JP2018054968A - 観察装置および方法並びに観察装置制御プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】培養容器を結像光学系によって走査し、各観察位置においてオートフォーカス制御を行う場合において、オートフォーカス制御をより効率的に行い、撮影時間の短縮を図ることができる観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムを提供する。
【解決手段】複数のウェル５２を有する培養容器５０が設置されるステージおよびウェル５２内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、ステージ内の観察位置を走査して観察対象を観察する。対物レンズを光軸方向に移動させて、観察位置毎のオートフォーカス制御を行う際、観察位置の走査方向に隣接するウェル５２の境界部分Ｄに基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える。
【選択図】図４

Description

本発明は、観察対象が収容された容器が設置されたステージを、観察対象の像を結像させる結像光学系に対して移動させることによって、観察対象全体の像を観察する観察装置および方法並びにプログラムに関するものである。

従来、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態などを判定する方法が提案されている。

ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、および病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。

一方、上述したように細胞を顕微鏡で撮像する際、高倍率な広視野画像を取得するため、いわゆるタイリング撮影を行うことが提案されている。具体的には、たとえばウェルプレートなどの培養容器の範囲内を結像光学系によって走査し、観察位置毎の画像を撮像した後、その観察位置毎の画像を結合する。

そして、このようなタイリング撮影を行う場合には、培養容器内の各観察位置においてオートフォーカス制御を行うことによって、ボケの少ない高画質な画像を取得することが提案されている（特許文献１〜特許文献３を参照）。

特開２０１０−７２０１７号公報 特開２００８−２９２２１６号公報 特開２００９−２５３４９号公報

ここで、上述したようにタイリング撮影においてオートフォーカス制御を行う場合、撮影時間の短縮の観点から、オートフォーカス制御を高速かつ高精度に行うことが重要である。

しかしながら、たとえば培養容器として複数のウェルを有するウェルプレートを使用し、そのウェルプレート全体を結像光学系によって走査し、各観察位置についてオートフォーカス制御を行いながらタイリング撮影をする場合、各ウェルの底部の厚さは、製造上の誤差などに起因してウェル毎に異なる。

したがって、たとえばウェルの底面（観察対象設置面）の位置を検出してオートフォーカス制御を行う場合、隣接するウェル間で底部の厚さが大きく異なる場合には、ウェルの底面の位置が大きく異なるため、オートフォーカス制御の時間が長くなり、撮影時間が長くなる問題がある。

本発明は、上記の問題に鑑み、オートフォーカス制御をより効率的に行い、撮影時間の短縮を図ることができる観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムを提供することを目的とする。

本発明の観察装置は、観察対象が収容される複数の容器が設置されるステージと、容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系と、ステージおよび結像光学系の少なくとも一方を水平面内において移動させる水平方向駆動部と、水平方向駆動部を制御して、ステージおよび結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、ステージ内の観察位置を走査する走査制御部と、対物レンズを光軸方向に移動させる結像光学系駆動部と、結像光学系駆動部を制御して、観察位置毎のオートフォーカス制御を行うオートフォーカス制御部とを備え、オートフォーカス制御部が、観察位置の走査方向に隣接する容器の境界部分に基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える。

また、上記本発明の観察装置において、オートフォーカス制御部は、境界部分の直後の観察位置のオートフォーカス制御を、境界部分の直前の観察位置のオートフォーカス制御の終了時点から境界部分の直後の観察位置に結像光学系が到達する前までの間に開始することができる。

また、上記本発明の観察装置において、オートフォーカス制御部は、境界部分の直後以外の観察位置については、その観察位置に結像光学系が到達した時点からオートフォーカス制御を開始することができる。

また、上記本発明の観察装置において、境界部分の直後の観察位置のオートフォーカス制御のための時間は、境界部分の直後以外の観察位置のオートフォーカス制御のための時間よりも長いことが好ましい。

また、上記本発明の観察装置においては、結像光学系が観察位置に到達する前に、先行して観察位置におけるステージ上に設置された容器の鉛直方向の位置を検出する検出部を備え、オートフォーカス制御部は、検出部の検出信号に基づいて、各観察位置のオートフォーカス制御を行うことができる。

また、上記本発明の観察装置において、検出部は、対物レンズを挟んで走査方向について並べて設けられた少なくとも２つの変位センサを有し、走査方向の向きの変更に応じて、使用する変位センサを切り換えることができる。

