CN105408484B - 来自红冬孢属和红酵母属的多核苷酸序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的启动子和合成构建体的应用，其用于在选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的物种，尤其是选自红冬孢属、红酵母属、Pseudozyma、黑粉菌属或掷孢酵母属的物种中有效产生遗传学修饰的细胞。

Description

来自红冬孢属和红酵母属的多核苷酸序列及其用途

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请系列号61/782,832的权益。该申请通过引用并入本文。

序列提交

本申请和电子格式的序列表一起提交。所述序列表名为2577230PCTSequencListing.txt，创建于2014年2月18日且大小为39kb。该序列表的电子格式中的信息是本申请的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

发明背景

本发明涉及真菌生物技术的领域，更具体涉及在柄锈菌(Pucciniomycotina)亚门和黑粉菌(Ustilaginomycotina)亚门物种中的强基因表达系统。

本文中用于说明发明背景的出版物和其它材料，以及尤其是针对实施提供额外细节的例子，通过引用并入，并且出于方便在下文通过作者和日期引用并在所附参考书目中以作者字母顺序列出。

柄锈菌是担子菌(Basidiomycota)门中的真菌亚门(Kirk et al.，2008)。其包括许多具有重要工业应用的物种。例如，红冬孢属(Rhodosporidium)和锁掷酵母属(Sporidiobolus)的许多物种，如类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)(也已知为纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)、Rhodosporidium glutinis、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、小石川氏圆酵母(Torula koishikawensis)和Torularubescens)和赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)，是能够高密度发酵的富油单细胞酵母(Hu et al.，2009；Meng et al.，2009)。这些物种具有作为产生长链烃类，例如三酰基甘油(TAG，或脂肪)、脂肪酸酯(生物柴油)、脂肪族醇类、醇类、内酯类、萜类化合物和维生素的宿主的极大潜能(Wu et al.，2010a；Wu et al.，2010b；Zhao et al.，2010a；Zhaoet al.，2010b)。在另一实例中，黑粉菌亚门中的物种，尤其是黑粉菌属(Ustilago)和Pseudozyma属，已知产生糖脂类，其可以作为表面活性剂或杀真菌剂(Hewald et al.，2005；Teichmann et al.，2010)。

能够驱动强基因表达(组成型或诱导型)的启动子，对于微生物的生物技术应用开发是关键的。WO 2012/169969，以其整体通过引用并入本文，描述了若干衍生自选定的真菌物种的磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD1)、翻译起始因子基因(TEF1)和假定的硬脂酰-CoA-Δ9-去饱和酶基因(FAD1)的多核苷酸序列，其能够充当柄锈菌亚门和黑粉菌亚门中基因表达的强启动子。由于重复使用相同或高度同源的启动子存在基因组不稳定性、重复诱导的点突变(RIP)或RNA沉默导致的染色质表观遗传修饰和遗传修饰的风险(Horns et al，2012)，对于罕有经功能验证的启动子的柄锈菌亚门和黑粉菌亚门而言，非常需要扩大的启动子库。

启动子是位于5’区邻接转录起始位点的DNA序列。其包括顺式作用DNA元件的组合，所述元件与转录因子相互作用激活或抑制RNA聚合酶的转录。至今，已经公布胶粘红酵母ATCC 204091(GenBank Accession：GL989638.1)、类酵母红冬孢MTCC 457(GenBankAccession：PRJNA112573)、类酵母红冬孢NP11(GenBank：ALAU00000000.1)的基因组鸟枪序列且已经公布禾木科红酵母(Rhodotorula graminis)WP1(http：//genome.jgi-psf.org/Rhobal_1/Rhobal_1.home.html)和红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)(http：//genome.jgi-psf.org/Sporol/Sporol.home.html)基因组草图序列。类酵母红冬孢NP11所释放的RNA-Seq、蛋白组和基因组鸟枪数据(Zhu，Z.，et al，2012)不能明确功能启动子的序列，因为启动子的活性受若干因素的影响，例如5’和3’末端的定位、转录后沉默、内含子影响等。启动子在异源宿主物种中的活性更加无法预测。

发明概述

本发明涉及真菌生物技术的领域，更具体涉及在柄锈菌(Pucciniomycotina)亚门和黑粉菌(Ustilaginomycotina)亚门物种中的强基因表达系统。

在第一方面，本发明提供多核苷酸序列，其作为红冬孢属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、Pseudozyma或黑粉菌属(Ustilago)中基因表达的强启动子起作用。这些多核苷酸序列在本文中有时称作多核苷酸启动子序列。在一实施方式中，所述多核苷酸启动子序列包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11中任一所示的序列。在另一实施方式中，所述多核苷酸启动子序列包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11中任一所示的启动子序列，即不含克隆位点的序列。所述多核苷酸启动子序列的每一个含有至少一个GAGGAG序列基序，其功能为在所述真菌物种中增强基因表达。多核苷酸的每一个有效地在红冬孢属、红酵母属、掷孢酵母属、Pseudozyma或黑粉菌属中进行强基因表达。此外，这些多核苷酸启动子序列的可操作片段可以使用常规启动子筛选测定分离以及可以被筛选用于使用本文描述的技术有效地选择经转化的真菌细胞。在一实施方式中，可操作片段，本文也称作启动子部分，从ATG密码子-1位开始长度为大约400碱基对至多达大约1100碱基对。如本文所用“多达”指的是所公开的SEQ ID NO中所示的启动子的启动子部分的长度。因而，如果所公开的SEQ ID NO的启动子少于1100个核苷酸，那么“多达”指的是启动子序列的最大长度。

在第二方面，本发明提供DNA构建体，其包含本文所描述的多核苷酸启动子序列、可操作地连接的多肽编码序列和可操作地连接的RNA转录终止序列。可以使用本领域技术人员熟知的任何真核转录终止子。这样的DNA构建体允许多肽在基因组偏向C和G的真菌物种中的强表达。尤其相关的是选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的物种。所述尤其相关的物种是红冬孢属、红酵母属、掷孢酵母属、黑粉菌属或Pseudozyma中的那些，其中存在大量物种具有将可再生资源生物转化为高价值产品的巨大潜能，所述产品例如，甘油三酯、生物柴油、脂肪醇、维生素、内酯、萜类化合物和生物表面活性剂。

