JP2018502139A

JP2018502139A - 抗ｅｇｆｒ抗体を含む医薬製剤

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Publication number: JP2018502139A
Application number: JP2017537953A
Authority: JP
Inventors: チェ・ヨンウン; キム・ユフン; チェ・チョンスプ
Original assignee: Green Cross Corp; Green Cross Corp Japan
Current assignee: Green Cross Corp; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2015-01-19
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2018-01-25
Anticipated expiration: 2036-01-15
Also published as: WO2016117883A8; KR20160089136A; EP3247394B1; EP3247394A2; DK3247394T3; US10918717B2; SI3247394T1; KR101776879B1; PL3247394T3; HUE054716T2; HRP20210890T1; US20170368175A1; ES2874593T3; WO2016117883A3; WO2016117883A2; PT3247394T; EP3247394A4; CN107249634A; CN107249634B; JP6545806B2

Abstract

本発明は、抗上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）抗体を含む医薬製剤を提供する。医薬製剤は、加速条件下でさえ凝集または粒子形成を示すことなく低い濁度を有し、良好な安定性を示す。したがって、医薬製剤は、癌などの障害の処置に効果的に用いられ得る。

Description

本発明は、抗EGFR抗体を含む医薬製剤に関する。

上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）に結合する抗体は、抗EGFR抗体と呼ばれる。該抗体の例としては、マウス起源の可変領域とヒト起源の定常領域を含むキメラ抗体であるセツキシマブ（Naramura et al., Cancer lmmunol. Immunotherapy, 1993, 37: 343-349、および国際公開第96/40210号）、およびEGFRに対するオリジナルマウス抗体であるMAB 425（Kettleborough et al., Protein Engineering, 1991, 4: 773-783）が挙げられる。

抗EGFR抗体についての様々なインビトロおよびインビボ研究結果によれば、抗EGFR抗体は、癌細胞の増殖を阻止し、腫瘍介在性血管新生を低下させ、癌細胞アポトーシスを誘導し、放射線療法および従来の化学療法の毒性効果を高める。このように、抗EGFR抗体は、様々なレベルで腫瘍を抑制することができる。

しかしながら、治療目的の抗EGFR抗体を含む液体製剤は、タンパク質多量体が抗体の凝集特性のために形成され得て、脱アミノ化反応もまたタンパク質分解反応のために起こり得るという問題を有し得る。このような変性反応は、例えば、輸送中の高温での保存またはせん断応力によって生じ得る。抗EGFR抗体を含む液体製剤が変性反応により凝集を示すならば、沈殿および粒子形成が起こり得て、これが塞栓形成を誘発し得る。

この点について、凝集を防止するために、液体製剤を患者への投与（例えばシリンジによる注射）の前にろ過工程に供し得る。しかしながらこのような追加の工程は、投与方法を複雑にし、臨床試験に不向きとし得る。また粒子形成は、ろ過工程の後もずっと起こり続け、安定性の低下をもたらし得る。

したがって、苛酷条件下でさえ、凝集または粒子形成を示すことなく低い濁度を有する、抗EGFR抗体を含む安定な医薬製剤を開発することが継続して必要とされている。

一方、抗EGFR抗体を含む従来の医薬製剤は、医薬製剤が投与されるときに浸透圧により生じる身体における疼痛反応を軽減させるために、塩化ナトリウム（NaCl）を等張化剤として通常含む。しかしながら、タンパク質治療薬を含む医薬製剤は、それに適した適切な成分を含有すべきである。この点について、NaClの適合性も検証されるべきである。

