JP2018065765A - 医療用タンパク質とポリアミノ酸の複合体、安定化方法およびその用途 - Google Patents
医療用タンパク質とポリアミノ酸の複合体、安定化方法およびその用途 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体は、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、当該タンパク質がより安定化でき、輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる。
【選択図】図1
Description
タンパク質医薬品の経口投与は、低分子化合物の医薬品とは異なり困難なので、注射によって体内に投与されることが多い。なかでも皮下注射は痛みも少なく、簡便で自己投与(患者の自己注射)も可能なので、新しい投与法として期待されている。しかし、皮下注射は投与量が1.5mL以下に制限されるため、通常、100mg/mL以上の高濃度のタンパク質溶液を調製する必要がある。
しかし、操作工程が増えるので、設備や時間のコストが課題として残される。近年では、液‐液相分離やゲル化、結晶化など、装置が不要な新しい濃縮法の開発も進んでいるが、処理に伴うタンパク質の不可逆な変性などの課題は残されてしまう。このように、高濃度のタンパク質溶液を得るために、1)タンパク質を変性させずに、2)簡便で迅速な工程で、3)装置などの投資が不要な方法の開発が期待されている。さらに、今後もタンパク質医薬品の種類が増えることを考えると、抗体や酵素やホルモンなどによらず、4)多様なタンパク質に利用できる汎用的な方法であることが望ましい。
本出願人は、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤を特許文献1で開示した。タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤は、溶媒を除去して濃縮することが可能であり、低濃度の電解質を添加して当該タンパク質を解離して医薬品として利用することができる。
(1)医療用たんぱく質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体。
(2)上記(1)に記載の複合体を含有する水性懸濁液またはその濃縮物を含有する注射剤。
(3)前記ポリアミノ酸がポリリジン、ポリグルタミン酸またはこれらの水溶性塩である(1)または(2)に記載の複合体、水性懸濁液、その濃縮物または注射剤。
(4)前記水性懸濁液のpHが、3.5〜4.5である(2)または(3)に記載の水性懸濁液。
(5)抗体たんぱく質と分子量1.5kDa〜5.5kDaのポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体たんぱく質を安定化させる方法。
(6)抗体たんぱく質と分子量5.5kDa超のポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体たんぱく質を安定化させる方法。
(7)前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸である(5)または(6)に記載のタンパク質を安定化させる方法。
(8)抗体タンパク質を、pH3.5〜4.5で、ポリグルタミン酸と複合体を形成させ、前記複合体に電解質(塩)を添加して、かつpHを高くして当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させる方法。
αヘリックス(Alpha helix)はタンパク質の二次構造の共通モチーフの1つで、バネに似た右巻きらせんの形をしている。溶液中の短いポリペプチド鎖は、ヘリックスを形成するのに要するエントロピーがヘリックスを結合することによる安定性によって補償されないため、αヘリックス構造を取ることはあまりない。異なったアミノ酸配列はαヘリックスの形成に対して異なった傾向を示す。メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、リシンは特にヘリックスを作る傾向が強いが、プロリン、グリシン、チロシン、セリンはヘリックスを作りにくい。
本発明者等は、下記2つの新たな知見を得て本発明をなした。第一はポリグルタミン酸はある程度以上の鎖長のものは低pHでαへリックス構造を取り、抗体タンパク質との複合体を形成した際の結合が強固になり、より安定化できる。第二はポリグルタミン酸はpHが高くなるとランダム構造をとるので抗体タンパク質との結合力が弱まり複合体からタンパク質を解離し易くなる。医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体は水溶液中のすべてのタンパク質がαへリックス構造との複合体を形成している必要は無く、その一部がポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成していれば、ランダム構造との複合体より安定化できるので、水溶液中のタンパク質の一部がαへリックス構造との複合体を形成していればよい。
図1は、ポリグルタミン酸のpH4でのαへリックス構造と、pH7におけるランダム構造とを説明する模式図である。ランダム構造では静電的相互作用によって複合体が形成される。αへリックス構造との複合体は静電的相互作用以外の疎水的相互作用がさらに働いていると考えられる。
(抗体)
