JP2018013385A - アスコルビン酸応答電極およびバイオセンサ - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献2には、アスコルビン酸測定の一例として、アスコルビン酸オキシダーゼおよびフェリシアン化合物等の電子メディエーターを含む検知層を構成要素とした電極を有するバイオセンサが開示されている。
先行文献2では、バイオセンサにより、簡便で即時(リアルタイム)測定が可能であるが、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酵素触媒を用いていることにより、非特異的な触媒反応による測定精度の悪化の問題があった。また、酵素の変性に起因しセンサの保存安定性が悪いため、酵素の処方量を増加する必要があり、コストが高くなるという課題があった。
上記に鑑み、本発明は、アスコルビン酸の即時測定を、精度よく、低コストで簡便に行うことを課題とする。
ビン酸オキシダーゼのような酵素触媒を用いることなくアスコルビン酸を簡便に測定することのできるアスコルビン酸応答電極を見出した。すなわち、本発明は、電極と、該電極と接触し、アスコルビン酸からの電子授受を行う非触媒の電子アクセプターを含む検知層を含み、前記検知層における前記電子アクセプターと前記電極間で還元反応が行われることを特徴とする、アスコルビン酸応答電極を提供する。
本発明はまた、前記アスコルビン酸応答電極を含むバイオセンサを提供する。
本発明はまた、該バイオセンサにアスコルビン酸含有試料を反応させ、前記アスコルビン酸応答電極に還元電位を印加して応答電流を測定し、該応答電流に基づいてアスコルビン酸濃度を算出することを特徴とする、アスコルビン酸濃度の測定方法、を提供する。
本発明はまた、前記バイオセンサと、バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、バイオセンサへの電圧印加により得られる、アスコルビン酸応答電流を検出する、検出部と、前記電流値からアスコルビン酸の濃度を算出する、演算部と、前記算出されたアスコルビン酸の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置、を提供する。
前記「電子アクセプター」は、電子を供与できる電子ドナーの機能を持った化合物からの電子を授受できる化合物である。前記「非触媒」とは、酵素やオルガネラ等、化学反応を触媒する生体触媒の機能を持っていないか、もしくは、生体触媒の機能が小さいことを意味する。アスコルビン酸は、還元性物質として強い電子ドナーの機能を持っている。この特性を利用し、アスコルビン酸からの電子を電子アクセプターへ電子授受させて、還元体の電子アクセプターを生成させることを実現した。その後、電極に負の電位を印加することで、未反応の酸化体の電子アクセプターと、電極との間で、電子授受が行われ、還元電流が流れる。この還元電流は、前記電子ドナーと負に相関することを見出した。これらの種々の機能により本発明を完成させた。
本発明のアスコルビン酸応答電極は、電極と、
該電極と接触し、アスコルビン酸からの電子授受を行う非触媒の電子アクセプターを含む検知層を含み、
該検知層において前記電子アクセプターと前記電極間で還元反応が行われることを特徴とする。
なお、検知層が酵素及び電子アクセプターを含む従来の酵素電極とは異なり、本発明のアスコルビン酸応答電極では、検知層は電子アクセプターを含むが、酵素は含まない。
電極は、導電性のある素材であれば特に制限されないが、例えば、金(Au)、白金(Pt)、銀(Ag)及びパラジウム(Pd)のような金属材料、或いはグラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、メソポーラスカーボンなどのカーボンに代表される炭素材料を用いて形成される。電極は、例えば、絶縁性基板上に形成される。絶縁性基板は、ポリエーテルイミド(PEI)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリエチレン(PE)のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂(プラスチック)、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極及び絶縁性基板の大きさ、厚さは適宜設定可能である。
電子アクセプターとしては、アスコルビン酸から電子を受け取って還元される一方で、電極でも還元されうる、触媒作用のない化合物であればよいが、例えば、プルシアンブルーが挙げられ、これらは単独で使用してもよいし、2種以上で併用してもよい。
この中では、酸化体のプルシアンブルーがより好ましい。ただし、酸化体と還元体の混合物でもよい。
プルシアンブルーの酸化体と還元体はそれぞれ下記の式で表される。
[酸化体]Fe2+ 4[Fe3+(CN)6]3- 3
[還元体]Fe3+ 4[Fe2+(CN)6]4- 3
ル(株)製の商品名ルーセンタイトSWN、商品名ルーセンタイトSWF(合成ヘクトライト)、商品名ME(フッ素雲母)、クニミネ工業(株)製の商品名スメクトンSA(合成サポナイト)、協和化学工業(株)製の商品名チキソピーW(合成ヘクトライト)、商品名キョーワード500(合成ハイドロタルサイト)、ラポー社製の商品名ラポナイト(合成ヘクトライト)、(株)ナカライテスク社製の天然ベントナイト、(株)豊順鉱業社製の商品名マルチゲル(ベントナイト)等が使用できる。検知層におけるバインダーの含有量は、例えば、検知層の面積1cm2当たり、0.003〜30mgの範囲である。
緩衝剤としては、アミン系緩衝剤が好ましく、例えば、Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis−Tris、TAPSO、TES、TricineおよびADA等が挙げられ、好ましくはACES、Trisであり、より好ましくはACESである。これらの物質は、1種類でもよいし2種類以上を併用してもよい。また、前記緩衝剤としては、カルボキシル基を有する緩衝剤も好ましく、例えば、酢酸−酢酸Na緩衝剤、リンゴ酸−酢酸Na緩衝剤、マロン酸−酢酸Na緩衝剤、コハク酸−酢酸Na緩衝剤等が挙げられ、この中でもコハク酸−酢酸Na緩衝剤が好ましい。
界面活性剤としては、Triton X−100、ドデシル硫酸ナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホン酸またはステアリン酸ナトリウムが含まれてもよい。アルキルアミノカルボン酸(またはその塩)、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等が挙げられる。