本発明の目的は、優れた安定性を示す抗EGFR抗体を含む医薬製剤を提供することである。

本発明は、抗EGFR抗体、酢酸ナトリウム無水物およびポリソルベート80を含有するが、塩化ナトリウム（NaCl）を含有しない医薬製剤を提供する。

本発明による抗EGFR抗体を含む医薬製剤は塩化ナトリウムを含有しないため、塩化ナトリウムを含有する抗EGFR抗体を含む大部分の従来の医薬製剤とは異なり、該医薬製剤は、加速条件下でさえ凝集または粒子形成を示すことなく低い濁度を有し、良好な安定性を示す。したがって、本医薬製剤は、癌などの処置に効果的に用いられ得る。

図1A、1Bおよび1Cは、界面活性剤および等張化剤（tonicifier）の種類の選択のために製造された試料を用いた、目視検査、濁度および動的光散乱（DLS）分析の結果をそれぞれ示す。図2Aおよび2Bは、凝集および粒子形成に関連する因子の選択のために製造された試料を用いた、濁度およびDLS分析の結果をそれぞれ示す。図3Aおよび3Bは、図2の説明に記載した試料を用いた、SE-HPLCおよびIE-HPLC分析の結果をそれぞれ示す。図4A、4Bおよび4Cは、等張化剤の種類のスクリーニングのために製造された試料を用いた、目視検査、濁度およびDLS分析の結果をそれぞれ示す。図5A、5Bおよび5Cは、ポリソルベート80の濃度の決定のために製造された試料を用いた、目視検査、濁度およびDLS分析の結果をそれぞれ示す。図6Aおよび6Bは、製造例および比較製造例の医薬製剤を用いた、高温で保存後の濁度およびDLS分析の結果をそれぞれ示す。図7A、7Bおよび7Cは、種々の温度における製造例1〜3（製剤3〜5）の濁度変化の結果をそれぞれ示す。図8Aおよび8Bは、非還元および還元条件下37℃で保存した、製造例および比較製造例の医薬製剤のSDS-PAGE結果をそれぞれ示す。図9〜14は、2週間37℃の保存条件下での、応答曲面法（RSM）設計により製造した各試料の目視検査、タンパク質濃度、SE-HPLC、IE-HPLC、IEF（等電点電気泳動）およびSDS-PAGE分析の結果をそれぞれ示す。図15〜18は、1日間60℃の保存条件下での、RSM設計により製造した各試料の目視検査、濁度、DLSおよび効力1（結合アッセイ）分析の結果をそれぞれ示す。図19は、RSM設計により製造された試料の最適化プロットの結果を示す。

本発明は、抗EGFR抗体、酢酸ナトリウム無水物およびポリソルベート80を含有するが、塩化ナトリウム（NaCl）を含有しない液体医薬製剤を提供する。

本発明の医薬製剤は、好ましくは、ユーザーの利便性を考慮して液体製剤の形態であり得る。

本発明の医薬製剤は、NaClを含有しないことを特徴とする。

一般的に、抗EGFR抗体を含有する医薬製剤は、医薬製剤が投与されるときに浸透圧により生じる身体における疼痛反応を軽減させるために、NaClを浸透圧調整剤として含む。しかしながら、従来の医薬製剤とは異なり、加速条件下でさえ、凝集または粒子形成を示すことなく低い濁度を有する、抗EGFR抗体を含むより安定な医薬製剤を製造するために、NaClが本発明の医薬製剤には含まれない。NaClとの適合性を考慮して、最小限の凝集および粒子形成をもたらす本発明の抗EGFR抗体製剤にはNaClが含まれないことが好ましく、これはより安定な製品の流通を可能にする。

本発明の一実施態様において、抗体製剤の濁度、凝集および粒子形成に影響を及ぼす主な因子を検討した。濁度に影響を及ぼす主な因子は、NaCl、緩衝剤の濃度およびpHであることが見出され（図2A）；DLS分析によれば、単量体強度の低下に影響を及ぼす主な因子は、pHおよびNaClであることが見出された（図2B）。また、SE-HPLC分析によれば、主ピーク低下に影響を及ぼす主な因子は、pHおよびNaClであることが見出され（図3A）；IE-HPLC分析によれば、主ピーク低下に影響を及ぼす主な因子は、pHおよび緩衝剤の濃度であることが見出された（図3B）。

