JP2018086011A - 白血球溢出を低下させる幹細胞の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に、白血球溢出を低下させる因子を分泌する細胞によって炎症を低下させることに関する。具体的には、本発明は、血管内皮細胞における細胞接着分子の発現をダウンレギュレートする因子を分泌する細胞を使用する方法に関する。細胞接着分子の発現をダウンレギュレートさせると、溢出が低下するように、上記内皮細胞への白血球接着が低下する。最終結果は、炎症の低下である。従って、本発明は、所望でない炎症成分と関連する病的状態(心血管疾患を含む)を処置する方法を提供する。本発明はまた、上記細胞が内皮細胞における細胞接着分子の発現をダウンレギュレートする能力を調節する因子をスクリーニングするための創薬方法に関する。本発明はまた、被験体への投与のための細胞を提供するのに使用され得る細胞バンクに関し、上記バンクは、内皮細胞における細胞接着分子の発現をダウンレギュレートし、白血球接着および溢出を低下させることに関して、所望の効力を有する細胞を含む。本発明はまた、特定の所望の効力がある細胞を含む組成物に関する。本発明はまた、投与されるべき上記細胞の所望の効力を評価するためのアッセイを含む、上記細胞を投与する前に行われる診断法に関する。本発明はさらに、処置されている被験体に対する上記細胞の効果を評価するための処置後診断アッセイに関する。本発明はまた、薬学的組成物における所望の効力がある細胞に関する。上記細胞は、多能性特徴を有する、非胚性の非生殖細胞である。これらは、多能性のマーカーの発現および広い分化能を含み得る。
(炎症)
急性炎症のプロセスは、周辺組織への血漿タンパク質および白血球の滲出を許容するように変化する、損傷した組織に位置する血管によって開始される。上記組織への流体の増大した流れは、炎症と関連する特徴的な腫脹を引き起こす。上記血管は、顕著な血管変化(血管拡張、増大した透過性、および血流が遅くなること)を受け、これは、種々の炎症メディエーターの作用によって誘導される。血管の増大した透過性は、上記組織への血漿の移動をもたらし、血液内の上記細胞の濃度の増加に起因して、鬱血が生じる。鬱血は、上記組織への白血球の動員に重要なプロセスである、白血球が上記内皮に沿って辺縁趨向することを可能にする。正常の血流は、これを妨げる。なぜなら、上記血管の周辺に沿った剪断力が、上記血液中の細胞を上記血管の中央部へ移動させるからである。よって、上記変化は、血管を構成する上記内皮および基底膜を通過する白血球の溢出を可能にする。いったん組織中に入ると、上記細胞は、走化性勾配に沿って移動して、損傷部位に達する。上記損傷部位では、上記細胞は、刺激物を除去し、上記組織を修復しようとし得る。
(1)炎症部位に位置する内皮への白血球局在化および動員−上記内皮細胞への辺縁趨向および接着を含む:白血球の動員は、レセプター媒介性である。炎症の生成物(例えば、ヒスタミン)は、内皮細胞表面のP−セレクチンの急激な発現を促進する。このレセプターは、白血球表面の炭水化物リガンドには弱く結合し、上記白血球が、その結合が作られ、壊されるにつれて、上記内皮表面に沿って「ローリング」することを可能にする。損傷した細胞からのサイトカインは、内皮細胞上にE−セレクチンの発現を誘導し、E−セレクチンは、P−セレクチンと同様に機能する。サイトカインはまた、内皮細胞上にインテグリンリガンドの発現を誘導し、このことは、白血球をさらに減速させる。これら弱く結合した白血球は、損傷組織において生じたケモカインによって活性化されなければ、自由に脱着する。活性化は、上記内皮細胞表面のリガンドに対して結合したインテグリンレセプターの親和性を増大させ、上記白血球を上記内皮へしっかり結合させる。
病原体の認識および病原体による活性化の際に、罹患組織に常在するマクロファージは、サイトカイン(例えば、IL−1、TNF−αおよびケモカイン)を放出する。IL−1およびTNF−αは、感染部位近傍の血管の内皮細胞が細胞接着分子(セレクチンを含む)を発現するようにさせる。循環白血球は、ケモカインの存在に起因して、損傷の部位または感染の部位に向かって局在化する(localised)。
ベルクロ(velcro)と同様に、循環白血球上の炭水化物リガンドは、限界に近い親和性(marginal affinity)で上記血管の内壁上のセレクチン分子に結合する。このことは、白血球を減速させ、上記血管壁の内表面に沿ったローリングを開始させる。このローリング運動の間に、セレクチンとそれらのリガンドとの間で一時的な結合が形成され、破壊される。
同時に、マクロファージから放出されたケモカインは、上記ローリングしている白血球を活性化し、表面インテグリン分子をデフォルトの低親和性状態から、高い親和性状態へと切り替えさせる。これは、内皮細胞が放出するケモカインおよび可溶性因子によるインテグリンのジャクスタクリン活性化(juxtacrine activation)を介して補助される。活性化状態において、インテグリンは、内皮細胞上で発現された相補的レセプターに、高親和性で密に結合する。このことは、続いている血流の剪断力にも拘わらず、上記白血球の固定化を引き起こす。
上記白血球の細胞骨格は、上記内皮細胞の一面に上記白血球が拡がる様式で認識される。この形態において、白血球は偽足を伸ばし、内皮細胞の間の間隙を通って通過する。上記白血球の遊出は、上記白血球および内皮細胞の表面で見いだされるPECAMタンパク質が、相互作用し、上記細胞を上記内皮を通って効率的に通過させる場合におこる。上記白血球は、基底膜を分解するプロテアーゼを分泌し、このことは、上記白血球が上記血管から脱出することを可能にする(血管外遊出として公知のプロセス)。いったん間質液に入ると、白血球は、走化性勾配に沿って、損傷の部位または感染の部位に向かって移動する。
セレクチンは、組織マクロファージによる内皮細胞のサイトカイン活性化直後に発現される。活性化された内皮細胞は、最初に、P−セレクチン分子を発現するが、活性化後2時間以内に、E−セレクチン発現が優勢になる。内皮セレクチンは、白血球膜貫通糖タンパク質上の炭水化物(シアリル−LewisXを含む)と結合する。
細胞接着に関与するインテグリンは、主に白血球で発現される。ローリングしている白血球上のβ2インテグリンは、内皮細胞接着分子に結合し、細胞移動を停止させる。
溢出は、上記炎症性応答によって生成されるバックグラウンドサイトカイン環境によって調節され、それは特定の細胞抗原とは無関係である。最初の免疫応答において放出されるサイトカインは、血管拡張を誘導し、血管表面に沿った電気的変化を低くする。血流は遅くなり、分子間結合が促進される。
