JP2018157800A - 遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システム - Google Patents

Abstract

【課題】複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で実現する遺伝子検査方法を提供する。
【解決手段】検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、加熱ステップにより周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した（Ｓ１０１）後、第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出ステップ（Ｓ１０２）と、加熱ステップにより周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した（Ｓ２０１）後、第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出ステップ（Ｓ２０２）と、を含み、判定ステップでは、第１蛍光検出ステップ及び第２蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う（Ｓ３０４）。
【選択図】図１Ａ

Description

本開示は、遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムに関する。

遺伝子多型とは、遺伝子を構成しているＤＮＡの塩基配列の個体差であり、一般には集団の１％以上の頻度で出現するものと定義されている。遺伝子多型としては、ＤＮＡ塩基配列の一塩基のみが変異する一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の他、２から４塩基程度の一単位の繰り返し数の差であるマイクロサテライト多型（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、塩基の欠損、挿入がある。遺伝子多型には、病気の罹り易さや薬物代謝等に影響を及ぼすものがあることが知られており、病気罹患率の診断や投与薬物の効果、副作用の予測等のためにＳＮＰ部位の塩基の判定が行われている。

特許文献１は、波長の異なる蛍光色素で修飾した３つのプローブを用いて３種類の遺伝子タイプを判定する技術を開示している。また、非特許文献１は、ＰＣＲサイクル中のアニール温度を、回数ごとに段階的に下げることで、増幅性能を改善する、タッチダウンＰＣＲ法を開示している。

特許第５２７９４９２号公報

Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ’ＰＣＲ ｔｏ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｐｒｉｍｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．１９， Ｎｏ．１４（１９９１）４００８

しかし、特許文献１に開示される従来技術では、複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で行うためにＰＣＲの周期を短くすると、遺伝子間で増幅特性の差が徐々に顕著となり、誤判定を生じるという問題がある。また、非特許文献１に開示される従来技術では、単独のＳＮＰに対する遺伝子タイプの判定は可能であるが、複数のＳＮＰに対する遺伝子タイプの判定が難しいという問題がある。

そこで、本開示は、複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で実現する遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムを提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る遺伝子検査方法は、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、蛍光検出ステップにより得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、蛍光検出ステップは、加熱ステップにより周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定する第１蛍光変化測定ステップと、第１蛍光変化測定ステップ後に、加熱ステップにより周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定する第２蛍光変化測定ステップと、を含み、判定ステップでは、第１蛍光変化測定ステップ及び第２蛍光変化測定ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う。

また、上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る遺伝子検査チップは、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体を保持する検体保持部と、複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体の加熱の回数に対応づけられる識別子を保持する媒体４と、を備える。

さらに、上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る遺伝子検査システムは、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部と、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部と、蛍光検出部において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、蛍光検出部は、加熱部により周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部により複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出部と、第１蛍光検出部による測定の後に、加熱部により周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部により検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出部と、を含み、判定部は、第１蛍光検出部及び第２蛍光検出部において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う。

本開示によれば、複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で実現する遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムを提供できる。

第１実施形態における第１態様に係る遺伝子検査方法を示すフローチャート 第１実施形態における第１態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャート 第１実施形態における第２態様に係る遺伝子検査方法を示すフローチャート 第１実施形態における第２態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャート 第１実施形態における第３態様に係る遺伝子検査方法を示すフローチャート 第１実施形態における第３態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャート 第２実施形態に係る遺伝子検査方法を示すフローチャート 第２実施形態に係る遺伝子検査方法における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ１）の蛍光強度の変化点を検出するためのグラフ 第２実施形態に係る遺伝子検査方法における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ２）の蛍光強度の変化点を検出するためのグラフ 第２実施形態に係る遺伝子検査方法における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ３）の蛍光強度の変化点を検出するためのグラフ 実施の形態に係る遺伝子検査チップの一例を示す斜視図 実施の形態に係る遺伝子検査チップを用いた遺伝子検査方法の一例を示すフローチャート 実施の形態に係る遺伝子検査システムを示すブロック図

以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本開示を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本開示の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。

なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。

（実施の形態）
以下、本実施の形態に係る遺伝子検査方法について、図１Ａ〜図５Ｃを用いて説明する。

［Ａ．遺伝子検査方法］
本実施の形態に係る遺伝子検査方法は、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップ（いわゆる、ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）と、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、蛍光検出ステップにより得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含む。

加熱ステップ（ＰＣＲ）においては、予め、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに異なる蛍光色素を修飾して調製した検体を、目的のＳＮＰ部位を含む、複数種類の標的遺伝子を増幅させ、それらの遺伝子のＰＣＲ増幅産物を得る。その後の蛍光検出ステップにおいては、加熱ステップで得られたＰＣＲ増幅産物を含む検体を、一定の昇温速度で加熱し、蛍光色素で標識されたプローブが標的遺伝子のＰＣＲ増幅産物から離れる解離温度の違いにより遺伝子型を判定する。

ここで、本開示の遺伝子検査方法は、予め、複数種類の標的遺伝子の分析条件が決められた遺伝子検査方法（第１実施形態）と、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を測定しながら分析条件（具体的には、ＰＣＲのサイクル数、ＰＣＲの実施回数等）を決定する遺伝子検査方法（第２実施形態）とに分類することができる。

以下、第１実施形態及び第２実施形態に係る遺伝子検査方法について詳細に説明する。

［Ａ−１．第１実施形態］
本実施の形態に係る遺伝子検査方法は、上述のとおり、予め、複数種類の標的遺伝子の分析条件が決められた遺伝子検査方法である。

本実施の形態では、蛍光検出ステップは、加熱ステップにより周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより複数種類の標的遺伝子のうち第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出ステップと、第１蛍光検出ステップ後に、加熱ステップにより周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出ステップと、を含み、判定ステップでは、第１蛍光検出ステップ及び第２蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う。