附图简述

图1显示启动子的克隆和转化载体。pPN007和pRH2031均是基于pPZP200且含有Umgpd1：：hpt-3潮霉素选择标记。RtGFP是针对富含GC的基因组优化的密码子优化的GFP基因。

图2显示GAGGAG基序的定位。具有*的垂直线指示有义方向的GAGGAG基序，其余的线为反义方向。

图3显示由不同长度的ENO1和FD1启动子驱动的RtGFP的相对荧光，所述长度定义为从假定翻译起始密码子(ATG)第一个核苷酸开始直至5’末端的点的核苷酸数目，不包括添加的限制性位点。所述启动子在YNB和YNB无氮(N^-)培养基中显示相似的趋势。35S-Ω是基础启动子，含有花椰菜花叶病毒35S基因启动子从TATA盒开始直至5’UTR的-1位以及插入至RtGFP直接上游的烟草花叶病毒(TMV)的Ω翻译增强子序列。所有值已经扣除了非转化菌株(R.toruloides ATCC 10657)的背景荧光。

图4A显示了519bp Rg2ENO1启动子序列的细节。箭头指示不同缺失的5’端的位置。

图4B显示每个截短的Rg2ENO1启动子的编码和长度。

图5A和图5B显示由不同长度的ENO1启动子驱动的RtGFP的相对荧光，所述长度定义为从假定翻译起始密码子(ATG)第一个核苷酸开始直至5’末端的点的核苷酸数目，不包括添加的限制性位点。所述启动子在YNB(图5A)和YNB无氮(N^-)(图5B)培养基中显示相似的趋势。Rg1 Wt指的是R.glutinis ATCC 90781的背景荧光。

发明详述

除非另外定义，本文所用全部技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

术语“可操作地连接(operably linked)”或“可操纵地连接(operativelylinked)”本文定义为这样的构型，其中调控序列或控制序列被置于相对于核酸构建体的核苷酸序列的适当位置，使得所述控制序列指导本发明的多核苷酸的表达。如本领域所熟知，调控或控制序列可以被置于所述核苷酸序列的5’侧或在所述核苷酸序列的3’侧。

如本文所用术语“强表达”意指标记蛋白或mRNA的表达达到使用已知的检测方法(例如，对于GFP的荧光、对于GUS和lacZ基因的活性测定)可检测的水平。

本发明涉及真菌生物技术的领域，更具体涉及在柄锈菌(Pucciniomycotina)亚门和黑粉菌(Ustilaginomycotina)亚门物种中的强基因表达系统。

在第一方面，本发明提供多核苷酸序列，其作为红冬孢属、红酵母属、掷孢酵母属、Pseudozyma或黑粉菌属中基因表达的强启动子起作用。这些多核苷酸序列在本文中有时称作多核苷酸启动子序列。在一实施方式中，所述多核苷酸启动子序列包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11中任一所示的序列。在另一实施方式中，所述多核苷酸启动子序列包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11中任一所示的启动子序列，即不含克隆位点的序列。所述多核苷酸启动子序列的每一个含有至少一个GAGGAG序列基序，其功能为在所述真菌物种中增强基因表达。多核苷酸的每一个有效地在红冬孢属、红酵母属、掷孢酵母属、Pseudozyma或黑粉菌属中进行强基因表达。此外，这些多核苷酸启动子序列的可操作片段可以使用常规启动子筛选测定分离以及可以被筛选用于使用本文描述的技术有效地选择经转化的真菌细胞。在一实施方式中，可操作片段，本文也称作启动子部分，从ATG密码子-1位开始长度为大约400碱基对至多达大约1100碱基对。如本文所用“多达”指的是所公开的SEQ ID NO中所示的启动子的启动子部分的长度。因而，如果所公开的SEQ ID NO的启动子少于1100个核苷酸，那么“多达”指的是启动子序列的最大长度。

在第二方面，本发明提供DNA构建体，其包含本文所描述的多核苷酸启动子序列、可操作地连接的多肽编码序列和可操作地连接的RNA转录终止序列。可以使用本领域技术人员熟知的任何真核转录终止子。这样的DNA构建体允许多肽在基因组偏向C和G的真菌物种中的强表达。尤其相关的是选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的物种。所述尤其相关的物种是红冬孢属、红酵母属、掷孢酵母属、黑粉菌属或Pseudozyma中的那些，其中存在大量物种具有将可再生资源生物转化为高价值产品的巨大潜能，所述产品例如，甘油三酯、生物柴油、脂肪醇、维生素、内酯、萜类化合物和生物表面活性剂。

本领域技术人员熟知的DNA操作技术，核酸杂交，可以用于鉴别其它合适的多核苷酸。根据本发明，通过在低严格性条件、中严格性条件或高严格性条件下的杂交鉴别与上面描述的启动子选择性杂交的多核苷酸，可以获得适用的其它启动子。选择性杂交的序列一般相互之间具有至少50％序列相同性，优选具有至少70％、80％或90％序列相同性，且最优选具有95％、98％或99％序列相同性。

数据库搜索以及基因组和核苷酸数据库的同源性搜索基于核苷酸比对使用算法或计算机程序鉴别类似的DNA或RNA分子，且这些技术是本领域技术人员熟知的。根据本发明，适用的其它多核苷酸可以通过计算机模拟鉴别相互之间具有至少50％序列相同性，优选具有至少70％、80％或90％序列相同性，且最优选具有95％、98％或99％序列相同性的调控序列的多核苷酸来获得。

