JP2018147833A

JP2018147833A - 電極及びその使用

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Publication number: JP2018147833A
Application number: JP2017044376A
Authority: JP
Inventors: 松彦西澤; Matsuhiko Nishizawa; 洋行甲斐; Hiroyuki Kai; 清水　潔; Kiyoshi Shimizu; 潔清水; 周島本; Shu Shimamoto
Original assignee: Tohoku University NUC; Daicel Corp
Current assignee: Tohoku University NUC; Daicel Corp
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2017-03-08
Publication date: 2018-09-20
Anticipated expiration: 2037-03-08
Also published as: JP6826335B2

Abstract

【課題】グルコース燃料電池、グルコースセンサ等に用いることができ、メディエーターが不要な電極を提供する。【解決手段】導電性基材と、前記導電性基材上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼと、前記フルクトースデヒドロゲナーゼの近傍に配置されたグルコースイソメラーゼと、を備える、グルコース燃料電池用又はグルコースセンサ用電極。【選択図】なし

Description

本発明は、電極及びその使用に関する。より詳細には、電極、グルコース燃料電池、グルコースセンサ及び酵素複合体に関する。

近年、酵素を固定した電極を、電気化学センサや電池に利用する研究が活発に行われている。酵素を固定した電極を利用した電気化学センサは、既に、医療・環境・食品等の分野における計測に広く利用されている。また、例えば、酵素を固定した電極を利用したグルコース燃料電池を、血液や組織液等の体液中のグルコースを燃料として発電する埋め込み電源として実用化することが期待されている。

例えば、非特許文献１には、グルコースオキシダーゼと、オスミウム錯体と、カーボンナノチューブフォレストフィルムとの複合体からなる電極が報告されており、この電極を、グルコース燃料電池やグルコースセンサに利用することが記載されている。

Yoshino S., et al., Molecularly Ordered Bioelectrocatalytic Composite Inside a Film of Aligned Carbon Nanotubes., Adv. Energy Mater., 3, 60-64, 2013.

しかしながら、非特許文献１に記載された電極は、電子の移動を媒介するメディエーターとしてオスミウム錯体を必要とする。オスミウム錯体は生体に対して毒性を有するため、非特許文献１に記載された電極を生体内に埋め込んで利用するためには改良の余地がある。そこで、本発明は、グルコース燃料電池、グルコースセンサ等に用いることができ、メディエーターが不要な電極を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］導電性基材と、前記導電性基材上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼと、前記フルクトースデヒドロゲナーゼの近傍に配置されたグルコースイソメラーゼと、を備える、電極。
［２］前記フルクトースデヒドロゲナーゼが配置された前記導電性基材が、前記グルコースイソメラーゼが分散されたゲルで被覆されている、［１］に記載の電極。
［３］前記フルクトースデヒドロゲナーゼ及び前記グルコースイソメラーゼが結合している、［１］に記載の電極。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の電極を備える、グルコース燃料電池。
［５］生体表面への接触用又は生体内への埋め込み用である、［４］に記載のグルコース燃料電池。
［６］［１］〜［３］のいずれかに記載の電極を備える、グルコースセンサ。
［７］生体表面への接触用又は生体内への埋め込み用である、［６］に記載のグルコースセンサ。
［８］フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼが結合した、酵素複合体。
［９］グルコース燃料電池用電極製造用又はグルコースセンサ用電極製造用である、［８］に記載の酵素複合体。

本発明により、グルコース燃料電池、グルコースセンサ等に用いることができ、メディエーターが不要な電極を提供することができる。

１実施形態にかかる電極の構成を説明する模式図である。第１実施形態のグルコース燃料電池の一例を説明する模式図である。（ａ）及び（ｂ）は、第２実施形態のグルコース燃料電池の一例を説明する模式図である。第３実施形態のグルコース燃料電池の一例を説明する模式図である。１実施形態にかかるグルコースセンサの構成を説明する模式図である。（ａ）は、実験例２におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２における発電により得られた電流密度を示すグラフである。実験例３におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。実験例４におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。実験例５におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。実験例５におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。実験例５におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。実験例５におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。実験例６におけるサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

