JP2018145122A - Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブ - Google Patents

Abstract

【解決課題】新規なＡｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブを提供すること。【解決手段】以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。：【化１】

Description

本発明は、新規なＡｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブに関する。

光音響イメージング法は、観察対象にパルス光を照射し、光を吸収した物質が放出する超音波を検出することで画像を構築するイメージング法である。この手法は、光によって特定の吸収体を選択的に励起できる光イメージングの利点と、超音波で検出を行うことでより生体深部のイメージングを可能にする超音波イメージングの利点の両方を併せ持つことから、近年大きな注目を集めている（非特許文献１）。

光音響イメージングは、ヘモグロビン等の内因性物質を用いたイメージングと、外部から加えた造影剤を用いた外因性物質によるイメージングの２つに大別することができる。内因性物質を用いたイメージングでは、造影剤等を投与することなく観察対象の形態学的及び機能的情報を得ることができる一方で、観察できる生命現象は限られてしまう。他方、造影剤等の外因性物質を用いたイメージングを行うことで、コントラストの向上や、特定の標的分子特異的な光音響イメージングが可能となる（非特許文献２）。特に、標的分子と反応して初めて光音響シグナルが発生するactivatable型光音響プローブは、バックグラウンドシグナルの影響を最小限にする高感度なイメージングや、リアルタイムでの標的分子の可視化を可能にすることから注目を集めているものの、その報告例は少ない（非特許文献３）。

Nat. method, 2016, 13, 627-638. Nat. method, 2016, 13, 639-650 Bioconjug. Chem., 2016, 27, 2808-2823.

本発明は、新規なＡｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブ、より具体的には、既存の蛍光プローブで用いられている蛍光制御原理を応用したａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型の光音響プローブを提供することを目的とする。

本発明者等は、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブを開発するにあたり、まず、標的分子として生体内の炎症等に関わる活性酸素種（ＲＯＳ）の１種である次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）に着目し、また、光音響シグナルの制御原理としては、ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型の蛍光プローブとして報告がされている、ＨｙＳＯｘの制御原理を応用した。ＨｙＳＯｘは、分子内スピロ環化を動作原理とし、ＨＣｌＯと反応することで初めてキサンテン環に由来する可視光領域での吸収及び蛍光が回復する。この制御原理を光音響プローブに応用するにあたり、より効率的に光音響シグナルを放出することのできる色素骨格を検討した結果、Ｓｉ−ローダミン（ＳｉＲ）の３、６位のＮ原子にＰｈ基が結合した構造を有する近赤外光領域に吸収を有するキサンテン環系無蛍光性色素（Ｎ−ＰｈＳｉＲ類）が最も効率的に光音響シグナルを放出することを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる置換基を示し：
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、それぞれ独立に、水素、スルホ基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基、カルボキシ基、ヒドロキシ基又はチオール基から選択され；
Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
Ｒ^７及びＲ^９は、一緒になってＲ^７が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく；
Ｒ^８及びＲ^１０は、一緒になってＲ^８が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく；
ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、ＳＯ_２、Ｇｅ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、テルル原子又はセレン原子から選択され、
ここで、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ^ｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
ｙは、酸素原子、硫黄原子、ＮＲ、ＮＰｈ（ｏ−ＮＨ_２）、Ｃ＝Ｎ^＋＝Ｎ⁻、又はセレン原子から選択され、
ここで、Ｒは、水素又は有機基を表し、Ｐｈはフェニル基を表し；
ｗは、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基、Ｃ＝Ｏ、ＳＯ_２、又はＣ＝Ｓから選択され、
ここで、ｗがＣ＝Ｏ、ＳＯ_２又はＣ＝Ｓの場合は、これらの基のＣ（炭素原子）又はＳ（硫黄原子）に、１又は２個の置換されていてもよいメチレン基、あるいは１つの置換されていてもよいエチレン基が結合して６又は７員環を形成してもよい；
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基又はプロピル基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｒ^７及びＲ^８は何れもメチル基である、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｒ^７及びＲ^９は、一緒になってＲ^７が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成しており、Ｒ^８及びＲ^１０は、一緒になってＲ^８が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していている、［１］に記載の化合物又はその塩。
［５］前記ヘテロシクリルがピロリジンである、［４］に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは何れもスルホ基である、［１］〜［５］の何れか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］ｘがＳｉ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）である、［１］〜［６］の何れか１項に記載の化合物又はその塩。
［８］ｙは硫黄原子であり、ｗは、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基又はＣ＝Ｏである、［１］〜［７］の何れか１項に記載の化合物又はその塩。
［９］ｗはメチレン基である、［８］に記載の化合物又はその塩。
［１０］［１］〜［９］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含有する光音響プローブ。
［１１］［８］又は［９］に記載の化合物又はその塩を含有するＨＣｌＯ検出光音響プローブ。
［１２］［１０］に記載の光音響プローブを用いる光音響イメージング方法であって、生体分子にプローブ分子を結合させ、これに光を照射して前記プローブ分子からの光音響シグナルを検出することを含む、前記方法。
を提供するものである。

本発明により、高い光音響シグナル変換効率を有するａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブを提供することができる。
また、本発明により、高い感度及び特異性を持ってＨＣｌＯを検出することが可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ＨＣｌＯ検出光音響プローブを提供することができる。

