CN113138220A - 电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电化学生物传感器及其制备方法。该电化学生物传感器，包括工作电极，在所述工作电极上依次形成有酶层、载体层和交联层；所述酶层包括葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；所述载体层由包括壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖、和海藻酸或其盐中至少一种的原料制备而成；所述交联层由包括交联剂的原料制备而成。本发明的电化学生物传感器在体内监测长时间不脱落不降解，可以长时间保持电流稳定。

Description

电化学生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及分析领域，具体涉及一种电化学生物传感器及其制备方法。

背景技术

生物传感器是利用电化学原理，把酶，抗体，抗原，微生物，核酸等生物活性物质作为敏感元件，将其浓度转化为电信号来快速，准确，方便测量生物物质含量的分析系统，其构成材料必须具有特定的性质，从而在体内发挥作用，并提供适宜的信号。电化学生物感应器已经被广泛应用于临床诊断、食品和药品分析以及环境控制等领域。

近年来，葡萄糖传感器，尤其是可植入式葡萄糖传感器受到人们的广泛关注。这类传感器在临床应用中具有重要意义，特别式在监测糖尿病方面有重要的应用价值。基于过氧化氢电极的葡萄糖传感器具有很强的吸引力是因为它结构简单，适用于植入式监测。这类传感器的基本原理是，在葡萄糖氧化酶的参与下，氧气将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，然后通过过氧化氢和电极发生电化学反应产生的信号强度来计算葡萄糖的含量。

葡萄糖氧化酶或者乳酸氧化酶的电极扎入人体后，酶会脱落，使信号降低，因此人体需要频繁更换电极，造成痛苦。

过去十几年中，人们尝试各种方法来解决酶的固定化的问题。但是目前固定的方法很复杂，并且固化效果不好。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种在体内监测长时间不脱落不降解，可以长时间保持电流稳定的电化学生物传感器。

具体技术方案如下：

一种电化学生物传感器，包括工作电极，在所述工作电极上依次形成有酶层、载体层和交联层；

所述酶层包括葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；

所述载体层由包括壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖、和海藻酸或其盐中至少一种的原料制备而成；

所述交联层由包括交联剂的原料制备而成。

在其中一些实施例中，所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖。

在其中一些实施例中，所述海藻酸或其盐为海藻酸钠。

在其中一些实施例中，所述载体层由包括海藻酸钠的原料制备而成。

在其中一些实施例中，制备所述载体层的原料还包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅和琼脂糖中的至少一种。

在其中一些实施例中，制备所述载体层的原料还包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅和琼脂糖中的至少二种。

在其中一些实施例中，所述载体层由包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖和海藻酸钠的原料制备而成。

在其中一些实施例中，所述酶层和/或交联层中还包括氯化钙。

在其中一些实施例中，所述载体层由载体层原料水溶液在所述酶层表面点胶或印刷而成；海藻酸钠在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～5wt％，优选为1～3wt％。

在其中一些实施例中，当所述载体层中包括羧甲基壳聚糖时，所述羧甲基壳聚糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％。

在其中一些实施例中，当所述载体层中包括二氧化硅时，所述二氧化硅在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.05～0.5wt％，优选为0.1～0.2wt％。

在其中一些实施例中，当所述载体层中包括琼脂糖时，所述琼脂糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％，优选为1wt％。

在其中一些实施例中，所述载体层由载体层原料水溶液在所述酶层表面点胶或印刷而成；

所述海藻酸钠在所述载体层原料水溶液中的浓度为1～3wt％；

所述羧甲基壳聚糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％；

所述二氧化硅在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.1～0.2wt％；

所述琼脂糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％。

在其中一些实施例中，所述二氧化硅在使用前先分散在水中，再经高速匀浆机匀浆处理。

在其中一些实施例中，所述海藻酸钠在使用前先高温加热，并与虾青素混合。

在其中一些实施例中，所述羧甲基壳聚糖在使用前先在水中浸泡1～3天。

在其中一些实施例中，所述琼脂糖在使用前先在水中浸泡1～3天。

在其中一些实施例中，所述交联剂包括戊二醛、二环氧辛烷、辛二亚胺和碳二亚胺中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述交联层由所述交联剂的水溶液在所述载体层表面点胶或印刷而成；所述交联剂的水溶液中交联剂的浓度为0.5～2wt％。