これらの結果に基づいて、好ましくは、抗体製剤は、濁度を低下させ、凝集および粒子形成を阻止するために、NaClを含有してはならない。

本発明の医薬製剤は、抗EGFR抗体を含有する。

抗EGFR抗体は、1〜16 mg/ml、好ましくは2〜10 mg/ml（例えば、10 mg/ml）の濃度で含まれ得る。

本発明で使用するための抗EGFR抗体は、すでに公知であるかまたは市販の従来の抗EGFR抗体であり得る。例えば、米国特許第6,217,866号または韓国特許第1108642号に開示される抗EGFR抗体が用いられ得る。

本発明の医薬製剤は、酢酸ナトリウム無水物を緩衝剤として含有する。

本発明の一実施態様によれば、濁度、凝集および粒子形成に影響を及ぼす主な因子は、緩衝剤の濃度およびpHを含む。したがって、緩衝剤の種類、ならびにその濃度およびpHは、重要な因子である。

酢酸ナトリウム無水物は、本発明の医薬製剤のpHを維持するために用いられ、これは外部の影響によるpH変化を最小限にする。

酢酸ナトリウム無水物は、リン酸ナトリウム、グルタミン酸塩、ヒスチジン、およびそれらの組合せからなる群より選択される緩衝剤で置き換えられ得る。しかしながら、医薬製剤において濁度を低下させ、凝集および粒子形成を阻止するために、適切な範囲のpHが選択されるべきである。本発明によれば、5〜6のpH範囲においてまたはその付近で、酢酸ナトリウム無水物を緩衝剤として用いることが好ましい。

酢酸ナトリウム無水物は、10〜200mM、好ましくは10〜100mM（例えば、50mM）の濃度で含まれ得る。

本発明の医薬製剤は、5〜7、好ましくは5.3〜6.1の範囲であるpHを有し得る。

本発明の医薬製剤は、ポリソルベート80を界面活性剤として含有する。

一般的に、抗体を含有する溶液は、空気-水界面に高い表面張力を有する。このような表面張力を低下させるために、抗体は、空気-水界面で凝集する傾向がある。空気-水界面での抗体凝集を最小限することにより、界面活性剤は、溶液中で抗体の生物学的活性を維持するのを助ける。

本発明の一実施態様によれば、ポリソルベート80、ポリソルベート20またはポロキサマー188を界面活性剤として含有する抗体製剤の機械的ストレス試験を実施した。その結果、医薬製剤の濁度を低下させ、凝集および粒子形成を阻止する効果を達成するためにポリソルベート80を含有することが好ましいことが分かった（実施例1参照）。

また本発明の別の一実施態様によれば、様々な濃度のポリソルベート80を含有する抗体製剤に関して、0.05〜2.0 mg/mlの濃度でポリソルベート80を含有する抗体製剤は、濁度を低下させ、凝集および粒子形成を阻止する効果があることが分かった。特に、凝集および粒子形成の程度は、ポリソルベート80が0.2 mg/mlの濃度で含まれるとき、最小であることが分かった（実施例4参照）。

したがってポリソルベート80は、0.05〜2.0 mg/ml、好ましくは0.1〜1.0 mg/ml（例えば、0.2 mg/ml）の濃度で含まれ得る。

本発明の医薬製剤は、さらに等張化剤を含有し得る。

本発明における等張化剤は、医薬製剤の凝集および分解を阻止する役割を果たす。

特に、濁度を低下させ、凝集および粒子形成を阻止するために、マンニトール、グリシンまたはそれらの組合せを等張化剤として使用することが好ましい。本発明の一実施態様によれば、マンニトールまたはグリシンを等張化剤として含有する抗体製剤が濁度の上昇を著しく阻止することができることが分かった（実施例3参照）。