モデル化合物の化学式とλ_ｅｘ、λ_ｅｍ及びΦ_ｆｌ ＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏ（左）、ＳｉＲ６５０（中央）、Ｃｙ５（右）の光音響イメージングを示す。 ＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏ（左）、ＳｉＲ６５０（中央）、Ｃｙ５（右）の光音響シグナルの強度 従来報告されたａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ＨＣｌＯ検出プローブ（ＨｙＳＯｘ及びＭＭＳｉＲ）（Ａ）及び、本発明のａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ＨＣｌＯ検出光音響プローブ（ＰＡ−ＲＯＳ）（Ｂ） ＨＣｌＯ（６００μＭ）との反応前（左）と反応後（中央）でのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）の光音響イメージング、及びＰＢＳのみの光音響イメージング（右）を示す。 図３Ａの光音響イメージングにおいて四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度をイメージＪで計算した結果を示す。 様々なＲＯＳを添加した後の、ＰＢＳ（（ｐＨ７．４、共溶媒として１％ＤＭＳＯを含有）中のＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）の光音響イメージングを示す。 図４Ａの光音響イメージングにおいて四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度をイメージＪで計算した結果を示す。 Ｈ_２Ｏ_２（５００μＭ）を添加した場合（左）、添加しない場合（中央）でのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）（１００ｎＭ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）の光音響イメージング、及び、ＭＰＯ（１００ｎＭ）、Ｈ_２Ｏ_２（５００μＭ）及びＭＰＯ阻害剤（４−アミノ安息香酸ヒドラジド（５０μＭ）の光音響イメージングを示す。 図５Ａの光音響イメージングにおいて四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度をイメージＪで計算した結果を示す。 マウス皮下においてＰＡ ＲＯＳを用いたＨＣｌＯ依存的な光音響イメージングの検討結果 マウス皮下においてＰＡ ＲＯＳを用いたＨＣｌＯ依存的な光音響イメージングの検討結果

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。

本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。

本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物」とも言う）。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる置換基を示す。Ｒ^１は、同一であっても異なっていてもよい。

Ｒ^１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基、マレイミド基等からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ^１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ^１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ^１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ^１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。

本発明の好ましい側面においては、Ｒ^１は何れも水素原子である。

また、本発明の好ましい側面においては、Ｒ^１の少なくとも１つは、炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシ基、アミド基又はアルキルアミド基から選択され、残りは水素原子である。

本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、ローダミン骨格の３、６位のＮ原子にフェニル基が結合した構造を有することを一つの特徴としている。理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明の化合物は、Ｎ原子上へフェニル基を導入することにより、無蛍光性にすることによる光音響シグナルの増強を図ることができると考えている。

Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、それぞれ独立に、水素、スルホ基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基、カルボキシ基、ヒドロキシ基又はチオール基から選択される。Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、同一であっても異なっていてもよい。Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、スルホ基、リン酸基、カルボキシ基の場合には、水溶性が向上することから好ましい。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは何れもスルホ基である。また、本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂとして、各ベンゼン環のパラ位に１つのスルホ基が結合する。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ^３又はＲ^４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^３又はＲ^４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^３及びＲ^４がともに水素原子である場合、又はＲ^３及びＲ^４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示すが、Ｒ^３及びＲ^４について説明したものと同様である。Ｒ^５及びＲ^６が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^７及びＲ^９は、一緒になってＲ^７が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリルとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^８及びＲ^１０は、一緒になってＲ^８が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリルとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の化合物の１つの好ましい側面において、Ｒ^７及びＲ^８は何れも炭素数１〜６個のアルキル基（好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、より好ましくはメチル基）であり、Ｒ^９及びＲ^１０は何れも水素原子である。

また、本発明の化合物の別の好ましい側面において、Ｒ^７及びＲ^９は、一緒になってＲ^７が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成しており、Ｒ^８及びＲ^１０は、一緒になってＲ^８が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成している。形成されるヘテロシクリルとしては、何れのヘテロシクリルもピロリジン又はピペリジンが好ましく、ピロリジンが更に好ましい。
Ｒ^７及びＲ^９が、一緒になってＲ^７が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成しており、Ｒ^８及びＲ^１０が、一緒になってＲ^８が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成している構造であると、本発明の化合物は、７００ｎｍを超える近赤外領域に吸収・蛍光波長を有することが可能であり、このような波長領域の光はヘモグロビンの吸収が少ないため生体内透過性に優れ、生体深部の観察が可能となり好ましい。

一般式（Ｉ）において、ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、ＳＯ_２、Ｇｅ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、テルル原子又はセレン原子から選択される。
本発明の好ましい態様においては、ｘは、Ｓｉ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）である。

Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基である。Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ^ａ及びＲ^ｂがともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ^ａ及びＲ^ｂが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^ａ及びＲ^ｂが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^ａ及びＲ^ｂがアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。

Ｒ^ｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基である。フェニル基の置換基としては、メチル基、ヒドロキシ基、メトキシ基などが挙げられる。
合成上の導入のし易さの点から、Ｒ^ｃは、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Ｒ^ｃがメチル基である方が水溶性は高いため、より好ましい。

一般式（Ｉ）において、ｙは、酸素原子、硫黄原子、ＮＲ、ＮＰｈ（ｏ−ＮＨ_２）、Ｃ＝Ｎ^＋＝Ｎ⁻、又はセレン原子から選択される。ここで、Ｒは、水素又は有機基を表し、Ｐｈはフェニル基を表す。

