JP2018198618A - モルティエレラ属微生物内で高発現活性を示すプロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
このような菌類を利用する上で、育種、すなわち有用生物の遺伝的性質をより望ましい性質に改良する(品種改良する)ことがなされている。特に醗酵技術では、微生物による有用化合物の生産効率を向上し、当該化合物の製造コストを低減する等の観点から、育種は非常に重要なものとなっている。
より好ましい性質を持った有用生物を育種するためには、形質転換による方法が利用されている。この場合、目的の形質を獲得するために必要なタンパク質をコードするDNA断片を、適切な遺伝子プロモーターの制御下で発現するようにして、育種しようとする有用生物(宿主)に導入し、形質転換体の集団を得る。その後、この中から望ましい品種(株)を選抜することになる。この際、宿主となる生物種に応じて、また改変しようとする性質に応じて適切な遺伝子プロモーターが必要である。
モルティエレラ属の菌類が属する糸状菌の形質転換方法については、多くの技術が報告されている。また、モルティエレラ属の菌類の脂質生産能力に関連して、脂質合成系に関与する多数の酵素遺伝子が取得されている。しかしながら、これらの有用な酵素遺伝子をモルティエレラ属へ導入し、高いレベルで発現させるために必要となる遺伝子プロモーターについては、これまでほとんど報告がない。
[1] 以下の(a)〜(c)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号1〜28からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号1〜28からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド;及び
(c)配列番号1〜28からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド
[2] 前記プロモーター活性は、モルティエレラ属に属する微生物細胞内でGUSレポーター遺伝子を発現させた場合に少なくとも500 nmol/(mg・分)のGUSタンパク質活性が確認されるものである、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[3] 配列番号1〜28からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有する、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[4] DNAである、前記[1]又は[2]に記載のポリヌクレオチド。
[5] 前記[1]〜[4]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
[6] 前記[1]〜[4]のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
[7] 前記[6]に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
[8] 前記形質転換体が脂質生産菌である、前記[7]又は[8]に記載の形質転換体。
[9] 前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)である、前記[8]に記載の形質転換体。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2013年3 月27日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2013-066265号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明者らは、後述の実施例において詳細に記載するように、脂質生産菌であるM. alpinaから複数種類のプロモーター配列をクローニングすることに初めて成功した。また、本発明者らは、これらのプロモーターにより発現されるタンパク質がその生物活性を示すことも確認した。
本発明のプロモーターは、PP7p、CIT1p、PP3p、PP2p、PP6ps、HSC82p、SSA2p、GAL10-2p及び又はこれらの部分配列(短縮型)である。これらのプロモーター領域配列及びその短縮型配列を以下の表に示す。
上記表に示す塩基配列、つまり、配列番号1〜28からなる群より選択されるいずれか1つの任意の配列を、以下、「本発明のプロモーター配列」と総称する。
以下の(a)〜(c)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(a)本発明のプロモーター配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)本発明のプロモーター配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド;及び
(c)本発明のプロモーター配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド
また、本発明において、本発明のプロモーター配列を「有する」とは、本発明のプロモーター配列を「含む」ことを意味する。従って、本発明のプロモーター配列以外の付加的な配列、例えば、エンハンサー配列等が本発明のプロモーター配列の上流(5’末端側)又は下流(3’末端側)に付加されていてもよい。このような付加的な配列は、本発明のプロモーター配列との間に1〜1000 bp、1〜900 bp、1〜800 bp、1〜700 bp、1〜600 bp、1〜500 bp、1〜400 bp、1〜300 bp、1〜200 bp、1〜100 bp、1〜75 bp、1〜50 bp、1〜25 bp、1〜10 bpの塩基配列を介して付加されていてもよく、あるいは本発明のプロモーター配列に直結(つまり本発明のプロモーター配列と付加的な配列との間に介在するヌクレオチド残基数が0)していてもよい。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、本発明のプロモーター配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
ここで、「発現産物」とは、同遺伝子の転写産物であるRNA(例えば、hnRNA、mRNA、siRNA、miRNAなど)及び同遺伝子の翻訳産物であるタンパク質のいずれか一方又は両方を意味する。
GUS活性は、モルティエレラ属に属する微生物の細胞内で本発明のプロモーター配列を用いてGUS遺伝子を発現させ、前記細胞から回収したGUSタンパク質をp-ニトロフェニル-β-D-グルクロニドと反応させて、反応系の波長405nmの吸光度を経時的に測定し、その測定値を以下の式に当てはめることによって測定することができる。
GUS活性(nmol/(mg・min)) =
1000 × [(各サンプルにおける吸光度の経時変化グラフの勾配値)/(検量線グラフの勾配値)]/[(サンプルのタンパク濃度)/5]
コドンの使用の改変の例については、図12A及び図12Bに示すGUSm vs GUSアラインメントを参照することができる。
宿主細胞に遺伝子を導入する方法については、後述のとおりである。
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター(以下、「本発明のベクター」)を提供する。
本発明のベクターは、通常、
(i)本発明のプロモーター;及び
(ii)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。本発明において使用される適切な宿主細胞の例としては、脂質生産菌、酵母等が挙げられる。
(1) メチオニン要求性マーカー:met1、met2、met3、met4、met5、met6、met7、met8、met10、met13、met14、met20;
(2) チロシン要求性マーカー:tyr1、イソロイシン;
(3) バリン要求性マーカー:ilv1、ilv2、ilv3、ilv5;
(4) フェニルアラニン要求性マーカー:pha2;
(5) グルタミン酸要求性マーカー:GLU3;
(6) トレオニン要求性マーカーthr1、thr4;
(7) アスパラギン酸要求性マーカー:asp1、asp5;
(8) セリン要求性マーカー:ser1、ser2;
(9) アルギニン要求性マーカー:arg1、arg3、arg4、arg5、arg8、arg9、arg80、arg81、arg82、arg84;
(10) ウラシル要求性マーカー:ura1、ura2、ura3、ura4、ura5、ura6;
(11) アデニン要求性マーカー:ade1、ade2、ade3、ade4、ade5、ade6、ade8、ade9、ade12、ADE15;
(12) リシン要求性マーカー:lys1、lys2、lys4、lys5、lys7、lys9、lys11、lys13、lys14;
(13) トリプトファン要求性マーカー:trp1、trp2、trp3、trp4、trp5;
(14) ロイシン要求性マーカー:leu1、leu2、leu3、leu4、leu5;
(15) ヒスチジン要求性マーカー:his1、his2、his3、his4、his5、his6、his7、his8
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いたタンパク質、脂質又は脂肪酸の製造方法を提供する。
本発明のプロモーターが導入された非ヒト形質転換体(以下、「本発明の形質転換体」)、特に、モルティエレラ属に属する微生物を宿主細胞として作成された形質転換体では目的遺伝子が高発現する。従って、本発明の形質転換体を用いれば、効率的に目的タンパク質を生成することができる。
発現された目的タンパク質は、例えば、形質転換体から細胞溶解物を調製し、同溶解物から公知の方法に沿って回収することができる。目的タンパク質回収の詳細については"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)"等を参照することができる。
M. alpina 1S-4株を100mlのGY2:1培地(2%グルコース、1%酵母エキス pH6.0)に植菌し、28℃で2日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを調製した。
上記ゲノムDNAの塩基配列を、 Roche 454 GS FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を2ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を3ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、300個のSuper Contigが得られた。
