JP2018082697A - 向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属微生物、それを利用してセルロースを生産する方法、及び該微生物を製造する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属微生物を提供する。【解決手段】向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物であって、前記微生物は、ホスホフルクトースキナーゼ（ＰＦＫ）活性を増加させる遺伝的改変を含む、微生物。【選択図】図３

Description

本発明は、向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属微生物、それを利用してセルロースを生産する方法、及び前記微生物を製造する方法に関する。

微生物培養を介して作られたセルロースは、グルコースが、β−１，４グルカンという一次構造で存在し、それらが、いくつかの鎖のフィブリル（ｆｉｂｒｉｌ）の網状構造をなしている。このようなセルロースを「バイオセルロース」あるいは「微生物セルロース」ともいう。

かような微生物セルロースは、植物セルロースと異なり、リグニンやヘミセルロースが全くない純粋なセルロース状態であり、纎維幅も１００ｎｍ以下であり、植物セルロースと比べて湿潤性、吸水性、高強度、高弾力性、高耐熱などの特性を有している。かような特性のために、微生物セルロースは、化粧品、医療用品、食物纎維、音響機器振動板、機能性フィルムなどの多様な産業に応用されて開発されている。

微生物セルロース生産菌株としては、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）またはサルシナ（Ｓａｒｃｉｎａ）が報告されており、そのうち、特に優秀な菌株としては、コマガタエイバクター・キシリナス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）（「グルコンアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）」ともいう）が知られている。好気的条件で静置培養すれば、培養液表面に薄膜形態として、三次元網状組織のセルロースが形成される。

ホスホフルクトースキナーゼ（ＰＦＫ：ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｓｅ ｋｉｎａｓｅ）は、その反応において、フルクトース−６−ホスフェートをリン酸化させ、フルクトース−１，６−ビスホスフェート（ＦＢＰ）に変換させるタンパク質である。該ＰＦＫは、その反応において、核心的に調節的な役割を果たす。該ＰＦＫは、ＡＴＰによって、アロステリックに阻害され、ＡＭＰによって、アロステリックに活性化される。それは、その反応が進められるとき、細胞がエネルギーを要求するということを示す。該ＰＦＫは、バクテリア及び哺乳動物においては、ホモテトラマーとして、及び酵母においては、オクタマーとして存在すると知られている。

セルロース生産菌株に多様な変異を誘導し、セルロース生産能を向上させる研究が進められているが、前述の従来技術にもかかわらず、向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物への要求がある。

本発明の一態様は、向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属微生物を提供することである。

本発明の他の態様は、前記微生物を利用して、セルロースを生産する方法を提供することである。

本発明の他の態様は、前記微生物を製造する方法を提供することである。

前記課題を解決するために、本発明は、向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物であって、前記微生物は、ホスホフルクトースキナーゼ（ＰＦＫ）活性を増加させる遺伝的改変を含む、微生物を提供する。

前記課題を解決するために、本発明はまた、向上したセルロース生産能を有し、ホスホフルクトースキナーゼ活性を増加させる遺伝的改変を含むコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物を培地中で培養して、セルロースを生成する段階と、培養物から前記セルロースを回収する段階と、を含む、セルロースを生産する方法を提供する。

前記課題を解決するために、本発明はまた、コマガタエイバクター属微生物に、ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子を導入する段階を含む、セルロース生産能が向上した微生物を製造する方法を提供する。

ｐｆｋＡ遺伝子が導入されたＫ．キシリナス（ｘｙｌｉｎｕｓ）菌株のセルロースナノ纎維（ＣＮＦ：ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｎａｎｏｆｉｂｅｒ）生産量を示したグラフである。 ｐｆｋＡ遺伝子が導入されたＫ．キシリナス（ｘｙｌｉｎｕｓ）菌株のＣＮＦ収率を示したグラフである。 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ：ｃａｒｂｏｘｙ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）未添加培地において、発酵中のｐｆｋＡ遺伝子が導入されたＫ．ｘｙｌｉｎｕｓ菌株のＣＮＦ生産量及びその収率を示したグラフである。 ＣＭＣ添加培地において、発酵中のｐｆｋＡ遺伝子が導入されたＫ．キシリナス（ｘｙｌｉｎｕｓ）菌株のＣＮＦ生産量及びその収率を示したグラフである。