一般式（Ｉ）において、ｗは、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基、Ｃ＝Ｏ、ＳＯ_２、又はＣ＝Ｓから選択される。
ここで、アルキレン基が有することができる置換基としては、炭素数１〜６個のアルキル基が挙げられる。アルキレン基としては、置換されていてもよいメチレン基、エチレン基及びプロピレン基が挙げられ、好ましくはメチレン基である。

また、ｗがＣ＝Ｏ、ＳＯ_２又はＣ＝Ｓの場合は、これらの基のＣ（炭素原子）又はＳ（硫黄原子）に、１又は２個の置換されていてもよいメチレン基、あるいは１つの置換されていてもよいエチレン基が結合して６又は７員環を形成してもよい。
即ち、ｗがＣ＝Ｏの場合の実施態様には、（ｉ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ＝Ｏ及び（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）（即ち、ｗとｙとが一緒になって６員環を形成する）、（ｉｉ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）、Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）Ｃ＝Ｏ及び（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）（即ち、ｗとｙとが一緒になって７員環を形成する）も含まれる。
同様に、ｗがＳＯ_２の場合の実施態様には、（ｉ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）ＳＯ_２及び（ＳＯ_２）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）（ｗとｙとが一緒になって６員環を形成する）、（ｉｉ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）（ＳＯ_２）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）、Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）ＳＯ_２及び（ＳＯ_２）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）（ｗとｙとが一緒になって７員環を形成する）も含まれる。
ｗがＣ＝Ｓの場合の実施態様には、（ｉ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ＝Ｓ及び（Ｃ＝Ｓ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）（ｗとｙとが一緒になって６員環を形成する）、（ｉｉ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）（Ｃ＝Ｓ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）、Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）Ｃ＝Ｓ及び（Ｃ＝Ｓ）Ｃ（Ｒ^ｄＲ^ｅ）Ｃ（Ｒ^ｆＲ^ｇ）（ｗとｙとが一緒になって７員環を形成する）も含まれる。
ここで、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｆ及びＲ^ｇは、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表す。
以下の説明においては、特段の定めがない限りは、ｗがＣ＝Ｏ、ＳＯ_２又はＣ＝Ｓである場合は、これらの基のＣ（炭素原子）あるいはＳ（硫黄原子）に１又は２個の置換されていてもよいメチレン基、あるいは１つの置換されていてもよいエチレン基が結合して６又は７員環を形成する場合も含まれる。

一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、キサンテン骨格とこれに結合しているベンゼン環の間に５〜７員環の閉環構造を有しているが、標的分子と反応することで５〜７員環が開環して、キサンテン環に由来する可視光領域での吸収及び蛍光が回復して光音響シグナルが放出される。従って、標的分子の種類に応じて、標的分子により開環し易い、適切なｙとｚの組み合わせを選択することができる

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙは硫黄原子であり、ｗは炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基（好ましくはメチレン基）又はＣ＝Ｏである。
この実施形態における化合物又はその塩は、ＨＣｌＯとの反応性が高いことから、有効なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ＨＣｌＯ検出光音響プローブを提供することができる。

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙはＮＲであり、ｗはＣ＝Ｏである。この実施形態における化合物又はその塩は、重金属イオンと反応して５〜７員環が開環することから、有効なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型重金属イオン検出光音響プローブを提供することができる。重金属イオンとしては、例えば、Ａｇ^＋、Ｃｕ^２＋、Ｐｂ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ａｌ^３＋等が挙げられる。
ここで、ｗとｙ部分（Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ）が金属イオンを捕捉（キレート）する構造を形成する。Ｃ（＝Ｏ）ＮＲにより形成される金属イオンを捕捉（キレート）する構造については、例えば、Chem. Soc. Rev., 2008, 37, 1465-1472等を参照して選択することができる。具体例として、ＲがＮＨ_２の場合、Ｃｕ_２ ^＋を捕捉することができる。

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙはＮＲであり、ｗはＣ＝Ｓである。この実施形態における化合物又はその塩は、水銀イオン等の重金属イオンと反応して５〜７員環が開環することから、有効なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型重金属イオン検出光音響プローブを提供することができる。
ここで、例えば、ＲがＮＨ_２である場合水銀イオンの検出に有効である。

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙはＮＲであり、ｗは炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基である。ここで、アルキレン基は、好ましくはメチレン基である。
この実施形態における化合物又はその塩は、水素イオンと反応して５〜７員環が開環することから、有効なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型プロトン検出光音響プローブを提供することができる。
ここで、例えば、Ｒは水素又はアルキル基（メチル基等）が好ましい。

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙは酸素原子であり、ｗは炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基である。ここで、アルキレン基は、好ましくはメチレン基である。
この実施形態における化合物又はその塩は、硫化水素、ＣＮ⁻と反応して５〜７員環が開環することから、これら化合物を有効に検出するａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブを提供することができる。

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙはセレン原子であり、ｗはＣ＝Ｏである。この実施形態における化合物又はその塩は、水銀イオン、銀イオン等の重金属イオンや一酸化窒素（ＮＯ）と反応して５〜７員環が開環することから、これら化合物又は金属イオンを有効に検出するａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型光音響プローブを提供することができる。

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙはＮＰｈ（ｏ−ＮＨ_２）であり、ｗはＣ＝Ｏである。この実施形態における化合物又はその塩は、一酸化窒素（ＮＯ）と反応して５〜７員環が開環することから、有効なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ＮＯ検出光音響プローブを提供することができる。