本发明提供选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的多核苷酸启动子序列，或其启动子序列，即，不含克隆位点的序列。在一实施方式中，提供了与这些多核苷酸启动子序列中的任一具有至少60％相同性的多核苷酸启动子序列。在另一实施方式中，提供了与这些多核苷酸启动子序列中的任一具有至少70％相同性的多核苷酸启动子序列。在另一实施方式中，提供了与这些多核苷酸启动子序列中的任一具有至少80％相同性的多核苷酸启动子序列。在另一实施方式中，提供了与这些多核苷酸启动子序列中的任一具有至少90％相同性的多核苷酸启动子序列。在另一实施方式中，提供了与这些多核苷酸启动子序列中的任一具有至少95％相同性的多核苷酸启动子序列。在另一实施方式中，提供了与这些多核苷酸启动子序列中的任一具有至少98％相同性的多核苷酸启动子序列。在一实施方式中，本文的启动子序列，从ATG密码子-1位开始长度为大约400碱基对至多达大约1100碱基对。如本文所用“多达”指的是所公开的SEQ ID NO中所示的启动子的启动子部分的长度。因而，如果所公开的SEQ ID NO的启动子少于1100个核苷酸，那么“多达”指的是启动子序列的最大长度。

本发明提供了多核苷酸构建体，其包含本文所述的分离的启动子，例如选自SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之一或其启动子部分，所述分离的启动子可操作地与多肽编码序列连接，所述多肽编码序列可操作地与转录终止子连接。在一实施方式中，可操作片段，本文也称作启动子部分，从ATG密码子-1位开始长度为大约400碱基对至多达大约1100碱基对。如本文所用“多达”指的是所公开的SEQ ID NO中所示的启动子的启动子部分的长度。因而，如果所公开的SEQ ID NO的启动子少于1100个核苷酸，那么“多达”指的是如果启动子序列的最大长度。在一实施方式中，所述多核苷酸构建体使得多肽能够在选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的真菌物种中有效表达。所述真菌物种优选选自红冬孢属、红酵母属、黑粉菌属、Pseudozyma或掷孢酵母属的物种，其基因组含有至少50％C和G，优选超过60％C和G。

在一实施方式中，所述多核苷酸构建体被插入于T-DNA载体、穿梭载体或真菌染色体中，其中所述多肽编码序列含有至少50％CG，优选60％CG且最优选超过80％CG。

在另一实施方式中，所述多核苷酸启动子序列含有至少一个GAGGAG序列，或其反向互补序列。在另一实施方式中，所述分离的启动子可操作地连接于编码抗生素抗性酶、除草剂抗性酶、GFP、GUS、lacZ、萜烯合酶、脂肪酸去饱和酶、P450细胞色素氧化酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡甘聚糖酶、木葡聚糖酶(xyluglucanase)、羟甲基戊二酸-CoA合酶、羟甲基戊二酸-CoA还原酶、乙酰-CoA C-乙酰转移酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基-二磷酸Δ异构酶、法尼基二磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、甲基转移酶或葡萄糖基转移酶、β-类胡萝卜素羟化酶、β-类胡萝卜素氧化酶的基因。

在一实施方式中，可以使用在真菌物种中有效的任何转录终止子。终止子一般位于基因的下游(3’)，在终止密码子(TGA、TAG或TAA)之后。终止子在RNA的加工和稳定以及在翻译中起重要作用。大部分(但不是全部)终止子含有多聚腺苷酸化序列或切割位点。具体多聚腺苷酸化序列的例子是AAUAAA或AAUAAU。这些序列已知是近上游元件(NUE)(Nagayaet al.，2010)。NUE通常位于离GU富含区域大约30bp处(Mogen et al.，1990；Mogen etal.，1992；Rothnie et al.1994)，所述GU富含区域已知为远上游元件(FUE)。所述FUE增强在多聚腺苷酸化序列或切割位点处的加工，其通常是U-富含区域中的CA或UA(Bassett，2007)。在所述终止子内，存在增加所转录的RNA的稳定性(Ohme-Takagi et al.，1993；Newman et al.，1993；Gutiérrez et atl.，1999)且也能够控制基因表达(Ingelbrecht，1989；An et al.，1989)的元件。

本领域技术人员熟知的DNA操作技术，核酸杂交，可以用于鉴别其它合适的终止子。根据本发明，通过在低严格性条件、中严格性条件或高严格性条件下的杂交鉴别与上面描述的启动子选择性杂交的终止子，可以获得适用的其它启动子。选择性杂交的序列一般相互之间具有至少50％序列相同性，优选具有至少70％、80％或90％序列相同性，且最优选具有95％、98％或99％序列相同性。

数据库搜索以及基因组和核苷酸数据库的同源性搜索基于核苷酸比对使用算法或计算机程序鉴别类似的DNA或RNA分子，且这些技术是本领域技术人员熟知的。根据本发明，适用的其它终止子可以通过计算机模拟鉴别相互之间具有至少50％序列相同性，优选具有至少70％、80％或90％序列相同性，且最优选具有95％、98％或99％序列相同性的调控序列的终止子来获得。

可以将感兴趣的DNA添加至所述多核苷酸构建体。所述感兴趣的DNA与启动子和终止子可操作地连接。可以使用在柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的物种中有效的任何启动子和终止子。在一些实施方式中，感兴趣的DNA可用来插入或修饰代谢途径，例如脂肪酸生物合成、脂质生物合成、甘油三酯生物合成等等。可以将感兴趣的DNA插入进真菌细胞的基因组以增强可再生资源生物转化成高价值产品，例如甘油三酯、生物柴油、脂肪醇、维生素、生物表面活性剂、内酯、萜类化合物等等。

可以使用电穿孔和植物细胞原生质体微注射的技术将多核苷酸构建体直接导入真菌细胞的基因组DNA内，或者可以使用弹射方法例如DNA颗粒轰击将所述多核苷酸构建体直接导入真菌组织。可选地，所述多核苷酸构建体可以和合适的T-DNA侧翼区域组合并导入至常规根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主载体。当细胞被细菌感染时，所述根瘤农杆菌宿主的毒力功能将指导所述构建体插入至真菌细胞DNA。因此，可以采用任何提供有效转化/转染的方法。见，例如，美国专利号7,241,937，7,273,966和7,291,765以及美国专利申请公开号2007/0231905和2008/0010704以及其中引用的参考文献。也见，国际公开申请号WO 2005/103271和WO 2008/094127以及其中引用的参考文献。