また本実施の形態に係る遺伝子検査方法は、蛍光検出ステップは、さらに、第２蛍光検出ステップ後に、加熱ステップにより周期的変化を第３の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより複数種類の標的遺伝子のうち第３標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定する第３蛍光検出ステップを含み、判定ステップは、さらに、第３蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップを含んでもよい。

なお、本明細書では、第１、第２、又は第３標的遺伝子とは、個別の標的遺伝子の１種類ではなく、各蛍光検出ステップでの蛍光検出対象である１種類以上の標的遺伝子を意味する。

ここで、本実施の形態では、加熱ステップ（ＰＣＲ）における所定の温度範囲での周期的変化を繰り返して加熱をする回数（加熱サイクル数）、加熱ステップ（ＰＣＲ）の実施回数、蛍光検出ステップで蛍光変化検出の対象とする標的遺伝子、及び遺伝子型判定のタイミングにより、以下の３つの態様に分類することができる。

［Ａ−１−１．第１態様］
第１態様に係る遺伝子検査方法について、図１Ａ及び図１Ｂを用いて説明する。図１Ａは、第１実施形態に係る遺伝子検査方法を示すフローチャートであり、図１Ｂは、第１態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートである。

図１Ａに示すように、第１態様では、まず、遺伝子検査チップに検体を注入し、チップを装置にセットした後（Ｓ１００）、標的遺伝子を増幅させるために、１回目の加熱ステップ（ＰＣＲ１）を実施する（Ｓ１０１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第１標的遺伝子（ＳＮＰ１）の蛍光強度を測定する（Ｓ１０２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値を算出する（Ｓ１０３）。次に第１標的遺伝子（ＳＮＰ１）の遺伝子型を判定する（Ｓ１０４）。ステップＳ１０１からＳ１０４までのフローを第１態様における「第１蛍光検出ステップ」という。第１蛍光検出ステップの詳細を、図１Ｂに示す第１態様の具体例のタイミングチャートを参照して説明する。

第１蛍光検出ステップは、図１Ｂに示すタイミングチャートのＰＣＲ１及びＳＮＰ−１の各ラベルで示す区間と対応する。

ステップＳ１０１では、所定の温度範囲での周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する。例えば、図１ＢのＰＣＲ１の区間に示すように、Ｔ１からＴ３までの温度範囲で２０秒周期の周期的変化を５０回繰り返して検体を加熱する。Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第１態様における所定の温度範囲の例であり、５０回は、第１態様における第１の回数の例である。

ステップＳ１０２では、検体を一定の昇温速度で定速加熱する。図１ＢのＳＮＰ−１の区間における、Ｔ１より低い温度からＴ３に近い温度まで２００秒間の加熱がこの定速加熱の例である。この区間では、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち第１標的遺伝子のＰＣＲ増幅産物（以下、単に、「第１標的遺伝子」と称する場合がある。）に結合した蛍光色素（蛍光色素で標識されたプローブ）が、温度の上昇に伴い解離し、再び蛍光を発する。この蛍光変化を連続的に測定すると、蛍光色素で標識されたプローブは、完全には相補的でない配列（例えば、１塩基のみ異なる配列）を有する遺伝子型（１）では、完全に相補的な配列を有する遺伝子型（２）に比べて、低い温度で解離し発光する。一方、完全に相補的な配列を有する遺伝子型（２）では、完全には相補的でない配列有する遺伝子型（１）の場合に比べて高い温度で、蛍光色素で標識されたプローブが解離し発光する。また、完全に相補的な配列を有する遺伝子型（２）と完全には相補的でない配列を有する遺伝子型（１）の両方の配列を有する遺伝子型（ヘテロ型）では、前記の低い温度と高い温度の両方の温度で解離し発光する。このような解離温度Ｔｍ値を算出し（Ｓ１０３）、その解離温度の違いから遺伝子型を判定する（Ｓ１０４）。

第１蛍光検出ステップに続いて、さらに標的遺伝子を増幅させるために、２回目の加熱ステップ（ＰＣＲ２）を実施する（Ｓ２０１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第２標的遺伝子（ＳＮＰ２）の蛍光強度を測定する（Ｓ２０２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値を算出する（Ｓ２０３）。次に、第２標的遺伝子（ＳＮＰ２）の遺伝子型を判定する（Ｓ２０４）。ステップＳ２０１からＳ２０４までのフローを第１態様における「第２蛍光検出ステップ」という。第２蛍光検出ステップは、上述した第１蛍光検出ステップと基本的に同様であるため、詳細な説明を省略する。

第２蛍光検出ステップが第１蛍光検出ステップと異なる点は、ステップＳ２０１で検体の加熱のために所定の温度範囲での周期的変化を繰り返す回数が第２の回数（図１ＢのラベルＰＣＲ２の区間における１０回）であることと、ステップＳ２０４で判定する標的遺伝子が異なることである。このような第２蛍光検出ステップを実施するのは、ＳＮＰ２の増幅はＳＮＰ１よりも遅く、ＰＣＲ１のみでは確度よく判定を実施できる程度に増幅できないためである。したがって、上記のようにＰＣＲ２を実行して標的遺伝子をさらに増幅させてからＳＮＰ２の判定を行うことで、確度を確保している。

