２±２．４１nMを有して類似の最大効果を示したが、一方で、ｐＥ１３Ｆ及びペプチド２６についてのＥＣ_５０値は、Ｋ１７Ｆよりも３及び１８倍高い（それぞれＥＣ_５０＝１２．０±２．７９ １０^−９M及び７１．３±１９．１ １０^−９M）（表２）。様々な化合物を用いたＥＲＫ１／２リン酸化の用量反応曲線は、Ｋ１７Ｆ、Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂについてそれぞれ４．０８±１．１７nM、３．４２±２．４１nM及び０．８９±０．６１nMのＥＣ５０値を有して、類似の最大効果を示した（表７）。対照的に、ｐＥ１３Ｆ及びＰ２６は、それぞれ対応するＥＣ５０値１２．０１±２．７９nM及び７２．１０±１９．６０nMを有して、ＥＲＫ１／２リン酸化のより弱いプロモーターであった（表７）。したがって、以下の化合物についての効率の順位は、ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ＞Ｐ９２＝Ｋ１７Ｆ＞ｐＥ１３Ｆ≫Ｐ２６であった。

５ − ＣＨＯ細胞内に安定発現されるラットアペリン受容体−ＥＧＦＰに対するＫ１７Ｆ由来のアルキルペプチド及びパーフルオロアルキルペプチドの親和性並びにフォルスコリン誘導ｃＡＭＰ産生に及ぼすそれらの阻害剤効力
アペリン受容体に対するアルキルＫ１７Ｆ類似体の親和性は、パーフルオロアルキルペプチドの親和性よりも低かった（表３）。

最良の化合物は、親和性０．２nMを有するＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ及びＪＦＭ Ｖ−０２２０Ｂである。Ｋ１７ＦのＮ末端部分にパーフルオロアルキル鎖を有するリシン残基を付加する事実（化合物ＪＦＭ Ｖ−０２１０／１）は、それ自体のリシンのイプシロンにパーフルオロアルキルで標識されたＫ１７Ｆと比べて親和性に影響しない。フォルスコリン誘導ｃＡＭＰ産生に及ぼすこれらの化合物の阻害効力は、ナノモル濃度範囲である。結論として、Ｋ１７ＦのＮ末端部分にアルキル又はパーフルオロアルキル基を付加するための事実は、その親和性（４から１５倍の間）又はフォルスコリン誘導ｃＡＭＰ産生を阻害する能力（１５から４０の間）を大々的には改変しない（表３）。

６ − ｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６、Ｋ１７Ｆ、Ｐ９２並びに化合物ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ａ及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの血漿半減期
マウス血漿中の安定性。３７℃のマウス血漿中のＫ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ２６、Ｐ９２、ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ａ及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの安定性を決定した（表４）。Ｋ１７Ｆ及びｐＥ１３Ｆの血漿中半減期の値は、それぞれ４．６及び７．２分である一方、Ｋ１７Ｆ及びｐＥ１３Ｆのそれぞれの誘導体：Ｐ９２及びＰ２６は、半減期の値が２４及び８６分と血漿安定性の増加を示す。そのうえ、Ｋ１７Ｆのアルキル又はパーフルオロアルキル誘導体は、４時間インキュベーション後であっても分解が観察されなかったので、より高い血漿安定性を示す。

７ − Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ９２及びＰ２６の血管弛緩効果
ノルアドレナリン（ＮＡ）により予備収縮したラット大動脈輪に対して
３×１０^−６M ＮＡを用いて予備収縮されたラット大動脈輪において、Ｋ１７Ｆ、ｐＥ１３Ｆ、Ｐ９２及びＰ２６は、濃度依存性弛緩を誘導した（図２）。Ｐ２６の効力（ｐＤ_２）（６．２７±０．４２）は、Ｋ１７Ｆ（８．３０±０．４４）、ｐＥ１３Ｆ（８．００±０．５９）及びＰ９２（７．６８±０．５７）の効力よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。対照的に、ｐＥ１３Ｆにより誘導される最大効果（６２±６％）は、Ｋ１７Ｆ（８７±８％、Ｐ＜０．０１）、Ｐ２６（９３±３％、Ｐ＜０．００１）及びＰ９２（１００±１％、Ｐ＜０．００１）により誘導される最大弛緩効果よりも有意に低かった（図２Ａ）。対照的に、最大濃度１００μＭで、ｐＥ１３Ｆ（６２±６％）及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂ（６０±３％）により誘導される血管弛緩効果は、同濃度のＫ１７Ｆにより誘導される効力よりも有意に低く（９３±３％、Ｐ＜０．０１）、Ｋ１７Ｆと比較してこれらの２つの化合物が低い効力であることを示した（図１０Ａ）。

アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）により予備収縮したラット糸球体細動脈に対して
ラット糸球体細動脈の血管反応性にこれらの化合物が及ぼす効果を評価するために、１）基礎状態で、２）ＡｎｇＩＩを添加後に、並びに３）ＡｎｇＩＩ及びＰ９２の存在下で直径を測定した。結果を図２Ｂに示すが、１nM ＡｎｇＩＩがベースライン状態で測定された値と比較して細動脈直径を有意に減少させたことを示した（それぞれ１００．０±４．１対８７．６±１．９％、ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）。１nM ＡｎｇＩＩにより予備狭窄した細動脈への５００nM Ｐ９２の添加は、８７．６±１．９から９８．１±２．５％に細動脈直径を増加させた（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）。これらの結果は、Ｐ９２が、Ｋ１７ＫとしてＡｎｇＩＩにより予め予備狭窄した糸球体細動脈の血管拡張を誘導可能であったことを示した。

そのうえ、１nM ＡｎｇＩＩにより予備収縮した細動脈への５００nM ＪＦＭ Ｖ−１９６Ｂの適用は、細動脈直径を１２．９７±０．５０から１３．８８±０．４５μmに増加させた（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）。Ｋ１７Ｆ及びＰ９２の血管弛緩効果は、有意に変化しなかったＪＦＭ Ｖ−１９６Ｂの効果と対照的に、ＮＯシンターゼ阻害剤である２０M Ｌ−ＮＡＭＥの存在下で遮断された（図１０Ｂ）。

８− 麻酔された正常血圧ラットにおける動脈圧に及ぼすＫ１７Ｆ又はＰ９２又はＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの静脈内注射の効果
Ａ）動脈圧に及ぼすＰ９２の効果
イナクチン（用量１００mg/kg）で麻酔された正常血圧Wistarラット（３００ｇ）において基礎ＭＢＰは１００．３±１．２mmHgであった。Ｋ１７Ｆ（１５nmol／ラット＝５０nmol/kg）の静脈内注射は、平均動脈圧（ＭＡＢＰ）を７．８mmHg減少させた。おそらく血流中でのペプチドの急速な分解を反映して、降圧応答は、注射の１．２分後に最大であり、単に一過性であった。ベースラインへの復帰は、注射の４．２分後に観察された。用量１５nmol／ラットで、Ｐ９２は、Ｋ１７ＦよりもＢＰの減少にずっと有効であり（１５nmol Ｋ１７Ｆの投与を受けているWistarラットと比較して、１分で−２０．８mmHg、Ｐ＜０．０５）、注射の１０．８分後にベースラインに復帰した（１５nmol Ｋ１７Ｆの投与を受けているWistarラットと比較してＰ＜０．０５）（図３Ａ）。Ｋ１７Ｆの静脈内注射（１００nmol／ラット＝３３３nmol/kg＝０．３μg/kg）は、ＭＡＢＰを３０．５mmHg減少させ、プラトー値−１２mmHgへの復帰が、約２２分で観察された。同用量のＰ９２について、本発明者らは、約３５分で観察された−約２０mmHgというプラトー値への復帰を伴うＭＡＢＰにおける５５．４mmHgの減少を観察した（図３Ｂ）。

Wistarラットにおいて、Ｐ９２又はＫ１７Ｆ（５〜１００nmol/ラット）のｉ．ｖ．注射は、それぞれ２９．５及び３０nmolのＥＤ５０でＭＡＢＰを用量依存的に減少させた（図４）。ＢＰ応答のＡＵＣの計算によると、Ｐ９２をｉ．ｖ．注射されたWistarラットにおいて、Ｋ１７Ｆを注射されたラットと比較して、より重大な降圧応答が確認された（１００nmol Ｐ９２ ｖｓ １００nmol Ｋ１７Ｆ後のＡＵＣ：−３４３０３±４００３mmHg.s ｖｓ −１３７１２±５２７１mmHg.s、Ｐ＜０．０５）。