M. alpina 1S-4株を100 mlの培地(1.8%グルコース、1%酵母エキス、pH6.0)に植菌し、3日間28℃で前培養した。10 L培養槽(Able Co.,東京)に5 Lの培地(1.8%グルコース、1%大豆粉、0.1%オリーブ油、0.01%アデカノール、0.3%KH2PO4、0.1% Na2SO4、0.05% CaCl2・2H2O、0.05% MgCl2・6H2O、pH6.0)を入れ、前培養物を全量植菌し、300 rpm、1 vvm、26℃の条件で8日間通気攪拌培養した。培養1、2、及び3日目に各々2%、2%、及び1.5%相当のグルコースを添加した。培養1、2、3、6、及び8日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアジニン/CsCl法でtotal RNAを調製した。SOLiDTM Total RNA-Seq for Whole Transcriptome Libraries(アプライドバイオシステムズ)により、cDNAを合成し、SOLiDでシーケンシングを行った。
発現解析の結果より、M. alpina 1S-4株で発現量が多いと考えられる遺伝子のプロモーター領域、または、ガラクトース代謝系遺伝子のホモログのプロモーター領域を以下のとおりクローニングした。
まず、各プロモーター領域をPCRにて増幅するためのプライマーを以下の通り設計した。なお、以下に示すプライマーの塩基配列において下線部は制限酵素認識部位を示す。プライマーはプロモーター領域両端にそれぞれXbaI、SpeI認識配列を付加するよう設計した。ただし、GAL10-2pに限り、配列中にSpeI認識配列が存在するため、両端に共にXbaI認識配列を付加するよう設計した。プライマーの名称に含まれる「F」及び「R」は、そのプライマーがそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーであることを示す。
PP7p F XbaI AATATCTAGATGACCGTGCGCTTTTTGAGAC(配列番号33)
PP7p R SpeI AGCAACTAGTCGTATATTTGTTGAAAGGTG(配列番号34)
プロモーターCIT1p
CIT1p F XbaI ATTTTCTAGACACCTCAAAAACGTGCCTTG(配列番号35)
CIT1p R SpeI AATAACTAGTGGCGGATATGTGTATGGAG(配列番号36)
プロモーターPP3p
PP3p F XbaI AACGTCTAGACGTGTTATCTTGCGCTGC(配列番号37)
PP3p R SpeI TCATACTAGTGATGATTTAGAGGTGTTGG(配列番号38)
プロモーターPP2p
PP2p F XbaI AAGCTCTAGAGACTGTAAAGACGGAGGGG(配列番号39)
PP2p R SpeI AGTAACTAGTTGTGGATAGTGGGTAGTGG(配列番号40)
プロモーターPP6ps
PP6ps F XbaI AAAGTCTAGACTGGCAATAGTTAGTGCACG(配列番号41)
PP6ps R SpeI ATCAACTAGTGATGGAGGTTTGTTTGAGAAG(配列番号42)
プロモーターHSC82p
HSC82p F XbaI ATCATCTAGAGAGCTCAAGATGAAGGTGCTC(配列番号43)
HSC82p R SpeI AATAACTAGTGGTGTGTGTGGTTTGCGGG(配列番号44)
プロモーターSSA2p
SSA2p F XbaI TTAGTCTAGAAAAGTGCTGCTTCGGAACC(配列番号45)
SSA2p R SpeI AGATACTAGTGATGTAGATGTGAGTGTGAG(配列番号46)
プロモーターGAL10-2p
GAL10-2p F XbaI AATATCTAGAGGTTCCGAGAGGTGGATTTG(配列番号47)
GAL10-2p R XbaI ATAATCTAGATGGCTCCTGAAAGGACGAG(配列番号48)
Mortierella alpina 1S-4株のゲノムを鋳型としてPCRにて各プロモーター領域をクローニングした。ポリメラーゼはPrimeSTAR GXL(TaKaRa)を使用した。
大腸菌由来のGUS遺伝子(配列番号29)のコドンの使用をモルティエレラ属の微生物用に改変したGUSm遺伝子(配列番号31)(図12A及び図12B)をレポーター遺伝子として用いた。
GUSmを恒常的発現プロモーターであるヒストンプロモーター(HisP)を含むプラスミドpBIG35(Appl. Environ. Microbiol., (2009), vol.75, p.5529-5535)に連結し、発現カセットを構築した。当該発現カセットを、さらに、ウラシル要求性のマーカー遺伝子(ura5)とタンデムに連結させ、形質転換用バイナリーベクターpBIG35ZhGUSmを構築した(図1)。なお、ベクターに使用したGUSm遺伝子はコドン使用頻度をM. alpinaに合わせて人工的に合成したβ-D-グルクロニダーゼ遺伝子である。Ura5は、M. alpinaのオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子である。HisPは、M. alpinaのヒストンH4.1遺伝子のプロモーターである。SdhBtは、M. alpinaのコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のターミネーターである。ColE1 oriは、複製起点、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子、TrfAはプラスミドの増幅にかかる遺伝子であり、Left border とRight borderは遺伝子転移のための繰返し配列である。