第２蛍光検出ステップに続いて、さらに標的遺伝子を増幅させるために、３回目の加熱ステップ（ＰＣＲ３）を実施する（Ｓ３０１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第３標的遺伝子（ＳＮＰ３）の蛍光強度を測定する（Ｓ３０２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値を算出する（Ｓ３０３）。次に、第３標的遺伝子（ＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ３０４）。ステップＳ３０１からＳ３０４までのフローを第１態様における「第３蛍光検出ステップ」という。第３蛍光検出ステップも、上述した第１蛍光検出ステップと基本的に同様であるため、詳細な説明を省略する。

第３蛍光検出ステップが第１蛍光検出ステップと異なる点は、ステップＳ３０１で検体の加熱のために所定の温度範囲での周期的変化を繰り返す回数が第３の回数（図１ＢのラベルＰＣＲ３の区間における１０回）であることと、ステップＳ３０４で判定される標的遺伝子が異なることである。このような第３蛍光検出ステップを実施するのは、ＳＮＰ３の増幅はＳＮＰ１及びＳＮＰ２よりも遅く、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２のみでは確度よく判定を実施できる程度に増幅できないためである。したがって、上記のようにＰＣＲ３を実行して標的遺伝子をさらに増幅させてからＳＮＰ３の判定を行うことで、確度を確保している。

このように、各標的遺伝子の判定は、それぞれの標的遺伝子の増幅のための加熱が各標的遺伝子に適した回数繰り返された後で実施されるため、タイプ（遺伝子型）判定の確度が向上する。

なお、第２の回数及び第３の回数は、上記の例では第１の回数と異なるが、各判定ステップでの判定対象である標的遺伝子を確度よく判定できる程度に増幅させることができる回数であればよく、第１の回数と同じであってもよい。

［Ａ−１−２．第２態様］
第２態様に係る遺伝子検査方法について、図２Ａ及び図２Ｂを用いて説明する。図２Ａは、第２態様に係る遺伝子検査方法を示すフローチャートであり、図２Ｂは、第２態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートである。なお、図１Ａのフローチャートにおける処理ステップと同じものには同一の符号を付している。以降でも同様とする。

図２Ａに示すように、第２態様では、まず、遺伝子検査チップに検体を注入し、チップを装置にセットした後（Ｓ１００）、標的遺伝子を増幅させるために、１回目の加熱ステップ（ＰＣＲ１）を実施する（Ｓ１１１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第１標的遺伝子（ＳＮＰ１及びＳＮＰ２）の蛍光強度を測定する（Ｓ１１２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１及びＴｍ２）を算出する（Ｓ１１３）。次に、第１標的遺伝子（ＳＮＰ１及びＳＮＰ２）の遺伝子型を判定する（Ｓ１１４）。ステップＳ１１１からＳ１１４までのフローを第２実施形態における「第１蛍光検出ステップ」という。第１蛍光検出ステップの詳細を、図２Ｂに示す第２態様の具体例のタイミングチャートを参照して説明する。

第１蛍光検出ステップは、図２Ｂに示すタイミングチャートのＰＣＲ１及びＳＮＰ−１、ＳＮＰ−２のラベルで示す区間と対応する。

ステップＳ１１１では、所定の温度範囲での周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する。例えば、図２ＢのＰＣＲ１の区間に示すように、Ｔ１からＴ３までの温度範囲で２０秒周期の周期的変化を６０回繰り返して検体を加熱する。Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第２態様における所定の温度範囲の例であり、６０回は、第２態様における第１の回数（ＰＣＲ１のサイクル数）の例である。

ステップＳ１１２では、検体を一定の昇温速度で定速加熱する。図２ＢのＳＮＰ−１、ＳＮＰ−２の区間における、Ｔ１より低い温度からＴ３に近い温度まで２００秒間の加熱がこの定速加熱の例である。この区間では、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち第１標的遺伝子（ここでは、ＳＮＰ−１及びＳＮＰ−２）のＰＣＲ増幅産物（以下、単に、「第２標的遺伝子」と称する場合がある。）に結合した蛍光色素（蛍光色素で標識されたプローブ）が、温度の上昇に伴い解離し、再び蛍光を発する。第１態様と同様に、この蛍光変化を連続的に測定し、Ｔｍ値を算出し（Ｓ１１３）、遺伝子型を判定する（Ｓ１１４）。

第１蛍光検出ステップに続いて、標的遺伝子をさらに増幅させるために、２回目の加熱ステップ（ＰＣＲ２）を実施する（Ｓ２１１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第２標的遺伝子（ＳＮＰ３）の蛍光強度を測定する（Ｓ２１２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ３）を算出する（Ｓ２１３）。次に、第２標的遺伝子（ＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ２１４）。ステップＳ２１１からＳ２１４までのフローを第２態様における「第２蛍光検出ステップ」という。

第１態様と異なり、ＳＮＰ１及びＳＮＰ２とはＰＣＲによって同程度の速度で増幅させることができるため、第２態様では、第１蛍光検出ステップでまとめて遺伝子型の判定の対象としている。しかし、ＳＮＰ３の増幅はＳＮＰ１及びＳＮＰ２よりも遅く、ＰＣＲ１のみでは確度よく判定を実施できる程度に増幅できないため、第１態様と同様に、追加でＰＣＲ（ＰＣＲ２）を実行して標的遺伝子をさらに増幅させてから遺伝子型の判定を行うことで、確度を確保している。つまり、複数種類の標的遺伝子に適合した加熱の回数で遺伝子を増幅させることができるため、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定の確度を向上させることができる。