经转化的真菌转移至标准生长培养基(如，固体或液体营养培养基、谷物、蛭石、堆肥、泥炭、木材、木屑、秸秆等)并以本领域技术人员已知的方式生长或培养。

多核苷酸在稳定地并入所转化的真菌后，其可以通过有性杂交转移至其它真菌。可以使用多种标准育种技术中的任一种，这取决于所杂交的物种。

用任何重组构建体产生许多单独转化真菌可能是有用的，用以回收无任何位置效应的真菌。也可能优选选择含有多于一个拷贝的导入的多核苷酸构建体的真菌，从而获得重组分子的高水平表达。

如果在特定物种中有可能的话，期望产生对特定基因是纯合的真菌品系。在一些物种中，这通过使用单孢子培养实现。通过使用这些技术，有可能产生携带所插入基因的单倍体品系，然后自发地或通过使用秋水仙碱使染色体数目加倍。这导致对于所插入的基因是纯合的真菌，其可以容易地测定，如果所插入的基因伴随其携带有合适的选择标记基因，所述选择标记基因用于检测携带该基因的真菌。可选地，真菌可以是自交的(self-fertilized)，导致产生孢子混合物，在最简单的实例中，其由对插入基因纯合(25％)、杂合(50％)、空白(25％)三种类型组成。尽管从含有所述基因的真菌鉴定(score)出空白真菌相对容易，在实践中也可能通过Southem印迹分析从杂合真菌鉴定出纯合真菌，其中要认真注意上样完全相等的量的来自混合群体的DNA，并且通过来自特异于插入基因的探针的信号强度鉴定杂合体。通过使各独立转化体自交来确证Southern印迹分析的结果是可取的，因为纯合性的额外的证据可以通过这样的简单事实获得，即如果该真菌对插入基因是纯合的，来自该自交个体的全部后续真菌品系将含有所述基因，而如果该真菌对所述基因是杂合的，生长自该自交种子的后代将包含空白真菌品系。因此，用简单的自交，可以选择纯合的真菌品系，其也可以通过Southern印迹分析确认。

纯合亲本品系的创建使得有可能产生杂交真菌和孢子，其将含有修饰的蛋白组分。用含有与启动子可操作连接的第一或者第二重组DNA序列的各自亲本维持转基因纯合亲本品系。该方案也并入了生长杂交作物的优势，包括组合更多有价值的形状和杂种优势。

本发明的实施采用了，除非另外指明，化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，其在本领域的能力范围内。见例如，Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，2ndEd.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrookand Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)；Ausubel et al.，1992)，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNACloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecular biology of plants：alaboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)；Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(AcademicPress，New York，1992)；Guthrie and Fink，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology(Academic Press，New York，1991)；Harlow and Lane，1988，Antibodies，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Methods In Enzymology，Vols.154and 155(Wu etal.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，EssentialImmunology，6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Fire etal.，RNA Interference Technology：From Basic Science to Drug Development，Cambridge University Press，Cambridge，2005；Schepers，RNA Interference inPractice，Wiley-VCH，2005；Engelke，RNA Interference(RNAi)：The Nuts&Bolts ofsiRNA Technology，DNA Press，2003；Gott，RNA Interference，Editing，andModification：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，Human Press，Totowa，NJ，2004；Sohail，Gene Silencing by RNA Interference：Technology andApplication，CRC，2004。

实施例

本发明通过参考下面的实施例进行描述，其以说明的方式提供，且不旨在以任何方式限制本发明。使用本领域熟知的标准技术或下文具体描述的技术。

实施例1

微生物菌株培养和基本分子方法

类酵母红冬孢菌株ATCC10657(称作Rt1)，和胶粘红酵母菌株ATCC204091(称作Rg2)、Pseudozyma aphidis ATCC32657，来源于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。红色掷孢酵母FGSC 10293(IAM13481)和禾木科红酵母WP1(FGSC WP1)(称作Rg3)获得自真菌遗传学储存中心(美国密苏里大学)。玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)菌株和根瘤农杆菌菌株AGL-1已被描述(Ji et al.，2010；Lazo et al.，1991)。大肠杆菌菌株XL1-Blue用于常规质粒操作和扩增。真菌菌株在YPD肉汤(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中或在固体马铃薯-右旋糖琼脂(PDA)上在28℃培养。根瘤农杆菌在液体或固体2YT培养基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl)中在28℃培养。大肠杆菌在LB肉汤或在固体LB琼脂上生长。

基于针对玉蜀黍黑粉菌(Ji et al.，2010)描述的并进行一些修改的方法提取基因组DNA。简言之，收集指数期的细胞培养物并用1M山梨醇洗涤。将细胞重悬于0.1ml的SCS缓冲液(1M山梨醇、20mM柠檬酸钠，pH5.8)并补充玻璃珠(直径1mm，Sigma-Aldrich，USA)。通过涡旋制备细胞裂解物，并在酚/氯仿提取和乙醇沉淀后分离基因组DNA。所提取的DNA用

ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies，USA)定量且通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA质量。

实施例2

根瘤农杆菌介导的转化(ATMT)

ATMT基本上如之前针对类酵母红冬孢、红色掷孢酵母、玉蜀黍黑粉菌和Pseudozyma aphidis所描述的进行(Ji，et al.，2010；Liu，et al，2012)。真菌细胞和农杆菌供体的共培养在尼龙膜上在pH5.6，24℃进行2.5-3天，且选择在含300μg/ml头孢噻肟和150-300μg/ml(对类酵母红冬孢、胶粘红酵母150μg/ml，而对P.aphidis和红色掷孢酵母300μg/ml)潮霉素B的YPD板在28℃进行3-5天。

实施例3

启动子的克隆

基于公开的在不同培养基中的EST序列丰度(Ho et al，2007)，我们选择了许多基因(表1)作为用于红冬孢属和红酵母属的强启动子的潜在来源。其它候选基因包括编码红冬孢属和红酵母属脂肪酸生物合成中的蛋白质的那些，如，乙酰-CoA合酶(ACC1)、酰基-CoA载体蛋白(ACP1)、丙酮酸脱羧酶(PDC1)和硝酸盐调控基因(NAR1)。针对红冬孢属和红酵母属基因组数据库搜索玉蜀黍黑粉菌CDS序列。