上述のとおりクローニングしたプロモーター領域を制限酵素XbaIとSpeI、またはXbaIで切り出し、XbaI、SpeI消化したベクターpBIG35ZhGUSmにHisPの代わりに挿入した。
M. alpina 1S-4株より特許文献(WO2005/019437)に記載された方法にしたがって誘導したウラシル要求性株Δura-3を0.05 mg/mLウラシル含有Czapek-Dox寒天培地(3% スクロース、0.2% NaNO3、0.1% KH2PO4、0.05% KCl、0.05% MgSO4・7H2O、0.001% FeSO4?7H2O、2% 寒天、pH 6.0)で培養して得た培養物を集菌し、Miracloth (Calbiochem)でろ過することで、M. alpinaΔura-3の胞子懸濁液を調製した。アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens C58C1)に、作製した各プロモーター評価用ベクターをエレクトロポレーションで形質転換し、LB-Mg寒天培地(1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、85 mM NaCl、0.5 mM MgSO4・7H2O、0.5 mM NaOH、1.5% 寒天、pH 7.0)上で28℃、48時間培養した。PCR法で当該ベクターを含むアグロバクテリウムを確認した。当該ベクターを有するアグロバクテリウムを100mL MM培地(10 mM K2HPO4、10 mM KH2PO4、2.5 mM NaCl、2 mM MgSO4・7H2O、0.7 mM CaCl2、9 μM FeSO4・7H2O、4 mM (NH4)2SO4、10 mM グルコース、pH 7.0)で28℃、120 rpm、2日間振とう培養し、5,800×gで遠心分離し、新鮮なIM培地(MM培地に0. 5% グリセロール、 200μM アセトシリンゴン、40 mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)を加え、pH 5.3に調製)を加えて懸濁液を調製した。当該懸濁液を、8〜12時間、28℃、300 rpmでOD 660=0.4 - 3.7になるまで振とう培養した。当該菌懸濁液100 μLを、等量の前記M. alpinaΔura−3懸濁液(108 mL-1)と混合し、ニトロセルロース膜(直径70 mm ; hardened low-ash grade 50、Whatman)を載せた共培養培地(IM培地と同様の組成、ただし、10 mMグルコースの代わりに5 mMグルコース及び1.5% 寒天を含む)上に塗布し、23℃で2 - 5日間培養した。共培養後、当該膜をウラシルフリー、0.03% Nile blue A (Sigma)を含むSC寒天培地(5.0 g Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco)、1.7 g (NH4)2SO4、、20 gグルコース、20 mgアデニン、30 mgチロシン、1.0 mgメチオニン、2.0 mgアルギニン、2.0 mgヒスチジン、4.0 mgリジン、4.0 mgトリプトファン、5.0 mgスレオニン、6.0 mgイソロイシン、6.0 mgロイシン、6.0 mgフェニルアラニン、寒天20 g/L)に移し、28℃で5日間培養した。視認可能な真菌コロニーからの菌糸を、ウラシルフリーSC培地に移した。新鮮なウラシルフリーSC培地に移す作業を2回おこなうことにより、形質を安定して保持する形質転換体を選抜した。
菌株の培養および回収
GY寒天培地(2 % グルコース、1 % 酵母エキス、1.5% 寒天)にて28℃、2日間培養した。培養終了後の菌体は、菌体を寒天ごと削り取って回収した。
回収した菌体に500μL破砕バッファ(100 mM Tris-HCl(PH8.0)、5 mM 2-メルカプトエタノール)を添加し、0.1 mm径ガラスビーズを用いてTOMY製ビーズショッカーにて5000 rpm、30 sec、2回破砕した。8000×g、10 min遠心し、回収した上清をさらに20400×g、10 min遠心し、上清をタンパク質溶液として回収した。タンパク質濃度を測定し、必要に応じて破砕バッファで任意の濃度に希釈した。以上の操作は全て氷上で行なった。
基質(p-ニトロフェニル-β-D-グルクロニド)を終濃度1.25mMとなるようアッセイ用バッファ(21.7 mM NaH2PO4、33.9 mM Na2HPO4、1.11 mM EDTA(pH 8.0))に溶解した。この基質溶液160μLとタンパク質サンプル40μLとを96-wellマイクロタイタープレート上で混合し、37℃、405 nmにおける吸光度を経時的に測定した。0.05、0.1、0.2、0.5 mM p-ニトロフェノールの吸光度を測定して検量線を作成し、以下の計算式によって各サンプルのGUS活性値を算出した。