例えば、ムロモナブ-CD3、卜ラスツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、卜シリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ベパシズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エクリズマブ、パニツムマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、力ナキヌマブ、デノスマブ、モガムリズマブ、セル卜リズマブペゴル、オファツムマブ、ペルツズマブ、卜ラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、ナタリズマブ、ニポルマブ、アレムツズマブ、ヨウ素131修飾卜シツモマブ、力ツマキソマブ、アデ力ツムマブ、エドレコロマブ、アブシキシマブ、シルツキシマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、オビヌツズマブ、ベドリズマブ、ペムブロリズマブ、イクセキズマブ、ジリダブマブ、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマフがある。
(融合タンパク質)
例えば、エタネルセプ卜、アバタセプ卜、ロミプロスチム、アフリベルセプ卜がある。
その他の医療用タンパク質としては、酵素、血液凝固線溶系因子、血清タンパク質、ホルモン、ワクチン、インターフェロン類、エリスロポエチン類、サイトカイン類が挙げられる。
本発明の複合体はタンパク質とポリアミノ酸とを水溶液中でpH調整してポリアミノ酸がα構造をとる条件でたんぱく質と結合させて製造することができる。複合体を含有する水性懸濁液は、水、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸およびpH調整剤を適宜組合せて含有することができる。しかし、ここで記載する成分以外の添加剤を含有しないことが好ましい。また、複合体を含有する水性懸濁液を濃縮することでタンパク質を濃縮することができる。複合体を含有する水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して複合体を解離してタンパク質を得ることができる。
複合体は主として静電相互作用を介して形成されるので、タンパク質とそれと反対の電荷をもつポリアミノ酸とを組み合わせて複合体とする。
カチオン性のタンパク質に用いるアニオン性ポリアミノ酸の例は、ポリグルタミン酸(MW:750〜5000、pI:2.81〜3.46)、ポリグルタミン酸(MW:3000〜15000、pI:2.36〜3.00)、ポリグルタミン酸(MW:15000〜50000、pI:1.85〜2.36)、ポリグルタミン酸(MW:50000〜100000、pI:1.56〜1.85)、ポリアスパラギン酸(MW:2000〜11000、pI:2.06〜2.75)、ポリアスパラギン酸(MW:5000〜15000、pI:1.93〜2.39)およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも1つのアニオン性ポリアミノ酸であり、これらとカチオン性タンパク質との複合体が形成できる。
アニオン性のタンパク質に用いるカチオン性ポリアミノ酸の例は、ポリリジン(MW:1000〜5000、pI:10.85〜11.58)、ポリリジン(MW:4000〜15000、pI:11.49〜12.06)、ポリリジン(MW:15000〜30000、pI:12.06〜12.37)、ポリリジン(MW:30000〜、pI:12.37〜)、ポリアルギニン(MW:5000〜15000、pI:13.49〜13.97)、ポリアルギニン(MW:15000〜70000、pI:13.98〜14.00)、ポリアルギニン(MW:70000〜、pI:14.00)、ポリヒスチジン(MW:5000〜25000、pI:7.74〜8.30)およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも1つのカチオン性ポリアミノ酸であり、これらとアニオン性タンパク質との複合体が形成できる。
本発明に使用する緩衝液は、水素イオン濃度に対する緩衝作用のある溶液を指し、緩衝液は少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしてもpHが大きく変化しないように調整された水溶液である。緩衝液は通常化学的に用いられるものであれば特に限定されないが、生物学的に用いられる緩衝液が好ましい。より好ましい形態の緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液、MOPS緩衝液(3−(N−morpholino)propanesulfonic acid)緩衝液、MOPS‐HaOH緩衝液、PIPES(Piperazine−1,4−bis(2−ethanesulfonic acid))緩衝液、TrisHCl緩衝液(トリスヒドロキシメチルアミノメタン−HCl緩衝液)、MES(2−Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)緩衝液、HEPES(4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazine ethanesulfonic acid)緩衝液、HEPES−NaOH緩衝液、グリシンNaOH緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、グリシルグリシン−NaOH緩衝液、グリシルグリシン−KOH緩衝液、トリス−ホウ酸緩衝液、ホウ酸−NaOH緩衝液、ホウ酸緩衝液、TES緩衝液(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸緩衝液)、イミダゾール緩衝液等の生体試料に適したもので、生体への投与が可能な緩衝液を用いることができる。緩衝液の、複合体を含有する水性懸濁液への配合は、予め複合体を解離させずに投与でき、投与後体内でタンパク質を解離させて使用する投与方法に好適である。