また、図１Ｂ及び図２Ｂを比較すると、図２Ｂに示す第２態様におけるＰＣＲ１（Ｓ１１１）での所定の温度範囲での周期的変化を繰り返す回数（６０回）は、図１Ｂに示す第１態様におけるＰＣＲ１（Ｓ１０１）の加熱の回数（５０回）よりも多い。図２Ｂでは、図１ＢのＰＣＲ１及びＰＣＲ２の加熱の回数（５０回及び１０回）を足し合わせた回数（６０回）でＰＣＲ１を実施している。しかしながら、図１Ｂに示す定速加熱１及び定速加熱２を、図２Ｂでは定速加熱１の１回に集約し、蛍光検出を実施している。これにより、第２態様における遺伝子検査方法では、第１態様における遺伝子検査方法よりも短時間で複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定を実現することができる。

［Ａ−１−３．第３態様］
第３態様に係る遺伝子検査方法について、図３Ａ及び図３Ｂを用いて説明する。図３Ａは、第３態様に係る遺伝子検査方法を示すフローチャートであり、図３Ｂは、第３態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートである。

図３Ａに示すように、第３態様では、まず、遺伝子検査チップに検体を注入し、チップを装置にセットした後（Ｓ１００）、第１，２，３蛍光検出回路を起動（ＯＮ）させ（Ｓ１３０）、標的遺伝子を増幅させるために１回目の加熱ステップ（ＰＣＲ１）を実施し（Ｓ１３１）、蛍光検出ステップにおいて一定の昇温速度で加熱をしながら第１標的遺伝子（ＳＮＰ１ａ、ＳＮＰ２ａ、ＳＮＰ３ａ）の蛍光強度を測定する（Ｓ１３２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１ａ、Ｔｍ２ａ、Ｔｍ３ａ）を算出する（Ｓ１３３）。ステップＳ１３１からＳ１３３までのフローを第３態様における「第１蛍光検出ステップ」という。第１蛍光検出ステップの詳細を、図３Ｂに示す第３態様の具体例のタイミングチャートを参照して説明する。

第１蛍光検出ステップは、図３Ｂに示すタイミングチャートのＰＣＲ１及びＳＮＰ−１ａ、ＳＮＰ−２ａ、ＳＮＰ−３ａのラベルで示す区間と対応する。

ステップＳ１３１では、所定の温度範囲での周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する。例えば、図１ＢのＰＣＲ１の区間に示すように、Ｔ１からＴ３までの温度範囲で２０秒周期の周期的変化を５０回繰り返して検体を加熱する。Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第３態様における所定の温度範囲の例であり、５０回は、第３態様における第１の回数の例である。

ステップＳ１３２では、検体を一定の昇温速度で定速加熱する。図３ＢのＳＮＰ−１ａ、ＳＮＰ−２ａ、ＳＮＰ−３ａの区間における、Ｔ１より低い温度からＴ３に近い温度まで２００秒間の加熱がこの定速加熱の例である。この区間では、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち第１標的遺伝子のＰＣＲ増幅産物（以下、単に、「第１標的遺伝子」と称する場合がある。）に結合した蛍光色素（蛍光色素で標識されたプローブ）が、温度の上昇に伴い解離し、再び蛍光を発する。第１態様と同様に、この蛍光変化を連続的に測定し、Ｔｍ値を算出し（Ｓ１３３）、遺伝子型を判定する（Ｓ１３４）。

第１蛍光検出ステップに続いて、さらに標的遺伝子を増幅させるために、２回目の加熱ステップ（ＰＣＲ２）を実施する（Ｓ２３１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第２標的遺伝子（ＳＮＰ１ｂ、ＳＮＰ２ｂ、ＳＮＰ３ｂ）の蛍光強度を測定する（Ｓ２３２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１ｂ、Ｔｍ２ｂ、Ｔｍ３ｂ）を算出する（Ｓ２３３）。ステップＳ２３１からＳ２３３までのフローを第２態様における「第２蛍光検出ステップ」という。

なお、本態様においては、第１標的遺伝子（ＳＮＰ１ａ、ＳＮＰ２ａ、ＳＮＰ３ａ）および第２標的遺伝子（ＳＮＰ１ｂ、ＳＮＰ２ｂ、ＳＮＰ３ｂ）は、ＳＮＰ１ａとＳＮＰ１ｂとが同じ標的遺伝子ＳＮＰ１であり、ＳＮＰ２ａとＳＮＰ２ｂとが同じ標的遺伝子ＳＮＰ２であり、ＳＮＰ３ａとＳＮＰ３ｂとが同じ標的遺伝子ＳＮＰ３である。後述する第３標的遺伝子についても同様とする。

第２蛍光検出ステップに続いて、さらに標的遺伝子（ＳＮＰ１ｃ、ＳＮＰ２ｃ、ＳＮＰ３ｃ）を増幅させるために、３回目の加熱ステップ（ＰＣＲ３）を実施する（Ｓ３３１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第３標的遺伝子（ＳＮＰ１ｃ、ＳＮＰ２ｃ、ＳＮＰ３ｃ）の蛍光強度を測定する（Ｓ３３２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１ｃ、Ｔｍ２ｃ、Ｔｍ３ｃ）を算出する（Ｓ３３３）。ステップＳ３３１からＳ３３３でのフローを第３態様における「第３蛍光検出ステップ」という。第３蛍光検出ステップも、上述した第１蛍光検出ステップと基本的に同様であるため、詳細な説明を省略する。

上述のように、第１蛍光検出ステップから第３蛍光検出ステップまで終了した後、それぞれのステップにおいて検出した、３種類の標的遺伝子（ここでは、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３）それぞれに対して検出した３つの蛍光波形（蛍光強度の微分値の波形）を比較し、最も顕著に各標的遺伝子の特徴を表す蛍光波形に基づいてそれぞれの標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ１８０）。その後、第１，２，３蛍光検出回路の電源を切る（ＯＦＦ）（Ｓ１９０）。