等張化剤はマンニトールであり得て、これは、1〜20％（w/v）、好ましくは2〜10％（w/v）、例えば5％（w/v）の濃度で含まれ得る。

等張化剤はグリシンであり得て、これは、1〜10％（w/v）、好ましくは2〜5％（w/v）、例えば3％（w/v）の濃度で含まれ得る。

等張化剤は、マンニトールとグリシンの組合せであり得て、ここでマンニトールとグリシンは、5：1〜1：5の重量比で混合され、これは、1〜10％（w/v）、好ましくは2〜5％（w/v）の濃度で含まれ得る。

本発明の一実施態様は、10 mg/mlの抗EGFR抗体、50mMの酢酸ナトリウム無水物および0.2 mg/mlのポリソルベート80からなり、NaClを含有しない医薬製剤を提供する。

本発明の別の一実施態様は、10 mg/mlの抗EGFR抗体、50mMの酢酸ナトリウム無水物、0.2 mg/mlのポリソルベート80および5％（w/v）のマンニトールからなり、NaClを含有しない医薬製剤を提供する。

本発明の更なる実施態様は、10 mg/mlの抗EGFR抗体、50mMの酢酸ナトリウム無水物、0.2 mg/mlのポリソルベート80および3％（w/v）のグリシンからなり、NaClを含有しない医薬製剤を提供する。

苛酷条件下で検討した安定性分析結果によれば、本発明の医薬製剤は、無色澄明状態を維持し、低い濁度上昇率を示し；そして、長期保存後も凝集を示さず、NaClを含有する医薬製剤と比較して良好な純度を維持した。これらの結果に基づいて、抗EGFR抗体を含有する医薬製剤は、NaClを含まないとき、優れた安定性を有することが分かった（試験例参照）。

本発明による医薬製剤は、医薬的に許容される添加剤、例えば希釈剤、担体、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤などを必要に応じてさらに含有し得る。

希釈剤は、生理食塩水、グルコース、リンガーまたは水性緩衝溶液であり得る。担体は、緩衝生理食塩溶液、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）などであり得る。安定化剤は、アミノ酸、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン（HSA）およびウシ血清アルブミン（BSA））、塩（例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウム）、キレート剤（例えばEDTA）などであり得る。抗酸化剤は、アスコルビン酸、グルタチオンなどであり得る。防腐剤は、フェノール、m-クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなどであり得る。

本発明による医薬製剤は、当該技術分野で公知の様々な方法、例えば経口または非経腸投与で投与され得る。非経腸投与の例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管支、皮下、皮下層内、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および点滴が挙げられ得るが、これらに限定されない。

本発明の医薬製剤の1日投与量は、0.01〜10 mg/kg（体重）、好ましくは0.01〜1.0 mg/kg（体重）の範囲であり得て、それは1日当たり1回または分割した用量で投与され得る。しかしながら、医薬製剤の実際の用量は、様々な因子、例えば投与経路、年齢、性別、体重、疾患の重症度などを考慮して決定されるべきであり、それ故に上記投与量は、決して本発明の範囲を限定するものではない。

以下に本発明を実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに例示することを意図する。

以下の実施例で用いられる試薬の提供者は次のとおりである。
（試薬および試験溶液）
酢酸ナトリウム無水物（Scharlau、Cat. No. SO0032）
リン酸二水素一ナトリウム（Scharlau、Cat. No. SO0333）
リン酸水素二ナトリウム（JT Baker、Cat. No. 3817-05）
ポリソルベート20（Tween 20、Merck、Cat. No. 8.17072.1000）
ポリソルベート80（Tween 80、Fluka、Cat. No. 59924）
ポロキサマー188（Pluronic F68、Sigma、Cat. No. P-1300）
NaCl（Scharlau、Cat. No. SO0225）
マンニトール（JT Baker、Cat. No. 238506）
ソルビトール（Sigma、Cat. No. S7547）
グリシン（Sigma、Cat. No. 15527）
トレハロースニ水和物（Sigma、Cat. No. T5251）
アルギニン塩酸塩（Arg-HCl、Scharlau、Cat. No. AR0125）