また、上記本発明の観察装置において、検出部は、容器の境界部分を検出することができる。

また、上記本発明の観察装置において、オートフォーカス制御部は、検出部によって検出された検出信号が異常である場合には、異常な検出信号が検出された観察位置については、その観察位置の走査方向について前後の観察位置の検出部の検出信号に基づくオートフォーカス制御を行うことができる。

また、上記本発明の観察装置においては、容器の境界部分の位置情報を記憶する記憶部を備え、オートフォーカス制御部は、記憶部に記憶された境界部分の位置情報に基づいて、オートフォーカス制御の開始タイミングを切り換えることができる。

また、上記本発明の観察装置において、容器は、ウェルプレートの各ウェルであることが好ましい。

本発明の観察方法は、観察対象が収容される複数の容器が設置されるステージおよび容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、ステージ内の観察位置を走査して観察対象を観察する観察方法において、対物レンズを光軸方向に移動させて、観察位置毎のオートフォーカス制御を行う際、観察位置の走査方向に隣接する容器の境界部分に基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える。

本発明の観察装置制御プログラムは、観察対象が収容される複数の容器が設置されるステージおよび容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、ステージ内の観察位置を走査する手順をコンピュータに実行させる観察装置制御プログラムであって、対物レンズを光軸方向に移動させて、観察位置毎のオートフォーカス制御を行う手順をさらにコンピュータに実行させる観察装置制御プログラムにおいて、観察位置の走査方向に隣接する容器の境界部分に基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える手順をコンピュータに実行させる。

本発明の観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムによれば、観察対象が収容される複数の容器が設置されるステージおよび容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、ステージ内の観察位置を走査して観察対象を観察する。そして、対物レンズを光軸方向に移動させることによって、観察位置毎のオートフォーカス制御を行う際、観察位置の走査方向に隣接する容器の境界部分に基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換えるようにしたので、オートフォーカス制御をより効率的に行い、撮影時間の短縮を図ることができる。

本発明の観察装置の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムにおける顕微鏡装置の概略構成を示す図 ステージの構成を示す斜視図 結像光学系の構成を示す模式図 ウェルプレートの各ウェルの境界部分を説明するための図 本発明の観察装置の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムにおけるオートフォーカス制御を説明するための図 本発明のオートフォーカス制御の開始タイミングの一例を説明するための図 本発明の観察装置の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 培養容器内における観察位置の走査位置を示す図 本発明の観察装置の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムの作用を説明するためのフローチャート ステージが往路移動している場合における顕微鏡観察システムの作用を説明するための模式図 ステージが往路移動している場合における顕微鏡観察システムの作用を説明するための模式図 本発明の観察装置のその他の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 ウェルの底面にキズなどがある場合において、検出部によって検出された検出信号に基づくＺ方向の位置を示す図

以下、本発明の観察装置および方法の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡観察システムにおける顕微鏡装置１０の概略構成を示す図である。

顕微鏡装置１０は、観察対象である培養された細胞の位相差画像を撮像するものである。具体的には、顕微鏡装置１０は、図１に示すように、白色光を出射する白色光源１１と、コンデンサレンズ１２と、スリット板１３と、結像光学系１４と、結像光学系駆動部１５と、撮像素子１６と、検出部１８とを備えている。

そして、スリット板１３と結像光学系１４および検出部１８との間に、ステージ５１が設けられている。ステージ５１上には、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が設置される。図２は、ステージ５１の一例を示す図である。ステージ５１の中央には、矩形の開口５１ａが形成されている。この開口５１ａを形成する部材の上に培養容器５０が設置され、培養容器５０内の細胞の位相差画像が開口５１ａを通過するように構成されている。

本実施形態においては、培養容器５０として、細胞が収容される複数のウェル（１つのウェルが、本発明の容器に相当する）を備えたウェルプレートを用いる。また、培養容器５０に収容される細胞としては、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などがある。

ステージ５１は、水平方向駆動部１７（図７参照）によって互いに直交するＸ方向およびＹ方向に移動するものである。Ｘ方向およびＹ方向は、Ｚ方向に直交する方向であり、水平面内において互いに直交する方向である。

スリット板１３は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられたものであり、白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌが形成される。

図３は、結像光学系１４の詳細な構成を示す図である。結像光学系１４は、図３に示すように、位相差レンズ１４ａおよび結像レンズ１４ｄを備えている。そして、位相差レンズ１４ａは、対物レンズ１４ｂおよび位相板１４ｃを備えている。位相板１４ｃは、照明光Ｌの波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板１３のスリットの大きさは、位相板１４ｃの位相リングと共役な関係にある。

