JP2018054459A - ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法、誘導体化試薬キット、および分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】誘導体化の際に、得られる誘導体の分解が抑制されたｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法、誘導体化試薬キット、および正確な定量分析が可能な、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る誘導体化法は、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン型誘導体化試薬を用いて誘導体化する、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法であって、前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止工程において、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤を添加する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法、誘導体化試薬キット、および分析方法を提供することにある。

病院での臨床検査等において、質量分析計（以下、「ＭＳ」とも呼ぶ。）を用いた分析が知られている。特に、化合物を高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）で分離し、分離された物質をＭＳでイオン化して分析する液体クロマトグラフィ−質量分析計（以下、「ＬＣ／ＭＳ」とも呼ぶ。）によるホルモン等の生体由来物質の分析は、従来から用いられているイムノアッセイ等と比較して高感度かつ高特異性があり、さらには、多項目の同時分析が可能なことから、近年急速に普及しつつある。ＬＣ／ＭＳの中でも、特にＭＳとしてタンデム質量分析計（以下、「ＭＳ／ＭＳ」とも呼ぶ。）を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量分析では、ＬＣ／ＭＳよりも高感度な選択反応検出（以下、「ＳＲＭ」とも呼ぶ。）モードを用いることにより、選択的に複数の物質を定量分析することが可能となる。

これらのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる生体由来物質の分析の１つとして、近年、血中のビタミンＤ（以下、「Ｖ．Ｄ．」とも呼ぶ。）およびビタミンＤ代謝物の分析が注目されている。ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物であり、カルシウム代謝調節に必須な脂溶性ビタミンであるビタミンＤは、活性型ビタミンＤ（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、以下、「１，２５（ＯＨ）_２Ｄ」とも呼ぶ。）として、血中のカルシウム（Ｃａ^２＋）濃度を高める作用を有する。この作用に加え、１，２５（ＯＨ）_２Ｄや２５−ヒドロキシビタミンＤ（以下、「２５（ＯＨ）Ｄ」とも呼ぶ。）等の生体内代謝物は、細胞の分化・増殖、ホルモンの産生・分泌、免疫反応等に関与するタンパク質の発現制御に重要な役割を果たしていると考えられている。このため、作用機構および機能の観点により、ビタミンＤはホルモンに分類されることがある。

このように、ビタミンＤおよびビタミンＤ代謝物（以下、両者をまとめて「ビタミンＤ」とも呼ぶ。）は、栄養素としての役割と共に多岐にわたる生理活性を有しているため、ビタミンＤの過不足は様々な疾患の罹患性を高めると考えられている。このため、血中のビタミンＤの測定件数は増加している。そして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるビタミンＤの分析により、活性が異なる個別の物質を、従来よりも感度よく正確に分析することが可能となっている。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで用いられるイオン化法として、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）やＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）等が利用されている。中でもＥＳＩは、最もフラグメンテーションを起こし難く、適用可能な化合物の範囲の広さと高い操作性から、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで最も汎用されるイオン化法である。しかしながら、一般的にビタミンＤ代謝物のＥＳＩ応答性は低く、また、血中のビタミンＤ代謝物は微量成分であるため、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いても感度が不足する場合がある。そこで、ビタミンＤ代謝物のイオン化効率を高めることによりＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける検出感度を向上させる目的で、例えば、クックソン（Ｃｏｏｋｓｏｎ）型誘導体化試薬の１つであるＰＴＡＤ（４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）を用いて誘導体化した後に分析することがある（例えば、特許文献１参照。）。ビタミンＤをＰＴＡＤで誘導体化することにより、誘導体化前と比較して感度が向上し、また、高選択的な検出が可能となる。

しかし、例えば、新生児から採取した血液等の微量の試料を測定するためには、更なる感度の向上が望まれる。そこで、発明者らは、新規なクックソン型誘導体化試薬として、ＤＡＰＴＡＤ（４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）を開発した（例えば、非特許文献１参照。）。ＤＡＰＴＡＤにより誘導体化したビタミンＤは、誘導体化前と比較して約１００倍にシグナル強度が増大しているため、微量の試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析するのに好適である。これは、従来より用いられているＰＴＡＤと比較しても、約１０倍のシグナル強度である。さらに、ビタミンＤ代謝物の１つである２５（ＯＨ）ＤをＤＡＰＴＡＤで誘導体化することにより、不活性妨害代謝物である３−エピ体（３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ）等の構造異性体を区別して定量することも可能となり、従来の方法よりも更に選択性が向上している。