在其中一些实施例中，所述酶层由葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的水溶液在所述工作电极表面点胶或印刷而成；所述葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的水溶液中葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的浓度为0.1-5wt％。

本发明的另一目的是提供一种上述的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)在工作电极表面，点胶或印刷所述葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的水溶液，形成所述酶层；

(2)在所述酶层的表面，点胶或印刷载体层原料的水溶液，形成所述载体层。

(3)在所述载体层的表面，点胶或印刷所述交联剂的水溶液，形成所述交联层。

在其中一些实施例中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)在工作电极表面，点胶或印刷所述葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的水溶液，干燥，形成所述酶层；

(2)在所述酶层的表面，点胶或印刷载体层原料的水溶液，干燥，形成所述载体层。

(3)在所述载体层的表面，点胶或印刷所述交联剂的水溶液，干燥，形成所述交联层。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人首次意外发现，在酶层上用特定的载体材料先形成载体层后，再在载体层上形成交联层，通过在酶层和交联层中间形成载体层的设计可以使得酶层和交联层之间交联效果很好，酶活性很高，最终使得葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶生物传感器在体内具有优异的固酶时长，在长时间内可以维持很好的电流稳定性，最终以很简便的方式实现了很好的效果。

进一步地，本发明的发明人在研发中还发现，载体层原料的种类对于生物传感器固酶时长会具有一定的影响，选择包括海藻酸钠的载体层，尤其是选择包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖和海藻酸钠的载体层，可以显著提高固酶效果，实现更长的固酶时长。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本实施方式提供一种电化学生物传感器，包括工作电极，在所述工作电极上依次形成有酶层、载体层和交联层(在所述工作电极上表面形成的酶层、在所述酶层表面上形成的载体层和在所述载体层表面上形成的交联层)；

所述酶层包括葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；

所述载体层由包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖和海藻酸钠中至少一种的原料制备而成；

所述交联层由包括交联剂的原料制备而成。

本发明的发明人首次意外发现，在酶层上用特定的载体材料先形成载体层后，再在载体层上形成交联层，通过在酶层和交联层中间形成载体层的设计可以使得酶层和交联层之间交联效果很好，酶活性很高，最终使得葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶生物传感器在体内具有优异的固酶时长，在长时间内可以维持很好的电流稳定性，最终以很简便的方式实现了很好的效果。此外，本发明的葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶生物传感器为网状空间结构，比表面积大，孔隙性和吸水性好，残留在人体内有害物质少。

优选地，所述载体层由包括海藻酸钠的原料制备而成。加入海藻酸钠制备的载体层，结合本发明其他工艺，最终可实现固酶时长可达20天以上。进一步地，除海藻酸钠外，制备所述载体层的原料还包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅和琼脂糖中的至少一种。此时，固酶时长可达21天以上。

优选地，除海藻酸钠外，制备所述载体层的原料还包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅和琼脂糖中的至少二种。此时，结合本发明其他工艺，最终可实现固酶时长可达24天以上。

优选地，所述载体层由包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖和海藻酸钠的原料制备而成。此时，结合本发明其他工艺，最终可实现固酶时长可达30天以上。