位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、観察対象によって回折された回折光は大部分が位相板１４ｃの透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。

対物レンズ１４ｂを有する位相差レンズ１４ａは、図１に示す結像光学系駆動部１５によって対物レンズ１４ｂの光軸方向に移動するものである。なお、本実施形態においては、対物レンズ１４ｂと光軸方向とＺ方向（鉛直方向）とは同じ方向である。位相差レンズ１４ａのＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像素子１６によって撮像される位相差画像のコントラストが調整される。

また、位相差レンズ１４ａの倍率を変更可能な構成としてもよい。具体的には、異なる倍率を有する位相差レンズ１４ａまたは結像光学系１４を交換可能に構成するようにしてもよい。位相差レンズ１４ａまたは結像光学系１４の交換は、自動的に行うようにしてもよいし、ユーザが手動で行うようにしてもよい。

結像光学系駆動部１５は、たとえば圧電素子のようなアクチュエータを備えたものであり、後述するオートフォーカス制御部２１から出力された制御信号に基づいて駆動するものである。なお、結像光学系駆動部１５は、位相差レンズ１４ａを通過した位相差画像をそのまま通過させる構成となっている。また、結像光学系駆動部１５の構成は圧電素子に限らず、位相差レンズ１４ａをＺ方向に移動可能なものであればよく、その他の公知な構成を用いることができる。

結像レンズ１４ｄは、位相差レンズ１４ａおよび結像光学系駆動部１５を通過した位相差画像が入射され、これを撮像素子１６に結像するものである。

撮像素子１６は、結像レンズ１４ｄによって結像された位相差画像を撮像するものである。撮像素子１６としては、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。

検出部１８は、ステージ５１に設置された培養容器５０のＺ方向（鉛直方向）の位置を検出するものである。検出部１８は、具体的には、第１のオートフォーカス用変位センサ１８ａおよび第２のオートフォーカス用変位センサ１８ｂを備えたものである。なお、第１および第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ、１８ｂは、本発明の変位センサに相当するものである。

第１のオートフォーカス用変位センサ１８ａおよび第２のオートフォーカス用変位センサ１８ｂは、結像光学系１４（対物レンズ１４ｂ）を挟んで、図１に示すＸ方向に並べて設けられている。本実施形態における第１のオートフォーカス用変位センサ１８ａおよび第２のオートフォーカス用変位センサ１８ｂはレーザ変位計であり、培養容器５０にレーザ光を照射し、その反射光を検出することによって、培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出するものである。なお、培養容器５０の底面とは、培養容器５０の底部と観察対象である細胞との境界面であり、すなわち観察対象設置面である。

検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報は、オートフォーカス制御部２１に出力され、オートフォーカス制御部２１は、入力された位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、オートフォーカス制御を行う。

より具体的には、本実施形態の顕微鏡装置１０においては、結像光学系１４がステージ５１上の培養容器５０の所定の観察位置に到達する前に、先行してその観察位置における培養容器５０のＺ方向の位置情報を第１または第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂによって検出し、結像光学系１４が、上記観察位置に到達した際に、第１または第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂによって検出された位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、オートフォーカス制御を行う。

ここで、本実施形態のように、培養容器５０として複数のウェルを備えたウェルプレートを用いた場合、ウェルプレートにおける全ての観察位置について、従来のように、結像光学系１４が各観察位置に到達した時点からオートフォーカス制御を行ったのでは、観察位置の走査方向に隣接するウェルの境界部分の直後の観察位置、すなわち隣接するウェルのうち走査方向前側のウェルの最初の観察位置のオートフォーカス制御を行う際、ウェル毎の底部の厚さの違いから、オートフォーカス制御に長い時間がかかってしまう。なお、上述した観察位置の走査方向とは、ステージ５１の移動方向とは逆の方向である。

図４は、複数のウェル５２を備えた培養容器５０（ウェルプレート）の一例の断面模式図である。図４に示す「Ｄ」が隣接するウェルの境界部分であり、「５２ａ」がウェル５２の底部である。なお、図４に示すように、各ウェル５２の底部５２ａの厚さは、製造上のばらつきによって異なっている。

そして、ステージ５１をＸ方向に往復移動させ、かつＹ方向に移動させながら２次元状に走査を行う場合には、何度もウェル５２の境界を通過するため、上述したようなウェル５２の境界部分Ｄを跨ぐ際のオートフォーカス制御の時間のロスが大きいものとなる。