本明細書で使用される用語「活性増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、または「増加した活性（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、細胞、タンパク質または酵素の活性検出可能な増加を示すであろう。「活性増加」、または「増加した活性」は、与えられた遺伝的改変（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を有さない細胞、タンパク質または酵素（例：起源または「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」の細胞、タンパク質または酵素）のような、同一タイプの比較細胞、タンパク質または酵素の活性レベルよりさらに高い改変された（例：遺伝的に操作された）細胞、タンパク質または酵素の活性レベルを示すであろう。「細胞の活性」とは、細胞の特定タンパク質または酵素の活性を示すであろう。例えば、前記改変されたまたは操作された細胞の活性は、同一タイプの操作されていない細胞または親細胞、すなわち野生型細胞の特定タンパク質または酵素の活性より、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上または約１００％以上向上されうる。タンパク質または酵素の増加した活性を有する細胞は、当業界にて公知である任意の方法を使用することにより確認されうる。

酵素またはポリペプチドの活性増加は、発現増加または比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）増加によって得ることができる。前記発現増加は、酵素またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されたり、そのコピー数が増加したりすること、あるいは前記ポリヌクレオチドの調節領域の変異に起因する。遺伝子が導入される微生物は、内因的に遺伝子を含むもの、または含んでいないものであり得る。前記遺伝子は、その発現を可能とする調節配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化部位、またはその組み合わせと作動可能に連結されたものでありうる。外部から導入されたまたはコピー数が増加されたポリヌクレオチドは、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）または外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）でありうる。前記内因性遺伝子は、微生物内部に含まれる遺伝物質上に存在する遺伝子をいう。前記外因性遺伝子は、外部から細胞内に導入される遺伝子を意味し、導入される遺伝子は、導入される宿主細胞に対して、同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）でありうる。「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、天然（ｎａｔｉｖｅ）ではない外因性（ｆｏｒｅｉｇｎ）を意味する。

用語「コピー数増加（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｅ）」は、遺伝子の導入または増幅によるものでもあり、操作されていない細胞に存在しない遺伝子を、遺伝的操作によって有することになる場合も含む。前記遺伝子の導入は、ベクターのような運搬体を媒介してなされうる。前記導入は、遺伝子がゲノムに統合されていない臨時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）導入や、ゲノムに挿入される導入でありうる。前記導入は、例えば、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを、細胞に導入した後、前記ベクターが細胞内で複製されるか、あるいは前記ポリヌクレオチドがゲノムに統合されることによってなされうる。

前記遺伝子の導入は、形質転換、形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）のような公知方法によってもなされうる。遺伝子は、運搬体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を介して導入されるか、あるいはそのまま導入される。本明細書において「運搬体」とは、連結されている他の核酸を伝達することができる核酸分子を含む。特定遺伝子の導入を媒介するヌクレオチド配列という観点において、本明細書において運搬体は、ベクター、核酸構造体及びカセットと相互交換可能に使用されると解釈される。ベクターには、例えば、プラスミド由来またはウィルス由来のベクターなどが含まれる。プラスミドとは、追加のＤＮＡが連結される円形の二本鎖ＤＮＡ環を含む。ベクターには、例えば、プラスミド発現ベクター、ウィルス発現ベクター、例えば、複製欠陥レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルス、またはその組み合わせが含まれてもよい。