特開２０１５−１６６７４０号公報

Ｓ.Ｏｇａｗａ，ｅｔ ａｌ、Ｒａｐｉｄｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍ，２５，２４５３−２４６０（２０１３）

上記のように、ＤＡＰＴＡＤによる誘導体化は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたビタミンＤの分析に好適であるが、発明者らは、ビタミンＤ代謝物のＤＡＰＴＡＤ誘導体は、ＤＡＰＴＡＤを合成する際に用いる酸化剤等の影響により、誘導体化の際にその一部が分解する場合があることに気がついた。あるビタミンＤ代謝物のＤＡＰＴＡＤ誘導体が分解すると、他の内因性のビタミンＤ代謝物のＤＡＰＴＡＤ誘導体と同じ構造になる場合も見られたため、ビタミンＤ代謝物の正確な定量分析が難しくなる。

本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、誘導体化で得られる誘導体の分解を抑制したｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法、および誘導体化試薬キットを提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、正確な定量分析が可能な、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法を提供することにある。

（１）本発明に係る誘導体化法は、
ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン（Ｃｏｏｋｓｏｎ）型誘導体化試薬を用いて誘導体化する、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法であって、
前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止工程において、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤を添加する。

このような誘導体化法では、誘導体化反応を停止させる反応停止工程において、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を誘導体化して得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤を添加することにより、クックソン型誘導体化試薬の製造時に使用して微量残留した酸化剤が分解されるため、得られる誘導体の分解を抑制することができる。

（２）本発明に係る誘導体化法において、
前記クックソン型誘導体化試薬は、４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）であってもよい。

このような誘導体化法では、得られるＤＡＰＴＡＤ誘導体の分解を抑制することができる。

（３）本発明に係る誘導体化法において、
前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物は、ステロイドであってもよい。

このような誘導体化法では、得られる誘導体の分解を抑制することができる。

（４）本発明に係る誘導体化法において、
前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物は、ビタミンＤまたはビタミンＤ代謝物であってもよい。

このような誘導体化法では、得られる誘導体の分解を抑制することができる。

（５）本発明に係る誘導体化法において、
前記分解防止剤は、アンモニアまたはアミンであってもよい。

このような誘導体化法では、アンモニアまたはアミンを分解防止剤として用いることにより、得られる誘導体の分解を抑制することができる。

（６）本発明に係る誘導体化法は、
前記分解防止剤は、トリエチルアミンであってもよい。

このような誘導体化法では、トリエチルアミンを誘導体の分解防止剤として用いることにより、得られる誘導体の分解を抑制することができる。

（７）本発明に係る誘導体化法において、
前記クックソン型誘導体化試薬は、安定同位体標識化合物であってもよい。

このような誘導体化法では、クックソン型誘導体化試薬が安定同位体標識化合物であっても分解が抑制され、さらには、安定同位体標識化合物で誘導体化することにより、質量分析計によって分析する際の選択性が向上する。

（８）本発明に係る誘導体化試薬キットは、
ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン型誘導体化試薬を用いて誘導体化するための誘導体化試薬キットであって、
前記誘導体化試薬キットは、クックソン型誘導体化試薬と、前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止剤と、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤と、を含む。

このような誘導体化試薬キットでは、得られる誘導体の分解が抑制され、正確な定量分析が可能な試薬キットを提供することができる。

（９）本発明に係るｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法は、
本発明に係る誘導体化法により得られる誘導体を質量分析計によって分析する。

このようなｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法では、本発明に係る誘導体化法により得られる誘導体を質量分析計によって分析するため、正確な定量分析が可能となる。