麻酔されたWistarラットに漸増する用量（１６．６〜５０nmol/kgに対応する５〜１５nmol/ラット）でｉ．ｖ．注射されたＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂは、用量依存的にＢＰを減少させ、用量１５nmolについて１０分で観察された最大減少が−５１．４±６．１mmHgであり、これに対し、同用量のＫ１７Ｆについては５．４±１mmHgであった。注射の１０８分後にＢＰにわずかな減少（６から１０mmHgの間）が、まだ観察された（示さず）。１５nmolでのＢＰにおける減少及び降圧効果の持続は、同用量のＫ１７Ｆの降圧効果よりもそれぞれ９及び２７倍高い。

Ｂ）動脈圧に及ぼすＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの効果
第２系列の実験では、本発明者らは、麻酔されたWistar正常血圧ラットにおけるＢＰに及ぼす化合物ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの効果を測定した（図５）。漸増する用量（５〜１５nmol／ラット）でｉ．ｖ．注射されたＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂは、用量依存的にＢＰを減少させ、用量１５nmolについて最大減少５０mmHgであり、それに対し、Ｋ１７Ｆについて７．８mmHgであった。プラトー値−２５mmHgへの復帰が、約３３分で１０又は１５nmol Ｐ９２について観察された。対照的に、１５nmol Ｋ１７Ｆの投与を受けているWistarラットでは、１０．８分後にベースラインへの復帰が観察された。

麻酔された正常血圧ラットにおけるｉ．ｖ．注射後の化合物Ｐ９２の最大降圧応答及び降圧効果の持続時間は、Ｋ１７Ｆよりも３倍高い（表５）。化合物ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂについて、最大降圧応答及び降圧効果の持続時間は、Ｋ１７Ｆよりもそれぞれ６．７及び８倍高く、３０分後にプラトー値でまだ２１mmHgのＢＰ減少があることが分かっている。Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂの注射後のベースラインに復帰する時間を定義するために追加的な実験が必要である（表５）。

９ − 血液循環内のＡＶＰ放出に及ぼす、覚醒している体水分正常マウス又は脱水マウスにおけるＫ１７Ｆ Ｐ９２又はＪＦＭＶ−１９６Ｂの脳室内（ｉｃｖ）注射の効果
マウスの２４時間水欠乏は、２セットの実験において血漿ＡＶＰレベルを有意に増加させる（４２５±４６pg/ml、ｎ＝１８に対して対照マウス１７５±１７pg/ml、ｎ＝２０；Ｐ＜０．００１、図６Ａ及びＢ並びに６４４±６０pg/ml、ｎ＝１４に対して対照マウス２３２±５４pg/ml、ｎ＝８；Ｐ＜０．００１、図６Ａ及びＢ）。以前に記載されたように｛Iturrioz, 2010 #32｝、絶水マウスにおける用量１μg（４６８pmol）でのＫ１７Ｆのｉ．ｃ．ｖ．注射は、食塩水を注射された絶水マウスと比較して（４２５±４６pg/ml）、血漿ＡＶＰレベル（１９０±２７pg/ml、ｎ＝７）を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１）（図６）。

絶水マウスへの漸増する用量（０．０１μg〜１μg、４．５〜４５４pmolに対応）のＰ９２のｉ．ｃ．ｖ．注射は、血漿ＡＶＰレベルに用量依存的な減少を誘導した。Ｐ９２（０．０２μg＝９．１pmol；図６）についてのＥＤ５０は、Ｋ１７ＦのＥＤ５０と比較して６倍低かった（ＥＤ５０＝５６pmol｛Iturrioz, 2010 #32｝）。Ｐ９２の用量０．１μg（４５pmol／マウス）で観察されたＰ９２により誘導されるＡＶＰ放出の最大減少（−８５％）は、Ｋ１７Ｆ １μg（４６８pmol／マウス）で観察された放出と類似していた（−９４％）（図１１）。絶水マウスに漸増する用量（０．００１μg〜０．０３μg、０．２９〜８．７９pmolに対応）のＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂをｉ．ｃ．ｖ．注射することは、血漿ＡＶＰレベルに漸進性の減少を誘導した（図１１）。用量０．０１μg（２．９３pmol／マウス）のＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂについて観察された、ＡＶＰ放出における最大減少が、ＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂにより誘導された（−７５％）。ＪＦＭ Ｖ−０１９６ＢについてのＥＤ５０（０．００１μg＝０．２９pmol；図１１）は、Ｋ１７ＦのＥＤ５０（ＥＤ５０＝５６pmol）の１９３倍低かった。体水分正常マウスに過最大用量１μgで単独ｉ．ｃ．ｖ注射されたＰ９２及びＪＦＭ Ｖ−０１９６Ｂは、血漿ＡＶＰレベルに効果を有さない。