このように、第３態様に係る遺伝子検査方法では、第１蛍光検出ステップ及び第２蛍光検出ステップでは、それぞれで複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を検出している。また、第３蛍光検出ステップでも複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を検出している。

このようにして第１〜第３蛍光検出ステップのそれぞれで得られた、複数種類の標的遺伝子の蛍光波形（蛍光強度の微分値の波形）同士を比較し、最も顕著に各標的遺伝子の特徴を表す蛍光波形に基づいてそれぞれの標的遺伝子の遺伝子型を判定することができる。そのため、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定の確度を向上することができる。

なお、上記の例では第１〜第３蛍光検出ステップまで実施されているが、上記の効果を得るためには、複数回の蛍光検出ステップで検出された共通の標的遺伝子の蛍光強度を比較して、最も顕著に各標的遺伝子の特徴を表す蛍光波形が選択できればよい。例えば図３Ａのフローチャートでいえば、第１蛍光検出ステップ及び第２蛍光検出ステップを含むステップＳ２３３までの実施後、第３蛍光検出ステップを省略し、ステップＳ１８０に進んでもよい。

第３態様では、図１Ｂ及び図３Ｂに示すように、全てのステップの条件（加熱ステップにおける加熱の回数、時間等）が第１態様と共通している。しかしながら、第３態様においては、第１蛍光検出ステップから第３蛍光検出ステップまでの全ての蛍光検出ステップにおいて生体試料に含まれる全ての標的遺伝子の蛍光変化を検出する点において第１態様と異なる。これにより、第３態様における遺伝子検査方法では、第１態様における遺伝子検査方法よりと同じ時間で、最も顕著に各標的遺伝子の特徴を表す蛍光波形に基づいて複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定を実現することができる。そのため、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定の確度を向上することができる。

Ａ−１−４．各標的遺伝子のＰＣＲ回数依存性に基づくＰＣＲ回数の決定
実施の形態に係る遺伝子検査方法における、各標的遺伝子のＰＣＲ増幅に必要なＰＣＲ回数（サイクル数）は、例えば以下のような検討を行い、決定される。この例では、具体的な標的遺伝子として、肥満に関する３遺伝子（ＡＤＢＲ２遺伝子、ＡＤＢＲ３遺伝子、及びＵＣＰ１遺伝子）を対象とした。ここでは、ＳＮＰ１をＡＤＢＲ２遺伝子、ＳＮＰ２をＡＤＢＲ３遺伝子、ＳＮＰ３をＵＣＰ１遺伝子とした。

なお、表１では、誤判定であった場合が×、判定可能であった場合が〇、確度よく判定可能であった場合が◎で示されている。

表１からわかるように、ＡＤＢＲ２（ＳＮＰ１）については５０と６０回で、ＡＤＢＲ３（ＳＮＰ２）については６０と７０回で、ＵＣＰ１（ＳＮＰ３）については７０と８０と９０回で、確度よく判定可能であった。

したがって、第１実施形態における遺伝子検査方法では、例えば、上記肥満遺伝子を標的遺伝子とする場合、ＰＣＲ１のサイクル数を５０回、ＰＣＲ２のサイクル数を１０回、ＰＣＲ３のサイクル数を１０回に設定する。これにより、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型（タイプ）を確度よく判定することが可能となる。

［Ａ−２．第２実施形態］
本実施の形態に係る遺伝子検査方法は、上述のとおり、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を測定しながら分析条件（具体的には、ＰＣＲのサイクル数、ＰＣＲの実施回数等）を決定する遺伝子検査方法である。

以下、第２実施形態に係る遺伝子検査方法について、図４〜図５Ｃを用いて説明する。図４は、第２実施形態に係る遺伝子検査方法を示すフローチャートであり、図５Ａ〜図５Ｃは、それぞれ、第２実施形態における複数種類の標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２及びＳＮＰ３）の蛍光強度の変化点の検出に用いるグラフである。

図４に示すように、まず、遺伝子検査チップに検体を注入し、チップを装置にセットした後（Ｓ１００）、第１，２，３蛍光検出回路を起動（ＯＮ）させる（Ｓ１３０）。次に、所定のサイクル数（例えば、５０回）に設定されたＰＣＲ（以下、「予備ＰＣＲ」と称する。）を実施しながら、複数種類の標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３）の蛍光強度の変化を測定する（Ｓ１４１）。次に、それぞれの標的遺伝子の蛍光強度の変化点（変曲点）を検出する（Ｓ１４２）。次に、それぞれの標的遺伝子の蛍光強度の変化点におけるＰＣＲのサイクル数に所定の係数を乗じ、Ｐｎ−１，Ｐｎ−２，Ｐｎ−３を算出する（Ｓ１４３）。ここで、Ｐｎ−１はＰＣＲ１完了までに実施する加熱のサイクル数であり、Ｐｎ−２は、ＰＣＲ２完了までに実施する加熱のサイクル数であり、Ｐｎ−３はＰＣＲ３完了までに実施する加熱のサイクル数である。算出されたＰｎ−１のサイクル数から実施したＰｎ−０のサイクル数を減算することで残サイクル数を算出する（Ｓ１４４）。

このステップＳ１４１からＳ１４４までのフローでは、例えば、図５Ａ〜図５Ｃに示すように、予備ＰＣＲ（５０サイクル）を実施する間（Ｓ１４１）、継続して複数種類の標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の蛍光強度の変化を測定する（Ｓ１４２）。例えば、実験の結果、複数種類の標的遺伝子のうち、ＳＮＰ１は２５サイクル目、ＳＮＰ２は２５サイクル目、ＳＮＰ３は３５サイクル目に変化点（変曲点）が見られた（Ｓ１４２）。