本明細書で使用される遺伝子の操作は、当業界にて公知である分子生物学的方法で行うことができる。

用語「親細胞（ｐａｒｅｎｔ ｃｅｌｌ）」は、起源細胞（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｅｌｌ）、例えば、操作された微生物に対して、同一タイプの、遺伝的に操作されていない細胞を示す。特定の遺伝的改変に関して、前記「親細胞」は、特定の遺伝的改変を有さない細胞であるが、他の点については、同一である。従って、前記親細胞は、与えられたタンパク質（例えば、ホスホフルクトースキナーゼと約９０％以上の配列同一性を有するタンパク質）の増加した活性を有する、遺伝的に操作された微生物を製造するために、出発物質（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）として使用された細胞でありうる。さらに説明すれば、ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子が、遺伝的に改変され、細胞内でホスホフルクトースキナーゼ活性が向上した微生物に対して、前記親細胞は、遺伝的に改変されていない微生物でありうる。同一の比較が、他の遺伝的改変にも適用される。
本明細書で使用される用語「遺伝子」は、特定タンパク質をコードする核酸断片を意味し、５’−ノンコーディング配列（５’−ｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び／または３’−ノンコーディング配列（３’−ｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでもよく、あるいは含まなくてもよい。

本明細書において、核酸またはポリペプチドの「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、特定の比較可能な領域において、両配列を最大限一致するように整列させた後、配列の塩基またはアミノ酸残基間の同一性の程度を意味する。配列同一性は、特定の比較可能な領域において、２個の配列を最適に整列して比較することによって測定される値であり、比較可能な領域内において配列の一部は、参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と比較し、付加または削除されうる。配列同一性のパーセンテージは、例えば、比較可能な領域全体において、２つの最適に整列された配列を比較する段階、２つの最適に整列された配列において、同一のアミノ酸またはヌクレオチドが示される位置の数を決定し、一致した（ｍａｔｃｈｅｄ）位置の数を得る段階、前記一致した位置の数を比較可能な範囲内の位置の総数（すなわち、範囲サイズ）で除する段階、及び除算の結果に１００を乗じ、配列同一性のパーセンテージを得る段階によって計算されうる。配列同一性のパーセントは、公知の配列比較プログラムを使用しても決定され、前記プログラムの一例として、ＢＬＡＳＴＮ（ＮＣＢＩ）、ＢＬＡＳＴＰ（ＮＣＢＩ）、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣｂｉｏ）、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）などを挙げることができる。

同一または類似の機能や活性を有する様々なタイプのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを同定するために、様々なレベルの配列同一性を使用することができる。例えば、配列同一性は、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を含みうる。

本明細書で使用される用語「遺伝的改変（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の遺伝物質の構成または構造を人為的に変更させることを含む。

本発明の一態様では、向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物であって、前記微生物は、ホスホフルクトースキナーゼ（ＰＦＫ）活性を増加させる遺伝的改変を含む、微生物を提供する。

ホスホフルクトースキナーゼ（ＰＦＫ）は、その反応において、フルクトース−６−ホスフェートをリン酸化してフルクトース−１，６−ビスホスフェートに変換するタンパク質である。前記ホスホフルクトースキナーゼは、外因性または内因性なものでありうる。前記ＰＦＫは、ＰＦＫ１（「ＰＦＫＡ」ともいう）でありうる。前記ＰＦＫ１は、ＥＣ（酵素番号）２．７．１．１１に属するものでありうる。前記ＰＦＫは、バクテリア由来のものでありうる。前記ＰＦＫは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）由来、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）由来またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）由来でありうる。前記ＰＦＫは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＭＧ１６５５由来のものでありうる。

ホスホフルクトースキナーゼは、ＡＴＰ及びフルクトース−６−ホスフェートを、フルクトース−１，６−ビスホスフェート及びＡＤＰに変換させることを触媒することができる。前記ホスホフルクトースキナーゼは、ＡＤＰ及びジホスホヌクレオシド（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）によって、アロステリックに（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ）活性化され、ホスホエノールピルベート（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）によって、アロステリックに抑制される。前記ホスホフルクトースキナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と、９０％以上、９５％以上または１００％の配列同一性を有するポリペプチドでありうる。