本発明のアスコルビン酸応答電極は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板の片面に、電極として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ(例えば100μm程度)のフィルム状の絶縁性基板の片面に、金属材料をスクリーン印刷、物理蒸着(PVD、例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜することによって、所望の厚さ(例えば30nm程度)を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。次に、電極上に電子アクセプターを含む検知層調製液をコートし、乾燥させることで検知層を電極上に配置することができる。
アスコルビン酸センサとしてのバイオセンサは、本発明のアスコルビン酸応答電極(作用極)とともに対極となる電極を含む。対極としては、バイオセンサの対極として一般的に使用できるものであればよいが、例えば、スクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着(PVD、例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜した金属電極や、スクリーン印刷により製膜した銀/塩化銀電極を用いることができる。また、銀/塩化銀電極やスクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着、或いは化学蒸着によって成膜した金属電極を参照極とした3電極系を用いてもよい。
スコルビン酸濃度と負に相関するが、この電流値に基づいて試料中のアスコルビン酸濃度を測定することができる。
。
作用極12に印加する電圧としては、対極に対して負の電圧であればよいが、−100〜−800mV、−200〜−700mV、又は−250〜−700mVが好ましい。
試料を接触させた後、所定の時間非印加の状態で保持した後、電極系に電圧を印加してもよいし、前記試料との接触と同時に電極系に電圧を印加してもよい。非印加の状態で保持する時間としては、例えば、30秒以下、又は10秒以下である。
次に、図面を用いて、本発明の測定装置について説明する。ここでは、アスコルビン酸測定装置の一態様について例示したが、本発明の測定装置は以下の態様には限定されない。図2は、測定装置B内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ28、ポテンショスタット29、電力供給装置31が、筐体内に収容された基板30上に設けられている。
制御コンピュータ28は、ハードウェア的には、CPU(中央演算処理装置)のようなプロセッサと、メモリ(RAM(Random Access Memory)、ROM(Read Only Memory))のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体(例えばROM)に記憶されたプログラムをRAMにロードして実行することによって、出力部21、制御部22、演算部23及び検出部24を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ28は、半導体メモリ(EEPROM、フラッシュメモリ)やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいてもよい。
電力供給装置31は、バッテリ26を有しており、制御コンピュータ28やポテンショスタット29に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置31は、筐体の外部に置くこともできる。
ポテンショスタット29は、作用極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制
御部22によって制御され、端子CR、Wを用いて、アスコルビン酸センサ27の対極と作用極との間に所定の電圧を印加し、端子Wで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部24に送る。
クリーン印刷を行わなかった。そして、155℃で20分間、加熱処理し、絶縁層14を形成した。
次に、所定濃度(0、3、6、100、300、または600mg/dL)となるようにアスコルビン酸(ASA)を含む、ヘマトクリット(Ht)値42%のアスコルビン酸の全血試料1を調製した。
図4にアスコルビン酸の電気化学測定における、電流と電圧(−500mV)印加時間の関係を示す。アスコルビン酸の濃度の増加に伴って、−500mV印加では応答電流が減少した電流プロファイルが得られることが確認できた。なお、200mV印加では濃度依存性がなかった。
また、図5のアスコルビン酸濃度と応答電流値のプロットにおいては、各サンプリング時間において、良好なアスコルビン酸濃度依存性が確認できた。本アスコルビン酸の濃度依存性は、負に相関している。これは、アスコルビン酸と未反応のセンサ中の酸化体のプルシアンブルーの還元反応を検出していることに起因する。また、上記アスコルビン酸の測定は、全血を用いているが、全血中には、尿酸、グルタチオン等の還元性物質が存在する。本発明では、上記還元性物質の存在化においても、アスコルビン酸の測定が、広い濃度域で出来ており、本測定条件において、測定の特異性があることが確認できている。
11・・・基板
12・・・作用極
12a・・・リード部
13・・・対極
13a・・・リード部
14・・・絶縁層
15・・・検出部
16・・・検知層
17・・・開口部
18・・・スペーサー
19・・・カバー
20・・・空気孔
B・・・測定装置
21・・・出力部
22・・・制御部
23・・・演算部
24・・・検出部
25・・・表示部ユニット
26・・・バッテリ
27・・・アスコルビン酸センサ
28・・・制御コンピュータ
29・・・ポテンショスタット
30・・・基板
31・・・電力供給装置
CR、W・・・端子
Claims (6)
- 電極と、
該電極と接触し、アスコルビン酸からの電子授受を行う非触媒の電子アクセプターを含む検知層とを含み、
該検知層において前記電子アクセプターと前記電極間で還元反応が行われることを特徴とする、アスコルビン酸応答電極。 - 前記電子アクセプターは、プルシアンブルーである、請求項1に記載のアスコルビン酸応答電極。
- プルシアンブルーは酸化体である、請求項2に記載のアスコルビン酸応答電極。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のアスコルビン酸応答電極を含むバイオセンサ。
- 請求項4に記載のバイオセンサにアスコルビン酸含有試料を反応させ、前記アスコルビン酸応答電極に還元電位を印加して応答電流を測定し、該応答電流に基づいてアスコルビン酸濃度を算出することを特徴とする、アスコルビン酸濃度の測定方法。
- 請求項4に記載のバイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、アスコルビン酸応答電流を検出する、検出部と、
前記電流値からアスコルビン酸の濃度を算出する、演算部と、
前記算出されたアスコルビン酸の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。
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