１０ − 単離された潅流ラット心臓調製物における心収縮性に及ぼすＫ１７Ｆ又はＰ９２の効果
単離されたラット心からの左室圧の記録から、Ｋ１７Ｆ（０．０１〜３００nM）は発生する圧を用量依存的に増加させたことが明らかとなった。１００から３００nMの間に含まれる用量について最大効果が観察された。他方で、用量２００及び４００nMのＰ９２は、Ｋ１７Ｆに類似した振幅で心収縮性を増加させる（図７）。試験した２つの化合物について変時効果は観察されなかった。

ペプチドの結合親和性の値（Ｋｉ）、ＦＳＫ誘導ｃＡＭＰ産生の阻害の効力（ＩＣ５０）、インターナリゼーションの効力（ＥＣ５０）及びＥＲＫ１／２リン酸化能は、２つ組又は３つ組で行われた少なくとも３つの独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。表２と比較して、Ｋ１７Ｆ、Ｐ９２及びＪＦＭ Ｖ−１９６ＢのＫｉ値をフルオロＰ９２及びリポＰ９２のＫｉ値と平行して決定するための追加的な実験を行った。

実施例：３ 化合物フルオロ−Ｐ９２及びリポ−Ｐ９２の結合試験：
本発明の他の化合物について実施例１に記載されたように、これらの化合物を合成する。フルオロ−Ｐ９２及びリポ−Ｐ９２の化学構造を、それぞれ図１２及び図１３に開示する。

アペリン受容体に対する化合物フルオロ−Ｐ９２及びリポ−Ｐ９２の親和性を、ラットアペリン受容体−ＥＧＦＰを安定発現しているＣＨＯ細胞からの膜調製物を用いてチェックした。これらの化合物は、ナノモル濃度以下の範囲の高い親和性を示す。フルオロ−Ｐ９２のＫｉ値は、０．３１±０．０５nMであり、一方でリポ−Ｐ９２のＫｉ値０．２５±０．０２nMは、P９２と比較してわずかに２〜３倍減少する（Ｋｉ値０．０９nM）。

参考文献：
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を記載している。これにより、これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。

Claims (19)