在本发明优选的实施方式中，选择由包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖和海藻酸钠四者相互配合制备载体层，意外发现具有特别优异的效果。羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，为一种两性聚电解质，其是在壳聚糖高分子链上引入亲水基团-CH₂COOH而成，壳聚糖经羧甲基化改性后，提高了水溶性，尤其是在中性和碱性溶液中的溶解性显著增强，使其具有成膜、增稠、保湿、螯合等的特性。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用(如水，pH4-9范围内的盐溶液)。通过羧甲基壳聚糖和二氧化硅和琼脂糖在交联剂和水分子的作用下，分子内和分子间可以发生交联作用而形成凝胶，形成优良的孔隙性和透气性的膜，二氧化硅的网状结构，琼脂糖的网状结构，使得膜的性能更加稳定；同时羧甲基壳聚糖和琼脂糖都具有优异的抑菌抗菌功效。放在人体组织液中，有消炎的作用，对炎症等有一定的作用。海藻酸钠，是一种天然高分子多糖类化合物，具有比较好的水溶性，充分吸水后，体积可膨胀至10倍以上，具有比较好的稳定性和比较好的凝胶成膜性，在少量含有钙离子的碱性溶液，钙离子可以迅速置换出组织液中的钠形成海藻酸钙凝胶，最终在所有材料的整体配合下，最终实现了本发明的生物传感器优异的固酶效果，实现很好的固酶时长和电流稳定性，以及很好的杀菌消炎效果。

优选地，所述酶层和/或交联层中还包括氯化钙。

可选地，所述载体层由载体层原料水溶液在所述酶层表面点胶或印刷而成。

优选地，所述载体层由包括海藻酸钠的原料制备而成，所述海藻酸钠在载体层原料水溶液中的浓度为0.5～5wt％，更优选为1～3wt％，海藻酸浓度为此范围时，固酶效果更优，浓度太高，重复性不好且膜太厚，浓度太低效果有所下降。

优选地，当载体层中包括羧甲基壳聚糖时，所述羧甲基壳聚糖在载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％，进一步为0.8～1.2wt％。

优选地，当载体层中包括二氧化硅时，所述二氧化硅在载体层原料水溶液中的浓度为0.05～0.5wt％，优选为0.1～0.2wt％，此时固酶效果更好。

优选地，当载体层中包括琼脂糖时，所述琼脂糖在载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％，进一步为0.8～1.2wt％。

优选地，所述羧甲基壳聚糖使用前先在水中浸泡1-3天。

优选地，所述二氧化硅使用前先分散在水中，再经高速匀浆机匀浆，将二氧化硅打散，匀浆后的二氧化硅，不容易沉淀，以及可以保持很好的网状结构，固酶效果比较好。

优选地，所述琼脂糖使用前先在水中浸泡1-3天。

所述海藻酸钠使用前先高温加热，并加入虾青素。其可以让海藻酸钠稳定，同时降低葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的用量。

本发明的电化学生物传感器放在皮肤外层，还可以很好的止血。

本发明的电化学生物传感器，生物相容性好，成膜性好，与电极附着好，在长期使用过程种，不会引起组织炎症，并容易降解。并且固定酶的效果好，时间长达30天，减轻了试用患者的痛苦。

本发明制备的生物传感器主要应用于葡萄糖或者乳酸传感器，当植入测试者的皮下的时候，皮下细胞间隙中的葡萄糖/乳酸通过半透膜透析到传感器工作电极表面，葡萄糖或者乳酸在电极表面与对应的酶发生反应，产生的电信号可以通过指尖血或者静脉血对比矫正，从而反应人体组织液葡萄糖/血糖水平。本发明的经过改进后的生物传感器稳定性好，灵敏性高，输出电流与葡萄糖浓度的线性范围广泛，相应时间短，可用于不间断实时监测。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶的酶活为2000U/ML。

以下实施例的葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶电化学生物传感器的制备方法如下(四种载体的浓度如实施例中所示)：

1.酶层的制备

含有葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶的酶溶液的制备：将葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶溶于水中，浓度为0.5～2wt％，并在酶溶液中含有1wt％的氯化钙。

在工作电极上印刷，点胶，或者涂酶，上面涂含有葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶的酶溶液；使得在工作电极上面涂有一层酶膜，然后放在65度烘箱中烘烤10分钟。