以下の実施例における試料を、各設計条件に従って成分を混合し、0.22μmフィルターを通してろ過し、クリーンベンチで3 mlガラスバイアルに分注し、ゴム栓で栓をすることにより製造し、これを実験で使用するために保存した。

本発明で用いられる試験方法は次のとおりである。
(1)機械的ストレス：バイアルをボルテックスミキサー（Vortex-Genie 2、Scientific Industries）に固定し、3000 rpmにて室温で4時間ボルテックスした。
(2)熱ストレス：バイアルを37℃の恒温恒湿器（LHD-2250C、Labtech）または60℃の恒温器（DX7、Hanyoung）に入れた。
(3)目視検査：凝集形成を肉眼で観察した。
(4)濁度：希釈せずに1 mLの各試料溶液を調製後、吸光度を、UV分光光度計（LibraS32、Biochem）を用いて350 nmにて測定して、濁度を分析した。
(5)動的光散乱（DLS）：希釈せずに少なくも1 mLの各試料溶液を調製後、試料溶液の粒子径分布チャートを、DLS装置（Zetasizer Nano ZS90、Malvern Instrument）を用いて分析した。
(6)SDS-PAGE：電気泳動装置を用いて従来のSDS-PAGE分析法により分析を行った。
(7)等電点電気泳動（IEF）：電気泳動装置を用いて従来のIEF分析法により分析を行った。
(8)UVタンパク質定量：吸光度を、分光光度計を用いて280 nmにて測定し、タンパク質定量分析を行った。
(9)SE-HPLC：SE-HPLC分析カラム（TSK gel G3000SW_XL、Cat. No. 08541、Tosoh Corporation）を用いることにより分析を行った。
(10)IE-HPLC：IE-HPLC分析カラム（Propac WCX-10 analytical、Cat. No. 054993、Dionex）を用いることにより分析を行った。
(11)効力1（結合アッセイ）：ELISAリーダー（Spectra Max 190、Molecular Devices）を効力1の分析に用いた。
(12)効力2（細胞ベースアッセイ）：細胞計数により計算された同一数の細胞を96ウェルプレートの各ウェルに等分した。24時間培養後、培地を除去した。その後、100μLの希釈した試料溶液を各ウェルに入れた。そして、100μLの希釈した標準物質および希釈した試料を各ウェルに入れ、5日間培養した。40μLのMTS試薬を各ウェルに入れ、ホイルで包み、37℃で3時間反応させた。吸光度を、490 nmにてELISAリーダー（Spectra Max 190、Molecular Devices）を用いて測定した。

＜最適化抗体製剤を製造するためのスクリーニング＞
実施例1：界面活性剤および等張化剤の種類の選択
凝集および粒子形成を阻止し得る界面活性剤および等張化剤の種類を選択するために、各試料を表1に示す成分を混合することにより製造した。

機械的ストレス試験を上記で製造した試料で実施し、目視検査、濁度およびDLS分析の結果を図1A、1Bおよび1Cにそれぞれ示す。

図1に示すように、目視検査により決定した濁度は、#1、#5、#8 > #7、#9 > #6 > #2、#3、#4の順であった。そして、試料の濁度の測定は次の結果を明らかにした：界面活性剤を有する試料は濁度の上昇を示さなかった；等張化剤をさらに有する試料は濁度の低下を示した。より具体的には、試料#1と比較して濁度において、Arg-HCl添加試料（#6）は46％低下を示し、トレハロース添加試料（#9）は12％低下を示した。DLS分析は、界面活性剤は凝集形成を阻止するが、一方、等張化剤は凝集強度を上昇させることを明らかにした。