医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体は、低pHで形成でき、医療用タンパク質とポリアミノ酸のランダム構造との複合体より安定である。そのため投与するまでは複合体としてより長期に安定で常温での保存が可能となり、体内に投与するとpH7の環境となり、複合体のαへリックス構造がランダム構造になりタンパク質が容易に解離するので医療用タンパク質として有効に利用することができる。
ポリアミノ酸がαへリックス構造をとるのは比較的低pHであり、例えばpH3.5〜4.5の緩衝液中でポリアミノ酸とタンパク質とを接触させて複合体を製造できる。製造したポリアミノ酸のαへリックスとタンパク質との複合体は、同じポリアミノ酸のランダム構造との複合体に比べて安定性が高い。必要な場合は電解質(塩)を、複合体を含有する水性懸濁液に加えて、そのまま、またはpHを高くして解離させ、タンパク質を得る。
〔沈澱−再溶解法〕
タンパク質の原液に(Step1)、αへリックス構造とする条件で反対の電荷をもつポリアミノ酸を加え,沈殿性の複合体を形成させる(Step2)。次に,この複合体を沈殿させ(Step3)、沈殿から上清を取り除くことで、タンパク質溶液を濃縮できる(Step4)。この後、そのまま複合体を生体内に投与することで、ポリアミノ酸がランダム構造をとるpHとなり、タンパク質は解離し易くなり元のネイティブ状態のタンパク質が得られる。解離に必要な濃度の塩を加えてあらかじめ複合体を再溶解させる、またその後生体内に投与することもできる(Step5)。具体的な条件として,再溶解時の塩の終濃度は,生理食塩水と同等の150 mMに設定するのが好ましい。
例における形成率および回収率の測定と算出方法は限定されないが、例えば、水性懸濁液中のタンパク質・ポリ‐L‐グルタミン酸複合体の形成率は、複合体を沈殿させた後、上清をサイズ排除クロマトグラフ(以下、SECということがある)法で測定し、タンパク量が0%であれば、全てのタンパク質が複合体になっているとし、形成率100%とする。また、回収率は、複合体を解離させた溶液をSECで測定し、形成率を加味した上で、タンパク濃度が複合体形成前の薬液濃度と比較して同じであれば、全てのタンパク質が形成かつ解離されたとし、回収率100%として得た値とすることができる。
以下に記載する例の中で、形成率および回収率のいずれも高い場合は本発明の水性懸濁液はそのままタンパク質製剤として利用可能であり、形成率および回収率のいずれかが優れている場合は条件を検討して改良してタンパク質製剤として利用できる。形成率および回収率がいずれも小さい場合は、その条件を検討して本発明の複合体形成の機構の研究に有用である。
以下の表では、目安として、形成率および回収率が優れている結果とそれ以外の結果とを区別できるよう例の番号の列に縦線を引いている。
(試験例1)
[複合体の形成]
10mM リン酸緩衝液(pH4.0)中において、ヒト型IgG2モノクローナル抗体を1.0mg/mLの濃度となるように調製し、ヒト型IgG2モノクローナル抗体1質量部に対し0.04〜0.14 質量部のポリ‐L‐グルタミン酸(E1:MW:1.5kDa−5.5kDa)を加え、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐L‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。この水性懸濁液を14000rpmで15分間遠心分離し、上清部を採取して、サイズ排除クロマトグラフ法(SEC)(測定機器 島津LC−20A)によりタンパク質含量を測定した。また、10mM リン酸緩衝液(pH4.0)中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を1.0mg/mLの濃度となるように調製した液を対照液(例1−1)として調製し、サイズ排除クロマトグラフ法(SEC)によりタンパク質含量を測定し、水性懸濁液の上清部のタンパク含量を差し引き、複合体の形成率とした。
[複合体の解離]
得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液(PBS)(商品名ダルベッコPBS(−)粉末「ニッスイ」)を加え、当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、サイズ排除クロマトグラフ法(SEC)によりタンパク質含量を測定した。また、PBS(pH7.0)中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を1.0mg/mLの濃度となるように調製した液を対照液(例1−1)として調製し、SECによりタンパク質含量を測定し、対照液のタンパク質濃度を100%とする相対値で回収率を算出した。結果を表1、図2Aおよび図2Bに示す。形成率、回収率とも同様な曲線が得られた。