上記シアリルLewis xオリゴサッカリド決定基は、白血球のE−セレクチンおよびP−セレクチン媒介性接着に関する白血球カウンターレセプターの必須の成分である。このオリゴサッカリド分子は、顆粒球、単球、およびナチュラル・キラー細胞の表面に表される。これらセレクチンへの白血球接着の形成は、最終的に、白血球が血管樹を離れ、リンパ系組織および炎症部位へと動員されることを可能にするプロセスにおいて、初期の重要なステップである。Natsukaら, J.Biol.Chem.269:16789−16794(1994)およびSasakiら, J.Biol.Chem.269:14730−14737(1994)は、上記シアリルLewis x決定基を合成し得るヒト白血球α−1,3−フコシルトランスフェラーゼ、FUT7をコードするcDNAを単離した。
本発明は、概して、炎症を低下させる方法に関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
以下:
(1)白血球溢出を低下させる、(2)血管内皮または単離された内皮細胞への白血球接着を低下させる、(3)内皮細胞のサイトカイン媒介性活性化を低下させる、(4)内皮細胞での1種以上の細胞接着分子の発現を低下させる、のうちの1つ以上の所望の効力を有する細胞を得る方法であって、該方法は、
上記(1)〜(4)の効果のうちの1つ以上について所望の効力を有する細胞を評価し、選択する工程であって、該細胞は、oct4、テロメラーゼ、rex−1、またはrox−1のうちの1種以上を発現し、そして/または内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚葉のうちの少なくとも2種以上の細胞型へと分化し得る非胚性の非生殖細胞である、工程
を包含する、方法。
(項目2)
被験体における炎症を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、治療上有効な量においてかつ治療結果を達成するに十分な時間にわたって、項目1に記載の選択された細胞を投与する工程を包含する、方法。
(項目3)
細胞バンクを構築する方法であって、該方法は、項目1に記載の選択された細胞を、被験体への将来の投与のために、拡大しかつ保存する工程を包含する、方法。
(項目4)
創薬の方法であって、該方法は、項目1に記載の選択された細胞と、因子とを接触させて、該細胞が事象(1)〜(4)のうちのいずれかをもたらす能力に対する該因子の効果を評価する工程、を包含する、方法。
(項目5)
以下:
(1)白血球溢出を低下させる、(2)血管内皮または単離された内皮細胞への白血球接着を低下させる、(3)内皮細胞のサイトカイン媒介性活性化を低下させる、(4)内皮細胞での1種以上の細胞接着分子の発現を低下させる、のうちの1つ以上を達成するための所望の効力について評価されかつ選択された細胞を含む組成物であって、
該細胞は、oct4、テロメラーゼ、rex−1、またはrox−1のうちの1種以上を発現し、そして/または内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚葉のうちの少なくとも2種の細胞型へと分化し得る非胚性の非生殖細胞である、
組成物。
(項目6)
前記サイトカインは、TNF−αおよびIL−1からなる群より選択される、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
サイトカイン媒介性活性化は、前記内皮細胞において、E−セレクチン、P−セレクチン、VCAM−1、ICAM、およびVCAM−2のうちの1種以上の発現の増大を生じる、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記内皮細胞において発現が低下させられる前記細胞接着分子は、E−セレクチン、P−セレクチン、VCAM−1、ICAM、およびVCAM−2のうちの1種以上である、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
以下:
1)白血球溢出を低下させる、(2)血管内皮または単離された内皮細胞への白血球接着を低下させる、(3)内皮細胞のサイトカイン媒介性活性化を低下させる、(4)内皮細胞での1種以上の細胞接着分子の発現を低下させる、のうちの1つ以上をもたらすための細胞の効力を増大させる方法であって、該方法は、細胞と、IFN−γ、IL−1β、およびTNF−αとを接触させて、効果(1)〜(4)のうちの1つ以上を達成する細胞を産生する工程を包含し、該細胞は、oct4、テロメラーゼ、rex−1、またはrox−1のうちの1種以上を発現し、そして/または内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚葉のうちの少なくとも2種の細胞型へと分化し得る非胚性の非生殖細胞である、
方法。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、よって変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、開示される発明の範囲(これは、特許請求の範囲によってのみ規定される)を限定することは意図しない。
「1つの、ある(a)」または「1つの、ある(an)」とは、本明細書において1つのまたは1つより多いこと;少なくとも1つを意味する。複数形が本明細書において使用される場合、それは、一般に、単数形を含む。
本発明は、好ましくは、脊椎動物種(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、飼い慣らされた動物、家畜、および他の非ヒト哺乳動物)の幹細胞を使用して実施され得る。これらとしては、以下に記載される細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