本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、ｙはＣ＝Ｎ^＋＝Ｎ⁻であり、ｗはＣ＝Ｏである。この実施形態における化合物又はその塩は、光照射でスピロ環が開環することから、有効なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ケージド光音響プローブを提供することができる。

本発明の化合物の好ましい非限定的な例は以下の通りである。

Ｒ^１＝Ｈ、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨＲ’（Ｒ’はアルキル基）
Ｒ^２＝Ｈ、ＳＯ_３Ｈ、ＯＭｅ、ＮＨ_２、ＯＨ、ＳＨ
Ｘ＝Ｏ、ＳｉＭｅ_２、Ｐ（＝Ｏ）Ｍｅ、Ｐ（＝Ｏ）Ｐｈ、ＳＯ_２、Ｔｅ、Ｇｅ（Ｍｅ_２）又はＳｅ
ｙ、ｚ＝Ｏ、ＮＲ（Ｒは水素又は有機基）、Ｓ、Ｃ＝Ｎ^＋＝Ｎ⁻、Ｓｅ又はＮＰｈ（ｏ−ＮＨ_２）

本発明の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。

本発明の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。

本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物を製造することができる。

本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む光音響プローブである。

また、本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）において、ｙが硫黄原子であり、ｗが炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基（好ましくはメチレン基）又はＣ＝Ｏである化合物又はその塩を含有するＨＣｌＯ検出光音響プローブである。

本発明のもう１つの態様は、本発明の光音響プローブを用いる光音響イメージング方法であって、生体分子にプローブ分子を結合させ、これに光を照射して前記プローブ分子からの光音響シグナルを検出することを含む、前記方法である。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

使用機器
（１）光音響顕微鏡
オリンパス製の光音響顕微鏡を使用した。この光音響顕微鏡は、６７１ｎｍのパルスレーザー（パルス幅：１５ｎｓ、パルス反復速度：１０ｋＨｚ、パルスエネルギー：１．０μＪ又は２．０μＪ）を照射し、超音波変換器（中央振動数：５ＭＨｚ）を備えている。なお、光音響顕微鏡はこれに限らずに同種の機器も使用することができる。

［参考例１］
予備検討：モデル化合物による光音響シグナル変換効率の比較
実施例において、６７１ｎｍの光で励起を行う光音響顕微鏡を使用することから、この波長付近に吸収のピークトップを持つ３種類の色素ＳｉＲ６５０、ＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏ、Ｃｙ５（図１Ａ）を合成し、その光音響シグナル変換効率の比較を行うことで光音響プローブとして最適な色素骨格の検討を行った。このうち、ＳｉＮＱ６６０ ＳｕｌｆｏはＳｉ−ローダミン（ＳｉＲ）の３、６位のＮ原子にＰｈ基が結合した構造をしており、このような構造を有するＮ−ＰｈＳｉＲ類は無蛍光性を示すことが知られている（J. Am. Chem. Soc., 2015, 137, 4759-4765.）。
図１Ａに、３種類の色素の化学式と、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有し、０．０５％ＴＦＡを含有するＨ_２Ｏ／ＥｔＯＨ＝１／１中で各色素のλ_ｅｘ、λ_ｅｍ及びΦ_ｆｌを示す。ここで、ＳｉＲ６５０のΦ_ｆｌを絶対蛍光量子収率として決定し、ＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏ及びＣｙ５のΦ_ｆｌは、参照として０．０５％ＴＦＡを含有するＨ_２Ｏ／ＥｔＯＨ＝１／１中のＳｉＲ６５０のΦ_ｆｌ(０．５０)を用いて決定した相対蛍光量子収率である。
図１Ａに示すように、実際に、ＳｉＮＱ６６０ ＳｕｌｆｏはΦ_ｆｌ＜０．００１となり無蛍光性を示した。一般的に、光音響シグナルは光によって励起された物質の無輻射失活によって生じるとされており、蛍光量子収率は低いほうがより効率的に光音響シグナルを放出すると考えられている。このため、本発明者等は、ＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏが３種の色素の中で最も効率よく光音響シグナルを放出するのではないかと予想した。
実験は、Ｈ_２Ｏ／ＥｔＯＨ＝１／１ ｗｉｔｈ ０．０５％ＴＦＡ中に溶解させた色素を内径１ｍｍのシリコンチューブに詰め、６７１ｎｍの光で励起した際の光音響シグナルを比較することで行った。濃度に関しては、ＳｉＲ６５０ は１００μＭで調整し、ＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏ及びＣｙ５については、励起波長である６７１ｎｍでＳｉＲ６５０と同じ吸光度を持つように濃度を調整した。６７１ｎｍにおいて同じ吸光度を持つように調整した３種の色素について光音響イメージングを行ったところ、ＳｉＲ類の３、６位のＮ原子にＰｈ基を結合させたＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏにおいて最も強い光音響シグナルが放出されることが明らかとなった（図１Ｂ及び１Ｃ）。
光音響イメージングは、６７１ｎｍのパルスレーザー（パルス幅：１５ｎｓ、パルス反復速度：１０ｋＨｚ、パルスエネルギー：２．０μＪ）及び超音波変換器（中央振動数：５ＭＨｚ）を用いて行った。
また、図１Ｂの各々の光音響イメージング中の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度をイメージＪで計算した。図１Ｂの光音響イメージングの外側の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度は、バックグラウンドシグナルとして各光音響シグナルから差し引いた。