2.载体层的制备：

羧甲基壳聚糖放在水中浸泡24小时，在机械搅拌器搅拌30-60min，得到羧甲基壳聚糖水溶液；

二氧化硅分散在水中30min，高速匀浆机均浆3000r/min；二氧化硅浓度0.1wt％。

琼脂糖凝胶放在水中浸泡1-3天后，在机械搅拌器搅拌30-60min，得到琼脂糖凝胶水溶液；

海藻酸钠在水中浸泡1-3天后，用高温加热后常温冷却，并放入1wt％虾青素以让海藻酸钠稳定，在机械搅拌器搅拌30-60min，得到海藻酸钠水溶液；

载体层溶液的制备：在羧甲基壳聚糖水溶液加入二氧化硅水溶液，交联时间为30-60min，再加入琼脂糖凝胶水溶液和海藻酸钠水溶液混合。

在工作电极上面，点胶或者印刷载体层溶液，放在65度烘箱中烘烤10分钟，在酶膜层表面形成载体层。

3.交联层的制备：

交联层溶液的制备：戊二醛和氯化钙溶于水中，加入磷酸缓冲盐，使戊二醛浓度为1-2wt％，氯化钙浓度为1wt％，搅拌30min，得交联层溶液；

在涂酶层和载体层后的传感器中，再点胶或者印刷交联层溶液，然后放在65度烘箱中烘干20分钟。得到葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶电化学传感器。

4.固定酶效果测试实验

随机挑选同一片经过激光切割后的10根传感器，对比浸泡不同天数的电极，其中电极浸泡在PBS溶液中(PBS购买自生物工程)对比不同浓度的浸泡的血糖浓度平均值的大小，确定固定酶天数。目前是要求浸泡后的血糖浓度是原来的±95％以上，固定效果符合要求，否则不符合要求；

本次实验中，浸泡前后，传感器的线性相应范围比较广。经过浸泡试纸前后，传感器的批量一致性好，以及浸泡效果好，浸泡不同的天数后，血糖浓度值不变。

传感器对葡萄糖的线性范围是1.1-33mm，相关系数是0.99.改传感器有比较快的相应速度。

实施例1

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％的葡萄糖氧化酶；

2.载体层：1wt％羧甲基壳聚糖；

3.交联层：1wt％的戊二醛。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为13天。说明添加一定浓度的高聚物，对固定酶的效果有一定的作用。

实施例2

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.载体层：0.1wt％浓度的二氧化硅；

3.交联层：1wt％的戊二醛。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为12天。说明添加一定浓度的高聚物，对固定酶的效果有一定的作用。

实施例3

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.载体层：1wt％的琼脂糖凝胶；

3.交联层：1wt％的戊二醛。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为14天。说明添加一定浓度的高聚物，对固定酶的效果有一定的作用。

实施例4

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶，1wt％的氯化钙；

2.载体层：1wt％的海藻酸钠；

3.交联层：1wt％的戊二醛，1wt％的氯化钙。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为20天。说明添加海藻酸钠后，固酶效果显著提高，说明海藻酸钠作为载体层，对酶的固定起到很好的作用。

实施例5

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.载体层：1wt％羧甲基壳聚糖，0.1wt％浓度的二氧化硅；

3.交联层：1wt％的戊二醛。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为15天。添加2种不同浓度的高聚物，对固定酶的效果有一定的作用，比单独添加高聚物的效果好一些。

实施例6

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.载体层：1wt％羧甲基壳聚糖，1wt％的琼脂糖凝胶；

3.交联层：1wt％的戊二醛。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为16天。添加2种不同浓度的高聚物，对固定酶的效果有一定的作用，比单独添加高聚物的效果好一些。

实施例7

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶，1wt％的氯化钙；

2.载体层：1wt％羧甲基壳聚糖，1wt％的海藻酸钠；

3.交联层：1wt％的戊二醛，1wt％的氯化钙。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为21天。说明添加海藻酸钠后，固酶效果显著提高，同时添加其他的高聚物，比单独添加海藻酸钠的效果好。说明在添加海藻酸钠作为载体层的情况下，添加另3种的其中一种高聚物，对酶的固定起到很好的作用。

实施例8

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.载体层：0.1wt％浓度的二氧化硅，1wt％的琼脂糖凝胶；

3.交联层：1wt％的戊二醛。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为16天。添加2种不同浓度的高聚物，对固定酶的效果有一定的作用，比单独添加高聚物的效果好一些。