もっともよく研究された幹細胞は、制限されない自己再生および多能性の分化能を有するような、胚性幹細胞(ESC)である。これら細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から得られるか、または着床後胚(胚性生殖細胞(embryonal germ cell)またはEG細胞)の原始生殖細胞から得られ得る。ES細胞およびEG細胞は、最初は、マウスから、後に、多くの異なる動物から、およびより近年では、非ヒト霊長類およびヒトからも得られるようになった。マウスの胚盤胞または他の動物の胚盤胞へ導入される場合、ESCは、上記動物の全ての組織に寄与し得る。ES細胞およびEG細胞は、SSEA1(マウス)およびSSEA4(ヒト)に対する抗体での陽性染色によって、同定され得る。例えば、米国特許第5,453,357号;同第5,656,479号;同第5,670,372号;同第5,843,780号;同第5,874,301号;同第5,914,268号;同第6,110,739号;同第6,190,910号;同第6,200,806号;同第6,432,711号;同第6,436,701号、同第6,500,668号;同第6,703,279号;同第6,875,607号;同第7,029,913号;同第7,112,437号;同第7,145,057号;同第7,153,684号;および同第7,294,508号(これらの各々は、胚性幹細胞、ならびに胚性幹細胞を作製し拡大する方法を教示するために参考として援用される)を参照のこと。よって、ESCおよびESCを単離し、拡大する方法は、当該分野で周知である。
幹細胞は、大部分の組織において同定されてきた。おそらく、最もよく特徴付けられたのは、造血幹細胞(HSC)である。HSCは、細胞表面マーカーおよび機能的特徴を使用して精製され得る中胚葉由来の細胞である。HSCは、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝臓、および卵黄嚢から単離されている。HSCは、造血を開始し、複数の造血系列を生成する。致死的に照射された動物に移植される場合、HSCは、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、およびリンパ系造血細胞プールを再生息させ得る。HSCはまた、いくらかの自己再生細胞分裂を経験するように誘導され得る。例えば、米国特許第5,635,387号;同第5,460,964号;同第5,677,136号;同第5,750,397号;同第5,681,599号;および同第5,716,827号を参照のこと。米国特許第5,192,553号は、ヒト新生児または胎児の造血幹細胞もしくは前駆細胞を単離する方法を報告する。米国特許第5,716,827号は、Thy−1+前駆体(progenitor)であるヒト造血細胞、およびそれらをインビトロで再生するための適切な増殖培地を報告する。米国特許第5,635,387号は、ヒト造血細胞およびそれらの前駆体(presursor)を培養する方法およびデバイスを報告する。米国特許第6,015,554号は、ヒトリンパ系細胞および樹状細胞を再構築する方法を記載する。よって、HSCおよびこれらを単離し、拡大する方法は、当該分野で周知である。
いくつかの異なるストラテジー(例えば、核移植、細胞融合、および培養誘導性再プログラミング)が、分化した細胞の胚性の状態への変換を誘導するために使用されてきた。核移入は、体細胞核を除核した卵母細胞に注射することを包含する。これは、代理母へ移入する際にクローン(「生殖クローニング)を生じ得るか、または培養での外植の際に、遺伝的にマッチした胚性幹(ES)細胞(「体細胞核移入」、SCNT)を生じ得る。体細胞とES細胞との細胞融合は、多能性ES細胞の全ての特徴を示すハイブリッドの生成を生じる。培養における体細胞の外植は、多能性または複能性(multipotent)であり得る不死細胞系を選択する。現在では、精原幹細胞は、出生後の動物に由来し得る多能性細胞の唯一の供給源である。規定された因子での体細胞の形質導入は、多能性状態への再プログラミングを開始し得る。これら実験的アプローチは、広範に検討されてきた(Hochedlinger and Jaenisch,Nature,441:1061−1067(2006)およびYamanaka,S.,Cell Stem Cell,1:39−49(2007))。
核移植(NT)はまた、体細胞核移入(SCNT)ともいわれ、ドナー体細胞由来の核を、除核した除核した卵母細胞(ogocyte)へと導入して、クローン化した動物(例えば、ヒツジのドリー)を生み出すことを表す(Wilmutら,Nature,385:810−813(1997)。NTによる生きた動物の発生は、安定である一方、最終まで分化した後生的状態を含む体細胞の後生的な状態が、不可逆的には固定されてはいないが、新たな生物の発生を指向し得る胚状態に再プログラムされ得ることを示した。胚の発生および疾患に関与する基本的な後生的機構を解明するための刺激的な実験的アプローチを提供することに加えて、核クローニング技術は、患者特異的移植医療のために潜在的に重要である。
未分化状態への体細胞核の後生的再プログラミングは、胚性細胞と体細胞との融合によって産生したマウスハイブリッドにおいて実証された。種々の体細胞と、胚性癌細胞(Solter,D.,Nat Rev Genet,7:319−327(2006)、胚性生殖細胞(EG)、またはES細胞(Zwaka and Thomson,Development,132:227−233(2005))との間のハイブリッドは、上記親の胚性細胞と多くの特徴を共有し、このことは、上記多能性の表現型が、このような融合生成物において優勢であることを示す。マウスのように(Tadaら,Curr Biol,11:1553−1558(2001))、ヒトES細胞は、融合後の体細胞核を再プログラムする能力を有する(Cowanら,Science,309:1369−1373(2005));Yuら,Science,318:1917−1920(2006))。サイレントな多能性マーカー(例えば、Oct4)の活性化または不活性な体細胞X染色体の再活性化は、上記ハイブリッド細胞において体細胞ゲノムの再プログラミングの分子的証拠を提供した。DNA複製は、多能性マーカーの活性化(これは、融合の2日後に最初に観察される)に必須であり(Do and Scholer,Stem Cells,22:941−949(2004))、ES細胞におけるNanogの強制された過剰発現が、神経幹細胞との融合のときに多能性を促進する(Silvaら,Nature,441:997−1001 (2006))ことが示唆された。
