JP2018042572A - 組織の作製方法 - Google Patents
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Abstract
する。
【解決手段】本発明に係る組織の作製方法は、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変
化することが可能である内底面1aを有する培養容器1に、細胞2及び細胞接着性微粒子
3を含有する培養液4を加える細胞添加工程と、培養容器1に加えられた細胞2に対し内
底面1a方向への遠心力Gを作用させながら細胞培養を行い、細胞2間を接着させてシー
ト状細胞組織体5を形成する細胞培養工程と、得られたシート状細胞組織体5を内底面1
aから剥離し回収する剥離工程とを含むことを特徴とする。
【選択図】図1
Description
状細胞組織体の製造に適した方法に関する。
ため、医療目的の移植用組織として適したものではない。移植に適した、細胞密度が高い
細胞シート等の組織を製造する技術は、ティッシュエンジニアリングの分野において重要
である。しかしながら、従来の高細胞密度の生体組織の作製方法にはいくつかの問題点が
存在する。
細胞シートの剥離を容易にする目的で、細胞接着面に温度応答性ポリマーの層を設け、細
胞の剥離を促進させる技術も開発されており、異物をほとんど含まない細胞シートの回収
が可能である。しかしながら、この方法により形成される細胞シートは、単層又は3層以
下の細胞層から構成されることが通常であり、多層化を行うには、細胞シートを複数重ね
合わせることが必要である。細胞シートは極めて薄く、取扱いが困難であるため、複数重
ね合わせることは容易でなく手間がかかる。
ば、(特許文献1)には、細胞を基材上に播種する工程と、細胞を基材に対して遠心力に
より加圧する工程と、細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程と、形成され
た培養物を基材から遊離させる工程とを含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法が
開示されている。
に変化することが可能である内底面を有する培養容器に、細胞及び細胞外マトリクス成分
を含有する培養液を加える細胞添加工程と、培養容器に加えられた細胞に内底面方向への
遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接
着させて組織を形成する細胞培養工程と、細胞培養工程において得られた組織を前記内底
面から剥離し回収する剥離工程とを含む、組織の作製方法を提案している。この技術では
、細胞外マトリクス成分として、培養される細胞と同一の個体に由来する細胞から調製さ
れた成分を別途添加することによって、最終的に製造される組織の生体成分が全て同一個
体由来となり、組織を移植する上での安全性が高まるとともに、細胞外マトリックスを培
養細胞から分泌させて細胞同士を接着させる場合に比べると細胞間接着が加速されるとい
う利点を有する。
っても、シート状の細胞組織体を得るために数時間を要することがあり、細胞へのダメー
ジを低減する観点からより短時間での組織作製が望まれていた。特に近年では、例えば人
工多能性幹細胞(iPS細胞)において力学的な刺激を加えることにより分化が始まる可
能性が報告されており、そのため効率的な組織作製を行うことによって未分化の状態を維
持することが望まれていた。
可能な方法を提供することを目的とする。また、その方法により得られるシート状の細胞
組織体を提供することを目的とする。
添加することによって上記課題を解決できることを見出し、発明を完成した。すなわち、
本発明の要旨は以下の通りである。
培養容器に、細胞及び細胞接着性微粒子を含有する培養液を加える細胞添加工程と、
前記培養容器に加えられた前記細胞に対し前記内底面方向への遠心力を作用させながら
細胞培養を行い、前記細胞間を接着させて組織を形成する細胞培養工程と、
得られた前記組織を前記内底面から剥離し回収する剥離工程と
を含む、組織の作製方法。
(2)前記細胞接着性微粒子の平均粒径が、500nm〜10μmである、上記(1)に
記載の組織の作製方法。
(3)前記培養容器に加えられる前記細胞接着性微粒子の量が、前記細胞一個当たり0.