［電極］
１実施形態において、本発明は、導電性基材と、前記導電性基材上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼと、前記フルクトースデヒドロゲナーゼの近傍に配置されたグルコースイソメラーゼとを備える電極を提供する。

図１は、本実施形態の電極の構成を説明する模式図である。図１に示すように、電極１００は、導電性基材１１０と、導電性基材１１０上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）１２０と、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍に配置されたグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）１３０とを備えている。本実施形態の電極は、グルコース燃料電池、グルコースセンサ等の電極として用いることができる。

導電性基材１１０としては、特に限定されず、例えば、カーボンファブリック、カーボンナノチューブで修飾したカーボンファブリック、金属基板、ポリウレタン・ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）複合体フィルム、酸化インジウムスズ膜付きガラス、無電解めっきやスパッタリング等によって金属膜を積層した、樹脂フィルム、ゴムフィルム、ガラス等を用いることができる。

フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０としては、例えばグルコノバクター属細菌由来のフルクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．９９．１１）等を用いることができる。フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０は、導電性基材１１０に電子を伝達可能に固定されている必要がある。具体的には、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０は、そのヘムＣ（ＨｅｍｅＣ）含有サブユニット１２２が導電性基材１１０に接するように固定されていることが好ましい。

グルコースイソメラーゼ１３０としては、例えば、ストレプトマイセス・ムリヌス由来のグルコースイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．１．５）等を用いることができる。グルコースイソメラーゼ１３０は、酵素単体で存在していてもよいし、担体上に固定されていてもよい。担体としては、多孔性担体が挙げられ、例えば珪藻土、樹脂等が挙げられる。

フルクトースデヒドロゲナーゼは、ｐＨ約４、温度約４０℃で最も活性が高い。これに対し、グルコースイソメラーゼはｐＨ約７、温度約９０℃で最も活性が高い。このように、フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼは、至適反応条件が異なっている。このため、両酵素を同一条件下で使用することはできないと予想された。しかしながら、意外なことに、実施例において後述するように、発明者らは両酵素を同一条件下で使用することが可能であることを見出した。

本実施形態の電極１００において、グルコースイソメラーゼ１３０は、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍に配置されている。ここで、「近傍」とは、グルコースイソメラーゼがグルコースから生成したフルクトースを、効率的にフルクトースデヒドロゲナーゼに引き渡すことができる距離を意味する。グルコースイソメラーゼとフルクトースデヒドロゲナーゼとの距離が離れすぎていると、グルコースイソメラーゼにより生成されたフルクトースが拡散してしまい、フルクトースデヒドロゲナーゼによる反応の効率が低下してしまう傾向にある。

フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍へのグルコースイソメラーゼ１３０の配置は、例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０が配置された導電性基材１１０を、グルコースイソメラーゼ１３０が分散されたゲルで被覆することによって行ってもよい。

この場合、ゲルとしては、特に限定されず、例えば、アガロースゲル、アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、寒天、ペクチンゲル、ジェランガムゲル、カラギナンゲル、ダブルネットワークゲル、ポリエチレングリコールジメタクリレートゲル、ポリビニルメチルエーテルゲル、ヒドロキシプロピルセルロースゲル、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）ゲル等のハイドロゲル等を用いることができる。

あるいは、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍へのグルコースイソメラーゼ１３０の配置を、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０及びグルコースイソメラーゼ１３０を結合させることにより行ってもよい。

フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０及びグルコースイソメラーゼ１３０は、例えば、化学架橋剤を反応させることによって結合させてもよい。化学架橋剤としては特に限定されず、例えば、第一級アミン（−ＮＨ_２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、スルフヒドリル基（−ＳＨ）等を互いに結合する架橋剤が挙げられる。より具体的な架橋剤としては、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド（ＥＤＣ）、ビス−Ｎ−スクシンイミジル−（ペンタエチレングリコール）−エステル（Ｂｉｓ（ＮＨＳ）ＰＥＧ_５）等が挙げられるがこれらに限定されない。

あるいは、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０及びグルコースイソメラーゼ１３０は、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０をコードする遺伝子及びグルコースイソメラーゼ１３０をコードする遺伝子を遺伝子工学的に連結し、大腸菌や酵母等の宿主内で融合タンパク質として発現させること等により結合させてもよい。

また、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０及びグルコースイソメラーゼ１３０の間には、ポリエチレングリコール、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルイミダゾール、ポリエチレン、多糖類等からなるスペーサーが存在していてもよい。

図１に示すように、電極１００をグルコース（Ｄ−グルコース）と接触させると、グルコースイソメラーゼ１３０が、その酵素活性により、グルコースをフルクトース（Ｄ−フルクトース）に変換する。

続いて、生成されたフルクトースが、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の酵素活性によって５−ケト−Ｄ−フルクトースに変換される。この過程で、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有サブユニット１２１がフルクトースから電子（ｅ⁻）を受け取り、その電子をヘムＣ含有サブユニット１２２に伝達する。ヘムＣ含有サブユニット１２２は、メディエーターが存在しなくても、導電性基材１１０に電子を伝達することができる。このようにして、本実施形態の電極によれば、グルコースから電子を取り出すことができる。

本実施形態の電極は、グルコース燃料電池のアノード電極、グルコースセンサの作用電極等の、グルコースから電子を取り出す電極として用いることができ、メディエーターが不要である。本実施形態の電極は、有毒なメディエーターを含まないことから、例えば、眼球表面、皮膚、口腔等の生体表面に接触させて用いた場合においても安全であり、また、血管内、皮下等の生体内に埋め込んで用いた場合においても安全である。また、生体外で使用する場合においても、環境を汚染することがない。

［グルコース燃料電池］
１実施形態において、本発明は、上述した電極、すなわち、導電性基材と、導電性基材上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼと、フルクトースデヒドロゲナーゼの近傍に配置されたグルコースイソメラーゼとを備える電極を備える、グルコース燃料電池を提供する。燃料電池とは、燃料を酸化させ、その反応から得られるエネルギーを熱としてではなく電気として取り出す装置である。

（第１実施形態）
図２は、第１実施形態のグルコース燃料電池の一例を説明する模式図である。図２に示すように、グルコース燃料電池２００は、容器２１０と、容器２１０の内部にそれぞれ配置されたアノード電極１００及びカソード電極２２０と、アノード電極１００及びカソード電極２２０にそれぞれ接続された配線２３０と、容器２１０の内部に収容された、グルコースを含む媒体２４０とを備えている。

グルコース燃料電池２００において、媒体２４０は、水、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート等の液体であってもよく、アガロースゲル、アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、ダブルネットワークゲル、ポリエチレングリコールジメタクリレートゲル、ポリビニルメチルエーテルゲル等のハイドロゲル等であってもよい。

グルコース燃料電池２００において、アノード電極１００は、上述した、導電性基材１１０と、導電性基材１１０上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼ１２０と、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍に配置されたグルコースイソメラーゼ１３０とを備える電極である。

本実施形態のグルコース燃料電池２００によれば、配線２３０を通じて燃料であるグルコースから電気エネルギーを取り出し、所望のデバイスを駆動することができる。また、アノード電極１００は有毒なメディエーターを含まないため、カソード電極２２０としてメディエーターを含まない電極を採用すれば、メディエーターを含まないグルコース燃料電池を構成することができる。