前記微生物において、遺伝的改変は、ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子の発現を増加させることができる。前記遺伝的改変は、ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子のコピー数増加、または前記ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子の発現調節配列の改変でありうる。該コピー数増加は、前記遺伝子の細胞外部から細胞内部への導入、または内因性遺伝子の増幅によるものでありうる。前記遺伝子は、ＥＣ２．７．１．１１に属するＰＦＫ１をコードするポリヌクレオチドでありうる。前記ＰＦＫは、バクテリア由来でもよい。前記遺伝子は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）由来、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）由来またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）由来でありうる。前記遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来物でありうる。前記遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するものでありうる。前記遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列と、９０％以上、９５％以上または１００％の配列同一性を有するものでありうる。

前記遺伝的改変は、ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子が導入されたもの、例えば、ベクターのような運搬体を介して導入されたものでありうる。前記ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子は、染色体内または染色体外に存在することができる。導入されたホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子は、複数個、例えば、２以上、５以上、１０以上、３０以上、５０以上、１００以上または１，０００以上でありうる。

前記微生物は、コマガタエイバクター属に属するものであり、バクテリアセルロース生産能を有するものでありうる。前記微生物は、内在性ＰＦＫ１を有していないものでもよい。従って、前記微生物は、内在的な解糖経路（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）を有していないものでもよい。前記微生物は、Ｋ．キシリナス（Ｋ．ｘｙｌｉｎｕｓ）（「Ｇ．キシリナス（Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ）」ともいう）、Ｋ．ラエティカス（Ｋ．ｒｈａｅｔｉｃｕｓ）、Ｋ．スウィングシイ（Ｋ．ｓｗｉｎｇｓｉｉ）、Ｋ．コンブチャ（Ｋ．ｋｏｍｂｕｃｈａｅ）、Ｋ．ナタイコラ（Ｋ．ｎａｔａｉｃｏｌａ）またはＫ．スクロフェルメンタス（Ｋ．ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）でありうる。

本発明の他の態様は、向上したセルロース生産能を有し、ホスホフルクトースキナーゼ活性を増加させる遺伝的改変を含むコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物を培地中で培養して、セルロースを生成する段階と、培養物から前記セルロースを回収する段階と、を含む、セルロースを生産する方法を提供する。

前記方法は、向上したセルロース生産能を有し、ホスホフルクトースキナーゼ活性を増加させる遺伝的改変を含むコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物を培地中で培養して、セルロースを生成する段階を含む。前記コマガタエイバクター属微生物については、前述の通りである。

前記培養は、炭素源、例えば、グルコースを含む培地でも行うことができる。微生物培養に使用される培地は、適切なサプリメントを含む最小培地または複合培地のような、宿主細胞の成長に適する任意の一般的な培地でありうる。前記培地は、市販のものあるいは公知の製法によって製造されたものでもよい。

前記培地は、選択される培養産物に応じて、特定微生物の要求条件を満足させることができる培地でありうる。前記培地は、炭素源、窒素源、塩、微量元素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含む培地でありうる。

培養条件は、選択される産物、例えば、セルロース生産のために適切に調節されうる。前記培養は、細胞増殖のために、好気条件下で行うことができる。前記培養は、撹拌培養（ｓｐｉｎｎｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）あるいは撹拌なしの静置培養（ｓｔａｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ）であってもよい。前記微生物の濃度は、セルロース生成を妨害しないために十分な間隔が与えられる濃度でありうる。

用語「培養条件」は、微生物を培養するための条件を意味する。かような培養条件は、例えば、微生物が利用する炭素源、窒素源または酸素条件でありうる。微生物が利用することができる炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類を含んでもよい。前記炭素源は、資化可能な糖であり、グルコース、フルクトース、マンノースまたはガラクトースを含んでもよい。前記窒素源は、有機窒素化合物または無機窒素化合物でありうる。前記窒素源は、アミノ酸、アミド、アミン、硝酸塩またはアンモニウム塩でありうる。微生物を培養する酸素条件には、正常酸素分圧の好気性条件、または大気中に、０．１％ないし１０％の酸素を含む低酸素条件がある。代謝経路は、微生物が実際に利用可能な炭素源及び窒素源に合わせて改変できる。