次に、これらのサイクル数に、予め算出した各標的遺伝子に対応する係数を乗じ、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３のそれぞれを完了するまでに実施する加熱のサイクル数を算出する（Ｓ１４４）。

その後、予備ＰＣＲの所定のサイクル数（例えば、５０回）から、上述のとおり算出したＰｎ−１のサイクル数を引き、ＰＣＲ１で実施する残サイクル数を算出する（Ｓ１４４）。この残サイクル数が０である場合は、予備ＰＣＲ（Ｓ１４１）をＰＣＲ１（Ｓ１５１）とする。一方、この残サイクル数が０より大きい場合は、ＰＣＲ１でその残サイクル数を実施する（Ｓ１５１）。その後、Ｔｍ値（Ｔｍ１）を算出し（Ｓ１５２）、第１標的遺伝子（ＳＮＰ１）の遺伝子型を判定する（Ｓ１５３）。

さらに、ステップＳ１４３で算出されたＰｎ−２のサイクル数からＰｎ−０を減算することによりＰＣＲ２で実施する残サイクル数を算出する（Ｓ１４４）。これにより、ＰＣＲ２で第２標的遺伝子（ＳＮＰ２）に対応した残サイクル数を実施し（Ｓ２５１）、Ｔｍ値（Ｔｍ２）を算出し（Ｓ２５２）、第２標的遺伝子（ＳＮＰ２）の遺伝子型を判定する（Ｓ２５３）。

次に、ステップＳ１４３で算出されたＰｎ−３のサイクル数からＰｎ−２を減算することによりＰＣＲ３で実施する残サイクル数を算出する（Ｓ１４４）。これにより、ＰＣＲ３で第３標的遺伝子（ＳＮＰ３）に対応した残サイクル数を実施し（Ｓ３５１）、Ｔｍ値（Ｔｍ３）を算出し（Ｓ３５２）、第３標的遺伝子（ＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ３５３）。

ステップＳ１３１からＳ３５３までのフローが完了（全ての複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定が終了）した後、蛍光検出器１〜３を停止する（Ｓ１９０）。

すなわち、上述した第２実施形態に係る遺伝子検査方法は、第１蛍光検出ステップは、周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する間に、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出し、蛍光強度の変化に基づいて第１の回数及び第２以降の回数の少なくとも一つを決定する加熱サイクル決定ステップを有してもよい。これにより、既存の分析データ（分析条件等）を有しない新たな種類の標的遺伝子に対しても、遺伝子型の判定が可能となる。

［Ｂ．遺伝子検査チップ及び遺伝子検査チップを用いた遺伝子検査方法］
以下、本実施の形態に係る遺伝子検査チップについて図６及び図７を用いて説明する。図６は、本実施の形態に係る遺伝子検査チップの一例を示す斜視図である。また、図７は、本実施の形態に係る遺伝子検査チップを用いた遺伝子検査方法の一例である。

図６に示すように、本実施の形態に係る遺伝子検査チップ１０は、チップ部１とチップフォルダー２とを備える。チップ部１は、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体を保持する検体保持部３と、チップフォルダー２には複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体の加熱の回数に対応付けられる識別子を保持する媒体４と、を備える。本実施の形態に係る遺伝子検査チップ１０が上述した識別子を有することにより、遺伝子検査の条件設定等の操作が不要となり、検査を自動化することができる。そのため、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型（タイプ）の判定を短時間で実現することができる。また、識別子に対応付けられる他の情報（例えば、サンプルＩＤ、ＰＣＲサイクル数の決定に必要な係数等）により、複数種類の標的遺伝子に適した条件設定等の煩雑な操作も不要となり、遺伝子検査を自動化できる。さらに、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型を判定する確度を向上させることができる。

ここで、識別子を保持する媒体４は、例えば、二次元バーコード、ＩＣチップ等を挙げることができる。

なお、遺伝子検査チップ１０には、検体注入口５及び検体注入口５と検体保持部３とを連通する流路（図示せず）を備えてもよい。

遺伝子検査チップ１０を用いた遺伝子検査の一例は、図７に示すように、まず、遺伝子検査チップに検体を注入し、チップを装置にセットした後（Ｓ１００）、識別子に対応付けられた第１の回数（ＰＣＲ１の加熱サイクル数）及び第２の回数（ＰＣＲ２の加熱サイクル数）等の情報を読み取る（Ｓ１７０）。次に、１回目の加熱ステップ（ＰＣＲ１）において第１標的遺伝子（ＳＮＰ１）を増幅させる（Ｓ１７１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第１標的遺伝子（ＳＮＰ１）の蛍光強度を測定する（Ｓ１７２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１）を算出する（Ｓ１７３）。次に、第１標的遺伝子（ＳＮＰ１）の遺伝子型を判定する（Ｓ１７４）。

第１蛍光検出ステップに続く２回目の加熱ステップ（ＰＣＲ２）においては、まず、識別子に対応付けられた情報に基づき、第２標的遺伝子（ＳＮＰ２）を増幅させる（Ｓ２７１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第２標的遺伝子（ＳＮＰ２）の蛍光強度を測定する（Ｓ２７２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ２）を算出する（Ｓ２７３）。次に、第２標的遺伝子（ＳＮＰ２）の遺伝子型を判定する（Ｓ２７４）。