２５（ＯＨ）Ｄ_３と３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３をＰＴＡＤで誘導体化して得られたマスクロマトグラムを示す図。 ２５（ＯＨ）Ｄ_３と３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤで誘導体化して得られたマスクロマトグラムを示す図。 ２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 ２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 比較例１のマスクロマトグラムを示す図。 実施例１のマスクロマトグラムを示す図。 比較例２のマスクロマトグラムを示す図。 実施例２のマスクロマトグラムを示す図。 比較例３のマスクロマトグラムを示す図。 実施例３のマスクロマトグラムを示す図。 比較例４のマスクロマトグラムを示す図。 実施例４のマスクロマトグラムを示す図。

以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

１．１． 誘導体化法
まず、本実施形態に係る誘導体化法について説明する。本発明の一実施形態に係る誘導体化法は、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン（Ｃｏｏｋｓｏｎ）型誘導体化試薬を用いて誘導体化する、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法であって、前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止工程において、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤を添加するものである。

本実施形態に係る誘導体化法で得られる誘導体は、反応停止工程において分解防止剤を添加することにより、クックソン型誘導体化試薬の製造時に使用して残留した酸化剤が分解される。これにより、得られる誘導体の分解が防止されるため、誘導体が高収率で得られるだけでなく、残留した酸化剤の影響で生成する分解物等も減少する。このため、本実施形態に係る誘導体化法で得られる誘導体を、ＭＳ、特に、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（以下、「ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ」とも呼ぶ。）によって分析することにより、感度および選択性が高く、正確な定量分析が可能となる。

なお、本明細書において、「誘導体」とは、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物のｓ−ｃｉｓ−ジエン部分にクックソン型誘導体化試薬が付加することにより形成された化合物を意味する。また、本明細書において、「誘導体化」とは、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物にクックソン型誘導体化試薬を付加させて、誘導体を形成することを意味する。さらに、本明細書において、「誘導体化反応」とは、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物にクックソン型誘導体化試薬を反応させて誘導体を形成するための反応を意味する。また、本明細書において、「反応停止工程」とは、この誘導体化反応を行っている反応溶液中に反応停止剤を添加することにより、誘導体化反応を停止する工程を意味する。

１．１．１． ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物
本実施形態に係る誘導体化法で誘導体化の対象となる化合物は、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物である。ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、ステロイド、ビタミンＤまたはビタミンＤ代謝物等が挙げられる。これらのｓ
−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物は、後述するクックソン型誘導体化試薬とディールス・アルダー反応により定量的に反応して誘導体化され、特にＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる分析において、高感度および高選択性な定量分析が可能となる。

ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物のうち、ステロイドとしては、特に限定されないが、天然に存在する化合物に限られず、合成物やその類縁体であってもよく、例えば、７−デヒドロコレステロール、エルゴステロール、共役リノール酸、ビタミンＡ等が挙げられる。

ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物のうち、ビタミンＤは、広義の分類ではセコステロイドに属し、植物性食品に由来するビタミンＤ_２と動物性食品や皮膚産生に由来するビタミＤ_３の総称である。両者は側鎖構造のみが異なる同族体であり、ヒトの体内では同様に代謝され、同等の生理活性を有すると考えられている。このため、本明細書においては、両者を区別せず、単にビタミンＤと表記する。また、本明細書において、ビタミンＤおよびビタミンＤ代謝物を単にビタミンＤとも呼ぶが、これらは、天然若しくは合成により得られたビタミンＤ又はビタミンＤ代謝の中間体及び生成物等の、ビタミンＤの変換により生成したビタミンＤに関連するいずれかの分子種を意味する。

そのようなビタミンＤの分子種としては、特に限定されないが、例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（２５（ＯＨ）Ｄ_３）、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２（２５（ＯＨ）Ｄ_２）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）、２３，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２３，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）、２５，２６−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２５，２６（ＯＨ）_２Ｄ_３）、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）、４β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（４β，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）等が挙げられる。ビタミンＤの分子種は、前記の分子種の異性体であってもよく、例えば、３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（３−エピ−２５（ＯＨ）Ｄ_３）等が挙げられる。また、これらのビタミンＤの分子種は硫酸塩であってもよく、例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３−３β−硫酸塩（２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ）等が挙げられる。なお、ビタミンＤの定量分析の際には、これらのビタミンＤの分子種が複数種含まれていても構わない。