前記培地は、エタノールまたはセルロースを含んでもよい。前記エタノールは、培地体積に対して、０．１ないし５％（ｖ／ｖ）、例えば、０．３ないし２．５％（ｖ／ｖ）、０．３ないし２．０％（ｖ／ｖ）、０．３ないし１．５％（ｖ／ｖ）、０．３ないし１．２５％（ｖ／ｖ）、０．３ないし１．０％（ｖ／ｖ）、０．３ないし０．７％（ｖ／ｖ）、または０．５ないし３．０％（ｖ／ｖ）でありうる。前記セルロースは、培地体積に対して、０．５ないし５％（ｗ／ｖ）、０．５ないし２．５％（ｗ／ｖ）、０．５ないし１．５％（ｗ／ｖ）、または０．７ないし１．２５％（ｗ／ｖ）でありうる。前記セルロースは、カルボキシル化されたセルロースでありうる。前記セルロースは、ＣＭＣでありうる。前記ＣＭＣは、ナトリウムＣＭＣでありうる。

前記方法は、微生物培養物から、セルロースを回収する段階を含む。前記回収は、例えば、培地上端に形成されたセルロース薄膜（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐｅｌｌｉｃｌｅ）を回収することでありうる。前記セルロース薄膜は、物理的に取り除いたり、培地を除去したりすることによっても回収されうる。前記回収は、セルロース薄膜の形態を毀損させずに維持したまま回収することができる。

他の態様は、コマガタエイバクター属微生物に、ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子を導入する段階を含む、セルロース生産能が向上した微生物を製造する方法を提供する。ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子の導入は、前記遺伝子を含む運搬体を、前記微生物に導入することでされうる。前記方法において、遺伝的改変は、前記遺伝子を増幅すること、前記遺伝子の調節配列を操作すること、または前記遺伝子自体の配列を操作することを含むものでありうる。前記操作は、ヌクレオチドの挿入、置換、転換または付加でありうる。

一実施形態によれば、向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属微生物は、セルロースを高効率で生産するのに使用することができる。

他の実施形態によれば、セルロースを生産する方法は、セルロースを効率的に生産するために使用できる。

他の実施形態によれば、セルロース生産能が向上した微生物を製造する方法は、セルロース生産能が向上した微生物を効率的に製造するために使用できる。

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

実施例１．ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を含むＫ．キシリナス（ｘｙｌｉｎｕｓ）の作製及びセルロースの生産
本実施例では、コマガタエイバクター・キシリナス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ） ＤＳＭ２３２５（ＤＳＭ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、外因性ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を導入し、前記遺伝子が導入された微生物を前記微生物がグルコースを消費してセルロースを生産できるように培養することによって、前記遺伝子の導入がセルロース生産能に及ぼす影響を確認した。

１．ｐｆｋＡを過発現させるためのベクター作製
Ｋ．キシリナスに、ホスホフルクトースキナーゼ（ｐｆｋ）遺伝子を相同組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって導入した。具体的手順は、次の通りである。

ｐＴＳａ−ＥＸ１ベクター（配列番号９）をテンプレートとして、配列番号５及び配列番号６のプライマーセットと、配列番号７及び配列番号８のプライマーセットとを使用して、ＰＣＲ増幅によって増幅産物を得た。前記増幅産物を、ｐＴＳａ−ＥＸ１ベクターのＢａｍＨＩとＳａｌＩとの制限酵素位置に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＧＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を利用してクローニングすることにより、ｐＴＳａ−ＥＸ１１ベクターを作製した。ｐＴＳａ−ＥＸ１ベクターは、大腸菌とＫ．キシリナスとの両方において複製可能なシャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ）である。