GUS活性(nmol/(mg・min)) =
1000 ×[(各サンプルにおける吸光度の経時変化グラフの勾配値)/(検量線グラフの勾配値)]/[(サンプルのタンパク質濃度)/5]
各プロモーター評価用に選抜した安定形質転換株30株を、上述のとおりGY寒天培地で培養し、GUS活性を測定した。30株中で中程度のGUS活性を示した10株を選抜した。
選抜した株をGY液体培地10 ml、または大豆粉培地10 mlにて、28℃、300 rpmで5日間振とう培養した。培養終了後、菌体をろ過により回収し、GUS活性を測定した。その平均値を当該プロモーターの活性として評価した。その結果を図2に示す。
評価したプロモーターは、GY培地および/または大豆粉培地において、既知のモルティエレラ由来のプロモーターであるHisPやGAPpよりもプロモーター活性が高かった。
培養時間によるプロモーター活性の変化を調べるため、各プロモーターにつき選抜した株をGY液体培地 10 ml、28℃にて2日間、5日間、7日間、14日間、振とう培養した。培養終了後、菌体をろ過により回収し、GUS活性を測定した。結果を表に示す。
プロモーターGAL10-2pの評価は以下のとおり行った。
まず、安定形質転換株30株をSC + gal寒天培地(2%グルコースの代わりに2%ガラクトースを含むSC寒天培地)にて28℃、3日間培養し、上述のとおりGUS活性を測定し、中程度のGUS活性を示す株を10株選抜した。GY液体培地に植菌し、4日目または7日目にガラクトースを2%になるように添加した。培養条件は、28℃、300 rpmとした。培養開始2日目から14日目までのGUS活性を図3に示す。プロモーターGAL10-2pは、ガラクトースの添加により、発現誘導された。
各プロモーターのプロモーター活性に必要な領域を調べるため、各プロモーターの上流領域を削ったDNA断片を作製し、プロモーター活性を評価した。
DNA断片を得るために、各プロモーターにつき以下のプライマーを作製した。なお、下線部は制限酵素認識部位である。
プロモーターPP7p-D1000増幅用プライマー
PP7p D1000 F XbaI AGCATCTAGAAAAACTATTCAATAATGGGCG(配列番号49)
プロモーターPP7p-D750増幅用プライマー
PP7p D750 F XbaI ATTTCTAGAATGGCGAGACGCAGGGGGTAG(配列番号50)
プロモーターPP7p-D500増幅用プライマー
PP7p D500 F XbaI AATATCTAGAGAGTGGGCACTGAACTAAAAAG(配列番号51)
プロモーターPP7p-D250増幅用プライマー
PP7p D250 F XbaI AATATCTAGAGACACTGCATGACGCGAAATC(配列番号52)
CIT1p
プロモーターCIT1p-D1300増幅用プライマー
CIT1p D1300 F XbaI AAGTCTAGATGTCAATCATCTTTGCTGCTG(配列番号53)
プロモーターCIT1p-D1000増幅用プライマー
CIT1p D1000 F XbaI TGCGTCTAGAATTATAATTATAATGAGGAAGTG(配列番号54)
プロモーターCIT1p-D700増幅用プライマー
CIT1p D700 F XbaI TTATCTAGAGGCGAGTGGCGGACTGC(配列番号55)
プロモーターCIT1p-D400増幅用プライマー
CIT1p D400 F XbaI TTGTCTAGACAATTGGCAAGGCTGGGTTG(配列番号56)
PP3p
プロモーターPP3p-D1600増幅用プライマー
PP3p D1600 R XbaI AATATCTAGAGATCCTGGTCGAAAAAGACAG(配列番号57)
プロモーターPP3p-D1200増幅用プライマー
PP3p D1200 R XbaI AATGTCTAGATGAGTTTCTGTTTTTTCCTTTTTGC(配列番号58)
プロモーターPP3p-D800増幅用プライマー
PP3p D800 R XbaI AATATCTAGATGAACAATTCATGCAGCTTCACG(配列番号59)
プロモーターPP3p-D400増幅用プライマー
PP3p D400 R XbaI AATATCTAGACGTCTAAGCGTTTACGTGCC(配列番号60)
プロモーターPP3p-D200増幅用プライマー
PP3p D200 R XbaI AATATCTAGACTCGTTTTGATGGAGTTCTC(配列番号61)
PP2p
プロモーターPP2p-D1200増幅用プライマー
PP2p D1200 F XbaI ATTTCTAGATGCATTTACAGGTGAATATTAC(配列番号62)
プロモーターPP2p-D800増幅用プライマー
PP2p D800 F XbaI TTATCTAGACATAAAAGTGTCTGGAGCG(配列番号63)
プロモーターPP2p-D400増幅用プライマー
PP2p D400 F XbaI TTATCTAGAACTAAGTGGTGTCTACTTTGG(配列番号64)
プロモーターPP2p-D200増幅用プライマー
PP2p D200 F XbaI AATTCTAGAGGATACTCCATCCCCACCC(配列番号65)
プロモーターPP6ps増幅用プライマー
PP6ps-D1000