１．１．２． クックソン型誘導体化試薬
本実施形態に係る誘導体化法において、上記のｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物は、クックソン型誘導体化試薬によって誘導体化される。クックソン型誘導体化試薬は、化合物のｓ−ｃｉｓ−ジエンと選択的に反応し、ディールス・アルダー反応により定量的に誘導体を形成する。

そのようなクックソン型誘導体化試薬としては、公知および市販のクックソン型誘導体化試薬を使用することが可能であり、特に限定されないが、例えば、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）等が挙げられる。これらのクックソン型誘導体化試薬は、１種単独で用いてもよいし、２種以上混合して用いてもよい。これらの中でも、感度、選択性および安定性の観点から、クックソン型誘導体化試薬としては、ＤＡＰＴＡＤを用いることが好ましい。

本実施形態において、上記のクックソン型誘導体化試薬は、安定同位体標識化合物であ
ってもよい。クックソン型誘導体化試薬として安定同位体標識化合物を用いることにより、得られる誘導体を質量分析計によって分析する際の選択性が向上する。特に、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるＳＲＭモードにおいてトランジションの選択の幅が広がるため、より多くの検体および項目を同時に分析することが可能となる。なお、標識化に用いる安定同位体としては、Ｄ（重水素）、^１３Ｃ（炭素１３）、^１５Ｎ（窒素１５）が挙げられる。また、安定同位体標識化合物は１種単独で用いてもよいし、２種以上混合して用いてもよく、また、安定同位体標識化されていないクックソン型誘導体化試薬と同時に用いても構わない。

１．１．３． 分解防止剤
本実施形態に係る誘導体化法において、得られる誘導体の分解を防止するために用いられる分解防止剤としては、容易に揮発して、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる分析の際に、ＬＣでの分離や、ＥＳＩによるイオン化に影響を与えない化合物であれば、特に限定されず使用可能である。

本実施形態で使用可能な分解防止剤としては、例えば、アンモニアまたはアミンが挙げられる。アミンは、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンのいずれも使用可能である。これらの中でも特に、アンモニア、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミン、メチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミンを用いることが、得られる誘導体の分解防止の点で好ましい。

１．１．４． クックソン型誘導体化試薬による誘導体化
本実施形態に係る誘導体化法において、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物をクックソン型誘導体化試薬により誘導体化する際には、例えば、所定量のｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物をガラス製の共栓付遠心沈殿管に移し、Ｎ_２気流下で溶媒を留去し、これに、所定量および濃度のクックソン型誘導体化試薬溶液を加えて反応させることにより行う。

そして、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止工程において、例えば、エタノール等のアルコールを含む反応停止剤溶液を添加して誘導体化反応を停止させる際に、上記の分解防止剤を、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物とクックソン型誘導体化試薬の反応溶液に添加する。分解防止剤は、反応停止工程において反応液に含まれていれば、得られる誘導体の分解を防止する効果が得られるため、分解防止剤は反応停止工程の前に反応液に添加されていてもよく、また、反応停止剤溶液中に添加されていてもよい。

１．２． 誘導体化試薬キット
次に、本実施形態に係る誘導体化試薬キットについて説明する。本発明の一実施形態に係る誘導体化試薬キットは、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン型誘導体化試薬を用いて誘導体化するための誘導体化試薬キットであって、前記誘導体化試薬キットは、クックソン型誘導体化試薬と、前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止剤と、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤と、を含むものである。

このような誘導体化試薬キットは分解防止剤を含むため、このキットを用いてｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を誘導体化すると、得られる誘導体の分解が抑制され、誘導体が高収率で得られるだけでなく、分解に伴って生成した分解物等が少ない。このため、本実施形態に係る誘導体化試薬キットを用いてｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を誘導体化した場合には、特に、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いたｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析において、正確な定量分析が可能となる。

なお、本実施形態に係る誘導体化試薬キットは、クックソン型誘導体化試薬と、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止剤と、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤とは、それぞれが溶液の状態で別個の容器に保蔵されていてもよい。また、反応停止剤と分解防止剤とは、同じ容器中に溶液の状態で保存されていてもよい。