そこで、本実施形態においては、図５に示すように、隣接するウェル５２の境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２と境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２以外の観察位置とで、オートフフォーカス制御を開始するタイミングを切り換える。具体的には、本実施形態においては、境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御を、境界部分Ｄの直前の観察位置Ｒ１のオートフォーカス制御の終了時点から開始する。なお、図５における点線で示す矩形の範囲が各観察位置Ｒを示している。

すなわち、本実施形態においては、隣接するウェル５２の境界部分Ｄに含まれる観察位置については、オートフォーカス制御による撮像を行う必要がないので、この境界部分Ｄに含まれる観察位置についてはオートフォーカス制御を行わず、境界部分Ｄに含まれる観察位置の走査時間を利用して、境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御を行う。図６は、ウェル５２の境界部分Ｄの近傍の観察位置Ｒ０〜Ｒ３のオートフォーカス制御の開始タイミングと終了タイミングの一例を示す図である。図６に示すｆ０〜ｆ３が、各観察位置Ｒ０〜Ｒ３のフォートフォーカス制御を行っている時間であり、Ｔｘは、隣接する観察位置の間の走査時間（結像光学系１４がステージ５１に対して相対的に移動する時間）であり、Ｔｄは、観察位置Ｒ２から観察位置Ｒ３までの走査時間である。

図６に示すように、観察位置Ｒ０については、時刻ｔ０からオートフォーカス制御が開始され、時刻ｔ１の時点でオートフォーカス制御を終了する。そして、観察位置Ｒ０から観察位置Ｒ１まで走査された後、時刻ｔ２から観察位置Ｒ１のオートフォーカス制御が開始され、時刻ｔ３の時点でオートフォーカス制御を終了する。そして、観察位置Ｒ１のオートフォーカス制御を終了した時刻ｔ３から観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御を開始し、結像光学系１４が観察位置Ｒ２に到達する時刻ｔ５までの間の時刻ｔ４において、観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御を終了する。すなわち、観察位置Ｒ１から観察位置Ｒ２までの走査時間Ｔｄの間に、観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御を終了する。

そして、結像光学系１４が観察位置Ｒ２に到達した時刻ｔ５では、既に観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御が終了しているので、即座に観察位置Ｒ２の位相差画像の撮像が行われ、次の観察位置Ｒ３に向かって走査される。そして、観察位置Ｒ２から観察位置Ｒ３まで走査された後、時刻ｔ６から観察位置Ｒ３のオートフォーカス制御が開始され、時刻ｔ７の時点でオートフォーカス制御を終了する。

従来のオートフォーカス制御の場合、結像光学系１４が、観察位置Ｒ２に到達した時点（図６の時刻ｔ５）から観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御が開始されるので、その分撮影時間が長くなり、特に、ウェル５２の底部の厚さが異なる場合には、その時間のロスが大きくなる。

本実施形態では、上述したように境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御の開始タイミングを早くすることによって、撮影時間の短縮を図ることができる。

なお、境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２以外の観察位置については、上述したように、その各観察位置に到達した時点からオートフォーカス制御を開始する。また、本実施形態においては、境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御を、境界部分Ｄの直前の観察位置Ｒ１のオートフォーカス制御の終了時点ｔ３から開始するようにしたが、これに限らず、観察位置Ｒのオートフォーカス制御の終了時点ｔ３から結像光学系１４が観察位置Ｒ２に到達する時刻ｔ５の前であれば、その他の時点でもよい。すなわち、図６に示すＴｄの間であればその他の時点でもよい。

また、本実施形態においては、境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２以外の観察位置のオートフォーカス制御のための時間（たとえば図６に示す時刻ｔ０〜時刻ｔ２までの時間であり、結像光学系１４が観察位置Ｒ０に到達した時点から観察位置Ｒ１に到達するまでの時間）よりも、境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御のための時間（たとえば図６に示すＴｄの時間であり、結像光学系１４が観察位置Ｒ１から観察位置Ｒ２に到達するまでの時間）の方が長くなるように設定されている。