メディエーターを含まないカソード電極としては、例えば、導電性基材上に、メディエーターが存在しなくても導電性基材に電子を伝達することができる酸素還元酵素を配置した電極を利用することができる。メディエーターが存在しなくても導電性基材に電子を伝達することができる酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ番号：１．３．３．５）、ラッカーゼ（ＥＣ番号：１．１０．３．２）、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ番号：１．１０．３．３）、セルロプラスミン（ＥＣ番号：１．１６．３．１）等が挙げられる。

（第２実施形態）
図３（ａ）及び（ｂ）は、第２実施形態のグルコース燃料電池の一例を説明する模式図である。図３（ａ）に示すように、グルコース燃料電池３００は、シート状のアノード電極１００と、グルコースを含む媒体２４０と、シート状のカソード電極２２０と、アノード電極１００及びカソード電極２２０にそれぞれ接続された配線２３０とを備えており、アノード電極１００と媒体２４０とカソード電極２２０とはこの順に積層されている。

グルコース燃料電池３００において、媒体２４０としては、例えば、アガロースゲル、アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、ダブルネットワークゲル、ポリエチレングリコールジメタクリレートゲル、ポリビニルメチルエーテルゲル等のハイドロゲル等を好適に用いることができる。

グルコース燃料電池３００において、アノード電極１００は、上述した、導電性基材１１０と、導電性基材１１０上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼ１２０と、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍に配置されたグルコースイソメラーゼ１３０とを備える電極である。また、導電性基材１１０としては、上述したものと同様のものを用いることができるが、シート状の形状であることが好ましい。

本実施形態のグルコース燃料電池３００によれば、配線２３０を通じて燃料であるグルコースから電気エネルギーを取り出し、所望のデバイスを駆動することができる。また、アノード電極１００は有毒なメディエーターを含まないため、カソード電極２２０としてメディエーターを含まない電極を採用すれば、メディエーターを含まないグルコース燃料電池を構成することができる。メディエーターを含まないカソード電極としては、上述したものと同様のものが挙げられる。

本実施形態のグルコース燃料電池３００は、シート状の形状をしていることから、図３（ｂ）に示すように複数個積層することができる。これにより、得られる電圧を高めることができる。また、アノード電極１００及びカソード電極２２０の導電性基材として柔軟な基材を用いることにより、グルコース燃料電池３００全体を柔軟な構造体にすることができる。この結果、グルコース燃料電池３００を自由な形状に曲げたり、対象物に巻きつけて用いること等が可能になる。

（第３実施形態）
図４は、第３実施形態のグルコース燃料電池の一例を説明する模式図である。図４に示すように、グルコース燃料電池４００は、支持体４１０と、支持体４１０上にそれぞれ配置された、アノード電極１００及びカソード電極２２０と、アノード電極１００及びカソード電極２２０にそれぞれ接続された配線２３０とを備えている。

グルコース燃料電池４００において、アノード電極１００は、上述した、導電性基材１１０と、導電性基材１１０上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼ１２０と、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍に配置されたグルコースイソメラーゼ１３０とを備える電極である。

グルコース燃料電池４００は、例えば、生体表面に接触させて、あるいは生体内に埋め込んで用いることができる。すなわち、グルコース燃料電池４００は、生体表面への接触用又は生体内への埋め込み用であってもよい。生体表面及び生体内としては、上述したものが挙げられる。アノード電極１００及びカソード電極２２０は、使用時には、生体表面の涙、汗等の体液、生体内の血液、組織液等の体液と接触する。そして、これらの体液中のグルコースを燃料として発電する。

グルコース燃料電池４００において、アノード電極１００は、上述した、導電性基材１１０と、導電性基材１１０上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼ１２０と、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍に配置されたグルコースイソメラーゼ１３０とを備える電極である。また、導電性基材１１０としては、上述したものと同様のものを用いることができる。