ｐｆｋＡを相同組み換えにより導入するために、ｐｆｋＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）（配列番号２）を、大腸菌Ｋ１２ＭＧ １６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３及び配列番号４のプライマーセットをプライマーとして利用して、ＰＣＲ増幅によって得た。前記ｐｆｋＡ遺伝子断片を、ｐＴＳａ−ＥＸ１１ベクターのＢａｍＨＩとＳａｌＩとの制限酵素位置に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＧＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を利用してクローニングすることにより、ｐｆｋＡを過剰発現させるためのベクターｐＴＳａ−Ｅｃ．ｐｆｋＡを作製した。

２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ｐｆｋＡ遺伝子挿入用ベクター作製
ｐＴＳａ−Ｅｃ．ｐｆｋＡベクターをテンプレートとして、配列番号１０及び配列番号１１のプライマーセットをプライマーとして使用して、ＰＣＲ増幅によって、ｔｅｔＡ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、ｐＭＳＫ＋ベクター（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＫＪ９２２０１９）のＥｃｏＲＩ制限酵素位置に、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＧＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用してクローニングすることにより、ｐＴＳＫ＋ベクターを作製した。

Ｋ．キシリナス菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１２および１３、配列番号１４および１５ならびに配列番号１６および１７のプライマーセットをそれぞれプライマーとして、ｐｆｋＡ遺伝子が挿入される位置の相同領域（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ）を、ＰＣＲによって増幅し、増幅産物をｐＴＳＫ＋ベクターのＥｃｏＲＩ制限酵素位置に、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＧＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用してクローニングすることにより、ｐＴＳＫ−（ｄｅｌ）２７６０ベクターを作製した。

ｐＴＳａ−Ｅｃ．ｐｆｋＡベクターをテンプレートとして、配列番号１８及び配列番号１９のプライマーセットをプライマーとして使用して、ＰＣＲ増幅によって、Ｐｔａｃ：：Ｅｃ．ｐｆｋＡ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、ｐＴＳＫ−（ｄｅｌ）２７６０ベクターのＥｃｏＲＩ制限酵素位置に、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＧＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用してクローニングすることにより、ｐＴＳＫ−（ｄｅｌ）２７６０−Ｅｃ．ｐｆｋＡベクターを作製した。

３．ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子導入
Ｋ．キシリナスに、大腸菌のｐｋｆＡ遺伝子、すなわち、配列番号２のヌクレオチド配列を導入するために、ｐＴＳＫ−（ｄｅｌ）２７６０−Ｅｃ．ｐｆｋＡベクターをテンプレートとして、配列番号１２及び配列番号１７のプライマーセットをプライマーとして使用して、Ｐｔａｃ：：Ｅｃ．ｐｆｋＡ遺伝子挿入用カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を増幅し、増幅産物を、次のような形質転換方法を使用して、Ｋ．キシリナス菌株に導入した。具体的な導入手順は、次の通りである。

Ｋ．キシリナス菌株を、２％のグルコースが添加されたＨＳ培地（ペプトン（ｐｅｐｔｏｎｅ）０．５％、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）０．５％、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ０．２７％、クエン酸０．１５％、グルコース２％及びバクトアガー（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）１．５％）に塗抹し、３０℃で３日間培養した。前記菌株を、０．２％（ｖ／ｖ）セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）（ｓｉｇｍａ、Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＴＣＣ ２６９２１）が添加された５ｍｌ ＨＳ培地に植菌し、３０℃で２日間培養した。かように培養された細胞懸濁液（ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を、０．２％（ｖ／ｖ）セルラーゼが添加された１００ｍｌ ＨＳ培地に、細胞密度（ＯＤ_６００）が０．０４になるように植菌した後、３０℃で、細胞密度が０．４〜０．７になるように培養した。前記培養された菌株を、１ｍＭのＨＥＰＥＳバッファで洗浄し、１５％のグリセロールで３回洗浄した後、１５％のグリセロール１ｍｌで懸濁し、コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を作製した。