表1具有强启动子的候选基因

注意：*数字表示在各培养基的EST文库中的总命中数。

为了明确启动子的3’端，使用BD SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，California，USA)根据制造商说明进行5’RACE。通过PCR获得启动子DNA片段，使用3’端引物，其设计在5’非翻译区的第一个ATG处，通常在ATG密码子处具有重叠的NcoI(CCATGG)或BspHI位点。如果所述DNA序列含有NcoI和BspHI位点则使用BamHI。5’引物设计为距离ATG1-2kb。使用的引物在表2中列出。PCR片段用相应的酶消化，克隆于pPN006或pRH2031(图1)，其是T-DNA载体，含有RtGPD1：：RtGFP：nos盒(Liu et al，2012)。

表2所选启动子的克隆

实施例4

液体生产培养基中红冬孢属中的启动子活性

通过ATMT方法将启动子GFP报道子(reporter)构建体转化至类酵母红冬孢ATCC10657。合并经转化的菌落(＞100)，在含有150μg/ml潮霉素B和300μg/ml头孢噻肟的YPD培养基中培养，并在无抗生素添加的液体生产培养基[10mM K2HPO4-KH2PO4，(pH6.13)，4g/L酵母提取物，0.3g/L尿素，0.1g/L Na2SO4，酪氨酸、缬氨酸和维生素B(B1+B6)各10mg/L，8％葡萄糖]中稀释至大约0.1OD600。菌株在28℃震荡(280rpm)培养2天，然后稀释至大约0.1OD600 24小时，将培养物调整至0.6 OD600单位，之后在Tecan M200读数仪使用476nM作为激发波长及509nM作为发射波长进行荧光测量；增益值100。荧光强度标准化至OD600并针对在相同条件下的非转化细胞培养物进行扣减。Rg3TAL1弱而Rg2ACC1显示没有明显活性(表3)。显示无GFP荧光的胶粘红酵母ATCC 90781中Rg2ACC1报道子的转化体也在氮限制性培养基(葡萄糖70g/l，酵母提取物0.75g/l，(NH4)2SO4 0.1g/l，KH2PO4 1.0g/l，MgSO4·7H2O1.5g/l，pH 5.6)中培养24小时(未显示)。启动子RtGPD1示于SEQ ID N：38。

表3选定的启动子在类酵母红冬孢中的相对GFP荧光

启动子	Rg2TEF1	Rg3TEF1	Rg3TAL1	Rg3S27	Rg3PPI	Rg2ENO1	Rg2ACC1	RtGPD1
									荧光读数	183	616	83	316	566	383	0	1100

实施例5

红冬孢属、Pseudozyma、黑粉菌属和掷孢酵母属中在富N和无N培养基的启动子活性

将选定的一组启动子GFP报道子构建体通过ATMT方法转化至类酵母红冬孢ATCC10657、玉蜀黍黑粉菌L8、Pseudozyma aphidis ATCC32657和红色掷孢酵母FGSC 10293。合并经转化的菌落(＞100)，在含150μg/ml(或对于Pseudozyma aphidis为300μg/ml)潮霉素B和300μg/ml头孢噻肟的YPD培养基中28℃培养2天，并在YNB培养基以及YNB N-培养基(两种培养基含5％葡萄糖)中稀释至大约0.1OD600，继续震荡培养1-3天。使用TecanInfinite200测量OD600和GFP荧光。GFP荧光强度(针对OD600标准化)列于表4-11。启动子Umgpd1、RtGPD1、Rg3GPD1、Rg2FAD1和SrGPD1分别示于SEQ IN NO：37、38、39、40和41。这些启动子的分离描述于WO 2012/169969。

实施例6

鉴别强启动子的关键元件

使用位于http：//ccmbweb.ccv.brown.edu/cgi-bin/gibbs.12.pl？data_type＝DNA&layout＝advancedprgm&restore＝/var/www/cgi-bin/euk.def.txt的Gibbs Mo tifSampler对Rg3TEF1、Rg3S27、Rg2ACP1、Rg2ENO1、Rg2PDC1、Rg3PDC1和Rg2FAD1(硬脂酰-CoAΔ-9去饱和酶)的启动子序列进行启动子基序扫描。

在各启动子中发现共有GAGGAG核心序列的保守基序。值得注意的是，最强启动子之一的Rg2FAD1启动子，含有最多数目的该基序。(图2)。

实施例7

Rg2FAD1和Rg2ENO1启动子的巢式缺失

pRH2031中的全长Rg2ENO1和Rg2FAD1(硬脂酰-CoA Δ-9去饱和酶)启动子GFP构建体被修饰为具有连续缩短的启动子。这通过用启动子大约300、500、1000和1500bp版本的PCR片段替换所述启动子实现。全部5’引物包含SpeI切割位点而3’引物含有NcoI切割位点。构建体通过ATMT方法转化至类酵母红冬孢ATCC 10657。合并经转化的菌落(＞500)，在含150μg/ml潮霉素B和300μg/ml头孢噻肟的YPD培养基中28℃培养2天，并在YNB培养基以及YNB N-培养基(两种培养基含5％葡萄糖)中稀释至大约0.1OD₆₀₀，继续震荡培养24小时。培养物在YNB N+和YNB N^-培养基中达到OD₆₀₀0.2单位。用Tecan infinite M200测量GFP荧光。增益参数一致地设为85；激发和发射波长为476，509。GFP荧光强度(针对OD600标准化)列于图3，其显示ENO1启动子对于报道子基因最优表达的最小长度是大约320至520bp，而FAD1启动子需要大约570至1120bp。