Ｎ−Ｐｈ ＳｉＲ 骨格を母核としたａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ＨＣｌＯ検出光音響プローブの開発に際し、本発明者らは、ＨＣｌＯの検出原理として本発明者等が開発したＨｙＳＯｘ（J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 7313-7318.）及びＭＭＳｉＲ（J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 5680-5682.）（図２のＡ）に用いられている制御原理を用いることとした。ＨｙＳＯｘ及びＭＭＳｉＲのベンゼン環部位２位のメチレンチオール基は、ＨＣｌＯによる酸化を受ける前は、キサンテン環９位に求核攻撃し分子内スピロ環化を起こす。その結果、キサンテン環の共役系が分断され、キサンテン環由来の吸収は生じない。しかし、ＨＣｌＯによる酸化を受けることでチオール基はスルホ基となり、求核性が減弱することでスピロ環が開環しキサンテン環由来の吸収および蛍光を回復する。今回光音響プローブを開発するにあたり、近赤外光領域の吸収、およびスルホ基の導入による高い水溶性を示し、参考例１の実験結果から高い光音響シグナル変換効率を有することが示されたＳｉＮＱ６６０ Ｓｕｌｆｏの構造を基本骨格としたＨＣｌＯ検出ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ光音響プローブ（図２のＢ）をデザイン、合成した。

［合成実施例１］
以下のスキーム１により、本発明の化合物である化合物９（ＰＡ−ＲＯＳ）（４，４’−（（５’，５’−ジメチル−３Ｈ，５’Ｈ−スピロ［ベンゾ［ｃ］チオフェン−１，１０’−ジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン］−３’，７’−ジイル）ビス（メチルアザネジル））ジベンゼンスルホン酸）を合成した。

スキーム１：ＰＡ−ＲＯＳ（化合物９）の合成スキーム

Scheme 1. (a) (i) sec-BuLi / THF, - 78°C (ii) dichlorodimethylsilane, THF, -78°C to r.t. (iii) KMnO₄ / CH₃CN, 0 °C, y. 28% (b) Pd(PPh₃)₄, 1,3-dimethylbarbituric acid / CH₂Cl₂, 35°C, y. 87% (c) NaNO₂ / MeOH, H₂SO₄ aq., 0°C to reflux, y. 59%, (d) N-phenyltrifluoromethanesulfonimide, DIEA / DMF, r.t., y. 80% (e) N-methylaniline, Cs₂CO₃, Pd₂(dba)₃, Xantphos / toluene, 100°C, y. 55% (f) (i) chlorosulfuric acid, / CH₂Cl₂, 0°C (ii) triisopropyl orthoformate / 2-propanol, 55°C, y. 66% (g) (i) sec-BuLi / THF, - 78°C (ii) 7, THF, -78°C to r.t. (iii) 2N HCl, CH₃CN, reflux, y. 38%.

（１）化合物１（ビス（２−ブロモ−４−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノフェニル）メタンの合成
文献（Chem. Commun., 2011, 47, 4162-4164.）に従って合成した。

（２）化合物２（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアルキルジアミノ−Ｓｉ−キサンテン）の合成

化合物１（５．３３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、−７８^ｏＣでｓｅｃ−ＢｕＬｉ（１．０Ｍヘキサン溶液）（３９ｍＬ、３０．９ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。これにＳｉＭｅ_２Ｃｌ_２（２．６６ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、室温下で１時間攪拌した。これに２Ｎ塩酸を加え反応を終了させた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え中和した。この溶液をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で有機層を乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解し、０°ＣでＫＭｎＯ_４（４．９３ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）を少量ずつ２時間かけて加えた。０°Ｃでさらに１時間攪拌し、セライトを懸濁させたＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、その後セライトろ過を行った。溶媒を減圧除去し、残渣を中圧分取（シリカゲル、ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製し、化合物２（１．２５ｇ、２工程で収率２８％）を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.41 (s, 6H), 4.02 (d, J = 4.4 Hz, 8H), 5.18 (d, J = 2.9 Hz, 4H), 5.18-5.23 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.80-6.84 (m, 4H), 8.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ-1.2, 52.6, 113.4, 114.7, 116.6, 133.0, 131.6, 133.0, 140.3, 150.1, 185.0 ; HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺, 429.2362; found, 429.2369 (+0.7 mmu).

（３）化合物３（ジアミノ−Ｓｉ−キサンテン）の合成

化合物２（５４９ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）と１，３−ジメチルバルビツール酸（１０１２ｍｇ、６．４９ｍｍｏｌ）をシュレンク管中でＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン置換した後、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（２３１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加え再度アルゴン置換を行い３５°Ｃで２６時間攪拌した。反応液を室温に戻し、飽和ＮａＨＣＯ_３を加えＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥を行った後、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝５０／５０ ｔｏ ７１／２９、ｌｉｎｉｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）で精製し、化合物３（２９７ｍｇ、収率８７％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 0.39 (s, 6H), 4.20 (s, 4H), 6.76 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4Hz, 2H), 6.81 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 8.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ-1.5, 116.1, 117.5, 131.6, 131.9, 140.9, 149.3, 185.3.; HRMS (ESI⁺) :Calcd for [M + H]⁺,269.1110; found, 269.1093 (-1.7 mmu).