前記作製されたコンピテントセル１００μｌを、２ｍｍのエレクトロキュベット（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｕｖｅｔｔｅ）に移し、３μｇの上記で作製したＰｔａｃ：：Ｅｃ．ｐｆｋＡカセットを添加した後、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（２．４ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）によって、ベクターをコンピテントセルに導入した。ベクターが導入された細胞を、２％のグルコース及び０．１％（ｖ／ｖ）セルラーゼを含む１ｍｌのＨＳ培地に懸濁し、１４ｍｌの丸底チューブに移した後、３０℃、１６０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、２％のグルコース、１％のエタノール及び５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンが添加されたＨＳ培地に塗抹し、３０℃で４日間培養した。テトラサイクリン耐性を有する菌株を選別して、ｐｆｋ遺伝子が過剰発現された菌株を作製した。

４．グルコース消耗量、セルロース及びグルコネートの生産量確認
指定されたＫ．キシリナス菌株を、５％グルコース及び１％エタノールが添加された５０ｍｌのＨＳ培地に植菌し、３０℃、２３０ｒｐｍで撹拌しながら５日間培養し、グルコース消耗量及びセルロース生産量を測定した。グルコース及びグルコネートは、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）が装着された高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して分析した。セルロース生産量は、フラスコ内に形成されたセルロース固形物を、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液と蒸溜水とで洗浄して凍結乾燥させた後で重量を測定した。グルコネート収率を分析した。

その結果を、図１ないし図３に示す。図１は、それぞれｐｆｋ遺伝子が導入されたＫ．キシリナス菌株を培養した培養物からのＣＮＦ生産量を示す。図１に示されているように、ｐｆｋＡ遺伝子がＫ．キシリナスに導入されたとき、ＣＮＦ生産量は、野生菌株に比べて約１１５％増加した。表１は、図１及び図２に示されたデータを示す。

図２は、それぞれｐｆｋ遺伝子が導入されたＫ．キシリナス菌株を培養した培養物から得られたセルロースナノファイバー（ＣＮＦ：ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｎａｎｏｆｉｂｅｒ）収率を示した図面である。図２に示されているように、ｐｆｋＡ遺伝子がＫ．キシリナスに導入されたとき、ＣＮＦ収率は、野生菌株に対して約１１３％増加した。

また、野生菌株及び組み換え菌株を、ＨＳＤ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、バクトペプトン（ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）５ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ２．７ｇ／Ｌ、クエン酸１．１５ｇ／Ｌ及びグルコース２０ｇ／Ｌ）及びアガー２０ｇ／Ｌ含有プレートに塗抹し、３０℃で３日培養した。

スターター発酵は、２５０ｍＬフラスコに１００ｍＬ ＨＳＤ培地を添加した後、３白金耳の菌を植菌した後、３０℃、１５０ｒｐｍで２０時間培養した。

前記発酵は、１．５Ｌベンチタイプ（ｂｅｎｃｈ−ｔｙｐｅ）発酵器（Ｂｉｏｔｒｏｎ、ＧＸ２−ｓｅｒｉｅｓ）システムを使用し、バッフル（ｂａｆｆｌｅ）を除去し、ピッチタイプインペラ（ｐｉｔｃｈ−ｔｙｐｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）とマイクロスパージャ（ｍｉｃｒｏｓｐａｒｇｅｒ）とを使用して、上下流動を強化した撹拌環境を構成した。

運転条件は、初期体積０．７Ｌ、温度３０℃、ｐＨ５．０（中和剤３Ｎ ＫＯＨ（ａｑ）で調整）、撹拌速度１５０ｒｐｍ、通気量０．７Ｌ／ｍｉｎ、そして培地は、グルコース４０ｇ／Ｌ添加されたＨＳ培地であり、１４％（ｖ／ｖ）比率で植菌した。