实施例8

519bp Rg2ENO1启动子的巢式缺失

在519bp Rg2ENO1启动子的不同位置设计引物，其用于与靶向启动子3’端的反向引物组合进行PCR(图4A)。全部5’引物包含SpeI切割位点而3’引物含有NcoI切割位点。PCR产物的长度(不包括5’端的额外接头序列和3’位点的ATG密码子)总结于图4B。PCR片段个别地用SpeI和NcoI消化并在相同位点克隆进pRH2031-Rg2ENO1-RtGFP，替换全长ENO1启动子。通过ATMT方法将构建体转化至胶粘红酵母ATCC90781，其是类酵母红冬孢10657和ATCC10788的二倍体亲本。合并经转化的菌落(＞500)，在含150μg/ml潮霉素B和300μg/ml头孢噻肟的YPD培养基中28℃培养2天，并在YNB培养基以及YNB N-培养基(两种培养基含5％葡萄糖)中稀释至大约0.1OD₆₀₀，继续震荡培养12小时。培养物在YNB和YNB N^-培养基中达到OD₆₀₀0.5～0.7。用Tecan infinite M200测量GFP荧光。增益参数一致地设为85；激发和发射波长为476，509。GFP荧光强度(针对OD600标准化)列于图5A和5B。在测试的两种培养基中，启动子显示类似的趋势。启动子M6和M7显示最大的活性下降。在M3和M6之间观察到另一显著下降，其中可以发现若干GAGGAG-相关基序(图4A)。

在描述本发明的上下文中，术语“一(a)”和“一(an)”和“所述(the)”及类似代词的使用应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指明或显然与上下文矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。除非本文另外指明，本文记载的数值范围仅仅旨在作为个别地引用落在该范围的各单独值的速记法，且各单独值并入本说明书就如同其在本文被个别地记载一样。本文描述的全部方法可以任何合适顺序进行，除非本文另外指明或另外地与上下文明显矛盾。本文提供的任何和全部实例或示例性语言(如，“例如”)的使用，仅仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明范围进行限制，除非另外声明。说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何未要求的元件对于本发明的实施是必要的。

本文描述了本发明的实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前面描述后，那些实施方式的变型对于本领域技术人员而言将变得显而易见。本发明人预期本领域技术人员能合适地采用这样的变型，且发明人预期本发明以本文所具体描述之外的方式实施。因此，如相关法律允许，本发明包括本文所附权利要求中记载的主题的全部修改和等同物。此外，本文涵盖上面描述的元件全部可能变型的任何组合，除非本文另外指明或另外明显与上下文矛盾。

术语“有效表达”指的是报道子蛋白表达至这样的水平，其可以用荧光计、光度计检测或通过抗生素如潮霉素对转化体进行表型选择。

参考书目

An，G.，et al.，1989.Functional analysis of the 3′control region of thepotato wound-inducible proteinase inhibitor II gene.Plant Cell，1：115-122.

Bassett，C.L.，2007.Regulation of Gene Expression in Plants：The Role ofTranscript Structure and Processing.New York：Springer Press.

M.，et al.，1995.Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydisby restriction enzyme-mediated integration(REMI).Mol Gen Genet.248，547-52.

Boulton，S.，et al.，1999.Interactive effects of inhibitors of poly(ADP-ribose)polymerase and DNA-dependent protein kinase on cellular responses toDNA damage.Carcinogenesis.20，199-203.

Boulton，S.，et al.，1996.Wortmannin is a potent inhibitor of DNA doublestrand break but not single strand break repair in Chinese hamster ovarycells.Carcinogenesis.17，2285-90.

Bundock，P.，et al.，1995.Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae.EMBO J.14，3206-14.

Choi，J.，et al.，2007.Genome wide analysis of T DNA integration intothe chromosomes of Magnaporthe oryzae.Molecular Microbiology.66，371-382.

Comai，L.，et al.，1983.An altered aroA gene product confers resistanceto the herbicide glyphosate.Science.221，370.

De Groot，M.J.A.，et al.，1998.Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of filamentous fungi.Nature Biotechnology.16，839-842.

de Oliveira，M.L.P.，et al.，2009.High-efficiency Agrobacterium-mediatedtransformation of citrus via sonication and vacuum infiltration.Plant CellReports.28，387-395.

Durant，S.，Karran，P.，2003.Vanillins--a novel family of DNA-PKinhibitors.Nucleic Acids Res.31，5501-12.

Gietz，R.D.and Woods，R.A.，2002.Transformation of yeast by lithiumacetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.MethodsEnzymol.350，87-96.

Goldstein，A.L.and McCusker，J.H.，1999.Three new dominant drugresistance cassettes for gene disruption in Saccharomycescerevisiae.Yeast.15，1541-1553.

Gutiérrez，R.A.，et al.，1999.Current perspectives on mRNA stability inplants：multiple levels and mechanisms of control.Trends Plant Sci，4：429-438.

Hajdukiewicz，P.，et al.，1994.The small，versatilepPZP family ofAgrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant MolecularBiology.25，989-994.

Haughn，G.W.，et al.，1988.Transformation with a mutant Arabidopsisacetolactate synthase gene renders tobacco resistant to sulfonylureaherbicides.Molecular and General Genetics.211，266-271.

Heiser，W.C.，2000.Optimizing electroporation conditions for thetransformation of mammalian cells.Methods in Molecular Biology.130，117-34.

Hentges，P.，et al.，2005.Three novel antibiotic marker cassettes forgene disruption and marker switching in Schizosaccharomyces pombe.Yeast.22，1013-9.

Hewald，S.，et al.，2005.Genetic analysis of biosurfactant production inUstilago maydis.Applied and Environmental Microbiology.71，3033.

Hill，J.，et al.，1991.DMSO-enhanced whole cell yeasttransformation.Nucleic Acids Research.19，5791.

Ho，Eric CH，et al(2007).Gene discovery and transcript analyses in thecorn smut pathogen Ustilago maydis：expressed sequence tag and genome sequencecomparison.BMC genomics8：334.

Horns，F.，et al.2012.Patterns of repeat-induced point mutation intransposable elements of basidiomycete fungi.Genome biology and evolution，4，240-247.

Hu，C.，et al.，2009.Effects of biomass hydrolysis by-products onoleaginous yeast Rhodosporidium toruloides.Bioresour Technol.100，4843-7.