02ng〜20ngである、上記(1)又は(2)に記載の組織の作製方法。
(4)前記細胞接着性微粒子が、ゲル化したコラーゲンの微粒子である、上記(1)〜(
3)のいずれかに記載の組織の作製方法。
(5)上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法により作製されるシート状細胞組織体
。
(6)上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法に用いられる細胞培養キットであって
、
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養
容器と、
細胞接着性微粒子と
を含む、前記細胞培養キット。
製することができる。作製した組織は、移植等の治療用途に好適に用いられる。
1.細胞添加工程
細胞添加工程は、容器部分の内表面のうち少なくとも内底面が細胞非接着性であるか、
細胞非接着性に変化することが可能である培養容器に、細胞及び細胞接着性微粒子を含有
する培養液を加える工程である。
底面が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であれば良い。特に、
培養液を収容する容器部分の内表面のうち、細胞と接触する表面の全て(例えば容器の内
底面及び内側面)が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であるこ
とが好ましい。
における静的水接触角が45°以下である表面が挙げられる。このような表面は、例えば
、炭素酸素結合を有する有機化合物の被膜を基材の表面上に形成することにより得ること
ができる。あるいは、親水性を有する材料で基材自体を構成しても良い。
、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック(例えば、
ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS
樹脂、ポリアミド樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタ
ン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニ
ル樹脂等)に代表される有機材料等を挙げることができる。
触角が45°以下である親水性被膜により形成することができる。ここで、炭素酸素結合
とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であっても
良い。炭素酸素結合としては、C−O結合、C(=O)−O結合、C=O結合等が挙げら
れる。
、界面活性物質、両親媒性物質等の親水性有機化合物が挙げられる。これらが場合により
相互に物理的又は化学的に架橋し、基材と物理的又は化学的に結合することによって親水
性被膜となる。
リル酸及びその誘導体、ポリメタクリル酸及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその
誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類等を挙げる
ことができる。分子形状は、直鎖状、分岐状、デンドリマー等を挙げることができる。よ
り具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリ
コールとの共重合体、例えば、Pluronic(登録商標)F108、Pluroni
c(登録商標)F127、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N−ビニル
−2−ピロリドン)、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メタクリロ
イルオキシエチルフォスフォリルコリン)、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリル
コリンとアクリルモノマーとの共重合体、デキストラン及びヘパリン等が挙げられるがこ
れらには限定されない。
ゴマー及びその誘導体、アクリル酸オリゴマー及びその誘導体、メタクリル酸オリゴマー
及びその誘導体、アクリルアミドオリゴマー及びその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーのケ
ン化物及びその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマー及びその誘導体、アクリ
ル酸及びその誘導体、メタクリル酸及びその誘導体、アクリルアミド及びその誘導体、双
性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物等を挙げることが
できる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、(N−イソプロピルアクリル
アミド)オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低
分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレン
グリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコー
ル、2−[メトキシ(ポリエチレンオキシ)−プロピル]トリメトキシシラン及びトリエ
チレングリコール−ターミネーティッド−チオール等が挙げられるがこれらには限定され
ない。
mがより好ましく、1nm〜10μmがさらに好ましく、1.5nm〜1μmが最も好ま
しい。平均厚さが0.8nm以上であれば、基材表面の親水性被膜で覆われていない領域
の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが500μm以下であればコーティン
グが比較的容易である。
る方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物
をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材への密着性を高めるために多段階式に
親水性被膜を形成させる方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、
次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基材表面に重合開始点を形成し、次い
で親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。
せる方法、並びに、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水