本実施形態のグルコース燃料電池４００によれば、配線２３０を通じて燃料であるグルコースから電気エネルギーを取り出し、所望のデバイスを駆動することができる。また、アノード電極１００は有毒なメディエーターを含まないため、カソード電極２２０としてメディエーターを含まない電極を採用することにより、生体に対する毒性がほとんどないグルコース燃料電池を構成することができる。メディエーターを含まないカソード電極としては、上述したものと同様のものが挙げられる。

［グルコースセンサ］
１実施形態において、本発明は、上述した電極、すなわち、導電性基材と、導電性基材上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼと、フルクトースデヒドロゲナーゼの近傍に配置されたグルコースイソメラーゼとを備える電極を備える、グルコースセンサを提供する。

図５は、本実施形態のグルコースセンサの一例を説明する模式図である。図５に示すように、グルコースセンサ５００は、支持体４１０と、支持体４１０上にそれぞれ配置された、電極１００及び電極５１０と、電極１００及び電極５１０にそれぞれ接続された配線２３０とを備えている。グルコースセンサ５００において、電極１００は、作用極として機能する。また、電極５１０は参照極として機能する。

グルコースセンサ５００において、電極１００は、上述した、導電性基材１１０と、導電性基材１１０上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼ１２０と、フルクトースデヒドロゲナーゼ１２０の近傍に配置されたグルコースイソメラーゼ１３０とを備える電極である。また、電極５１０（参照電極）としては、例えば、銀／塩化銀電極、飽和カロメル電極、標準水素電極等を用いることができる。

グルコースセンサ５００は、生体に対して有毒なメディエーターを含まないため、例えば、生体表面に接触させて、あるいは生体内に埋め込んで、経時的にグルコース濃度を測定するセンサ等として用いることができる。すなわち、グルコースセンサ５００は、生体表面への接触用又は生体内への埋め込み用であってもよい。生体表面及び生体内としては、上述したものが挙げられる。また、本実施形態のグルコースセンサ５００は、生体外で使用する場合においても、環境を汚染することがない。

［酵素複合体］
１実施形態において、本発明は、フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼが結合した、酵素複合体を提供する。

フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼとしては、上述した電極に使用するものと同様のものを用いることができる。

グルコースイソメラーゼとフルクトースデヒドロゲナーゼとが離れて存在している場合には、グルコースイソメラーゼがグルコースを変換して生成されたフルクトースは拡散してしまう。このため、フルクトースとフルクトースデヒドロゲナーゼとが接触する確率が低下し、フルクトースを５−ケト−Ｄ−フルクトースに変換する反応の効率も低下してしまう。

これに対し、本実施形態の酵素複合体によれば、酵素複合体のグルコースイソメラーゼ部分がグルコースを変換して生成されたフルクトースは、効率的に酵素複合体のフルクトースデヒドロゲナーゼ部分に引き渡される。そして、フルクトースデヒドロゲナーゼ部分でフルクトースを５−ケト−Ｄ−フルクトースに効率的に変換することができる。この結果、効率的にグルコースから電子を取出すことが可能となる。

したがって、本実施形態の酵素複合体は、グルコース燃料電池用電極の製造用、グルコースセンサ用電極の製造用に好適に用いることができる。

フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼは、例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼを含む溶液中で、化学架橋剤を反応させることによって結合させてもよい。化学架橋剤としては上述したものが挙げられる。

あるいは、導電性基材にフルクトースデヒドロゲナーゼを固定した後に、当該導電性基材を、グルコースイソメラーゼを含む溶液中に浸漬し、化学架橋剤を反応させることによって、フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼ結合させてもよい。この方法によれば、導電性基材にフルクトースデヒドロゲナーゼを直接結合させる確率が高まる。このため、フルクトースデヒドロゲナーゼから導電性基材へと効率的に電子を伝達することができる電極を作製しやすい傾向にある。

フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼの間には、ポリエチレングリコール、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリヌクレオチド、多糖類等からなるスペーサーが存在していてもよい。フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼの間の距離を制御することにより、酵素複合体のグルコースイソメラーゼ部分がグルコースを変換して生成されたフルクトースを、酵素複合体のフルクトースデヒドロゲナーゼ部分に引き渡す効率を調整することができる。

フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼは、例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子を遺伝子工学的に連結し、大腸菌や酵母等の宿主内で融合タンパク質として発現させること等により結合させてもよい。この場合においても、フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼの間に適切なペプチドリンカーを挿入し、フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼの間の距離を制御することができる。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（電極の作製１）
フルクトースデヒドロゲナーゼが固定された電極を作製した。まず、５ｍｍ×５ｍｍ×厚さ０．３ｍｍのカーボンファブリック（型式「ＴＣＣ−３２５０」、東邦テナックス社）の表面にマルチウォールカーボンナノチューブ（型式「Ｂａｙｔｕｂｅｓ」、バイエルマテリアルサイエンス社）を修飾し、表面積を増大させた。

まず、カーボンナノチューブを４００℃で１１時間加熱した後、硫酸及び硝酸を１：３の割合で混合した酸に５時間浸漬することにより前処理した。続いて、処理後のカーボンナノチューブを０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む水中に分散し、１０ｍｇ／ｍＬのカーボンナノチューブ分散液４０μＬをカーボンファブリックに滴下し空気中で乾燥させた。続いて、カーボンファブリックをマッキルベイン緩衝液中に浸漬し、減圧下（０．０９ＭＰａ）で撹拌して脱気した結果、カーボンファブリックが親水性を示すようになった。

続いて、カーボンナノチューブで修飾したカーボンファブリックをフルクトースデヒドロゲナーゼ（１６９．９Ｕ／ｍＬ、東洋紡エンザイム社）の溶液に浸漬し撹拌することにより、フルクトースデヒドロゲナーゼを固定し、電極を作製した。

［実験例２］
（酵素活性の検討１）
フルクトースデヒドロゲナーゼは、ｐＨ約４、温度約４０℃で最も活性が高い。これに対し、グルコースイソメラーゼはｐＨ約７、温度約９０℃で最も活性が高い。このように、フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼは、至適反応条件が異なっている。このため、両酵素を同一条件下で使用することができるか否かを検討した。

具体的には、まず、ｐＨ６、７、８、８．７に調整したリン酸緩衝液にグルコースを５００ｍＭの終濃度となるようにそれぞれ溶解した。続いて、上記の各グルコース溶液に、それぞれ１００ｍｇ／ｍＬのグルコースイソメラーゼを添加した。グルコースイソメラーゼとしては、珪藻土担体上にグルコースイソメラーゼを固定化したもの（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）を使用した。また、対照として、ｐＨ６のグルコース溶液にグルコースイソメラーゼを添加しなかったものを使用した。

続いて、各グルコース溶液を４５℃で一晩反応させ、グルコースをフルクトースに変換させた。続いて、実験例１で作製した電極を用いて各溶液を燃料とした発電を行い、フルクトースの生成量を測定した。

具体的には、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液５ｍＬに、上記の各グルコース溶液２ｍＬを混合したものを燃料として発電を行い、サイクリックボルタモグラムを測定した。参照電極としては、銀／塩化銀電極を使用した。

図６（ａ）は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。また、図６（ｂ）は、各グルコース溶液を燃料に用いた発電により得られた電流密度を示すグラフである。

その結果、ｐＨ８．０でグルコースイソメラーゼを反応させたグルコース溶液を燃料に用いた場合に発電量が最も高かったが、いずれのｐＨにおいてもグルコースイソメラーゼが十分な活性を示すことが明らかとなった。この結果は、フルクトースデヒドロゲナーゼとグルコースイソメラーゼとを同一条件下で使用できる可能性があることを示す。