多能性細胞は、胚の供給源(例えば、卵割球および胚盤胞の上記内部細胞塊(ICM)(ES細胞)、原外胚葉(EpiSC細胞)、原始生殖細胞(EG細胞)、および出生後精原幹細胞(「maGSCsm」、「ES様」細胞)から得られてきた。以下の多能性細胞は、それらのドナー細胞/組織とともに、以下のとおりである:病的(parthogenetic)ES細胞は、マウス卵母細胞に由来する(Narasimhaら,Curr Biol,7:881−884(1997));胚性幹細胞は、卵割球に由来した(Wakayamaら,Stem Cells,25:986−993(2007));内部細胞塊(供給源は該当なし)(Egganら,Nature,428:44−49 (2004));胚性生殖細胞および胎児性癌細胞は、原始生殖細胞に由来した(Matsuiら,Cell,70:841−847(1992));GMCS、maSSC、およびMASCは、精原幹細胞に由来した(Guanら,Nature,440:1199−1203(2006);Kanatsu−Shinoharaら,Cell,119:1001−1012(2004);およびSeandelら,Nature,449:346−350(2007));EpiSC細胞は、原外胚葉に由来する(Bronsら,Nature,448:191−195(2007);Tesarら,Nature,448:196−199(2007));病的ES細胞は、ヒト卵母細胞に由来した(Cibelliら,Science,295L819(2002);Revazovaら,Cloning Stem Cells,9:432−449 (2007));ヒトES細胞は、ヒト胚盤胞に由来した(Thomsonら,Science,282:1145−1147(1998));MAPCは、骨髄に由来した(Jiangら,Nature,418:41−49(2002);Phinney and Prockop,Stem Cells,25:2896−2902(2007));臍帯血細胞(臍帯血に由来する)(van de Venら,Exp Hematol,35:1753−1765(2007));ニューロスフェア由来細胞は、神経細胞に由来した(Clarkeら,Science,288:1660−1663(2000))。生殖細胞系列(例えば、PGCまたは精原幹細胞)に由来するドナー細胞は、インビボで単能性であることが公知であるが、多能性ES様細胞(Kanatsu−Shinoharaら,Cell,119:1001−1012(2004)またはmaGSC(Guanら,Nature,440:1199−1203(2006)が、長期のインビトロ培養後に単離され得ることが示された。これら多能性細胞型の大部分は、インビトロで分化可能および奇形腫形成の能力があった一方で、ES、EG、EC、および精原幹細胞由来のmaGCSまたはES様細胞のみが、より厳しい基準によって多能性であった。なぜなら、それらは、出生後キメラを形成し、上記生殖系列に寄与できたからである。近年になって、複能性成体精原幹細胞(MASC)は、成体マウスの精巣の精原幹細胞から得られ、これら細胞は、ES細胞の発現プロフィールとは異なる(Seandelら,Nature,449:346−350(2007))が、着床後マウス胚の原外胚葉に由来するEpiSC細胞(Bronsら,Nature,448:191−195(2007);Tesarら,Nature,448:196−199(2007)))に類似の発現プロフィールを有した。
TakahashiおよびYamanakaは、ES様状態に戻した再プログラミングされた体細胞を報告した(Takahashi and Yamanaka,Cell,126:663−676(2006))。彼らは、マウス胚性線維芽細胞(MEF)および成体線維芽細胞を、4種の転写因子であるOct4、Sox2、c−myc、およびKlf4のウイルス媒介性形質導入、続いて、上記Oct4標的遺伝子Fbx15の活性化について選択した後に多能性ES様細胞へと成功裏に再プログラムした(図2A)。活性化したFbx15を有する細胞は、造り出されたiPS(人工多能性幹)細胞であり、奇形腫を形成する能力によって多能性であることが示されたが、それらは、生きたキメラを産生することはできなかった。この多能性の状態は、上記形質導入したOct4遺伝子およびSox2遺伝子の連続するウイルス発現に依存したのに対して、上記内因性Oct4遺伝子およびNanog遺伝子は、発現されなかったかまたはES細胞より低いレベルで発現されたかのいずれかであり、それらそれぞれのプロモーターは、大部分メチル化されていることが見出された。これは、上記Fbx15−iPS細胞が、ES細胞に対応しなかったが、再プログラミングの不完全な状態を表した可能性があるという結論と一致する。遺伝的実験は、Oct4およびSox2が、多能性には必須であることを確立した(Chambers and Smith,Oncogene,23:7150−7160(2004);Ivanonaら,Nature,442:5330538(2006);Masuiら,Nat Cell Biol,9:625−635(2007))が、再プログラミングにおける2種の癌遺伝子c−mycおよびKlf4の役割は、あまり明確ではない。これら癌遺伝子のうちのいくつかは、実際に、再プログラミングには重要ではない可能性がある。なぜなら、マウスおよびヒト両方のiPS細胞は、c−myc形質導入の非存在下で得られたが、効率は低かったからである(Nakagawaら,Nat Biotechnol,26:191−106(2008);Werningら,Nature,448:318−324(2008);Yuら,Science,318:1917−1920(2007))。
MAPCは、「複能性成体前駆細胞」(非ES、非EG、非生殖)の頭字語である。MAPCは、少なくとも2種の細胞型(例えば、3種全ての原始胚葉(外胚葉、中胚葉、および内胚葉)へと分化する能力を有する。ES細胞において見いだされた遺伝子は、MAPCにおいても見いだされ得る(例えば、テロメラーゼ、Oct 3/4、rex−1、rox−1、sox−2)。Oct 3/4(ヒトにおけるOct 3A)は、ES細胞および生殖細胞に特異的であるようである。MAPCは、MSCより原始前駆細胞集団を表す(Verfaillie,C.M.,Trends Cell Biol 12:502−8(2002)、Jahagirdar,B.N.ら,Exp Hematol,29:543−56(2001);Reyes,M. and C.M.Verfaillie,Ann N Y Acad Sci,938:231−233(2001);Jiang,Y.ら,Exp Hematol,30896−904(2002);および(Jiang,Y.ら,Nature,418:41−9.(2002))。