PP6ps D1000 F XbaI AATTCTAGACAGTTACCGTGCGCCCACTG(配列番号66)
プロモーターPP6ps-D750増幅用プライマー
PP6ps D750 F XbaI AATTCTAGACTTTCACAAATAGGCATCCTATC(配列番号67)
プロモーターPP6ps-D500増幅用プライマー
PP6ps D500 F XbaI AATTCTAGAGGCTTTTTCGTTTATTGGATTG(配列番号68)
プロモーターPP6ps-D100増幅用プライマー
PP6ps D100 F XbaI ACGTCTAGATATCCAATTCTCACCACTTC(配列番号69)
HSC82p
プロモーターHSC82p-D800増幅用プライマー
HSC82p D800 F XbaI AATTCTAGATTTTACTACCGCATTCCCTTTTC(配列番号70)
プロモーターHSC82p-D600増幅用プライマー
HSC82p D600 F XbaI ACGTCTAGACCTTTTCAGTAAACAATTTC(配列番号71)
プロモーターHSC82p-D400増幅用プライマー
HSC82p D400 F XbaI ATTTCTAGACACAAAGAAGAAGGGTGTGTC(配列番号72)
プロモーターHSC82p-D200増幅用プライマー
HSC82p D200 F XbaI ACGTCTAGAACTGTTTTCTTGAAACTTC(配列番号73)
SSA2p
プロモーターSSA2p-D850増幅用プライマー
SSA2p D850 F SpeI AGTAACTAGTTGACGGCGTGTATATGTCAG(配列番号74)
プロモーターSSA2p-D600増幅用プライマー
SSA2p D600 F SpeI AGGTACTAGTCCATTGTATCGATTTCTGAT(配列番号75)
プロモーターSSA2p-D400増幅用プライマー
SSA2p D400 F SpeI AGTAACTAGTGCTATGCGAACGGTTCATTTTG(配列番号76)
プロモーターSSA2p-D200増幅用プライマー
SSA2p D200 F SpeI AGGTACTAGTTTTTTTCTCTCTGGTGTGAACG(配列番号77)
GAL10-2p
プロモーターGAL10-2p-D2000増幅用プライマー
GAL10-2p D2000 F XbaI AATTCTAGACGCAGAGTGATGGTCATTACC(配列番号78)
プロモーターGAL10-2p-D1600増幅用プライマー
GAL10-2p D1600 F XbaI AATTCTAGACTCTATGGCAAGATTACGAG(配列番号79)
プロモーターGAL10-2p-D1200増幅用プライマー
GAL10-2p D1200 F XbaI AATTCTAGATGCTCGTGAAGAGGGGCAC(配列番号80)
プロモーターGAL10-2p-D800増幅用プライマー
GAL10-2p D800 F XbaI ACGTCTAGACATTTTTTGCCGCCAATTCTG(配列番号81)
プロモーターGAL10-2p-D400増幅用プライマー
GAL10-2p D400 F XbaI ATTTCTAGACCCCCGCCTATTTTTTTTTTC(配列番号82)
項目「モルティエレラ・アルピナの形質転換」に記載の手法と同様にM. alpinaを形質転換し、安定形質転換株を選抜した。実施例と同様にGUS活性を測定した。なお、培養日数は、各プロモーターの特性に応じて3日間(CIT1p)、5日間(PP7p、PP6p、HSC82p、SSA2p、GAPp)、あるいは10日間(PP3p)とした。結果を図4〜10に示す。
Claims (9)
- 以下の(a)〜(c)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号1〜8、10、11、13〜20、22〜26からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号1〜8、10、11、13〜20、22〜26からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド;及び
(c)配列番号1〜8、10、11、13〜20、22〜26からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド。 - 前記プロモーター活性は、モルティエレラ属に属する微生物細胞内でGUSレポーター遺伝子を発現させた場合に少なくとも500 nmol/(mg・分)のGUSタンパク質活性が確認されるものである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1〜8、10、11、13〜20、22〜26からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
- 請求項5に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
- 前記形質転換体が脂質生産菌である、請求項7に記載の形質転換体。
- 前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)である、請求項8に記載の形質転換体。
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