Ianiri，G.，et al.，2011.Development of resources for the analysis ofgene function in Pucciniomycotina red yeasts.Fungal Genetics and Biology.48，685-695.

Ingelbrecht，I.L.，et al.，1989.Different 3′end regions stronglyinfluence the level of gene expression in plant cells.Plant Cell，1：671-680.

Ito，H.，et al.，1983.Transformation of intact yeast cells treated withalkali cations.Journal of bacteriology.153，163-8.

Ji，L.，et al.，2010.A Simplified and efficient method fortransformation and gene tagging of Ustilago maydis using frozen cells.FungalGenet Biol.47，279-87.

J.，2004.A PCR-based system for highly efficient generation ofgene replacement mutants in Ustilago maydis.Mol Genet Genomics.271，103-10.

Khanna，H.K.，et al.，2007.Inhibition of Agrobacterium-induced celldeath by antiapoptotic gene expression leads to very high transformationefficiency of banana.Molecular Plant-Microbe Interactions.20，1048-1054.

Kirk，M.P.，et al.Dictionary of the Fungi.CABI，Wallingford，2008，pp.716.

Krugel，H.，et al.，1988.Analysis of the nourseothricin-resistance gene(nat)of Streptomyces noursei.Gene.62，209-217.

Kück，U.and Hoff，B.，2010.New tools for the genetic manipulation offilamentous fungi.Appl Microbiol Biotechnol.86，51-62.

Kuo，C.Y.，et al.，2004.Cloning of glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase gene and use of the gpd promoter for transformation inFlammulina velutipes.Appl Microbiol Biotechnol.65，593-9.

Lazo，G.R.，et al.，1991.A DNA transformation-competent Arabidopsisgenomic library in Agrobacterium.Biotechnology(N Y).9，963-7.

Liu，Y.G.，Chen，Y.，2007.High-efficiency thermal asymmetric interlacedPCR for amplification of unknown flanking sequences.BioTechniques.43，649-50，652，654 passim.Liu et al，2012，Characterization of glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase gene RtGPD1and development of genetic transformation method bydominant selection in oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides.AppliedMicrobiology and Biotechnology.10.1007/s00253-012-4223-9.

Liu，Y.G.，Whittier，R.F.，1995.Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 andYAC clones for chromosome walking.Genomics.25，674-81.

Maehara，T.，et al.，2010.Improvement of the Transformation Efficiencyof Flammulina velutipes Fv-1 Using the Glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase Gene Promoter.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry.74，2523-2525.

Maier，F.J.，Schafer，W.，1999.Mutagenesis via insertional-or restrictionenzyme-mediated-integration(REMI)as a tool to tag pathogenicity related genesin plant pathogenic fungi.Biol Chem.380，855-64.

Meng，X.，et al.，2009.Biodiesel production from oleaginousmicroorganisms.Renewable Energy.34，1-5.

Meyer，V.，2008.Genetic engineering of filamentous fungi--Progress，obstacles and future trends.Biotechnology Advances.26，177-185.

Meyer，V.，et al.，2003.Comparison of different transformation methodsfor Aspergillus giganteus.Curr Genet.43，371-7.

Mogen，B.D.，et al.，1990.Upstream sequences other than AAUAAA arerequired for efficient messenger RNA 3′-end formation in plants.Plant Cell，2：1261-1272.

Mogen，B.D.，et al.，1992.Several distinct types of sequence elementsare required for efficient mRNA 3′end formation in a pea rbcS gene.Molecularand Cellular Biology，12：5406-5414.

Nagaya，S.，et al.，2010.The HSP terminator of Arabidopsis thalianaIncreases Gene Expression in Plant Cells.Plant Cell Physiol，51：328-332.

Newman，T.C.，et al.，1993.DST sequences，highly conserved among plantSAUR genes，target reporter transcripts for rapid decay in tobacco.Plant Cell，5：701-14.

Ochman，H.，et al.，1988.Genetic applications of an inverse polymerasechain reaction.Genetics.120，621-3.

Ohme-Takagi，M.，et al.，1993.The effect of sequences with high AUcontent on mRNA stability in tobacco.Proc Natl Acad Sci U S A，90：11811-5.

Pfeifer，T.A.，et al.，1997.Baculovirus immediate-early promoter-mediated expression of the Zeocin(TM)resistance gene for use as a dominantselectable marker in Dipteran and Lepidopteran insect cell lines.Gene.188，183-190.

Punt，P.J.，et al.，1987.Transformation of Aspergillus based on thehygromycin B resistance marker from Escherichia coli.Gene.56，117-124.

Rosenzweig，K.E.，et al.，1997.Radiosensitization of human tumor cellsby the phosphatidylinositol3-kinase inhibitors wortmannin and LY294002correlates with inhibition of DNA-dependent protein kinase and prolonged G2-Mdelay.Clin Cancer Res.3，1149-56.

Rothnie，H.M.，et al.，1994.The contribution of AAUAAA and the upstreamelement UUUGUA to the efficiency of mRNA 3′-end formation in plants.EMBO(EurMol Biol Organ)J，13：2200-2210.

Schulz，B.，et al.，1990.The b alleles of U.maydis，whose combinationsprogram pathogenic development，code for polypeptides containing ahomeodomain-related motif.Cell.60，295-306.

Scorer，C.A.，et al.，1994.Rapid Selection Using G418 of High CopyNumber Transformants of Pichia pastoris for High level Foreign GeneExpression.Nature Biotechnology.12，181-184.Skalitzky，D.J.，et al.，2003.Tricyclic benzimidazoles as potent poly(ADP-ribose)polymerase-1inhibitors.J Med Chem.46，210-3.

Smith，G.and Jackson，S.，1999.The DNA-dependent protein kinase.Genes&development.13，916.

Smith，T.L.and Leong，S.A.，1990.Isolation and characterization of aUstilago maydis glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encodinggene.Gene.93，111-7.