また、上述したような境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２のオートフォーカス制御を行う場合、境界部分Ｄの直前の観察位置Ｒ１と境界部分Ｄの直後の観察位置Ｒ２のＸ−Ｙ平面内における座標位置を特定する必要がある。すなわち、境界部分Ｄを特定する必要がある。そこで、本実施形態においては、上述した第１または第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂによって隣接するウェル５２の境界部分Ｄを検出する。具体的には、境界部分Ｄには、ウェル５２の底面が存在しないので、明らかに第１または第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂによって検出される検出信号が異なるものとなる。したがって、たとえば第１または第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂによって検出された検出信号が、予め設定された閾値の範囲内であるかを判定することによって、境界部分Ｄを検出することができる。

次に、顕微鏡装置１０を制御する顕微鏡制御装置２０の構成について説明する。図７は、本実施形態の顕微鏡観察システムの構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡装置１０については、顕微鏡制御装置２０の各部により制御される一部の構成のブロック図を示している。

顕微鏡制御装置２０は、顕微鏡装置１０全体を制御するものであり、特に、オートフォーカス制御部２１、走査制御部２２および表示制御部２３を備えたものである。

顕微鏡制御装置２０は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えたコンピュータから構成されるものであり、ハードディスクに本発明の観察装置制御プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、この観察装置制御プログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図７に示すオートフォーカス制御部２１、走査制御部２２および表示制御部２３が機能する。

オートフォーカス制御部２１は、上述したように検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御するものである。そして、結像光学系駆動部１５の駆動によって結像光学系１４の対物レンズ１４ｂが光軸方向に移動し、オートフォーカス制御が行われる。そして、本実施形態のオートフォーカス制御部２１は、上述したように、隣接するウェルの境界部分の直後の観察位置と境界部分の直後の観察位置以外の観察位置とで、オートフフォーカス制御を開始するタイミングを切り換える。

走査制御部２２は、水平方向駆動部１７を駆動制御し、これによりステージ５１をＸ方向およびＹ方向に移動させるものである。水平方向駆動部１７は、圧電素子などを有するアクチュエータから構成されるものである。

本実施形態においては、上述したように走査制御部２２による制御によってステージ５１をＸ方向およびＹ方向に移動させ、培養容器５０内における観察位置を２次元状に走査し、各観察位置の位相差画像を撮像する。図８は、培養容器５０内における観察位置の走査位置を実線Ｍで示した図である。なお、本実施形態においては、培養容器５０として６つのウェル５２を有するウェルプレートを用いる。

図８に示すように、培養容器５０において、観察位置は、ステージ５１のＸ方向およびＹ方向の移動によって走査開始点Ｓから走査終了点Ｅまで実線Ｍに沿って走査される。すなわち、観察位置は、Ｘ方向の正方向（図８の右方向）に走査された後、Ｙ方向（図８の下方向）に走査され、逆の負方向（図８の左方向）に走査される。次いで、観察位置は、再びＹ方向に走査され、再びＸ方向の正方向に走査される。このように、ステージ５１のＸ方向についての往復移動とＹ方向への移動を繰り返し行うことによって、観察位置は、培養容器５０内を２次元状に走査される。

次に、図７に戻り、表示制御部２３は、顕微鏡装置１０によって撮像された各観察位置の位相差画像を結合することによって、１枚の合成位相差画像を生成し、その合成位相差画像を表示装置３０に表示させるものである。

表示装置３０は、上述したように表示制御部２３によって生成された合成位相差画像を表示するものであり、たとえば液晶ディスプレイなどを備えたものである。また、表示装置３０をタッチパネルによって構成し、入力装置４０と兼用するようにしてもよい。

入力装置４０は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。本実施形態の入力装置４０は、たとえば位相差レンズ１４ａの倍率の変更指示およびステージの移動速度の変更指示などの設定入力を受け付けるものである。

次に、本実施形態の顕微鏡観察システムの作用について、図９に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が、ステージ５１上に設置される（Ｓ１０）。

次に、ステージ５１が移動して結像光学系１４の観察位置が、図８に示す走査開始点Ｓの位置に設定され、ステージ５１の移動が開始される（Ｓ１２）。

ここで、本実施形態においては、上述したように各観察位置について、先行して培養容器５０のＺ方向の位置検出が行われ、その観察位置まで結像光学系１４が移動した時点において、位相差画像の撮像が行われる。そして、この培養容器５０のＺ方向の位置検出と位相差画像の撮像は、観察位置を走査しながら行われ、ある観察位置の位相差画像の撮像と、その観察位置よりも走査方向について前側の位置における培養容器５０のＺ方向の位置検出とが並行して行わる。