１．３． ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法
次に、本実施形態に係るｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法について説明する。本実施形態に係るｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法は、上記実施形態に係る誘導体化法により得られる誘導体を質量分析計によって分析するものである。

本実施形態に係るｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法では、本実施形態に係る誘導体化法により得られる誘導体を質量分析計によって分析するため、感度および選択性が高く、正確な定量分析が可能となる。

本実施形態に係るｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法は、例えば、次のようにして行う。

まず、本実施形態に係る誘導体化試薬キットを用いて、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン型誘導体化試薬により誘導体化する。次に、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止工程において、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤を反応溶液に添加する。

こうして得られたｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体を含む溶液の一部をそのまま、または、Ｎ_２気流等を用いて溶媒を留去し、得られた残渣をＬＣ用の移動相に溶解させたその一部を、例えば、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに付すことにより行う。

なお、分析対象であるｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物は、標準品以外の生体試料の場合は、誘導体化の前に固相抽出や液液抽出等の抽出操作を行い、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を抽出および粗精製することが好ましい。このような操作を行うことにより、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおいて、より正確な定量分析が可能となる。

ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いた定量分析では、ＳＲＭモードを用い、適宜トランジッションを選択することにより、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析を行う。その際に用いるＬＣ用のカラムや移動相等の測定条件は、分析対象および使用する装置に応じて適宜選択する。また、イオン化法は、上記したＥＳＩやＡＰＣＩが好ましいが、ＦＡＢ（高速原子衝突）等の他のイオン化法であっても構わない。また、質量分析計はＭＳ／ＭＳであることが好ましいが、ＭＳは１つであっても分析可能である。

２．実施例
以下、本発明を実験例および比較例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例等の記載において、特に言及しない限り「％」は「質量％」の意味で用いる。

なお、以下の実施例では、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン型誘導体化試薬を用いて誘導体化する誘導体化法の一例として、４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）を用いたビタミンＤの誘導体化の例を示す。なお、以下の例では、分解防止剤としてトリエチルアミンを用いている。

２．１． ＤＡＰＴＡＤ（１）の合成
下記スキームに基づき、ＤＡＰＴＡＤ（１）を合成した。

２．１．１． ４−ジメチルアミノベンゾイルアジド（３）の合成［工程（ｉ）］
３０ｍｌナス型フラスコに、市販の４−（ジメチルアミノ）ベンゾイルクロリド（２；２００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、アセトン１５ｍｌで溶解させた。これを氷冷し、アジ化ナトリウム（１００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）水溶液０．５ｍｌを滴下した。この溶液を大気圧下にて氷冷しながら、１時間撹拌した。得られた反応液を酢酸エチル２５ｍｌで希釈し、飽和食塩水２５ｍｌを用いて３回洗浄した（２５ｍｌ×３）。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、その後溶媒を減圧留去した。その後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（Ｍｅｒｃｋ製、商品名「Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０(６３−２００μｍ)」、カラムサイズ；１５０×１２ｍｍｉ．ｄ．）に付した。ヘキサン−酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去し、４−ジメチルアミノベンゾイルアジド（３）を無色固体（１５７ｍｇ、７６％、０．８ｍｍｏｌ）として得た。

２．１．２． １−エトキシカルボニル−４−（４’−ジメチルアミノフェニル）セミカルバジド（５）の合成［工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）］
得られた４−ジメチルアミノベンゾイルアジド（３）（１５７ｍｇ、７６％、０．８ｍｍｏｌ）を３０ｍｌナス型フラスコに移した後、トルエン５ｍｌで溶解し、大気圧下で２０分還流して化合物（４）に変換した［工程（ｉｉ）］。化合物（４）を単離することなく、反応液にカルバジン酸エチル（１００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液を５ｍｌ加え、大気圧下、室温で１時間撹拌した。その後、１時間還流した。得られた反応液を放冷した後、生成した沈殿物を吸引ろ過し、１−エトキシカルボニル−４−（４’−ジメチルアミノフェニル）セミカルバジド（５）を無色固体（２１３ｍｇ、９７％）として得た［工程（ｉｉｉ）］。得られた１−エトキシカルボニル−４−（４’−ジメチルアミノフェニル）セミカルバジド（５）は、精製することなく次の反応に用いた。