［実験例３］
（酵素活性の検討２）
上述したように、グルコースイソメラーゼはｐＨ約７．５〜８．０、温度約４８〜５０℃で最も活性が高い。これに対し、実験例２の結果から、ｐＨ６〜８．７の範囲において、グルコースイソメラーゼが十分な活性を示すことが明らかとなった。そこで、フルクトースデヒドロゲナーゼの反応条件と同じｐＨ５において、グルコースイソメラーゼの活性が認められるか否かについて検討した。

まず、ｐＨ５に調整したクエン酸緩衝液にグルコースを５００ｍＭの終濃度となるように溶解した。続いて、この溶液に、１００ｍｇ／ｍＬのグルコースイソメラーゼ（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）添加した。また、対照として、グルコースイソメラーゼを添加しないｐＨ５のグルコース溶液を使用した。

続いて、各グルコース溶液を４５℃で一晩反応させ、グルコースをフルクトースに変換させた。続いて、実験例２と同様にして、実験例１で作製した電極を用いて各溶液を燃料とした発電を行ってサイクリックボルタモグラムを測定し、フルクトースの生成量を測定した。

図７は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。その結果、ｐＨ５においてもグルコースイソメラーゼが十分な活性を示すことが明らかとなった。

この結果は、フルクトースデヒドロゲナーゼとグルコースイソメラーゼとを同一条件下で使用できることを更に支持するものである。

［実験例４］
（グルコースを燃料に用いた発電）
グルコース溶液にグルコースイソメラーゼを添加するとともに発電を開始し、発電することが可能か否かを検討した。

ｐＨ５に調整したクエン酸緩衝液にグルコースを５００ｍＭの終濃度となるように溶解した。続いて、グルコース溶液にグルコースイソメラーゼ（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）を添加した。また、対照として、グルコースイソメラーゼを添加しないｐＨ５のグルコース溶液を使用した。

そして、グルコースイソメラーゼの添加と同時に、実験例２と同様にして、実験例１で作製した電極を用いた発電を行ってサイクリックボルタモグラムを測定し、発電することが可能か否かを検討した。

図８は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。その結果、グルコースイソメラーゼを一晩反応させた場合と比較すると発電量は少なかったが、発電することが可能であることが明らかとなった。

［実験例５］
（電極の作製２）
実験例１と同様にして作製した電極に、グルコースイソメラーゼを固定化する方法を検討した。グルコースイソメラーゼの固定化方法としては、浸漬、ナフィオン（登録商標）ポリマーによる固定、アルギン酸ゲルによる固定、及びアガロースゲルによる固定を検討した。

《浸漬》
実験例１と同様にして作製した電極を、１０ｍｇ／ｍＬのグルコースイソメラーゼ（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）の懸濁液中に一晩浸漬することにより、フルクトースデヒドロゲナーゼが固定化された電極上にグルコースイソメラーゼを固定した。

続いて、得られた電極を用いて、実験例２と同様にして、サイクリックボルタモグラムを測定し、発電することが可能か否かを検討した。対照として、実施例１と同様にして作製した電極を用いてサイクリックボルタモグラムを測定した。燃料としては、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液５ｍＬに、５００ｍＭグルコース水溶液を２ｍＬ添加したものを使用した。

図９は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。その結果、浸漬によりグルコースイソメラーゼを固定化した電極を用いた発電では、対照と比較して発電量に有意差が認められないことが明らかとなった。

《ナフィオン（登録商標）ポリマーによる固定》
まず、実験例１と同様にして作製した電極の表面に、グルコースイソメラーゼ（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）１００ｍｇを塗布した。続いて、この電極表面にナフィオン（登録商標）１０％分散液を塗布し、空気中・室温で乾燥することにより、フルクトースデヒドロゲナーゼが固定化された電極上にグルコースイソメラーゼを固定した。

図１０は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。その結果、ナフィオン（登録商標）ポリマーでグルコースイソメラーゼを固定化した電極を用いた発電では、２周目以降に急激に出力の低下が認められることが明らかとなった。