（４）化合物４（ジヒドロキシ−Ｓｉ−キサンテン）の合成

化合物３（２９７ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／６Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４ ａｑ．（１５ｍＬ／３０ｍＬ）に溶解させ、０°ＣでＨ_２Ｏ（５ｍＬ）に溶解させたＮａＮＯ_２（４９０ｍｇ、７．１０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間攪拌した。この反応液を沸騰している１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４ ａｑ．（５４ｍＬ）にゆっくり加え、１５分間加熱還流した。反応液を０°Ｃまで冷却しＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（シリカゲル、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝３０／７０ ｔｏ ５５：４５、ｌｉｎｉｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）で精製し、化合物４（１７６ｍｇ、収率５９％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 0.00 (s, 6H), 4.67 (br s, 2H), 6.55 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 2H) , 6.68 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD): δ -1.6, 118.3, 120.0, 133.3, 133.7, 143.0, 161.9, 187.7.; HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺, 271.0791; found, 271.0792 (+0.1 mmu).

（５）化合物５（３，６−ジ（トリフルオロメタンスルホネート）−Ｓｉ−キサンテン）の合成

化合物４（１７６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、Ｎ−フェニルトリフルオロメタンスルホンアミド（９４３ｍｇ、２．６４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６７５ｍｇ、５．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、アルゴン置換下室温で１．５時間攪拌した。これにＨ_２Ｏを加えてＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（シリカゲル、ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝８０：２０ ｔｏ ３０：７０、ｌｉｎｉｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）で精製し、化合物５（２７８ｍｇ、収率８０％）を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.59 (s, 6H), 7.49 (dd, J = 8.8 Hz, 2.2 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 8.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ -1.9, 118.7 (q, J = 318.9 Hz) 123.2, 125.4, 133.0, 139.9, 142.0, 152.1, 184.8.; HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺,534.9776; found, 534.6760 (-1.6 mmu).

（６）化合物６（３，６−ビス（Ｎ−メチルアニリン）−Ｓｉ−キサンテン）の合成

化合物５（２３５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルアニリン（２８２ｍｇ、２．６４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（８６７ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）をシュレンク管中でトルエン（４０ｍＬ）に溶解させアルゴン置換した後、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（１３５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）とキサントホス（１４０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を加え再度アルゴン置換を行い１００°Ｃで１４時間攪拌した。反応液を室温に戻し、桐山ろ過を行った後、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（シリカゲル、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９７：３ ｔｏ ７４：２６、ｌｉｎｉｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）で精製し、化合物６（１０９ｍｇ、収率５５％）を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.38 (s, 6H), 3.42 (s, 6H), 6.93 (dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.19-7.27 (m, 6H), 7.39-7.44 (m, 4H), 8.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ -1.3, 40.4, 116.9, 118.2, 125.4, 125.8, 130.1, 131.3, 131.8, 140.7, 147.9, 151.1, 185.0.; HRMS (Corona ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺, 449.2049; found, 449.2061 (+1.2 mmu).

（７）化合物７（３，６−ジ（４−ｉ−プロピルスルホン酸エステル−メチルアニリン）−Ｓｉ−キサントン）の合成

化合物６（１３７ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）に溶解させ、０°Ｃで塩化スルホン酸（６００μＬ）をゆっくり加え、４時間攪拌した。Ｈ_２Ｏを加え反応を終了させ、有機溶媒を減圧除去した。残った溶液をＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）（Ｖａｃ ３５ｃｃ（１０ｇ）Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）を用いてＨ_２Ｏで洗浄し、その後ＭｅＯＨで溶出した。有機溶媒を減圧除去し、残った溶液を凍結乾燥することで溶媒を除去した。凍結乾燥後の残渣を２−プロパノール（１３ｍＬ）に溶解させ、トリイソプロピルオルトホルメート（６．５ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）を加えＡｒ置換下５５°Ｃで５時間攪拌した。反応液を室温に戻した後、溶媒を減圧除去し、Ｈ_２Ｏを加えＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（シリカゲル、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝７３／２７ ｔｏ ５２／４８、ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）で精製し、化合物７（１４０ｍｇ、収率６６％）を得た。
¹H NMR (300 MHz, CD₂Cl₂): δ0.44 (s, 6H), 1.27 (d, J = 5.9 Hz, 12H), 3.48 (s, 6H), 4.69 (sep, J = 5.9 Hz, 2H), 7.10-7.15 (m, 4H), 7.34 (dd, J = 8.8 Hz, 2.2 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.74-7.78 (m, 4H), 8.40 (d, J = 8.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CD₂Cl₂): δ -1.4, 22.9, 40.4, 77.2, 118.3, 124.3, 126.5, 128.4, 129.6, 131.9, 136.4, 141.3, 150.3, 152.4, 185.5.; HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺, 693.2124; found, 693.2135 (+1.1 mmu).

（８）化合物８（２−［２−（ｅ−メチルプロピル）チオメチル］ブロモベンゼン）の合成
文献（J. Org. Chem., 2000, 65 (3), 900-906.）に従って合成した。

（９）化合物９（ＰＡ ＲＯＳ）の合成

化合物８（５７０ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、−７８^ｏＣでｓｅｃ−ＢｕＬｉ（１．０Ｍヘキサン溶液）（１．６５ｍＬ、１．６５ｍｍ）を加え、１５分間攪拌した。これに化合物７（３８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解したものを加え、室温で１時間攪拌した。これに２Ｎ塩酸を加え、反応を終了させた。さらに２Ｎ塩酸（１５ｍＬ）とＣＨ_３ＣＮ（１０ｍＬ）を加え、１１５°Ｃで１９時間加熱還流した。反応液を室温に戻し、溶媒を減圧除去した後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、４０分；Ａ：Ｈ_２Ｏ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ＝８０／２０ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物９（１７ｍｇ、収率３８％）を得た。
¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ0.46 (s, 3H), 0.52 (s, 3H), 3.34 (s, 6H), 4.38 (s, 2H), 6.81 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 6.99 (dd, J = 8.8, 1.5 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.31-7.42 (m, 4H), 7.49 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 4H).