MAPC単離方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第7,015,037号および米国特許出願第10/467,963号を参照のこと。これらの方法は、MAPCの特徴付け(表現型)とともに、本明細書に参考として援用される。MAPCは、複数供給源(骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋肉、脳、肝臓、脊髄、血液または皮膚が挙げられるが、これらに限定されない)から単離され得る。従って、骨髄吸引物、脳生検または肝臓生検、および他の器官から得ること、ならびにこれら細胞において発現される(または発現されない)遺伝子に依存して(例えば、機能アッセイまたは形態アッセイ(例えば、上記参考の出願(本明細書に参考として援用される)において開示されているもの)によって)、当業者に利用可能な陽性選択または陰性選択の技術を使用して、上記細胞を単離することは可能である。
MAPCは、一般的な白血球抗原CD45も赤芽球特異的グリコホリン−A(Gly−A)も発現しない。上記細胞の混合集団を、Ficoll Hypaque分離に供した。次いで、上記細胞を、抗CD45抗体および抗Gly−A抗体を使用して陰性選択に供し、CD45+細胞およびGly−A+細胞の集団を除去し、次いで、残存する約0.1%の骨髄単核球を回収した。細胞をまた、フィブロネクチンコーティングしたウェルに播種し、2〜4週間にわたって下記のように培養して、CD45+細胞およびGly−A+細胞を除去した。接着性骨髄細胞の培養物において、多くの接着性間質細胞が、細胞倍加30回あたりで複製老化を経験し、細胞のより均質な集団が、拡大し続け、長いテロメアを維持する。
本明細書で記載される単離されたMAPCは、本明細書中および米国特許第7,015,037号(これら方法について参考として援用される)に開示される方法を使用して培養され得る。
さらなる実験において、MAPCが培養される密度は、約100細胞/cm2または約150細胞/cm2〜約10,000細胞/cm2(約200細胞/cm2〜約1500細胞/cm2〜約2000細胞/cm2を含む)まで変動し得る。上記密度は、種間で変動し得る。さらに、最適密度は、培養条件および細胞供給源に依存して変動し得る。培養条件および細胞の所定のセットについて最適な密度を決定することは、当業者の技術範囲内である。
以下に列挙した成分全てに関しては、米国特許第7,015,037号(これは、これら成分を教示するために参考として援用される)を参照のこと。
米国特許第7,015,037号は、薬学的処方物を教示するために参考として援用される。特定の実施形態において、上記細胞集団は、送達に適合した、および送達に適した(すなわち、生理学的に適合性の)組成物内に存在する。
これら組織へ投与するための技術は、当該分野で公知である。例えば、骨髄内注射は、細胞を、代表的には、後部腸骨稜の骨髄腔へ直接注射することを包含し得るが、腸骨稜、大腿骨、脛骨、上腕骨、または尺骨における他の部位を含み得る;脾臓注射は、脾臓へのラジオグラフィーでガイドした注射、または腹腔鏡法または開腹術を介した脾臓の外科的曝露を含み得る;パイエル板、GALT、またはBALTへの注射は、開腹術または腹腔鏡下注射手順を要し得る。
ヒトまたは他の哺乳動物に対する用量は、当業者によって、過度の実験なくして、本開示、本明細書で引用された文書、および当該分野での知識から決定され得る。本発明の種々の実施形態に従って使用されるのに適した細胞/媒体の用量は、多くの要因に依存する。一次治療および補助的治療のために投与されるべき最適用量を決定するパラメーターは、一般に、以下のうちのいくつかまたは全てを含む:処置される疾患およびその病期;被験体の種、被験体の健康状態、性別、年齢、体重、および代謝速度;被験体の免疫応答性;施されている他の治療;ならびに上記被験体の病歴または遺伝子型から予期される潜在的合併症。上記パラメーターとしてはまた、以下が挙げられ得る:上記細胞が、同系であるのか、自己由来であるのか、同種異系であるのか、または異種であるのか;それらの効力(比活性);有効であるように、上記細胞/媒体について標的化されなければならない部位および/または分布;ならびにこのような上記部位の特徴(例えば、細胞/媒体への接近可能性および/または細胞の移植)。さらなるパラメーターとしては、他の因子(例えば、増殖因子およびサイトカイン)との同時投与が挙げられる。所定の状況における最適な用量はまた、上記細胞/媒体が処方される方法、それらが投与される方法、および上記細胞/媒体が、投与後の標的部位において局在化する程度を考慮に入れる。
本発明の細胞は、本願において記載される種々の生物学的機構を介して最終的に炎症を低下させる1種以上の因子を分泌するので、上記細胞の投与は、上記に列挙されるように、任意の数の病状における、望ましくない炎症を低下させるのに有用である。
1.MAPCと共培養した後、またはMAPCに由来する馴化培地とともにインキュベートした後に、接着分子の存在を試験するための内皮細胞のFACS分析
2.MAPCとの内皮細胞共培養物に、またはMAPCに由来する馴化培地とともにインキュベートした内皮細胞共培養物に結合する好中球の定量
3.MAPCと共培養後、またはMAPCに由来する馴化培地と共にインキュベートした後に、プロモーターベースのシステムを使用するNF−kB活性の定量
4.内皮層を、MAPCとともに共培養したか、またはMAPCに由来する馴化培地とともにインキュベートした後に、ECISベースのシステムまたは類似のシステムを使用する、内皮層を介した白血球溢出の定量。
本発明はまた、本明細書に記載される効果(すなわち、炎症、溢出、接着、内皮活性化の低下など)のうちのいずれかを達成するための特定の効力を有する細胞集団に関する。上記のように、これら集団は、所望の効力を有する細胞を選択することによって確立される。これら集団は、他の組成物(例えば、特定の効力を有する集団を含む細胞バンク、および特定の所望の効力を有する細胞集団を含む薬学的組成物)を作製するために使用される。
MultiStem(登録商標)は、この実施例に記載される実験手順において使用されるMAPC細胞調製物の商標化された名称である。
(原理/バックグラウンド)
炎症部位への免疫細胞の局在化は、損傷および感染に対する免疫応答の重要な一部である。炎症に応答して、白血球、リンパ球および単球を含む免疫細胞は、内皮細胞層に結合し、これを横断して損傷部位へと遊出する1、2。内皮細胞は、トロンビン、ヒスタミン、炎症性サイトカイン(例えば、TNF−α、インターロイキン1β)および酸素ラジカルによって活性化され得、これは、E−セレクチン、V−CAMおよびI−CAM−1を含む接着分子のアップレギュレーションをもたらす3-5。内皮細胞の細胞表面の細胞接着分子のアップレギュレーションは、活性化免疫細胞が、接着し、ローリングし、内皮細胞バリアを横断して遊出することを可能にする4。