具体的には、図１０の矢印方向にステージ５１が往路移動している場合には、第１のオートフォーカス用変位センサ１８ａによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出され（Ｓ１４）、その検出された位置情報が、オートフォーカス制御部２１によって取得される。オートフォーカス制御部２１は、取得した培養容器５０のＺ方向の位置情報を、培養容器５０の観察位置のＸ−Ｙ座標とともに記憶する。

さらに、第１のオートフォーカス用変位センサ１８ａは、各観察位置の培養容器５０のＺ方向の位置検出と並行して、ウェルの境界部分の検出処理を行う（Ｓ１６）。そして、ウェルの境界部分が検出された場合には、そのＸ−Ｙ座標を記憶する。

次いで、Ｓ１４において第１のオートフォーカス用変位センサ１８ａによって培養容器５０の位置検出が行われた観察位置に向かって結像光学系１４が移動し、その観察位置のオートフォーカス制御が行われるが、上述したように観察位置によってオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える。

具体的には、観察位置が、隣接するウェルの境界部分に到達していない場合には（Ｓ１８、ＮＯ）、各観察位置に到達した時点からオートフォーカス制御を開始する（Ｓ２０）。具体的には、各観察位置における培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系１４の対物レンズ１４ｂのＺ方向への移動量を算出し、その移動量に基づいてオートフォーカス制御を行う。

一方、隣接するウェルの境界部分の直前の観察位置に到達した場合には、その観察位置のオートフォーカス制御が終了した時点から、次のウェルの境界部分の直後の観察位置（次のウェルの最初の観察位置）のオートフォーカス制御を開始する（Ｓ２２）。すなわち、境界部分の直後の観察位置における培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系１４の対物レンズ１４ｂのＺ方向への移動量を算出し、その移動量に基づいてオートフォーカス制御を行う。

そして、各観察位置についてオートフォーカス制御が終了した後（Ｓ２４）、位相差画像の撮像を行う（Ｓ２６）。各観察位置の位相差画像は、撮像素子１６から表示制御部２３に出力されて記憶される。

そして、往路移動が終了し、図１１に示すように復路移動に切り換えられた場合には、使用する変位センサが第１のオートフォーカス用変位センサ１８ａから第２のオートフォーカス用変位センサ１８ｂに切り換えられる。

そして、この時点において、全ての走査が終了していない場合には（Ｓ２８，ＮＯ）、ステージ５１が復路移動し、Ｓ１４〜Ｓ２８の処理が行われる。

ステージ５１の移動方向が切り換えられる度に使用する変位センサが切り換えられ、全ての走査が終了するまでＳ１４〜Ｓ２６までの処理が繰り返して行われる。そして、観察位置が、図８に示す走査終了点Ｅの位置に到達した時点において全ての走査が終了する（Ｓ２８，ＹＥＳ）。

全ての走査が終了した後、表示制御部２３は、各観察位置Ｒの位相差画像を結合して合成位相差画像を生成し（Ｓ３０）、その生成した合成位相差画像を表示装置３０に表示させる（Ｓ３２）。

上記実施形態の顕微鏡観察システムによれば、培養容器５０内の観察位置毎のオートフォーカス制御を行う際、観察位置の走査方向に隣接するウェル５２の境界部分Ｄに基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換えるようにしたので、オートフォーカス制御をより効率的に行い、撮影時間の短縮を図ることができる。

なお、上記実施形態においては、ウェルの境界部分を第１または第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂによって検出するようにしたが、これに限らず、ウェルの境界部分を予め取得して記憶しておいてもよい。具体的には、図１２に示すように、ウェルの境界部分の位置情報を記憶する記憶部２４を設け、オートフォーカス制御部２１が、記憶部２４に記憶された境界部分の位置情報に基づいて、オートフォーカス制御の開始タイミングを切り換えるようにしてもよい。

また、このようにウェルの境界部分の位置情報を記憶する場合には、培養容器５０毎に識別情報を付与し、その識別情報とウェルの境界部分の位置情報を対応付けたテーブルを予め設定しておいてもよい。このようなテーブルを設けることによって、たとえばウェルの数が異なる培養容器５０が設置された場合でも、上述したようなオートフォーカス制御の開始タイミングの切り換えを適切に行うことができる。なお、培養容器５０の識別情報については、ユーザが入力装置４０を用いて設定入力するようにしてもよいし、培養容器５０に対し、識別情報が記憶されたバーコードまたはＲＦＩＤ（Radio frequency identification）タグを設け、こられから識別情報を読み出すようにしてもよい。