したがって濁度の点で、界面活性剤に関して（濁度、凝集形成および他の競合薬物製剤を考慮して）、ポリソルベート80（PS80）がポリソルベート20（PS20）またはポロキサマー188（P-188）より好ましく；等張化剤に関して、Arg-HClが好ましい。

実施例2：凝集および粒子形成の因子の選択
抗EGFR抗体（GC1118A、Mogam Biotechnology Institute）を含有する医薬製剤において凝集および粒子形成に影響を及ぼす主な因子を特定するために、各試料を表2に示す成分を混合することにより製造した。

熱ストレス試験を上記で製造した試料で実施した。熱ストレス試験（37℃で2週間保存）後、目視検査による濁度分析、ならびにDLS、SE-HPLCおよびIE-HPLC分析を、凝集および粒子形成に影響を及ぼす3つの主な因子を選択するために実施した。

主な因子の選択のために、Minitabソフトウェアを用いて、パレート図（アルファ=0.15）からの結果を分析した。結果を図2Aおよび2B、ならびに図3Aおよび3Bに示す。

図2に示すように、濁度に影響を及ぼす主な因子は、NaCl、緩衝液濃度およびpHであった（図2A）。またDLS分析の結果は、単量体強度の低下に影響を及ぼす主な因子がpHおよびNaClであることを示した（図2B）。

また図3に示すように、SE-HPLC分析の結果は、主ピーク低下に影響を及ぼす主な因子がpHおよびNaClであることを示した（図3A）。また、IE-HPLC分析の結果は、主ピーク低下に影響を及ぼす主な因子がpHおよび緩衝液濃度であることを示した（図3B）。

この結果に基づいて、pH、NaClおよび緩衝液濃度が凝集および粒子形成に影響を及ぼす主な因子として選択された。次の実験において、Minitabプログラムを用いて応答曲面法（RSM）設計を実施した。

実施例3：RSM設計による医薬製剤の条件の選択
熱ストレス下で安定な液体製剤のための最適化条件に関して実施例2において選択された凝集および粒子形成に影響を及ぼす主な因子を検討するために、RSM設計をMinitabプログラム（CCI、level 5）により実施し、様々な試料をpH（4〜8）、ならびにNaCl（0〜300mM）および緩衝液（10〜100mM）の濃度にしたがって製造した。

製造された試料の特定の成分を次の表3に示す。

まず各試料を表3に示す成分を混合することにより製造した。製造した試料を、(i)37℃で2週間；または(ii)60℃で1日間の保存条件下で熱試験に供した。

37℃で2週間の保存条件下での各試料の目視検査、タンパク質濃度、SE-HPLC、IE-HPLC、IEFおよびSDS-PAGE分析の結果を図9〜14に示す。目視検査分析結果は、#9のみが不透明であるが、一方、他のすべては無色澄明であることを明らかにし、IEF結果は、#9が粒子形成によって生じるバンド引っ張り（band dragging）現象を示すことを明らかにした。

60℃で1日間の保存条件下での各試料の目視検査、濁度およびDLS分析、および結合アッセイ1の結果を図15〜18に示す。目視検査分析は、濁度が#9 > #5 > #7 > #1および#3である（他のすべての試料は無色澄明であった）ことを示し、結合アッセイ1の結果は、コントロール群と比較して#15試料が114〜121％のEC₅₀％を有することを示した。

また、上記結果に基づく最適化プロットを図19および表4に示す。

表4の結果に基づく統計解析により示唆された好ましい医薬製剤の条件を次の表5に示す。

より具体的には、熱ストレス条件下で凝集、粒子形成および効力変化を最小限にしながら所望の効力を満たす条件は、10 mg/mlのタンパク質（抗EGFR抗体）濃度、10〜100mM 酢酸ナトリウム、pH 5.3〜6.1、および0mM NaClであると分かった（等高線に基づく）。また、上記条件の中で最適な安全条件は、pH 5.94、50mM 酢酸ナトリウム、およびNaCl無し（すなわち0mM NaCl）であった（最適化プロットに基づく）。