２．１．３． ４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン（６）の合成［工程（ｉｖ）］
得られた１−エトキシカルボニル−４−（４’−ジメチルアミノフェニル）セミカルバジド（５）を３０ｍｌナス型フラスコに移し、炭酸カリウム（１００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の水溶液１０ｍｌを加え、大気圧下、９０℃で３時間撹拌した。ユニバーサルｐＨ試験紙で確認しながら反応液に酢酸を加え、反応液のｐＨを約６に調整した。溶媒を減圧留去後、ＯＤＳカラムクロマトグラフィ−（和光純薬工業製、商品名「ｗａｋｏｇｅｌ(R)１００Ｃ１８(６３−２１２μｍ)」、カラムサイズ；３００×１０ｍｍｉ．ｄ．）に付し
た。５０ｍｌの水（Ｈ_２Ｏ）にて酢酸カリウム等を取り除いた後、メタノール（ＭｅＯＨ）−水（１：１、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去後、水により再結晶させ、４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン（６）の茶色不定形結晶（５２．４ｍｇ、６３％）を得た。

２．１．４． ４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ：１）の合成［工程（ｖ）］
得られた４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン（６；４ｍｇ、９．１μｍｏｌ）を１０ｍｌのふた付き試験管に移し、酢酸エチル１０ｍｌを加えて懸濁し、ヨードベンゼンジアセテート（６ｍｇ、９．３μｍｏｌ）を加え、大気圧下室温で３時間撹拌した。反応液を遠心分離（１０００ｇ、１０分）し、上清をＤＡＰＴＡＤ（１）の酢酸エチル溶液（４μｇ／１０μｌ）として保存した。なお、ビタミンＤの誘導体化には、このＤＡＰＴＡＤ酢酸エチル溶液をそのまま使用した。

２．２． ＤＡＰＴＡＤ誘導体Ｖ．Ｄ．のＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定
２．２．１． Ｖ．Ｄ．のＤＡＰＴＡＤ誘導体化
ビタミンＤ_３代謝物[２５（ＯＨ）Ｄ_３あるいは２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ]の標準品を１０ｍｌのガラス製の共栓付遠心沈殿管に移し、Ｎ_２気流下で溶媒を留去した。これに、２．１．で得られたＤＡＰＴＡＤ酢酸エチル溶液（４μｇ／１０μｌ；５０μｌ）を加え、室温で１時間放置した後、０．１％トリエチルアミンを含むエタノール４０μｌを加えて、反応を停止させた。Ｎ_２気流下溶媒を留去後、残渣を移動相１００μｌに溶解し、その一部（１０μｌ）をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに付した。なお、比較例では、反応を停止させる際に、トリエチルアミンを添加していないエタノール４０μｌを用いた。

２．２．２．使用した装置
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、日本ウォーターズ株式会社製、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標） Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ 三連四重極質量分析計に、日本ウォーターズ株式会社製、ＬＣ−ｅ２６９５クロマトグラフィ−を接続して使用し、イオン化法にはＥＳＩを用い、下記分析条件で分析した。

２．２．３．分析条件
分析対象：２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８ ＲＳ（粒子径３μｍ、カラムサイズ１５０×２．０ｍｍｉ．ｄ．）
カラム温度：４０℃
移動相：０．０５％ギ酸含有メタノール−１０ｍＭギ酸アンモニウム（４：１、ｖ／ｖ）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
イオン化モード：ＥＳＩ（＋）
キャピラリー電圧：２．８０ｋＶ
コーン電圧：４０Ｖ[２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ]、３５Ｖ[２５（ＯＨＤ）_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ]または３０Ｖ[２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ]
ＣＥ：２５ｅＶ
ソース温度：１２０℃
脱溶媒温度：３５０℃
脱溶媒ガス（Ｎ_２）流量：６００Ｌ／ｈ
コーンガス（Ｎ_２）流量：５０Ｌ／ｈ
コリジョンガス（Ａｒ）流量：０．１９ｍｌ／ｍｉｎ
ＳＲＭで使用したトランジション：
ｍ／ｚ ６１９．６→ｍ／ｚ ３４１．３[２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ]
ｍ／ｚ ５５８．４→ｍ／ｚ ２９８．０[２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＰＴＡＤ]
ｍ／ｚ ６９９．６→ｍ／ｚ ４２１．２[２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ]
なお、データの解析には、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標） ＭａｓｓＬｉｎｘ ４．１ソフトウェア内の自動処理システムであるＱｕａｎＬｉｎｘを用いた。