ＣＭＣ添加環境において発酵評価は、同一ＨＳ培地にＮａ＿ＣＭＣ １．０％（ｗ／ｖ）を添加すること、および前述の条件から撹拌速度を２５０ｒｐｍに変更することを含めた。ＣＮＦ量は、回収した発酵液を、前処理、すなわち０．１Ｎ ＮａＯＨ（ａｑ）溶液を使用して、９０℃で２時間洗浄した後、重量に基づいて測定した。

図３は、それぞれｐｆｋ遺伝子が導入されたＫ．キシリナス菌株を培養して発酵させたときに生産されたＣＮＦ生産量及びその収率を示す図面である。図３に示されているように、ｐｆｋＡ遺伝子がＫ．キシリナスに導入されたとき、ＣＮＦ生産量は、対照群に対して約３２％、収率は、５５％増加した。該収率は、使用されたグルコース重量に対する生産されたＣＮＦ重量のパーセント比率である。表２は、図３のデータを示す。

図４は、ｐｆｋＡ遺伝子が導入されたＫ．キシリナス菌株を、ＣＭＣを添加して発酵させたときに生産されたＣＮＦ生産量及びその収率を示す図面である。図４に示されているように、ｐｆｋＡ遺伝子がＫ．キシリナスに導入されたとき、ＣＮＦ生産量は、対照群に対して約５０％、収率は、１１６％増加した。表３は、図４のデータを示す。

図４および表３は、導入された外因性ｐｆｋＡが、前記菌株のフルクトース−６−ホスフェートをリン酸化して、フルクトース−１，６−ビスホスフェートに変換し、その反応とセルロース生産とに影響を与えたということを示す。

本発明の、向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属微生物、それを利用してセルロースを生産する方法、及び該微生物を製造する方法は、例えば、セルロース生産関連の技術分野に効果的に適用可能である。

Claims (17)

1. 向上したセルロース生産能を有するコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物であって、前記微生物は、ホスホフルクトースキナーゼ（ＰＦＫ）活性を増加させる遺伝的改変を含む、微生物。
2. 前記遺伝的改変は、前記ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子のコピー数増加、または前記ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子の発現調節配列の改変である、請求項１に記載の微生物。
3. 前記コピー数増加は、前記遺伝子の細胞外部から細胞内部への導入による、請求項２に記載の微生物。
4. 前記ホスホフルクトースキナーゼは、ＥＣ２．７．１．１１に属する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
5. 前記ホスホフルクトースキナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１に記載の微生物。
6. 前記ホスホフルクトースキナーゼは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）由来、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）由来またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
7. 前記遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の微生物。
8. 前記コマガタエイバクター属微生物は、コマガタエイバクター・キシリナス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
9. 向上したセルロース生産能を有し、ホスホフルクトースキナーゼ活性を増加させる遺伝的改変を含むコマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物を培地中で培養して、セルロースを生成する段階と、
   培養物から前記セルロースを回収する段階と、
   を含む、セルロースを生産する方法。
10. 前記遺伝的改変は、前記ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子のコピー数増加、または前記ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子の発現調節配列の改変である、請求項９に記載の方法。
11. 前記コピー数増加は、前記遺伝子の細胞外部から細胞内部への導入による、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ホスホフルクトースキナーゼは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）由来、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）由来またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）由来である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記ホスホフルクトースキナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
14. 前記遺伝的改変は、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させるか、または配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現調節配列を改変させることである、請求項９に記載の方法。
15. 前記コマガタエイバクター属微生物は、コマガタエイバクター・キシリナス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記培地は、０．５ないし５．０％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、０．１ないし５．０％（ｖ／ｖ）のエタノール、または０．５ないし５．０％（ｗ／ｖ）のＣＭＣおよび０．１ないし５．０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. コマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）微生物に、ホスホフルクトースキナーゼをコードする遺伝子を導入する段階を含む、セルロース生産能が向上した微生物を製造する方法。