ヒト型IgG2モノクローナル抗体を用いて試験例1と同様にして、pH4でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が150mM となるよう調製した塩化ナトリウム−10mMリン酸緩衝液(pH4.0)で解離させて、試験例1と同様に回収率を測定した。結果を表2に示す。
ヒト型IgG2モノクローナル抗体1質量部に対し 0.04〜0.13 質量部のポリ‐L‐グルタミン酸(E4:MW:50kDa−100kDa)を加えた以外は試験例 1と同様にして、pH4でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液(商品名ダルベッコPBS(−)粉末「ニッスイ」)を加え、ポリ‐L‐グルタミン酸(E4:MW:50kDa−100kDa)をランダム構造として当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、試験例1と同様に回収率を測定した。結果を表3、図3Aおよび図3Bに示す。分子量の高いポリグルタミン酸との複合体形成率は高く、回収率も高かった。
ヒト型IgG2モノクローナル抗体1質量部に対し 0.04〜0.13 質量部のポリ‐L‐グルタミン酸(E4:MW:50kDa−100kDa)を加えた以外は試験例 1と同様にして、pH4でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が150mM となるよう調製した塩化ナトリウム−10mMリン酸緩衝液(pH4.0)で解離させて、試験例1と同様に回収率を測定した。結果を表4に示す。分子量の高いポリグルタミン酸との複合体形成率は高かったが、回収率は低かった。
試験例1のポリ−L‐グルタミン酸(E1:MW:1.5kDa−5.5kDa)複合体の形成において、10mM リン酸緩衝液(pH7.0)とした以外は試験例1と同様にした。得られた複合体からタンパク質を解離させる場合は、等張となる生理的緩衝塩類溶液(商品名ダルベッコPBS(−)粉末「ニッスイ」)を加えた。試験例1と同様にして測定した結果を表5に示す。ポリ−L−グルタミン酸(E1:MW:1.5kDa−5.5kDa)複合体の形成において、pH7.0では複合体形成率が低く回収率も低かった。
ヒト型IgG2モノクローナル抗体1質量部に対し0.01〜0.04質量部のポリ‐L‐グルタミン酸(E4:MW:50kDa−100kDa)を加え、10mM リン酸緩衝液(pH7.0)とした以外は試験例1と同様に複合体を形成した。得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液(商品名ダルベッコPBS(−)粉末「ニッスイ」)を加え、当該抗体タンパク質をpH7で前記複合体から解離させて、試験例1と同様に回収率を測定した。結果を表6、図4Aおよび図4Bに示す。pH7で形成されたE4との複合体は形成率が多少下がり回収率も下がった。
(試験例7)
例1−7(E1/pH4)、例3−5(E4/pH4)、例6−5(E4/pH7) のヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐L‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を充填したポリプロピレン製ディスポーサブルチューブを、振とう機(バイオシェーカー・VR−36)に設置し、500rpm、室温下で27日間振とうした。また、各緩衝液中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を1.0mg/mLの濃度となるように調製しpH4、pH7とした対照液(例 1−1、6−1)を、同時に振とうした。なお表中製剤希釈(例7−1)は、pH5の商品名ランマーク製剤を希釈して対照液とした。
振とう前および後のヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐L‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液を14000rpmで、15分間遠心分離し、上清部を採取して、SECにより懸濁液および対照液に含まれるタンパク質含量を測定した。振とう前のタンパク質含量を100%として振とう後のタンパク質含量の測定結果を表7および図5に示す。
(試験例8)
試験例7と同様の別に用意した、例1−7(E1/pH4)、例3−5(E4/pH4)、例6−5(E4/pH7) のヒト型IgG2モノクローナル抗体・ポリ‐L‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を充填したポリプロピレン製ディスポーサブルチューブに入れ、7日間、60℃に保った。また、各緩衝液中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を1.0mg/mLの濃度となるように調製した液をpH4、pH7とした対照液(例 1−1、6−1)を、同様に7日間、60℃に保った。なお表中製剤希釈(例7−1)は、pH5の商品名ランマーク製剤を希釈して対照液とした。
加熱前および後のヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐L‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液を14000rpmで、15分間遠心分離し、上清部を採取して、SECにより懸濁液および対照液に含まれるタンパク質含量を測定した。加熱前のタンパク質含量を100%として加熱後のタンパク質含量の測定結果を表8および図6に示す。