２．２．４．分析結果
まず、図１−４により、ＰＴＡＤよりもＤＡＰＴＡＤの方が、高感度かつ高選択性であることを示す。図１は同一量に調整した（１インジェクションあたり２ｐｇ相当量）２５（ＯＨ）Ｄ_３と３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３をＰＴＡＤで誘導体化して得られたマスクロマトグラムであり、図２は同一量に調整した（１インジェクションあたり２ｐｇ相当量）２５（ＯＨ）Ｄ_３と３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤで誘導体化して得られたマスクロマトグラムである。図１に示すように、ＰＴＡＤ誘導体では２５（ＯＨ）Ｄ_３と３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３とは分離していないが、図２に示すように、ＤＡＰＴＡＤ誘導体では２５（ＯＨ）Ｄ_３と３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３とが明瞭に分離され、選択性が向上した。

なお、ＰＴＡＤ、ＤＡＰＴＡＤに限らず、クックソン型試薬は、ビタミンＤ代謝物のα，βの両面から攻撃し、６位のエピマーが生成する。このため、２５（ＯＨ）Ｄ_３のピークとして、２５（ＯＨ）Ｄ_３と反応する６Ｒ体（クロマトでは先に溶出する）と、６Ｓ体（クロマトでは後に溶出する主成績体）の２つのピークが存在する。そして、３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３では、６Ｒ、６Ｓが分離せずに共溶出するため、誘導体のピークは１本として観測された。また、図１、２の相対イオン強度を比較すると、図２に示すＤＡＰＴＡＤ誘導体では相対イオン強度が６４９０ｃｐｓと高い結果となった。

上記結果を、ＤＡＰＴＡＤ誘導体イオン強度を基準にして表示した例を図３、４に示す。図３は２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＰＴＡＤのマスクロマトグラムであり、図４は２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムである。図３、４を比較すると、図４の方が相対イオン強度が高く、ＤＡＰＴＡＤ誘導体化による効果が見られた。

次に、図５−１２に、本実施形態に係る誘導体化法による効果を示す。

まず、図５−８により、２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤを用いて誘導体化する際に、反応停止工程において、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加したことによる効果を説明する。

図５および７は２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加しなかった例（比較例１、２）のマスクロマトグラムであり、図６および８は、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加した例（実施例１、２）のマスクロマトグラムである。なお、実施例１、２および比較例１、２では、誘導体化する試料の中に２５（ＯＨ）Ｄ_３以外の化合物は加えておらず、分析条件は上記と同様であり、観測したトランジションは２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤである。また、図５および６では、使用した試料の量は２．５ｐｇ相当量、図７および８では、使用した試料の量は１００ｐｇ相当量をインジェクションした。

まず、２．５ｐｇ相当量をインジェクションした図５および６（比較例１、実施例１）を比較してみると、図５（比較例１）と比べて、図６（実施例１）ではＳＲＭ測定における２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのトランジションでのノイズが低減し、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が大きくなっていた。これにより、２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤで誘導体化する際に、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加すると、２５（ＯＨ）Ｄ_３
−ＤＡＰＴＡＤ誘導体の分解が抑えられ、ノイズも低減されたものと考えられる。

また、１００ｐｇ相当量をインジェクションした図７および８（比較例２、実施例２）を比較してみると、図７（比較例２）では、ノイズよりも誘導体のイオン強度が有意に減少していたが、図７（比較例２）と比べて、図８（実施例２）ではＳＲＭ測定における２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのトランジションでのイオン強度が大きくなっていた。