第２蛍光検出ステップに続く３回目の加熱ステップ（ＰＣＲ３）においては、第１及び第２蛍光検出ステップと同様に、識別子に対応付けられた情報に基づき、第３標的遺伝子（ＳＮＰ３）を増幅させる（Ｓ３７１）。次に、蛍光検出ステップにおいて第３標的遺伝子（ＳＮＰ３）の蛍光強度を測定する（Ｓ３７２）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ３）を算出する（Ｓ３７３）。次に、第３標的遺伝子（ＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ３７４）。

すなわち、本実施の形態に係る遺伝子検査方法は、検体は、第１の回数及び第２の回数を示す識別子を保持する媒体４を備えるチップ１０に保持され、第１蛍光検出ステップでは、識別子に対応する周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱し、第２蛍光検出ステップでは、識別子に対応する周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱してもよい。このように、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子に適した分析条件等の識別子を読み込み、遺伝子検査を実施することにより、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定を短時間で実現することができる。

［Ｃ．遺伝子検査システム］
以下、本実施の形態に係る遺伝子検査システムについて図７及び図８を用いて説明する。図８は、本実施の形態に係る遺伝子検査システムを示すブロック図である。

本実施の形態に係る遺伝子検査システムは、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部（ペルチェ素子２５）と、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部３０（第１蛍光検出部３１、第２蛍光検出部３２、及び第３蛍光検出部３３）と、蛍光検出部において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、蛍光検出部は、加熱部（ペルチェ素子２５）により周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部３０により複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出部３１と、第１蛍光変化測定後に、加熱部により周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部３０により検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出部３２と、を含み、判定部は、第１蛍光検出部３１及び第２蛍光検出部３２において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う。これにより、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定を短時間で実現することができる。さらに、遺伝子検査を自動化でき、迅速に、かつ、正確に、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型を判定できる。

図８に示すように、本実施の形態に係る遺伝子検査システムの一形態は、例えば、上述の識別子を保持する媒体４を備える遺伝子検査チップ１０から識別子リーダー２１で識別子を読み取り（Ｓ１７０）、パソコン２２ａ内部のコントローラ２２に識別子の情報が伝達される。コントローラ２２からの伝達により、温度設定回路２３を通じてペルチェ駆動回路２４が起動し、ペルチェ素子２５が検体保持部３を加熱又は冷却する。これにより、図７に示すステップＳ１７１（ＰＣＲ１）、Ｓ１７２の定速加熱１、Ｓ２７１（ＰＣＲ２）、Ｓ２７２の定速加熱２、Ｓ３７１（ＰＣＲ３）及びＳ３７２の定速加熱３を実行する。

蛍光検出は、第１〜第３蛍光検出ステップごと（ＰＣＲ１〜ＰＣＲ３の実施ごと）に実施される。各ステップで駆動する蛍光検出部３０は、そのステップで判定する標的遺伝子の種類により異なるが、例えば、１種類の標的遺伝子の遺伝子型を判定する場合について説明する。

第１蛍光検出部３１は、例えば、コントローラ２２からの指示により、蛍光検出器切替回路２６を通じて第１蛍光検出回路２７を起動させる。そして、第１蛍光検出部３１のＬＥＤから射出された所定の波長を有する光がフィルタを通過することにより光の波長帯域が絞られ、ダイクロイックミラーで反射されて検体保持部３に照射される（励起光）。検体保持部３からの蛍光を、ダイクロイックミラーを通じてフォトダイオード（ＰＤ）で受光する。ＰＤで蛍光を受光すると、ＰＤから受光信号がＰＣＲ蛍光検出回路３４を通じてコントローラ２２に送信される。第１蛍光検出ステップが終了した後、コントローラ２２からの指示によりＴｍ算出回路３５でＴｍ値が算出され、Ｔｍ値がコントローラ２２に送信される。そして、この信号を基にコントローラ２２の判定部が、第１標的遺伝子の遺伝子型の判定を行う。

なお、第２蛍光検出部３２、及び第３蛍光検出部３３についても上述した内容と同様であるため、詳細な説明を省略する。

（まとめ）
以上のように、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法は、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、蛍光検出ステップにより得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、蛍光検出ステップは、加熱ステップにより周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより複数種類の標的遺伝子のうち第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出ステップと、第１蛍光検出ステップ後に、加熱ステップにより周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出ステップと、を含み、判定ステップでは、第１蛍光検出ステップ及び第２蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う。このように、加熱ステップにより周期的変化を第１の回数及び第２の回数繰り返して検体を加熱することにより、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のそれぞれに適した条件で遺伝子を増幅させることができる。これにより、複数の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定の確度を向上することができる。

また、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法は、第１蛍光検出ステップ及び第２蛍光検出ステップでは、それぞれ複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を検出してもよい。これにより、複数種類の標的遺伝子の蛍光波形（蛍光強度の微分値の波形）を比較し、最も顕著に各標的遺伝子の特徴を表す蛍光波形に基づいてそれぞれの標的遺伝子の遺伝子型を判定することができる。そのため、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定の確度を向上することができる。

また、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法は、蛍光検出ステップは、さらに、第２蛍光検出ステップ後に、加熱ステップにより周期的変化を第３の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出ステップにより複数種類の標的遺伝子のうち第３標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定する第３蛍光検出ステップを含み、判定ステップは、さらに、第３蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップを含んでもよい。これにより、複数種類の標的遺伝子間の遺伝子増幅のばらつきを抑えることができ、複数種類の標的遺伝子のタイプ判定の精度を向上することができる。

また、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法は、第１蛍光検出ステップは、周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する間に、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出し、蛍光強度の変化に基づいて第１の回数及び第２以降の回数の少なくとも一つを決定する加熱サイクル決定ステップを有してもよい。これにより、既存の分析データ（分析条件等）を有しない新たな種類の標的遺伝子に対しても、遺伝子型の判定が可能となる。