性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。これらの方法を用いると、
基材に対する親水性有機化合物の密着性を高めることが容易であるためである。以下、「
結合層」という用語を用いて説明する。結合層とは、多段階式に親水性被膜を形成する場
合には最表面の親水性被膜層と基材との間に存在する層を意味し、基材表面に下地層を設
け当該下地層の上に親水性有機化合物をコーティングする場合には当該下地層を意味する
。結合層は、結合部分(リンカー)を有する材料を含む層であることが好ましい。リンカ
ーとリンカーに結合させる材料の末端の官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸
基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とN−ヒドロキシスクシイミド、カルボキ
シル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組
み合わせにおいて、いずれがリンカー側の官能基であっても良い。これらの方法において
は、親水性有機化合物をコーティングする前に、基材上にリンカーを有する材料による結
合層を形成する。結合層における前記材料の密度は、結合力を規定する重要な因子である
。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができ
る。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤(エポキシシラン)の場合
には、エポキシシランを付加した基材表面の水接触角が典型的には45°以上、望ましく
は47°以上であれば、次に酸触媒存在下でエチレングリコール系材料等を付加すること
によって十分な細胞非接着性を有する表面を得ることができる。
接着性であることが、組織の剥離の容易性という観点から好ましいが、細胞培養時には細
胞接着性であるが剥離の際に細胞非接着性に変化することが可能である表面であっても良
い。このような表面は、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリ
マーからなる群から選択される少なくとも1種の刺激応答性高分子を、基材の表面に固定
化することによって形成することができる。刺激応答性高分子としては特に温度応答性ポ
リマーが好ましいがこれには限定されない。
)においては疎水性を示し、培養した細胞組織体の回収時の温度下において親水性を示す
ものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度(水に対す
る臨界溶解温度(T))としては、特に限定されないが、培養後の細胞組織体の回収の容
易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度
応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場(細胞接着面)が
充分に確保されるため細胞培養を効率良く行うことができる。その一方、培養後の細胞組
織体の回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された細胞組織体を細胞
培養基材から分離させることで、細胞組織体の回収をより一層容易にすることができる。
特に、所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す
温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を
特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。
0℃〜80℃、好ましくは0℃〜50℃であるポリマーが好ましい。Tが80℃を超える
と細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。またTが0℃より低いと、一般に細胞
増殖速度が極度に低下するか、又は細胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような
好適なポリマーとしては、アクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。
好適なポリマーとしては、具体的には、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(T=3
2℃)、ポリ−N−n−プロピルアクリルアミド(T=21℃)、ポリ−N−n−プロピ
ルメタクリルアミド(T=32℃)、ポリ−N−エトキシエチルアクリルアミド(T=約
35℃)、ポリ−N−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(T=約28℃)、ポリ−
N−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド(T=約35℃)及びポリ−N,N−ジエ
チルアクリルアミド(T=32℃)等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えば
、ポリ−N−エチルアクリルアミド、ポリ−N−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−
N−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−N−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ
−N−アクリロイルピロリジン、ポリ−N−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニル
エーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のア
ルキル置換セルロース誘導体や、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイ
ドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、
ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体等が挙げられる。
がT=0℃〜80℃を有するようなモノマーであって、放射線照射によって重合し得るモ
ノマーが挙げられる。モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、N−
(もしくはN,N−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(
メタ)アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの1種以