(細胞培養)
ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)を、Lonza(Walkersville,MD, http://www.lonza.com)から購入し、製造業者の指示に従って、Lonzaの内皮増殖培地−2(EGM−2)を使用して、継代7まで培養した。ヒト肺微小血管内皮細胞(HPMEC)を、ScienCell(Carlsbad,CA,www.sciencellonline.com)から購入し、製造業者の指示に従って、ScienCellの内皮細胞培地(ECM)を使用して、継代4まで培養した。ヒト間葉性幹細胞(MSC)をLonzaから購入し、製造業者の指示に従って、Lonzaの間葉性幹細胞増殖培地(MSCGM)を使用して、継代6まで培養した。ヒトMultiStemを、記載されるように培養した18。
HAECまたはHPMECのいずれかを、6ウェルの0.4μm膜トランスウェルプレート(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA, http://www.fishersci.com)の底に、1×105細胞/cm2で、それらそれぞれの増殖培地中に播種し、加湿5% CO2、37℃雰囲気中、3日間にわたってインキュベートした。上記培地を吸引し、上記細胞をPBSですすいだ。2mlのMultiStem(登録商標)培地をウェル毎に添加し、1:1、1:4、1:10、または1:20(HAEC:MultiStem)を含む挿入物を添加した。1mlのMultiStem培地におけるMultiStemを、上記ウェル中に配置した。10ng/mlの、Sigma−Aldrich(St.Louis,MO, http://www.sigmaaldrich.com)の組換えヒト腫瘍壊死因子α(rhTNFα)を各ウェルに添加した。内皮細胞単独(−rhTNFα)、内皮細胞単独+10ng/ml rhTNFα、および1:1共培養物(−rhTNFα)からなるコントロールもまた設定した。コントロールを、3ml MultiStem培地中で行った。次いで、上記サンプルを、加湿5% CO2、37℃雰囲気中で3日間にわたってインキュベートした。あるいは、MSCおよびMSCGMを、比較研究のために、MultiStemおよびMultiStem培地の代わりに使用した。上記アッセイをまた、rhTNFαの代わりにSigma−Aldrichの10ng/ml 組換えヒトインターロイキン1β(rhIL−1β)を使用して行った。
細胞を、50/50 PBS/酵素フリー(Millipore,Billerica,MA,http://www.millipore.com)を使用して6ウェルプレートから剥がし、1600rpmで5分間にわたって遠心分離し、600μlのPBS中に再懸濁した。各サンプルを、フローサイトメトリー染色のために3本のチューブに等分した。上記細胞を、BD Pharmingen(San Jose,CA, http://www.bdbiosciences.com)のCD106 FITC結合体化(V−CAM1)、 CD54 PE結合体化(I−CAM1)、またはCD62E PE結合体化(E−セレクチン)のいずれかに対する抗体20μlと40分間にわたって4℃で暗所にてインキュベートした。さらに、アイソタイプコントロールを、FITCマウスIgG1κまたはPEマウスIgG1κ(BD Pharmingen)を使用して行った。上記細胞を、2mlのPBSで洗浄し、1600rpmにおいて5分間にわたって遠心分離した。その上清を廃棄し、上記細胞を、200μlのPBS+1% パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA, http://www.electronmicroscopysciences.com)中に再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、488nmアルゴンレーザーを備えたFACSVantage SEフローサイトメーター(Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose,California)で実施した。PE(FL2)蛍光からの放射を、585/42バンドパスフィルタを用いて検出した。データ取得および分析は、CellQuestTMソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して行った。
12mm顕微鏡用カバーグラス(Fisher Scientific)を、共培養アッセイのために上記HAECを播種する前に、上記6ウェルトランスウェルプレートの底に配置した。上記細胞を、10% ロバ血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA, http://www.jacksonimmuno.com)で室温において1時間にわたってブロッキングし、続いて、1:50希釈のマウス抗ヒトE−セレクチンモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,http://www.scbt.com)とともに4℃で穏やかに振盪しながら一晩インキュベートした。次いで、上記細胞を、5分間にわたって4回、各々PBS−Tで洗浄し、続いて、1:400希釈のロバ抗マウスAlexaFluor 488(Invitrogen,Carlsbad,CA,http://www.invitrogen.com)で室温において1時間にわたってインキュベートした。次いで、上記細胞を、PBS−Tで各々5分間にわたって4回洗浄した。Leica顕微鏡(Leica,Microsystems,Bannockburn,IL,http://www.leica−microsystems.com)、OptronicsカメラおよびMagnafireソフトウェア(Optronics,Goleta,CA,http://www.optronics.com)を使用して、100×倍率において画像を得た。
上記培地を、上記共培養アッセイ後に回収し、2倍希釈したサンプルを、製造業者の指示に従って、可溶性E−セレクチン(R&D Systems,Minneapolis,MN, http://www.rndsystems.com)についてのELISAで使用した。