实施例9

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶，1wt％的氯化钙；

2.载体层：0.1wt％浓度的二氧化硅，1wt％的海藻酸钠；

3.交联层：1wt％的戊二醛，1wt％的氯化钙。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为21天。说明添加海藻酸钠后，固酶效果显著提高，同时添加其他的高聚物，比单独添加海藻酸钠的效果好。说明在添加海藻酸钠作为载体层的情况下，添加另3种的其中一种高聚物，对酶的固定起到很好的作用。

实施例10

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶，1wt％的氯化钙；

2.载体层：1wt％的琼脂糖凝胶，1wt％的海藻酸钠；

3.交联层：1wt％的戊二醛，1wt％的氯化钙。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为22天。说明添加海藻酸钠后，固酶效果显著提高，同时添加其他的高聚物，比单独添加海藻酸钠的效果好。说明在添加海藻酸钠作为载体层的情况下，添加另3种的其中一种高聚物，对酶的固定起到很好的作用。

实施例11

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.载体层：1wt％羧甲基壳聚糖，0.1wt％浓度的二氧化硅，1wt％的琼脂糖凝胶；

3.交联层：1wt％的戊二醛。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为18天.添加3种不同浓度的高聚物，对固定酶的效果有一定的作用，比单独添加高聚物的效果好一些。

实施例12

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶，1wt％的氯化钙；

2.载体层：1wt％羧甲基壳聚糖，0.1wt％浓度的二氧化硅，1wt％的海藻酸钠；

3.交联层：1wt％的戊二醛，1wt％的氯化钙。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为24天。说明添加海藻酸钠后，固酶效果显著提高，同时添加其他的高聚物，比单独添加海藻酸钠的效果好。说明在添加海藻酸钠作为载体层的情况下，添加他们3种的其中2种高聚物，对酶的固定起到很好的作用。

实施例13

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶，1wt％的氯化钙；

2.载体层：0.1wt％浓度的二氧化硅，1wt％的海藻酸钠，1wt％的琼脂糖凝胶；

3.交联层：1wt％的戊二醛，1wt％的氯化钙。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为25天。说明添加海藻酸钠后，固酶效果显著提高，同时添加其他的高聚物，比单独添加海藻酸钠的效果好。说明在添加海藻酸钠作为载体层的情况下，添加他们3种的其中2种高聚物，对酶的固定起到很好的作用。

实施例14

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶，1wt％的氯化钙；

2.载体层：1wt％羧甲基壳聚糖，0.1wt％浓度的二氧化硅，1wt％的海藻酸钠，1wt％的琼脂糖凝胶；

3.交联层：1wt％的戊二醛，1wt％的氯化钙。

试验结果：符合要求的固定酶的天数为30天。说明添加海藻酸钠后，固酶效果显著提高，同时添加其他的高聚物，比单独添加海藻酸钠的效果好。说明在添加海藻酸钠作为载体层的情况下，添加他们3种高聚物，对酶的固定作用起到很好的作用。

对照1

酶层、载体层和交联层的物质组成和浓度分别为：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.载体层：不添加任何物质；

3.交联层：不添加任何物质。

结果显示，符合要求的固定酶的天数为0天；放在血浆中，葡萄糖氧化酶，很容易溶解在血浆中，固定酶的效果很差。

对照2

与实施例14的区别在于：直接将载体原料和交联剂的混合溶液在酶层上点胶或印刷形成交联层；具体如下：

1酶层：1wt％葡萄糖氧化酶；

2.交联层：1wt％羧甲基壳聚糖，0.1wt％浓度的二氧化硅，1wt％的海藻酸钠，1wt％的琼脂糖凝胶，1wt％的戊二醛。

结果显示，符合要求的固定酶的天数为10天；放在血浆中，葡萄糖氧化酶，很容易溶解在血浆中，固定酶的效果不好。

一、电化学生物传感器的固酶时长

实施例1-14和对照组的试验结果汇总如表1所示。

表1试验结果汇总如下：

二、电化学生物传感器的稳定性研究

在37度温度条件下，在血浆中配置不同的葡萄糖浓度并使用对照组1和实施例14制备的电化学生物传感器测量得到第0天的血糖浓度，同时将传感器保存在血液中在第7D，14D，21D，30D(D：天)再分别测量一次，每个样品重复试验20次后，取平均值。血糖浓度测试结果如表2所示。