(試験例9)
[複合体の形成]
10mM 酢酸緩衝液(pH4.0)中において、抗TNFαモノクローナル抗体を1mg/mLの濃度となるように調製し、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部に対し 0.01〜1.0 質量部のポリ‐L‐グルタミン酸(E1:MW:1.5kDa−5.5kDa)を加え抗TNFαモノクローナル抗体・ポリ‐L‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。この水性懸濁液を14000rpmで15分間遠心分離し、上清部を採取して、サイズ排除クロマトグラフ法(SEC)(測定機器 島津LC−20A)によりタンパク質含量を測定した。また、10mM 酢酸緩衝液(pH4.0)中において、抗TNFαモノクローナル抗体を1.0mg/mLの濃度となるように調製した液を対照液として調整し、SECによりタンパク質含量を測定し、水性懸濁液の上清部のタンパク質含量を差し引き、複合体の形成率とした。
得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液(商品名ダルベッコPBS(−)粉末「ニッスイ」)を加え、当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、SECによりタンパク質含量を測定し、対照液のタンパク質濃度を100%とする相対値で回収率を算出した。結果を表9、図7Aおよび図7Bに示す。形成率、回収率とも同様な曲線が得られた。
抗TNFαモノクローナル抗体1質量部に対し試験例9と同様にして、pH4でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が150mM となるよう調製した塩化ナトリウム−酢酸緩衝液(pH4.0)で解離させて、試験例9と同様に回収率を測定した。結果を表10、図8Aおよび図8Bに示す。複合体形成率は高かったが、回収率は低かった。
抗TNFαモノクローナル抗体1質量部に対し 0.01〜1.4 質量部のポリ‐L‐グルタミン酸(E4:MW:50kDa−100kDa)を加えた以外は試験例9と同様にして、pH4でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液(商品名ダルベッコPBS(−)粉末「ニッスイ」)を加え、ポリ‐L‐グルタミン酸(E4:MW:50kDa−100kDa)をランダム構造として当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、試験例9と同様に回収率を測定した。結果を表11、図9Aおよび図9Bに示す。複合体形成率は高く、質量比が増大するにつれて、回収率も増大した。
抗TNFαモノクローナル抗体1質量部に対し試験例11と同様にして、pH4でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が150mM となるよう調製した塩化ナトリウム―酢酸緩衝液(pH4.0)で解離させて、試験例9と同様に回収率を測定した。結果を表12、図10Aおよび図10Bに示す。複合体形成率は高かったが、回収率は低かった。
今回の実験においても、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体と同様に、塩を含んだ中性の溶液にすることによって、複合体からタンパク質を回収できることから、ポリグルタミン酸のαヘリックスと結合したタンパク質の複合体は、生体に投与された際に解離することが解った。
嫌われる存在であり,製剤として取り扱う可能性は検討されてこなかった。しかし,制御された凝集や沈殿は,タンパク質の濃縮や安定化にも有効であり、タンパク質製剤としての有用性が高い。
Claims (8)
- 医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体。
- 請求項1に記載の複合体を含有する水性懸濁液またはその濃縮物を含有する注射剤。
- 前記ポリアミノ酸がポリリジン、ポリグルタミン酸またはこれらの水溶性塩である請求項1または2に記載の複合体、水性懸濁液、その濃縮物または注射剤。
- 前記水性懸濁液のpHが、3.5〜4.5である請求項2または3に記載の水性懸濁液。
- 抗体タンパク質と、分子量1.5kDa〜5.5kDaのポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体タンパク質を安定化させる方法。
- 抗体タンパク質と分子量5.5kDa超のポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体タンパク質を安定化させる方法。
- 前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸である請求項5または6に記載のタンパク質を安定化させる方法。
- 抗体タンパク質を、pH3.5〜4.5で、ポリグルタミン酸と複合体を形成させ、前記複合体に電解質(塩)を添加して、かつpHを高くして前記抗体タンパク質を前記複合体から解離させる方法。
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