細胞を、0.25% トリプシン−EDTA(Invitrogen)を使用して上記6ウェルトランスウェルプレートから剥がし、遠心分離し、1.8ml 溶解緩衝液中に再懸濁した。RNAを、製造業者の指示に従って、Absolutely RNA Miniprepキット(Stratagene,La Jolla,CA,http://www.stratagene.com)を使用して抽出した。上記RNAを、65μlの提供された溶出緩衝液中に溶出した。RT−PCRを、100pmol ランダムプライマー(Promega,Madison,WI,http://www.promega.com)を使用して行った。RT陽性およびRT陰性、ならびに水を、96ウェルプレートで実施した。
好中球を、健康なボランティアの末梢血から単離した。単離後、好中球を、LPS(0.1μg/ml)を37℃において10分間添加することによって、10分間にわたって活性化した。HAECを、上記のように72時間にわたって、TNF−α、MultiStemまたはMSCとともに、またはそれらなしでインキュベートした。次いで、上記培地を除去し、上記細胞を洗浄し、次いで、内皮細胞を、活性化した好中球とともに1分間にわたってインキュベートした。次いで、上記内皮細胞を、PBSで4回洗浄して、いかなる結合していない好中球をも除去した。複数回の洗浄後に、内皮細胞に結合している好中球を、顕微鏡検査し(20×対物レンズ)、写真撮影した。上記内皮層に結合した好中球を、各視野において計数した。各条件を3連で行い、1ウェルあたり3視野を写真撮影した。
細胞調製−細胞中者の各日に、MultiStemを融解し、生存能について試験した。90%超の生存能を示す細胞を、PBS中に、5000万細胞/mLで再懸濁した。以前の融解実験から、MultiStem細胞が、最大8時間にわたってこれら条件下で95%超生存のままであることが示された。
統計分析を、適宜p<0.05を統計的に有意として受容したスチューデントT検定または事後分析を伴うANOVAを用いて行った。エラーバーは、標準偏差として表される。
(MultiStemは、活性化の際に細胞接着分子のアップレギュレーションを妨げる)
接着分子の発現は、炎症性サイトカイン(例えば、TNF−α)への曝露の際に、内皮細胞の細胞表面で劇的に増加する。MultiStemがこの応答を調節するか否かを試験するために、MultiStemを、ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)と、TNF−αの存在下または非存在下で3日間にわたってトランスウェル中で共培養した。その後、E−セレクチン、V−CAMおよびI−CAMの細胞表面発現を、FACs分析または免疫染色によって測定した(図1A)。72時間後に、TNF−αは、非活性化コントロールと比較して、MultiStemの非存在下において3種全てのマーカーの高レベルを誘導した。しかし、本発明者らは、MultiStemの存在下で、E−セレクチン(図1B)(p=0.0149)およびV−CAM(p=0.0037)の表面発現を有する細胞数が、有意に低下することを見いだした(図1B)。さらに、I−CAMの細胞表面発現のレベルは、MultiStemの最高用量において低下した(p=0.001)(図1C)。MultiStemによる細胞表面接着分子のアップレギュレーションの調節は、細胞用量依存性であり、MultiStemの濃度が減少するにつれて低下し、異なるドナーに由来するMultiStemで再現性がある(データは示さず)。この効果がTNF−αに特異的であったのか否かを調べるために、この実験を、インターロイキン1β(Il−1β)を使用して反復した。TNF−αでの結果と同様に、MultiStemとの共培養は、Il−1βで活性化した場合にコントロールと比較して細胞表面への接着分子(E−セレクチン、V−CAMおよびI−CAM)のアップレギュレーションを阻害した(図2B)。
MultiStemが接着分子(例えば、E−セレクチン)の細胞表面発現を減少させ得る1つの考えられる機構は、上記細胞表面からのそれら分子の切断を増大させることである。上記細胞表面からの接着分子の切断は、メタロプロテアーゼ(例えば、TACE/ADAM17)を含む異なるプロテアーゼによって媒介される。以前の研究から、可溶性接着分子が病的であり得、好中球活性化に寄与し得ることが示唆された19、20。MultiStemでの処置を、これがE−セレクチン表面脱落を増大させることによってE−セレクチン表面発現を減少させるかどうかを決定するために試験した。MultiStemの存在下または非存在下で内皮細胞によって馴化培地へと分泌された可溶性E−セレクチンのレベルを、ELISAによって測定した。HAECまたはHPMECSのいずれかとのMultiStemの共培養物から回収された馴化培地中では、sE−セレクチン濃度において増大は見いだされなかった(図3A,データは示さず)。逆に、可溶性E−セレクチンの減少が、最高の比でMultiStemと共培養したTNF−α活性化HAEC(p<0.001)およびHPMEC(p<0.001)に由来する培地中で見いだされた。このことは、E−セレクチンの表面発現の減少が、可溶性E−セレクチンの脱落におけるその後の低下とともに、減少した表面発現の結果であることを示唆する(図3A)。従って、E−セレクチンの表面発現における減少は、上記細胞表面からのこの分子の切断の増大に起因せず、このことは、内皮細胞の表面での細胞接着分子の減少が、これら分子のタンパク質分解切断の結果ではないことを意味する。
他の骨髄由来幹細胞はまた、T細胞増殖を妨げ、ナチュラル・キラー細胞機能を抑制し、免疫障害(例えば、クローン病および動物モデルにおけるGVHD)を調節することによって免疫機能を調節することが示されている。内皮細胞活性化に対するMultiStemの免疫調節効果がまた、他の幹細胞系によって生成されるかどうかを評価するために、内皮細胞を、TNF−αの存在下で72時間にわたってMSCと共培養し、その後、細胞接着分子の細胞表面発現を試験した。驚くべきことに、TNF−α誘導性の内皮細胞接着分子の表面発現は、未処理コントロールと比較して、MSCの存在下で変化しないのに対して、MultiStemは、接着分子発現を有意に低下させる(図4A〜C)。E−セレクチン表面発現の僅かな減少は、最高用量においてMSCで認められたが、この変化は、MultiStemの存在下で認められた低下より有意に小さかった(図4A)。従って、MSCは、TNF−αによる接着分子のアップレギュレーションを調節しない。これら結果は、MultiStemが、MSCからの機能的に異なる分泌プロフィールを有し、このことは、それらの生物学的活性の差異を反映していることを示す。