表2

从上表可知，对照1中不进行固定的酶膜，试纸几乎全部失效。本发明中，固定化后的葡萄糖氧化酶生物传感器在血浆中放置30天后，和新制备的葡萄糖氧化酶生物传感器相比，总体上保持相对稳定，保持电流在95％左右，稳定性比较好，用在提供频繁的血糖/乳酸浓度测量的可穿戴的体内装置，可以有效延迟维持在体内的时间。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (18)

1.一种电化学生物传感器，包括工作电极，其特征在于，在所述工作电极上依次形成有酶层、载体层和交联层；

所述酶层包括葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；

所述载体层由包括壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖、和海藻酸或其盐中至少一种的原料制备而成；

所述交联层由包括交联剂的原料制备而成。

2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述载体层由包括海藻酸钠的原料制备而成。

3.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，制备所述载体层的原料还包括壳聚糖、二氧化硅和琼脂糖中的至少一种；所述壳聚糖优选为羧甲基壳聚糖。

4.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，制备所述载体层的原料还包括壳聚糖、二氧化硅和琼脂糖中的至少二种；所述壳聚糖优选为羧甲基壳聚糖。

5.根据权利要求4所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述载体层由包括羧甲基壳聚糖、二氧化硅、琼脂糖和海藻酸钠的原料制备而成。

6.根据权利要求2～5任一项所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述酶层和/或交联层中还包括氯化钙。

7.根据权利要求2～5任一项所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述载体层由载体层原料水溶液在所述酶层表面点胶或印刷而成；所述海藻酸钠在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～5wt％，优选为1～3wt％。

8.根据权利要求7所述的电化学生物传感器，其特征在于，当所述载体层中包括羧甲基壳聚糖时，所述羧甲基壳聚糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％。

9.根据权利要求7所述的电化学生物传感器，其特征在于，当所述载体层中包括二氧化硅时，所述二氧化硅在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.05～0.5wt％，优选为0.1～0.2wt％。

10.根据权利要求7所述的电化学生物传感器，其特征在于，当所述载体层中包括琼脂糖时，所述琼脂糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％。

11.根据权利要求5所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述载体层由载体层原料水溶液在所述酶层表面点胶或印刷而成；

所述海藻酸钠在所述载体层原料水溶液中的浓度为1～3wt％；

所述羧甲基壳聚糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％；

所述二氧化硅在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.1～0.2wt％；

所述琼脂糖在所述载体层原料水溶液中的浓度为0.5～2wt％。

12.根据权利要求11所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述二氧化硅在使用前先分散在水中，再经高速匀浆机匀浆处理。

13.根据权利要求11所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述海藻酸钠在使用前先高温加热，并与虾青素混合。

14.根据权利要求11所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖在使用前先在水中浸泡1～3天；

和/或，所述琼脂糖在使用前先在水中浸泡1～3天。

15.根据权利要求1～5任一项所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述交联剂包括戊二醛、二环氧辛烷、辛二亚胺和碳二亚胺中的至少一种。

16.根据权利要求15所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述交联层由所述交联剂的水溶液在所述载体层表面点胶或印刷而成；所述交联剂的水溶液中交联剂的浓度为0.5～2wt％。

17.根据权利要求1～5任一项所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述酶层由葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的水溶液在所述工作电极表面点胶或印刷而成；所述葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的水溶液中葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的浓度为0.1～5wt％。

18.权利要求1～17任一项所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在工作电极表面，点胶或印刷所述葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的水溶液，形成所述酶层；

(2)在所述酶层的表面，点胶或印刷载体层原料的水溶液，形成所述载体层；

(3)在所述载体层的表面，点胶或印刷所述交联剂的水溶液，形成所述交联层。