Soltani，J.，et al.，Agrobacterium-mediated transformation of non-plantorganisms.In：T.Tzfira，V.Citovsky，Eds.)，Agrobacterium：from biology tobiotechnology.Springer press，New York，USA，2008，pp.649-675.

Spellig，T.，et al.，1996.Green fluorescent protein(GFP)as a new vitalmarker in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.Mol Gen Genet.252，503-9.

Steiner，S.and Phillippsen P，1994.Sequence and promoter analysis ofthe highly expressed TEF gene of the filamentous fungus Ashbya gossypii.MolGen Genet 242，263-271.

Sweigard，J.A.，et al.，1998.Magnaporthe grisea pathogenicity genesobtained through insertional mutagenesis.Mol Plant Microbe Interact.11，404-12.

Takeno，S.，et al.，2005.Transformation of oil-producing fungus，Mortierella alpina 1S-4，using Zeocin，and application to arachidonic acidproduction.Journal of bioscience and bioengineering.100，617-622.

Teichmann，B.，et al.，2010.Molecular characterization of the biocontrolactivity of Pseudozyma fiocculosa.Phytopathology.100.

Tentori，L.，et al.，2002.Potential clinical applications of poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitors.Pharmacol Res.45，73-85.

Tully，M.and Gilbert，H.J.，1985.Transformation of Rhodosporidiumtoruloides.Gene.36，235-40.

Turgeon，B.G.，et al.，2010.Protoplast transformation of filamentousfungi.Methods in molecular biology.638，3-19.

van Attikum，H.，et al.，2001.Non-homologous end-joining proteins arerequired for Agrobacterium T-DNA integration.Embo J.20，6550-8.

van Attikum，H.，et al.，2003.The Arabidopsis AtLIG4 gene is requiredfor the repair of DNA damage，but not for the integration of Agrobacterium T-DNA.Nucleic Acids Res.31，4247-55.Vega，J.M.，et al.，2008.Improvement ofAgrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize(Zea mays)using standardbinary vectors.Plant cell reports.27，297-305.

Veuger，S.J.，et al.，2003.Radiosensitization and DNA repair inhibitionby the combined use of novel inhibitors of DNA-dependent protein kinase andpoly(ADP-ribose)polymerase-1.Cancer Res.63，6008-15.

Willmore，E.，et al.，2004.A novel DNA-dependent protein kinaseinhibitor，NU7026，potentiates the cytotoxicity of topoisomerase II poisonsused in the treatment of leukemia.Blood.103，4659-65.

Wu，S.and Letchworth，G.J.，2004.High efficiency transformation byelectroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate anddithiothreitol.BioTechniques.36，152-155.Wu，S.，et al.，2010a.Phosphate-limitation mediated lipid production by Rhodosporidium toruloides.BioresourTechnol.101，6124-9.

Wu，S.，et al.，2010b.Microbial lipid production by Rhodosporidiumtoruloides under sulfate-limited conditions.Bioresour Technol.

Ye，X.and Gilbertson，L.，use of multiple transformation enhancersequences to improve plant transformation efficiency.EP Patent 2，038，420，2009.

Zhao，X.，et al.，2010a.Lipid production by Rhodosporidium toruloides Y4using different substrate feeding strategies.J Ind Microbiol Biotechnol.

Zhao，X.，et al.，2010b.Lipid production from Jerusalem artichoke byRhodosporidium toruloides Y4.J Ind Microbiol Biotechnol.37，581-5.

Zhu，Z.，et al，2012，A multi-omic map of the lipid-producing yeastRhodosporidium toruloides，Nature Communications，3，1112.

Claims (12)

1.DNA构建体，其包含与多肽编码序列可操作地连接的选自SEQ ID NO:6或8或其启动子部分的核苷酸序列，所述多肽编码序列与转录终止子可操作地连接，其中所述DNA构建体使得所述多肽能够在选自红冬孢属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodoturula)、假酶属(Pseudozyma)、黑粉菌属(Ustilago)或掷孢酵母属(Sporobolomyces)的真菌物种中有效表达，其中所述真菌物种的基因组含有至少50％C和G，并且其中所述启动子部分是ATG密码子的5’的序列并且是从ATG密码子的-1位开始的且长度为400碱基对至1100碱基对的序列。

2.权利要求1的DNA构建体，其中所述多肽编码序列含有至少50％CG。

3.权利要求2的DNA构建体，其中所述多肽编码序列含有多于60％CG。

4.权利要求2的DNA构建体，其中所述多肽编码序列含有多于70％CG。

5.权利要求1的DNA构建体，其中所述核苷酸序列含有至少一个GAGGAG序列基序，或其反向互补序列。

6.载体，其包含权利要求1-5任一项的DNA构建体，其中所述载体为T-DNA载体或穿梭载体。

7.真菌细胞，其包含至少一个权利要求1-5中任一项的DNA构建体，条件是，所述真菌细胞不是胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)ATCC 204091或禾木科红酵母(Rhodotorulagraminis)WP1。

8.权利要求7的真菌细胞，其中所述细胞含有不多于2个相同拷贝的SEQ ID NO:6或8所示核苷酸序列或其启动子部分。

9.权利要求7的真菌细胞，其中所述细胞含有不多于3个相同拷贝的SEQ ID NO:6或8所示的核苷酸序列或其启动子部分。

10.分离的启动子，其由SEQ ID NO:6或8或其启动子部分的核苷酸序列组成，其中所述启动子部分是ATG密码子的5’的序列并且是从ATG密码子的-1位开始的且长度为400碱基对至1100碱基对的序列，并且其中所述启动子使得所述多肽能够在选自红冬孢属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodoturula)、假酶属(Pseudozyma)、黑粉菌属(Ustilago)或掷孢酵母属(Sporobolomyces)的真菌物种中有效表达，其中所述真菌物种的基因组含有至少50％C和G。

11.载体，其包含权利要求10的启动子，其中所述载体为T-DNA载体或穿梭载体。

12.真菌细胞，其包含插入到所述真菌细胞的染色体中权利要求10的启动子，条件是，所述真菌细胞不是胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)ATCC 204091或禾木科红酵母(Rhodotorula graminis)WP1。

Images