また、上記実施形態の顕微鏡観察システムにおいては、第１および第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂを用いてウェルの境界部分を検出するようにしたが、これに限らず、第１および第２のオートフォーカス用変位センサ１８ａ，１８ｂの他にウェル境界検出用のセンサを設けるようにしてもよい。

また、上記実施形態の顕微鏡観察システムにおいては、培養容器５０として複数のウェル５２を有するウェルプレートを用いるようにしたが、本発明の容器としてシャーレを用い、複数のシャーレをステージ５１上に設置するようにしてもよい。上記実施形態においては、観察位置の走査方向に隣接するウェル５２の境界部分に基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換えるようにしたが、複数のシャーレをステージ５１上に設置する場合には、観察位置の走査方向に隣接するシャーレの境界部分に基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換えるようにすればよい。

具体的には、上述したウェル５２をシャーレに置き換えればよく、シャーレの境界部分の直後の観察位置のオートフォーカス制御を、たとえば境界部分の直前の観察位置のオートフォーカス制御の終了時点から開始するようにすればよい。そして、境界部分の直後以外の観察位置については、その観察位置に結像光学系１４が到達した時点からオートフォーカス制御を開始するようにすればよい。

また、上記実施形態においては、培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出するようにしたが、たとえば、培養容器５０の底面にキズまたは汚れの付着などがあり、検出部１８によって検出される検出信号が異常である場合には、適切なオートフォーカス制御を行うことができない。図１３は、培養容器５０の底面にキズまたは汚れの付着などがある場合において、検出部１８によって検出された検出信号に基づくＺ方向の位置を示す図である。図１３に示すＳ１の範囲は、各ウェル５２の底面の範囲であり、Ｓ３の範囲は、ウェル５２の境界部分Ｄの範囲である。そして、図１３に示すＳ２の範囲が、培養容器５０の底面におけるキズまたは汚れの付着の範囲である。

そこで、オートフォーカス制御部２１が、検出部１８によって検出された検出信号が異常である場合には、その異常な検出信号が検出された観察位置については、その観察位置の走査方向について前後の観察位置の検出部１８の検出信号に基づくオートフォーカス制御を行うようにしてもよい。図１３に示すような検出信号の場合には、Ｓ２の範囲については検出部１８によって検出された検出信号を用いず、Ｓ２の範囲の直前および／または直後の観察位置の検出信号を用いてオートフォーカス制御を行う。

具体的には、たとえばＳ２の範囲の直前の観察位置の検出信号と直後の観察位置の検出信号の平均値を用いて、Ｓ２の範囲の観察位置のオートフォーカス制御を行うようにすればよい。また、平均値に限らず、Ｓ２の範囲の直前の観察位置の検出信号または直後の観察位置の検出信号を用いるようにしてもよいし、Ｓ２の範囲の直前の観察位置の検出信号と直後の観察位置の検出信号とを用いて線形補間を行って、Ｓ２の範囲の観察位置の検出信号を取得するようにしてもよい。また、Ｓ２の範囲の直前および直後の観察位置だけでなく、Ｓ２の範囲の前の２以上の観察位置の検出信号と、Ｓ２の範囲の後の２以上の観察位置の検出信号とを用いて線形補間を行うことによって、Ｓ２の範囲の検出信号を取得するようにしてもよい。

なお、上記実施形態においては、ステージ５１を移動させることによって、培養容器５０内の観察位置を走査するようにしたが、これに限らず、結像光学系１４、検出部１８および撮像素子１６からなる撮影系を移動させるようにしてもよい。また、ステージ５１と撮影系との両方を移動させるようにしてもよい。

また、上記実施形態は、本発明を位相差顕微鏡に適用したものであるが、本発明は、位相差顕微鏡に限らず、微分干渉顕微鏡および明視野顕微鏡などのその他の顕微鏡に適用するようにしてもよい。

また、上記実施形態においては、結像光学系１４によって結像された位相差画像を撮像素子１６によって撮像するようにしたが、撮像素子を設けることなく、結像光学系１４によって結像された観察対象の位相差像をユーザが直接観察できるように観察光学系などを設けるようにしてもよい。