このように、２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤで誘導体化の反応停止工程において、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加することにより、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤの分解防止効果が得られることが分かった。

次に、図９−１２により、２５（ＯＨ）Ｄ_３ＳをＤＡＰＴＡＤを用いて誘導体化する際に、反応停止工程において、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加したことによる効果を説明する。

図９および１１は２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加しなかった例（比較例３、４）のマスクロマトグラムであり、図１０および１２は、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加した例（実施例３、４）のマスクロマトグラムである。図９および１０では、観測したトランジションは２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤであり、図１１および１２では、観測したトランジションは２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤである。なお、実施例３、４および比較例３、４では、誘導体化する試料の中に２５（ＯＨ）Ｄ_３等の２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ以外の化合物は加えておらず、分析条件は上記と同様である。

図９と１０を比較してみると、保持時間８．０分〜９．０分にかけて観測される２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤピークは、図９の方がイオン強度が高い結果となった。これに対し、図１１と１２を比較してみると、保持時間５．０分前後に観測される２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤピークは、図１２の方がイオン強度が高い結果となった。これらの結果により、２５（ＯＨ）Ｄ_３ＳをＤＡＰＴＡＤを用いて誘導体化する際に、トリエチルアミンを添加しない場合には、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤが分解して２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤへと脱硫酸抱合化される場合があるが、トリエチルアミンを添加すると、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤへの分解が抑制されることが示された。

ここで、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓおよび２５（ＯＨ）Ｄ_３は、いずれも内因性のビタミンＤ代謝物であり、いずれも測定対象となるが、図９および１１に示されたように、誘導体化した２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの一部が分解して２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤとなると、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの正確な定量も難しくなる。これに対し、図１０および１２に示したように、反応停止工程の際に分解防止剤を添加すると、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの分解が抑制されるため、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの精度の良い定量が可能となる。

さらに、上記実施例１、２および比較例１、２の結果により、２５（ＯＨ）Ｄ_３も、ＤＡＰＴＡＤによる誘導体化の際に、反応停止工程の際に分解防止剤としてトリエチルアミンを添加すれば誘導体の分解防止効果が得られるため、イオン強度も減少しない。このため、２５（ＯＨ）Ｄ_３と２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓとが混在する試料の場合であっても、ＤＡＰＴＡＤによる誘導体化の反応停止工程の際に分解防止剤としてトリエチルアミンを添加することにより、どちらか一方だけ測定したい場合であっても、また、同時に両方を測定したい場合にも、それぞれを精度良く定量することが可能となり、トリエチルアミンの添加
により測定値の信頼性を向上させることが可能となることが示された。

以上により、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤは、ＤＡＰＴＡＤ調製時に残ってしまった酸化剤（ヨードベンゼンジアセテート）により分解される場合もあるが、ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、分解防止剤としてトリエチルアミンを添加することで、誘導体の分解が抑えられ、従来よりも高感度で正確に定量分析することが可能となることがわかった。

本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

Claims (9)

1. ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン型誘導体化試薬を用いて誘導体化する、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法であって、
   前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止工程において、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤を添加する、誘導体化法。
2. 前記クックソン型誘導体化試薬は、４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）である、請求項１に記載の誘導体化法。
3. 前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物は、ステロイドである、請求項１に記載の誘導体化法。
4. 前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物は、ビタミンＤまたはビタミンＤ代謝物である、請求項１に記載の誘導体化法。
5. 前記分解防止剤は、アンモニアまたはアミンである、請求項１に記載の誘導体化法。
6. 前記分解防止剤は、トリエチルアミンである、請求項１に記載の誘導体化法。
7. 前記クックソン型誘導体化試薬は、安定同位体標識化合物である、請求項１に記載の誘導体化法。
8. ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物を、クックソン型誘導体化試薬を用いて誘導体化するための誘導体化試薬キットであって、
   前記誘導体化試薬キットは、クックソン型誘導体化試薬と、前記ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化反応を停止させる反応停止剤と、得られる誘導体の分解を防止するための分解防止剤と、を含む、誘導体化試薬キット。
9. 請求項１に記載の誘導体化法により得られる誘導体を質量分析計によって分析する、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の分析方法。
   

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