内皮細胞の細胞表面の細胞接着分子のアップレギュレーションは、免疫細胞(例えば、好中球)のローリングおよびしっかりとした接着にとって重要であることが示されている4。MultiStemによる上記細胞表面への接着分子のアップレギュレーションの調節が、内皮細胞への好中球結合に影響を与えるに十分であるかどうかを決定するために、MultiStem処理した内皮細胞への好中球結合を、未処理の内皮細胞と比較した。内皮細胞を、コンフルエントな単層へと増殖させ、MultiStemの存在下または非存在下で、TNF−αで72時間にわたって処理した。好中球を、少なくとも2名の異なるドナーから単離し、LPS(0.1μg/ml)の添加によって活性化し、1分間にわたって内皮細胞とインキュベートした。複数回の洗浄後、内皮細胞および好中球の結合を、顕微鏡検査し(10×対物レンズ)、写真撮影した。上記内皮層に結合した好中球を、各視野で計数した(図5A)。ごく低レベルの活性化されたまたは活性化されていない好中球は、活性化されていない内皮細胞に結合した。しかし、TNF−αで活性化すると、有意な増大が、予測されるように、結合した好中球において認められた(図5B)。内皮細胞を、MultiStemと予備インキュベートした場合、好中球結合は、有意に低下した(p<0.0001)。これら結果は、内皮細胞での接着分子発現の変化が、好中球への内皮細胞層の結合特性を変化させるに十分であることを実証する。対照的に、上記TNF−α活性化の間のMSCと上記内皮細胞との共培養は、好中球結合を変化させなかった。さらに、TNF−αにより活性化された内皮細胞が、単独で、またはMSCとの共培養において好中球に曝された場合、より長く薄い細胞型へと内皮細胞形態が顕著に変化し、細胞−細胞接触が減少した(図5C)。TNF−α活性化した場合にMultiStemと共培養した内皮細胞において、上記細胞形態は、それほど変化せず、細胞−細胞接触は、維持される。これらデータは、MultiStemが活性化された内皮細胞を機能的に変化させることを示唆する。従って、MultiStemを、これがインビボでの好中球移動に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために試験した。
以前の動物研究から、直接の左前下行枝結紮によって誘導された心筋梗塞後の梗塞周辺部位へのMultiStemの直接注射が、改善された心機能を生じることが示されている14、15。この報告における結果は、MultiStemが、TNF−αの存在下で、接着分子(E−セレクチン、V−CAMおよびI−CAM)の細胞表面発現をダウンレギュレートし得ることを示す。これら分子は、上記内皮を介した好中球接着および溢出に重要である。虚血後の心臓への好中球浸潤は、有害であり得かつ虚血傷害後の心機能の低下を生じ得る10、11ので、MultiStem処置後の心機能における改善は、一部は、低下した炎症およびAMI後の梗塞周辺領域への好中球浸潤に起因するとの仮説が立てられた。この仮説を試験するために、心臓に存在する好中球のレベルを、ラットにおいて心筋梗塞誘導後に調べた。
この研究において、MultiStemを、これが炎症刺激に応じて内皮細胞の活性化を調節し得るかどうかを決定するために試験した。MultiStemは、大規模に拡大した臨床グレードの複能性始原細胞(MAPC)である。その結果は、大動脈および肺両方の内皮細胞が、未処置コントロールと比較して、MultiStemと共培養したとき、TNF−αまたはIL−1βで活性化された場合に接着分子(E−セレクチン、V−CAMおよびI−CAM)の細胞表面発現を低下させたことを示す。さらに、上記実験は、E−セレクチン発現の減少が、上記細胞表面からのこの分子の低下脱落に起因しないことを実証する。むしろ、V−CAM、E−セレクチンおよびI−CAMのmRNA発現は、TNF−α処理内皮細胞単独と比較して低下しており、このことは、MultiStemが、炎症シグナルに応じてこれらタンパク質の転写の増大を調節していることを示唆する。さらに、活性化された内皮細胞への好中球接着がまた、内皮細胞がTNF−α活性化の間にMultiStemとインキュベートされた場合に減少することを観察した。これら変化がインビボで関連するかどうかを調べるために、MultiStemでの処置を試験して、上記処置が、虚血傷害後の炎症を調節するかどうかを決定した。実際には、好中球浸潤は、ビヒクルコントロールと比較して、ラットにおいてAMIの3日後に、MultiStem処置動物における梗塞周辺において低下した。
(ダウンレギュレーションに関して増大する効力)
上記内皮細胞アッセイは、MultiStemと活性化された内皮細胞または活性化されたT細胞との共培養を模倣する、MultiStemの処置レジメンを同定するために使用されてきた。以前に、本発明者らは、MultiStemと活性化された内皮細胞との共培養が、上記内皮細胞アッセイにおけるMultiStemの抗炎症活性を誘導するために必要とされる(E−セレクチン、I−CAMおよびV−CAMのダウンレギュレーション)ことを見いだした。言い換えると、通常の培養条件下で増殖したMultiStemから回収された馴化培地は、TNF−aまたはサイトミックス(cytomix)での活性化後に、内皮細胞接着分子をダウンレギュレートするには不十分であった。しかし、本発明者らは、MultiStemを3日間にわたって「サイトミックス」(TNF−α、インターフェロン−γおよびインターロイキン1βが各々10ng/mlの混合物)で処理した実験を行った。本発明者らは、その後、この処理後のMultiStemから上記馴化培地を回収した。次いで、この馴化培地を、上記内皮細胞アッセイにおいてMultiStemの代替物として使用した(TNF−aまたはサイトミックスのいずれかで活性化した内皮細胞に、この馴化培地を添加し、2日または3日間培養した)。本発明者らは、馴化していない基礎培地または通常の条件下で培養したMultiStemから集めた培地とは異なり、この「サイトミックス」処理培地は、内皮細胞接着分子のアップレギュレーションを妨げるに十分であることを見いだした。この培地は、MultiStemと上記活性化された内皮細胞との共培養物の代わりとなり得た。本発明者らは、その後、この培地を利用して、この培地がT細胞増殖アッセイにおいてMultiStemとT細胞との共培養物の代わりにし得るかどうかを試験し、未処理MultiStemからの馴化培地とは異なり、それがCD3/CD28によって誘導されるT細胞増殖を妨げるに十分であることを見いだした。
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