上記実施の形態に係る遺伝子検査方法は、検体は、第１の回数及び第２の回数を示す識別子を保持する媒体４を備えるチップ１０に保持され、第１蛍光検出ステップでは、識別子に対応する周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱し、第２蛍光検出ステップでは、識別子に対応する周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱してもよい。このように、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子に適した分析条件等の識別子を読み込み、遺伝子検査を実施することにより、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定を短時間で実現することができる。

上記実施の形態に係る遺伝子検査チップ１０は、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体を保持する検体保持部３と、複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体の加熱の回数に対応付けられる識別子を保持する媒体４と、を備える。上記実施の形態に係る遺伝子検査チップ１０が上述した識別子を有することにより、遺伝子検査の条件設定等の操作が不要となり、検査を自動化することができる。そのため、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型（タイプ）の判定を短時間で実現することができる。また、識別子に対応付けられる他の情報（例えば、サンプルＩＤ、ＰＣＲサイクル数の決定に必要な係数等）により、複数種類の標的遺伝子に適した条件設定等の煩雑な操作も不要となり、遺伝子検査を自動化できる。さらに、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型を判定する確度を向上させることができる。

上記実施の形態に係る遺伝子検査システムは、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部と、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部３０と、蛍光検出部３０において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、蛍光検出部３０は、加熱部により周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部３０により複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出部３１と、第１蛍光変化測定後に、加熱部により周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部３０により検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出部３２と、を含み、判定部は、第１蛍光検出部３１及び第２蛍光検出部３２において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う。これにより、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定を短時間で実現することができる。さらに、遺伝子検査を自動化でき、迅速に、かつ、正確に、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定ができる。

以上、本開示に係る遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムについて、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲内に含まれる。

本開示に係る遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムは、例えば、得られる遺伝子情報に基づいて個人の体質に合った食品、化粧品、サプリメント、トレーニングの提案、又は、病気罹患率の診断、投与薬剤の種類と効果及び副作用の予測等に応用できる。

１ チップ部
２ チップフォルダー
３ 検体保持部
４ 媒体
５ 検体注入口
１０ 遺伝子検査チップ
２１ 識別子リーダー
２５ ペルチェ素子
３１ 第１蛍光検出部
３２ 第２蛍光検出部
３３ 第３蛍光検出部

Claims (7)

1. 複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、前記複数種類の標的遺伝子のそれぞれに前記複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、
   前記検体を一定の昇温速度で加熱しながら前記検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、前記検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、
   前記蛍光検出ステップにより得られる蛍光強度の変化に基づき前記複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、
   前記蛍光検出ステップは、
   前記加熱ステップにより前記周期的変化を第１の回数繰り返して前記検体を加熱した後、前記蛍光検出ステップにより前記複数種類の標的遺伝子のうち第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出ステップと、
   前記第１蛍光検出ステップ後に、前記加熱ステップにより前記周期的変化を第２の回数繰り返して前記検体を加熱した後、前記蛍光検出ステップにより前記検体に含まれる前記複数種類の標的遺伝子のうち第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出ステップと、を含み、
   前記判定ステップでは、
   前記第１蛍光検出ステップ及び前記第２蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき前記複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う、
   遺伝子検査方法。
2. 前記第１蛍光検出ステップ及び前記第２蛍光検出ステップでは、それぞれ前記複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を検出する、
   請求項１に記載の遺伝子検査方法。
3. 前記蛍光検出ステップは、さらに、前記第２蛍光検出ステップ後に、前記加熱ステップにより前記周期的変化を第３の回数繰り返して前記検体を加熱した後、前記蛍光検出ステップにより前記複数種類の標的遺伝子のうち第３標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定する第３蛍光検出ステップを含み、
   前記判定ステップは、さらに、前記第３蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき前記複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップを含む、
   請求項１又は２に記載の遺伝子検査方法。
4. 前記第１蛍光検出ステップは、前記周期的変化を前記第１の回数繰り返して前記検体を加熱する間に、前記複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出し、前記蛍光強度の変化に基づいて前記第１の回数及び前記第２以降の回数の少なくとも一つを決定する加熱サイクル決定ステップを有する、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
5. 前記検体は、前記第１の回数及び前記第２の回数を示す識別子を保持する媒体を備えるチップに保持され、
   前記第１蛍光検出ステップでは、前記識別子に対応する前記周期的変化を前記第１の回数繰り返して前記検体を加熱し、
   前記第２蛍光検出ステップでは、前記識別子に対応する前記周期的変化を前記第２の回数繰り返して前記検体を加熱する、
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
6. 所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、前記検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体を保持する検体保持部と、
   前記複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、前記検体の加熱の回数に対応付けられる識別子を保持する媒体と、を備える、
   遺伝子検査チップ。
7. 複数種類の蛍光色素を含む検出試薬及び複数種類の標的遺伝子を含む生体試料を混合し、前記複数種類の標的遺伝子のそれぞれに前記複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部と、
   前記検体を一定の昇温速度で加熱しながら前記検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、前記検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部と、
   前記蛍光検出部において得られる蛍光強度の変化に基づき前記複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、
   前記蛍光検出部は、
   前記加熱部により前記周期的変化を第１の回数繰り返して前記検体を加熱した後、前記蛍光検出部により前記複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出部と、
   前記第１蛍光検出部による検出後に、前記加熱部により前記周期的変化を第２の回数繰り返して前記検体を加熱した後、前記蛍光検出部により前記検体に含まれる前記複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出部と、を含み、
   前記判定部は、
   前記第１蛍光検出部及び前記第２蛍光検出部において得られる蛍光強度の変化に基づき前記複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う、
   遺伝子検査システム。