実施例4：等張化剤の種類のスクリーニング
本発明による医薬製剤で用いられる等張化剤の種類を選択するために、各試料を表6に示す成分を混合することにより製造した。製造した試料を60℃で1日間保存し、そして目視検査、濁度およびDLS分析の結果を図4A、4Bおよび4Cにそれぞれ示す。

図4に示すように、目視検査分析結果は、すべての試料が無色澄明であることを示し（図4A）、濁度およびDLS分析結果は、3％グリシンまたは5％マンニトールを含有する製剤が濁度の上昇を著しく阻止することを示した（図4Bおよび4C）。

実施例5：ポリソルベート80の濃度の決定
本発明による医薬製剤で用いられるポリソルベート80の濃度を決定するために、各試料を表7に示す成分を混合することにより製造した。その後、製造した試料を機械的試験に供し、目視検査、濁度およびDLS分析の結果を図5A、5Bおよび5Cにそれぞれ示す。

図5に示すように、試料#1のみが不透明であり、他のすべては無色澄明であった（図5A）。また、試料#1を除いて顕著な濁度変化はなく、濁度阻害効果が0.05〜2.0 mg/mlの濃度範囲にわたって観察された（図5B）。一方、DLS分析はまた、凝集阻害効果が0.05〜2.0 mg/mlの濃度範囲にわたって観察されたことを明らかにした（図5C）。

それらのうち0.2 mg/mlのポリソルベート80が最も少ない凝集をもたらし、最適な濃度として選択された。

製造例1〜3ならびに比較製造例1および2：医薬製剤の製造
医薬液体製剤を、表8に示す成分を用いて従来法で製造した。

試験例：医薬製剤の安定性分析
製造例1〜3ならびに比較製造例1および2に従い製造した医薬製剤を下記の苛酷条件下で保存した後、目視検査、濁度、DLS、タンパク質含量、SE-HPLC、IE-HPLC、SDS-PAGE、IEFならびに効力1および2分析を行った。
（ストレス条件）
(1)60℃で2週間保存（1日間、3日間、1週間および2週間）
(2)5℃、25℃または37℃で2週間〜12ヵ月間保存（開始時、2週間、4週間、6週間、8週間および3〜12ヵ月）

（結果）
60℃で2週間の保存条件下、目視検査分析結果は、比較製造例1および2の医薬製剤が不透明になるが、一方、製造例3の医薬製剤は2週間保存後無色澄明のままであることを明らかにした。濁度およびDLS分析は、マンニトールおよびポリソルベート80を含有する製造例3の医薬製剤が最も小さい濁度の増加を示すことを示した（図6Aおよび6B）。

5℃、25℃または37℃で2週間〜12ヵ月間保存条件下、目視検査分析結果は、すべての医薬製剤がいずれの保存条件下でも無色澄明であることを明らかにした。種々の温度で保存した製剤の濁度変化分析は、5℃または25℃で保存した試料が製剤の種類にかかわらず濁度変化を示さないことを示した。しかしながら、37℃で保存した試料のうち、製造例2の製剤#4が、8週間保存後開始時と比較して濁度が2.3倍増加することを示した（図7）。

一方、UVタンパク質定量分析結果は、いずれの温度条件下のすべての製剤が開始時と比較して95〜105％の範囲であり、顕著な変化を示さないことを明らかにした。

SDS-PAGE分析結果は、製造例と比較製造例との間で保存温度によるバンドパターンに差異がないことを示した。しかしながら、図8Aおよび8Bから分かるように、開始時および8週間37℃にて非還元および還元条件下で保存後の結果は、開始時と高温保存後の試料の間でバンドパターンにおける差異を示した。非還元条件下では、37℃で保存後の製造例および比較製造例のすべての製剤#1〜#5は、開始時と比較して250 kDおよび37〜50 kDにおけるバンド強度の増加を示した。また、還元条件下では、37℃で保存後の製造例および比較製造例の製剤#1〜#5は、開始時と比較して75 kDにおけるバンド強度の増加、および25〜50 kDにおける新しいバンドの形成を示した。