《アルギン酸ゲルによる固定》
まず、実験例１と同様にして作製した、フルクトースデヒドロゲナーゼが固定化された電極を、アルギン酸ナトリウム溶液に浸した。続いて、この電極表面にグルコースイソメラーゼ（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）１００ｍｇを塗布した。続いて、電極を塩化カルシウム溶液に浸してアルギン酸ゲルを電極上に被覆することにより、フルクトースデヒドロゲナーゼが固定化された電極上にグルコースイソメラーゼを固定した。

図１１は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。その結果、アルギン酸ゲルでグルコースイソメラーゼを固定化した電極を用いることにより、グルコースを燃料として安定的に発電を行うことができることが明らかとなった。

《アガロースゲルによる固定》
まず、実験例１と同様にして作製した電極の表面に、グルコースイソメラーゼ（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）１００ｍｇを塗布した。続いて、その上に、９０℃に加熱して溶解したアガロースを塗布し、冷却固化することにより、フルクトースデヒドロゲナーゼが固定化された電極上にグルコースイソメラーゼを固定した。

図１２は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。その結果、アガロースゲルでグルコースイソメラーゼを固定化した電極を用いることにより、グルコースを燃料として安定的に発電を行うことができることが明らかとなった。

以上の本実験例の結果から、フルクトースデヒドロゲナーゼが固定化された電極上に、ゲルを用いてグルコースイソメラーゼを固定化することにより、グルコースを燃料として安定的に発電を行うことができる電極を作製することができることが明らかとなった。

［実験例６］
（電極の作製３）
実験例５で使用したグルコースイソメラーゼ（型式「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）」、ノボザイム社）は、珪藻土担体上にグルコースイソメラーゼが固定化されたものであった。そこで、グルコースイソメラーゼとして、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）をすりつぶしたものを用いた検討を行った。

まず、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）を乳鉢ですりつぶした。続いて、実験例１と同様にして作製した電極の表面に、すりつぶしたＳｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）のペースト状粉末１００ｍｇを塗布して室温で乾燥させた。続いて、その上に、９０℃に加熱して溶解したアガロースゲルを塗布し、冷却固化することにより、フルクトースデヒドロゲナーゼが固定化された電極上にグルコースイソメラーゼを固定した。

図１３は、サイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。その結果、乳鉢ですりつぶしたＳｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）をアガロースゲルで固定化することにより、グルコースを燃料として安定的に発電を行うことができることが明らかとなった。

１００，２２０，５１０…電極、１１０…導電性基材、１２０…フルクトースデヒドロゲナーゼ、１２１…フラビンアデニンジヌクレオチド含有サブユニット、１２２…ヘムＣ含有サブユニット、１３０…グルコースイソメラーゼ、２００，３００，４００…グルコース燃料電池、２１０…容器、２３０…配線、２４０…媒体、４１０…支持体、５００…グルコースセンサ。

Claims

導電性基材と、前記導電性基材上に配置されたフルクトースデヒドロゲナーゼと、前記フルクトースデヒドロゲナーゼの近傍に配置されたグルコースイソメラーゼと、を備える、電極。
前記フルクトースデヒドロゲナーゼが配置された前記導電性基材が、前記グルコースイソメラーゼが分散されたゲルで被覆されている、請求項１に記載の電極。
前記フルクトースデヒドロゲナーゼ及び前記グルコースイソメラーゼが結合している、請求項１に記載の電極。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の電極を備える、グルコース燃料電池。
生体表面への接触用又は生体内への埋め込み用である、請求項４に記載のグルコース燃料電池。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の電極を備える、グルコースセンサ。
生体表面への接触用又は生体内への埋め込み用である、請求項６に記載のグルコースセンサ。
フルクトースデヒドロゲナーゼ及びグルコースイソメラーゼが結合した、酵素複合体。
グルコース燃料電池用電極製造用又はグルコースセンサ用電極製造用である、請求項８に記載の酵素複合体。