上を使用することができる。一種類のモノマーが単独で使用された場合、基材上に形成さ
れるポリマーはホモポリマーとなり、複数種のモノマーが一緒に使用された場合、基材上
に形成されるポリマーはコポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。また
、増殖細胞の種類によってTを調節する必要がある場合等には、上記以外の他のモノマー
類をさらに加えて共重合して良い。さらに、本発明に使用する上記ポリマーとその他のポ
リマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは上記ポリマーと他のポリマーとの混
合物を用いても良い。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可
能である。
たものを適宜選択することができる。
胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜
内皮細胞等の内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細
胞等の表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の
上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲ
ルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞等の神経細胞、軟骨細胞、骨細胞等が挙げら
れる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、あるいは、それ
らを何代か継代させたものでも良い。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性肝細胞
、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞
等の単能性幹細胞、分化が終了した細胞のいずれであっても良い。また、細胞は単一種を
培養しても良いし二種以上の細胞を共培養しても良い。
養液中に懸濁させた状態で培養容器に収容される。培養液としては、当技術分野において
通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用い
る細胞の種類に応じて、MEM培地、BME培地、DME培地、αMEM培地、IMDM
培地、ES培地、DM−160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地及びRP
MI1640培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」58
1頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清(
ウシ胎児血清等)、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えても良い。また、Gib
co無血清培地(インビトロジェン社)等の市販の無血清培地等を用いることができる。
最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用す
ることが好ましい。
する。細胞接着性微粒子は、細胞とともに遠心力により沈殿し、細胞間を接着させて組織
を形成する機能を有する微粒子である。好ましくは1440Gの遠心力を付与した場合に
、通常の細胞培養時間(30分未満〜数時間)内に培養容器の内底面に沈殿するものが望
ましく、このような細胞接着性微粒子として、コラーゲン、フィブリン等の細胞外マトリ
ックス分子の集合体、ゼラチン等の細胞接着性分子からなる微粒子、それら細胞接着性分
子により表面を被覆もしくは修飾した有機もしくは無機材料からなる微粒子等を挙げるこ
とができる。例えば、各種のタンパク質もしくは多糖類をゲル化させた微粒子等が好まし
く用いられる。
微粒子等を挙げることができる。コラーゲンは、長さ300nm、太さ1.5nm程度の
棒状の塩基性タンパク質であるが、このコラーゲンをそのまま培養液に添加しても、より
効率的に組織作製を行う観点からは十分でない場合がある。本発明者らは、コラーゲンを
ゲル化させ、得られたコラーゲンゲルを微粒子化することによって細胞同士を強固に密着
させ、細胞密度の高い組織を効率的に得ることができることを見出した。このようなコラ
ーゲンゲルの微粒子を製造するには、例えば、まず塩基性タンパク質であるコラーゲンを
酸性下で可溶化してコラーゲン溶液を作製し、このコラーゲン溶液を生理的条件下(中性
、温度37℃程度)におくことにより、多数のコラーゲン分子を会合させてゲル化させる
。コラーゲンが十分にゲル化するか、好ましくは5%〜95%のゲル化度が得られた段階
で、ピペッティング、超音波処理等によってコラーゲンゲルに剪断力を加え、ゲルを粉砕
して微粒子化することにより得ることができる。
ぎると作製する組織の細胞密度が低下するため、これらのバランスを考慮して適宜設定さ
れる。培養する細胞よりは十分に小さいことが好ましい。具体的には、細胞の種類等によ
っても異なるが、平均粒径が500nm〜10μmであり、なかでも1μm〜3μmであ
ることが好ましい。なお、細胞接着性微粒子の平均粒径は、例えば上記のようにゲルを粉
砕して微粒子化する場合には、その粉砕条件(超音波による処理時間等)を適宜変化させ
ることにより所望の範囲内になるよう制御することができる。あるいは、微粒子化した後
、ふるい分けにより平均粒径を調整しても良い。ここで平均粒径は、顕微鏡観察による平
均粒径である。顕微鏡観察による平均粒径は、例えば、顕微鏡観察を行い、画像処理ソフ
ト等により任意の微粒子の粒径を100個測定して個数平均することにより得られる。な
お、粒径とは微粒子の長軸径と短軸径の平均値を指す。また、細胞接着性微粒子の比重は
、遠心力を加えた場合に、細胞間に細胞接着性微粒子が均一に位置し、作製される組織内
において微粒子の偏りができるだけ生じないような比重とする。具体的には、細胞の種類
によっても異なるが、細胞の比重の±20%以内であり、なかでも±10%以内とするこ
とが好ましい。
方が組織内の細胞密度が高くなるため好ましい。具体的には、細胞接着性微粒子の平均粒
径等によっても異なるが、細胞接着性微粒子の量を、細胞一個当たり0.002ng〜2
00ngとすることが好ましく、0.02ng〜20ngとすることが特に好ましい。一
例として、マウス線維芽細胞からなる組織を作製する場合、1×107個の細胞に対する
平均粒径3μm前後のコラーゲンゲルの微粒子の好適な量は、0.3mg(細胞一個当た
り0.03ng)程度である。
細胞培養工程を図1に基づき説明する。細胞培養工程は、培養容器1に収容された、細
胞2及び細胞接着性微粒子3を含有する培養液4に対し、内底面1a方向への遠心力Gを