一方、IEF結果は、いずれの保存条件下でも製剤間または異なる温度によりIEFバンドパターンに差異がなく、バンドがpI 7.8〜8.3の間に位置することを示した。

SE-HPLC分析結果は、製造例および比較製造例のすべての製剤#1〜#5が、5℃または25℃で保存後、顕著な純度変化を示さないことを示した。しかしながら、37℃で8週間保存後、製剤#1、#2、#3、#4および#5は、95.66％、95.15％、96.46％、96.42％および96.56％の値をそれぞれ示し、これは開始時と比較して3.14〜4.55％純度低下を意味する。そのため、本発明の製造例の製剤が、比較製造例と比較して顕著により高い安定性を示すことが分かった。特に比較製造例の製剤は、大きな純度低下を示し、これは、主ピークに先行するプレピーク部分（凝集であると推定される）の増加によって引き起こされた。

効力2分析（細胞ベースアッセイ）結果は、保存温度にかかわらずすべての製剤が、コントロール群と比較して70〜130％のEC₅₀を示すことを明らかにし、これは顕著な変化がないことを示している。

上記結果は、抗EGFR抗体を含む医薬製剤で用いるために熱ストレス条件下で凝集および粒子形成を阻止するための等張化剤は、NaCl、グリシン、マンニトールなどであることができ、好ましくはマンニトールであるまたはNaClではないことができ；機械的ストレス条件で凝集および粒子形成を阻止するためのポリソルベート80の好ましい濃度は0.2 mg/mlであることを示した。

また、60℃の高温で保存後の医薬製剤の安定性分析の結果は、10 mg/ml抗EGFR抗体を含む製剤が、50mM 酢酸ナトリウム、pH 5.7±0.4、0.2 mg/mlポリソルベート80および5％マンニトールを含有することにより機械的ストレス／熱ストレス下で安定化され得ることを示した。

さらに、5℃、25℃および37℃で8週間保存後の医薬製剤の安定性分析の結果は、10 mg/ml抗EGFR抗体を含む製剤について50mM 酢酸ナトリウム、pH 5.7±0.4、0.2 mg/mlポリソルベート80をさらに含有するが、NaClを含有しないことが物理的／化学的安定性の点で好ましいことを示した。

Claims

抗上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）抗体、酢酸ナトリウム無水物およびポリソルベート80を含む医薬製剤であって、該医薬製剤中に塩化ナトリウム（NaCl）が含まれない、医薬製剤。
マンニトール、グリシンまたはそれらの組合せより選択される等張化剤をさらに含む、請求項1に記載の医薬製剤。
医薬製剤のpHが5.3〜6.1の範囲である、請求項1に記載の医薬製剤。
抗EGFR抗体が2〜10 mg/mlの濃度で含まれる、請求項1に記載の医薬製剤。
酢酸ナトリウム無水物が10〜100mMの濃度で含まれる、請求項1に記載の医薬製剤。
ポリソルベート80が0.05〜2.0 mg/mlの濃度で含まれる、請求項1に記載の医薬製剤。
等張化剤がマンニトールであり、1〜20％（w/v）の濃度で含まれる、請求項2に記載の医薬製剤。
等張化剤がグリシンであり、1〜10％（w/v）の濃度で含まれる、請求項2に記載の医薬製剤。
等張化剤が5：1〜1：5の重量比で混合されるマンニトールとグリシンの混合物であり、1〜10％（w/v）の濃度で含まれる、請求項2に記載の医薬製剤。