１０ 顕微鏡装置
１１ 白色光源
１２ コンデンサレンズ
１３ スリット板
１４ 結像光学系
１４ａ 位相差レンズ
１４ｂ 対物レンズ
１４ｃ 位相板
１４ｄ 結像レンズ
１５ 結像光学系駆動部
１６ 撮像素子
１７ 水平方向駆動部
１８ 検出部
１８ａ 第１のオートフォーカス用変位センサ
１８ｂ 第２のオートフォーカス用変位センサ
２０ 顕微鏡制御装置
２１ オートフォーカス制御部
２２ 走査制御部
２３ 表示制御部
２４ 記憶部
３０ 表示装置
４０ 入力装置
５０ 培養容器
５１ ステージ
５１ａ 開口
５２ ウェル
５２ａ 底部
Ｄ 境界部分
Ｅ 走査終了点
Ｌ 照明光
Ｍ 走査位置を示す実線
Ｒ 観察位置
Ｒ１ 観察位置
Ｒ２ 観察位置
Ｓ 走査開始点

Claims (12)

1. 観察対象が収容される複数の容器が設置されるステージと、
   前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系と、
   前記ステージおよび前記結像光学系の少なくとも一方を水平面内において移動させる水平方向駆動部と、
   該水平方向駆動部を制御して、前記ステージおよび前記結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、前記ステージ内の観察位置を走査する走査制御部と、
   前記対物レンズを光軸方向に移動させる結像光学系駆動部と、
   前記結像光学系駆動部を制御して、前記観察位置毎のオートフォーカス制御を行うオートフォーカス制御部とを備え、
   前記オートフォーカス制御部が、前記観察位置の走査方向に隣接する前記容器の境界部分に基づいて、前記観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える観察装置。
2. 前記オートフォーカス制御部が、前記境界部分の直後の観察位置のオートフォーカス制御を、前記境界部分の直前の観察位置のオートフォーカス制御の終了時点から前記境界部分の直後の観察位置に前記結像光学系が到達する前までの間に開始する請求項１記載の観察装置。
3. 前記オートフォーカス制御部が、前記境界部分の直後以外の観察位置については、該観察位置に前記結像光学系が到達した時点からオートフォーカス制御を開始する請求項２記載の観察装置。
4. 前記境界部分の直後の観察位置のオートフォーカス制御のための時間が、前記境界部分の直後以外の観察位置のオートフォーカス制御のための時間よりも長い請求項２または３記載の観察装置。
5. 前記結像光学系が観察位置に到達する前に、先行して前記観察位置における前記ステージ上に設置された前記容器の鉛直方向の位置を検出する検出部を備え、
   前記オートフォーカス制御部が、前記検出部の検出信号に基づいて、前記各観察位置のオートフォーカス制御を行う請求項１から４いずれか１項記載の観察装置。
6. 前記検出部が、前記対物レンズを挟んで前記走査方向について並べて設けられた少なくとも２つの変位センサを有し、前記走査方向の向きの変更に応じて、使用する前記変位センサを切り換える請求項５記載の観察装置。
7. 前記検出部が、前記容器の境界部分を検出する請求項５または６項記載の観察装置。
8. 前記オートフォーカス制御部が、前記検出部によって検出された検出信号が異常である場合には、前記異常な検出信号が検出された観察位置については、該観察位置の前記走査方向について前後の観察位置の前記検出部の検出信号に基づくオートフォーカス制御を行う請求項５から７いずれか１項記載の観察装置。
9. 前記容器の境界部分の位置情報を記憶する記憶部を備え、
   前記オートフォーカス制御部が、前記記憶部に記憶された境界部分の位置情報に基づいて、前記オートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える請求項１から６いずれか１項記載の観察装置。
10. 前記容器が、ウェルプレートの各ウェルである請求項１から９いずれか１項記載の観察装置。
11. 観察対象が収容される複数の容器が設置されるステージおよび前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、前記ステージ内の観察位置を走査して前記観察対象を観察する観察方法において、
    前記対物レンズを光軸方向に移動させて、前記観察位置毎のオートフォーカス制御を行う際、
    前記観察位置の走査方向に隣接する前記容器の境界部分に基づいて、前記観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える観察方法。
12. 観察対象が収容される複数の容器が設置されるステージおよび前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、前記ステージ内の観察位置を走査する手順をコンピュータに実行させる観察装置制御プログラムであって、
    前記対物レンズを光軸方向に移動させて、前記観察位置毎のオートフォーカス制御を行う手順をさらに前記コンピュータに実行させる観察装置制御プログラムにおいて、
    前記観察位置の走査方向に隣接する前記容器の境界部分に基づいて、前記観察位置毎のオートフォーカス制御の開始タイミングを切り換える手順を前記コンピュータに実行させる観察装置制御プログラム。