1. 次式（Ｉ）：
   リシン−フェニルアラニン−Ｘａａ１−アルギニン−Ｘａａ２−アルギニン−プロリン−アルギニン−Ｘａａ３−セリン−Ｘａａ４−リシン−Ｘａａ５−プロリン−Ｘａａ６−プロリン−Ｘａａ７ （Ｉ）
   で示されるペプチド
   ［その際：
   − フルオロカーボン基、アセチル基、又はアシル基−Ｃ（Ｏ）Ｒは、該ペプチドと直接又はＰＥＧ、リシン及びアルギニンからなる群より選択されるスペーサーを経由して、式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも１つのリシンのアルファ−アミノ基又はイプシロン−アミノ基のいずれかで連結しており、スペーサーがリシンである場合、パーフルオロ基又はアセチル基又はアシル基は、該スペーサーのアルファ−アミノ基又はイプシロン−アミノ基のいずれかで直接連結しており、式中、
   Ｘａａ１は、アルギニン（Ｒ）又はＤ−異性体アルギニン（Ｒ_Ｄ）であり、
   Ｘａａ２は、グルタミン（Ｑ）又はＤ−異性体グルタミン（Ｑ_Ｄ）であり
   Ｘａａ３は、ロイシン（Ｌ）又はＤ−異性体ロイシン（Ｌ_Ｄ）であり、
   Ｘａａ４は、ヒスチジン（Ｈ）又はα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）であり、
   Ｘａａ５は、アラニン（Ａ）又はＤ−異性体アラニン（Ａ_Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であり、
   Ｘａａ６は、メチオニン（Ｍ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、
   Ｘａａ７は、フェニルアラニン（Ｆ）又は４−Ｂｒフェニルアラニン（Ｆ）であり、
   Ｒは、Ｃ７−３０アルキルである］
   を有するアペリン類似体。
2. 代謝的に安定な類似体である、請求項１記載のアペリン類似体。
3. Ｘａａ１が、Ｄ−異性体アルギニン（Ｒ_Ｄ）である、請求項１又は２記載のアペリン類似体。
4. Ｘａａ２が、Ｄ−異性体グルタミン（Ｑ_Ｄ）である、請求項１〜３のいずれか一項記載のアペリン類似体。
5. Ｘａａ３が、ロイシン（Ｌ_Ｄ）である、請求項１〜４のいずれか一項記載のアペリン類似体。
6. Ｘａａ４が、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）である、請求項１〜５のいずれか一項記載のアペリン類似体。
7. Ｘａａ５が、Ｄ−異性体アラニン（Ａ_Ｄ）である、請求項１〜６のいずれか一項記載のアペリン類似体。
8. Ｘａａ６が、ノルロイシン（Ｎｌｅ）である、請求項１〜７のいずれか一項記載のアペリン類似体。
9. Ｘａａ７が、４−Ｂｒフェニルアラニン（Ｆ）である、請求項１〜８のいずれか一項記載のアペリン類似体。
10. ペプチドと連結したフルオロカーボン基が、次の構造：ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｌ）−［式中、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０であり、適宜の（Ｌ）は、ペプチドのリシンへのアミド結合を形成するための、該ペプチドへの共有結合の結果として生じる官能基、好ましくはカルボニル−Ｃ（Ｏ）−である］を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載のアペリン類似体。
11. アシル基が、次の構造：ＣＨ３−ＣｙＨｘ−Ｃ（Ｏ）−［式中、ｙ＝７〜３０、ｘ＝２ｙである］を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載のアペリン類似体。
12. （ｉ）アセチル−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ−Ａｒｇ）−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｇｌｎ）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｄ−Ｌｅｕ）−Ｓｅｒ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ−Ｐｒｏ−（４−Ｂｒ）Ｐｈｅ；
    （ｉｉ）（ｉ）の配列と実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは（ｉ）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有するアペリン類似体；及び
    （ｉｉｉ）配列（ｉ）のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つ又は２つのアミノ酸保存的置換を有するアペリン類似体
    からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項記載のアペリン類似体。
13. ペプチドが：
    ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列（ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ）を有するペプチド；及び
    ｉｉ）（ｉ）の配列と実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは（ｉ）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列；及び
    ｉｉｉ）（ｉ）のペプチドと比較して、少なくとも１つ又は２つのアミノ酸保存的置換を有するペプチド
    からなる群より選択され、
    （ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドにおいて、フルオロカーボン基又はアシル基ＲＣ（Ｏ）−が、該ペプチドのＮＨ２末端残基若しくは最初のリシン残基のＮＨ２εに直接、又はリンカーＬリシンのリシン残基のεＮＨ２に連結している、
    請求項１又は２記載のアペリン類似体。
14. 薬物として使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項記載のアペリン類似体。
15. − 心血管疾患：心不全、腎疾患（例えば腎不全、腎炎など）、高血圧症、肺高血圧症、硬変、動脈硬化症、肺気腫、肺水腫；脳卒中、脳虚血、敗血症における心筋障害
    − 神経原性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症などの糖尿病性合併症）のような病理を含めた抗利尿ホルモン不適切分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）、敗血症性ショック、口渇トラブル；
    − 代謝疾患：肥満、食欲不振、過食症、大食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症；
    − 老人性認知症、脳血管性認知症、家系性変性疾患（genealogical denaturation degenerative disease）（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）が原因の認知症、感染症（例えば、クロイツフェルトヤコブ病などの遅発性ウイルス感染）に起因する認知症、内分泌疾患、代謝疾患、又は中毒（例えば甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール依存症、様々な薬物、金属、若しくは有機化合物により起こる中毒）に関連する認知症、腫瘍（例えば脳腫瘍）により起こる認知症、及び外傷性疾患（例えば慢性硬膜下血腫）が原因の認知症などの様々なタイプの認知症、抑うつ、過活動児童症候群（小頭症）、意識障害、不安障害、統合失調症、恐怖症；
    − サルコペニア；
    − 多発性嚢胞腎疾患；
    − 低ナトリウム血症
    からなる群より選択される、アペリン受容体により媒介される疾患の処置のための方法における使用のための、請求項１〜１３記載のアペリン類似体。
16. 心血管疾患及び／又はＳＩＡＤＨの処置のための方法における使用のための、請求項１５記載のアペリン類似体。
17. 心血管疾患が、心不全、腎不全、高血圧症、肺高血圧症からなる群より選択される、請求項１６記載の使用のためのアペリン類似体。
18. 請求項１〜１７のいずれか一項記載のアペリン類似体及び１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
19. 哺乳類におけるアペリンにより媒介される疾患、状態又は障害を治療及び／又は予防するための方法であって、それを必要とする哺乳類に、請求項１〜１７に記載の代謝的に安定なアペリン類似体又は請求項１８記載の医薬組成物の治療有効量を投与する段階を伴う方法。