精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。(A/B = 70/30→0/100, 40 min; A: H₂O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H₂O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 250 nm).

HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺, 715.1427; found, 715.1425 (-0.2 mmu).

［実施例１］
合成したＰＡ ＲＯＳ（化合物９）がＨＣｌＯとの反応によりＨＣｌＯ依存的に光音響シグナルを放出するかの検討を行った。プローブ（１００μＭ）とＨＣｌＯ（６００μＭ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた溶液、プローブ（１００μＭ）のみを溶解させた溶液、及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）の３種の溶液を内径１ｍｍのシリコンチューブに注入し、光音響イメージングを行った。
図３Ａは、ＨＣｌＯ（６００μＭ）との反応前（左）と反応後（中央）でのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）の光音響イメージング、及びＰＢＳのみの光音響イメージング（右）を示す。
光音響イメージングは、６７１ｎｍのパルスレーザー（パルス幅：１５ｎｓ、パルス反復速度：１０ｋＨｚ、パルスエネルギー：１．０μＪ）及び超音波変換器（中央振動数：５ＭＨｚ）を用いて行った。
図３Ｂは、図３Ａの各々の光音響イメージング中の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度をイメージＪで計算した結果を示す。図３Ａの光音響イメージングの外側の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度は、バックグラウンドシグナルとして各光音響シグナルから差し引いた。
図３Ａ及び３Ｂで示されるように、ＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）とＨＣｌＯ（６００μＭ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に加えた溶液からは強い光音響シグナルが観察された一方、プローブのみを注入したシリコンチューブからの光音響シグナルはほとんど観察されなかった。よって、開発したプローブは、分子設計通りにＨＣｌＯとの反応で６７１ｎｍにおける吸収が回復し、ＨＣｌＯ依存的な光音響シグナルの大きな増大を示すことが分かる。

［実施例２］
ＰＡ ＲＯＳが様々なＲＯＳの中でＨＣｌＯを特異的に検出するかの検討を行った。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中においてＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）と様々なＲＯＳ（ＨＣｌＯ、ＨＯＮＯＯ、Ｈ_２Ｏ_２、ＯＨ・、Ｏ_２ ⁻、ＮＯ）を反応させ、それぞれの溶液をシリコンチューブに詰めその光音響シグナルの比較を行った。
図４Ａは、以下の様々なＲＯＳを添加した後の、ＰＢＳ（（ｐＨ７．４、共溶媒として１％ＤＭＳＯを含有）中のＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）の光音響イメージングを示す。ＲＯＳ：（ａ）ＮａＯＣｌ溶液（５００μＭ）、（ｂ）ペルオキシ亜硝酸ナトリウム溶液（５００μＭ）、（ｃ）Ｈ_２Ｏ_２（５００μＭ）、（ｄ）Ｈ_２Ｏ_２（５００μＭ）及びＦｅ（ＣｌＯ_４）_２（５００μＭ）（Ｆｅｎｔｏｎ反応がヒドロキシラジカルを生成）、（ｅ）ＫＯ_２（５００μＭ）、（ｆ）ＮＯＣ７（酸化窒素ドナー）（２５０μＭ）光音響イメージングは、６７１ｎｍのパルスレーザー（パルス幅：１５ｎｓ、パルス反復速度：１０ｋＨｚ、パルスエネルギー：２．０μＪ）及び超音波変換器（中央振動数：５ＭＨｚ）を用いて行った。また、図４Ｂは、図４Ａの各々の光音響イメージング中の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度をイメージＪで計算した結果を示す。図４Ａの光音響イメージングの外側の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度は、バックグラウンドシグナルとして各光音響シグナルから差し引いた。
図４Ａ及び４Ｂで示すように、ＰＡ ＲＯＳはＨＣｌＯに高い特異性を持って光音響シグナルの増大を示し、様々なＲＯＳの中でＨＣｌＯを特異的に検出することができることが分かった。

［実施例３］
ＰＡ ＲＯＳが酵素反応によって産生されるＨＣｌＯを検出できるかどうかの検討を行った。ＭＰＯは好中球に多く含まれる酵素であり、Ｈ_２Ｏ_２及びＣｌ⁻を基質としてＨＣｌＯを産生することが知られている（Biochemistry, 2006, 45, 8152-8262.）。ＰＡ ＲＯＳ（１００μＭ）を、ＭＰＯ（１００ｎＭ）及びＨ_２Ｏ_２（５００μＭ）を加えたＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に加えたところ強い光音響シグナルが検出された一方、基質であるＨ_２Ｏ_２非存在下においては光音響シグナルが検出されなかった。また、ＭＰＯの特異的阻害剤として知られる４−アミノ安息香酸ヒドラジド（Biochem. J., 1997, 321, 503-508.）（５０μＭ）の存在下では、光音響シグナルが大きく減少した（図５Ａ及び５Ｂ）。
光音響イメージングは、６７１ｎｍのパルスレーザー（パルス幅：１５ｎｓ、パルス反復速度：１０ｋＨｚ、パルスエネルギー：２．０μＪ）及び超音波変換器（中央振動数：５ＭＨｚ）を用いて行った。また、図５Ａの各々の光音響イメージング中の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度をイメージＪで計算した（図５Ｂ）。図５Ａの光音響イメージングの外側の四角で囲んだ領域の光音響シグナル強度は、バックグラウンドシグナルとして各光音響シグナルから差し引いた。
以上の結果から、ＰＡ ＲＯＳは酵素反応によって生じるＨＣｌＯを検出することができることが明らかとなった。