作用させながら細胞培養を行い、細胞2間を接着させて組織を形成する工程である。図1
のA及びBがこの工程に対応する。本工程では、遠心力Gにより細胞2が内底面1aの形
状に対応して内底面1aに密着し、その状態で細胞2同士が細胞接着性微粒子3を介して
接着し、所望の形状の組織が形成される。
で適宜選択することができる。例えば、2G〜1440Gが好ましく、2G〜720Gが
より好ましい。細胞2及び細胞接着性微粒子3を含有する培養液4を収容した培養容器1
を遠心器に設置し、遠心操作を行うことで遠心力Gを付与することができる。
条件」とは、細胞が活動して細胞同士が接着できる条件を指す。培養する細胞の種類に応
じて変動するが、例えば温度条件は20℃〜40℃が好ましく、雰囲気ガス条件としては
二酸化炭素濃度が3%〜5%であることが好ましく、培養時間としては0.5〜24時間
が好ましい。本発明では、比較的大粒径の細胞接着性微粒子3を含有させることにより、
細胞間の接着がより加速化され、組織を効率的に得ることができる。
たされたインキュベータ内で数分間放置した後、雰囲気ガスが変化しないように培養容器
に蓋をして加重培養を行うことができる。あるいは、これには限定されず、例えば雰囲気
ガス及び温度が制御されたインキュベータ内であれば培養容器を開放した状態で加重培養
を行うこともできる。
とは必須ではない。培養液中における細胞数を適宜調節することにより、作製される組織
の厚さ(すなわち、組織の厚さ方向の細胞積層数)を制御することができる。細胞培養工
程において細胞の増殖を行う必要がないため、比較的短時間で組織を得ることができる。
また、組織の厚さ、形状を自在に調節することができる。
胞が高密度化された組織は移植用途に好ましく用いられる。
剥離工程は、遠心操作終了後に、得られた組織を培養容器1の内底面1aから剥離し回
収する工程である。図1のCがこの工程に対応する。例えば、ピペッティング操作等の物
理的な操作によって細胞を剥離することができる。培養容器1の内底面1aが細胞非接着
性の表面であればこの操作は容易であり、短時間の培養で組織の作製及び剥離回収が可能
である。図1に示すように、内底面1aの平坦形状に沿って、組織としてのシート状細胞
組織体5を得ることができる。培養容器1の内底面1aが、刺激応答性高分子等の、細胞
非接着性に変化する表面である場合には、細胞非接着性となるような環境(例えば、下限
臨界温度以下の温度)において剥離操作を行う。
面上に形成された組織の表面上にゼラチンを流してゲル化し、さらにPETフィルム等の
保持基材によりゼラチンゲルを保持し、次いで細胞非接着性の内底面からゼラチンゲルと
ともに組織を剥離して回収することができる。こうして剥離回収された組織は、さらに、
移植対象に密着させ、37℃でゼラチンを溶解させることにより所望の対象に移植するこ
とができる。
底面を有する培養容器と、上記の細胞接着性微粒子とを含む細胞培養キットを提供するも
のである。このキットを利用して、上述のような細胞培養を行うことにより、シート状細
胞組織体のような所望の組織を効率的に得ることができる。
。
底面の直径が2cmのガラスの容器の内底面の表面全体にポリエチレングリコールを化
学的に付与することで内底面の全体を細胞非接着性にしておき、10%ウシ胎児血清入り
DMEM培地で懸濁したマウス線維芽細胞4×106個、及びアテロコラーゲン(低抗原
性コラーゲン)ゲルの微粒子(平均粒径3μm、細胞一個当たりの微粒子の量は0.03
ng)を含む培養液2mlを培養容器に播種し、遠心器により内底面方向に720Gの遠
心力を作用させながら37℃、CO2濃度5%の環境下で0.5時間培養を行った。培養
後に、遠心器を止めて、内底面に水流による物理的な力を加えることにより組織構造を壊
すことなくシート状細胞組織体を内底面から容易且つ速やかに剥離回収することができた
(図2)。
胞密度の組織が形成されていることが確認された(図3)。また、得られた組織における
細胞生存の有無を調べるために、シート状細胞組織体をトリプシン及びEDTAで処理す
ることで細胞を分散させ、その後に細胞生死アッセイキット(製品名:細胞二重染色キッ
ト、メーカー:同仁化学、製品番号:CS01)により細胞生存率を測定したところ、遠
心力を作用させる前の細胞生存率は90%であったのに対し、得られたシート状細胞組織
体の細胞生存率も90%であった。この結果から、本発明の方法により細胞が死ぬことは
ほとんどないことが明らかとなった。
培養液にアテロコラーゲンゲルの微粒子を含有させない以外は上記実施例1と同様にし
て細胞培養を行った。培養後に遠心器を止めて内底面に水流による物理的な力を加えたと
ころ、組織構造が崩壊し、シート状細胞組織体は得られなかった。
1a 内底面
2 細胞
3 細胞接着性微粒子
4 培養液
5 シート状細胞組織体
G 遠心力
Claims (6)
- 細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養
容器に、細胞及び細胞接着性微粒子を含有する培養液を加える細胞添加工程と、
前記培養容器に加えられた前記細胞に対し前記内底面方向への遠心力を作用させながら
細胞培養を行い、前記細胞間を接着させて組織を形成する細胞培養工程と、
得られた前記組織を前記内底面から剥離し回収する剥離工程と
を含む、組織の作製方法。 - 前記細胞接着性微粒子の平均粒径が、500nm〜10μmである、請求項1に記載の
組織の作製方法。 - 前記培養容器に加えられる前記細胞接着性微粒子の量が、前記細胞一個当たり0.02
ng〜20ngである、請求項1又は2に記載の組織の作製方法。 - 前記細胞接着性微粒子が、ゲル化したコラーゲンの微粒子である、請求項1〜3のいず
れかに記載の組織の作製方法。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の方法により作製されるシート状細胞組織体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の方法に用いられる細胞培養キットであって、
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養
容器と、
細胞接着性微粒子と
を含む、前記細胞培養キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017245681A JP6558432B2 (ja) | 2017-12-22 | 2017-12-22 | 組織の作製方法 |
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WO2020203965A1 (ja) * | 2019-03-30 | 2020-10-08 | 国立大学法人九州大学 | 細胞接着用粒子及びその使用 |
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