［実施例４］
マウス皮下においてＰＡ ＲＯＳを用いたＨＣｌＯ依存的な光音響イメージングが可能か検討を行った。イソフルランで麻酔をかけて眠らせたマウスに、２０μＬの生理食塩水に溶解したＰＡ ＲＯＳ（ｆｉｎａｌ：２００μＭ）をマウスの大腿部に皮下注射し、続いて２０μＬの生理食塩水に溶解したＨＣｌＯ（ｆｉｎａｌ：５００μＭ）を同じ場所に皮下注射した（図６Ａ及び６Ｂの左側の〇で囲んだ部分）。また、コントロールとして、ＰＡ ＲＯＳのみ（図６Ａの右側の〇で囲んだ部分）、およびＨＣｌＯのみ（図６Ｂの右側の〇で囲んだ部分）の皮下注射も行い、生きたマウスの皮下におけるＰＡ ＲＯＳの光音響イメージングを行った。
明視野像は注射直後に得られ、光音響イメージは注射後２０分して得られた。光音響イメージングは、６７１ｎｍのパルスレーザー（パルス幅：１５ｎｓ、パルス反復速度：１０ｋＨｚ、パルスエネルギー：１．０μＪ）及び超音波変換器（中央振動数：５ＭＨｚ）を用いて行った。
実験の結果、ＰＡ ＲＯＳ及びＨＣｌＯの両方を皮下注射した部位からのみ強い光音響シグナルが検出され、ＰＡ ＲＯＳのみ、及びＨＣｌＯのみを皮下注射した部位からは光音響シグナルが検出されなかったことから、実際にＰＡ ＲＯＳはマウス皮下においてＨＣｌＯ依存的な光音響イメージングが可能であることが明らかとなった。

以上の実験結果から、今回開発したＮ−ＰｈＳｉＲ類を母核とするＨＣｌＯ検出光音響プローブＰＡ ＲＯＳは、高い感度及び特異性を持ってＨＣｌＯを検出することが可能であり、無蛍光性であるＮ−ＰｈＳｉＲ類が既存の蛍光プローブの蛍光制御原理を光音響プローブへと応用可能な構造であることが示された。

Claims (12)

1. 以下の一般式（Ｉ）：
   

   

   （式中、
   Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる置換基を示し：
   Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、それぞれ独立に、水素、スルホ基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基、カルボキシ基、ヒドロキシ基又はチオール基から選択され；
   Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
   Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
   Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
   Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
   Ｒ^７及びＲ^９は、一緒になってＲ^７が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく；
   Ｒ^８及びＲ^１０は、一緒になってＲ^８が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく；
   ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、ＳＯ_２、Ｇｅ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、テルル原子又はセレン原子から選択され、
   ここで、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ^ｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
   ｙは、酸素原子、硫黄原子、ＮＲ、ＮＰｈ（ｏ−ＮＨ_２）、Ｃ＝Ｎ^＋＝Ｎ⁻、又はセレン原子から選択され、
   ここで、Ｒは、水素又は有機基を表し、Ｐｈはフェニル基を表し；
   ｗは、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基、Ｃ＝Ｏ、ＳＯ_２、又はＣ＝Ｓから選択され、
   ここで、ｗがＣ＝Ｏ、ＳＯ_２又はＣ＝Ｓの場合は、これらの基のＣ（炭素原子）又はＳ（硫黄原子）に、１又は２個の置換されていてもよいメチレン基、あるいは１つの置換されていてもよいエチレン基が結合して６又は７員環を形成してもよい；
   で表される化合物又はその塩。
2. Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基又はプロピル基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
3. Ｒ^７及びＲ^８は何れもメチル基である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
4. Ｒ^７及びＲ^９は、一緒になってＲ^７が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成しており、Ｒ^８及びＲ^１０は、一緒になってＲ^８が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していている、請求項１に記載の化合物又はその塩。
5. 前記ヘテロシクリルがピロリジンである、請求項４に記載の化合物又はその塩。
6. Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは何れもスルホ基である、請求項１〜５の何れか１項に記載の化合物又はその塩。
7. ｘがＳｉ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）である、請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物又はその塩。
8. ｙは硫黄原子であり、ｗは、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキレン基又はＣ＝Ｏである、請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物又はその塩。
9. ｗはメチレン基である、請求項８に記載の化合物又はその塩。
10. 請求項１〜９の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含有する光音響プローブ。
11. 請求項８又は９に記載の化合物又はその塩を含有するＨＣｌＯ検出光音響プローブ。
12. 請求項１０に記載の光音響プローブを用いる光音響イメージング方法であって、生体分子にプローブ分子を結合させ、これに光を照射して前記プローブ分子からの光音響シグナルを検出することを含む、前記方法。

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