JP2017538446A - 糖タンパク質のグリカン含量のレベルを操作するためのプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、組換えタンパク質でのフコシル化グリカン含分を操作するための方法を提供する。

Description

メチル化、硫酸化、リン酸化、脂質付加、及びグリコシル化を包含する様々な翻訳後修飾が、高等真核生物によって発現されるタンパク質で行われる。グリコシル化は、特異的アミノ酸への糖部分の共有結合を必要とし、組換えタンパク質に最も共通し、かつ最も重要な翻訳後修飾の１つである。タンパク質グリコシル化は、タンパク質のフォールディング及び品質管理、分子輸送及びソーティング、ならびに細胞表面受容体相互作用を包含する多数の機能において役割を果たす。分泌されるタンパク質、膜タンパク質、及びベシクルまたは特定の細胞内細胞器官を標的とするタンパク質の多くは、グリコシル化されることが公知である。

グリコシル化は多くの形態を取り得るが、Ｎ連結グリコシル化が最も一般的である。Ｎ連結グリコシル化は、タンパク質における特定の認識配列（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）において存在するアスパラギン残基へのオリゴ糖の付加を伴う。Ｎ連結糖タンパク質は、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びノイラミン酸からなる標準的な分枝構造を含有する。組換え発現された治療用抗体のＦｃドメインのＮ連結グリコシル化は、重要な翻訳後修飾である。典型的な治療用抗体は、それぞれの枝上でＮ−アセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基によって封止されているトリマンノシルコアを含むフコシル化二分岐グリカンを有する複雑なグリコ型を有する。他のグリコ型は、アフコシル化、ガラクトシル化、シアリル化されている、末端またはバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する、高マンノース（５〜９残基）を有することがある、などである。

グリコシル化は、組換えタンパク質薬物の治療効力に影響を及ぼし得る。Ｆｃグリコシル化の変化は、Ｆｃ−媒介性エフェクター機能に影響を及ぼし得ることは周知である。ガラクトシル化及びシアリル化などの一部のグリコ型は、免疫原性などを低下させるために望ましく、アフコシル化、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基、及び高マンノースグリカンなどの他のグリコ型は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を増強する。

グリコシル化は、治療用抗体の構造及び機能の決定において重要である。これは、結合能を決定し、多くの場合に、治療用途において導入されると、抗体の認識及びプロセシングを決定する。ガラクトシル化及びフコシル化の場合には、これらはそれぞれ、それらが影響を及ぼす補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性及びＡＤＣＣ機能を決定する。

β−ガラクトシル化のレベルは、より「成熟した」グリコ型に関連する。ガラクトース付加は、分泌の前にゴルジ体で行われるグリコシル化の最終段階の１つである。末端ガラクトースがシアリル化には必要とされ、そのシアリル化は、一部のタンパク質のグリコシル化では最終ステップであり得る。ガラクトースはまた、ガラクトース結合性タンパク質のためのリガンドとして役立ち、炭水化物含量に関連する様々な抗原応答の基礎である。ガラクトースはまた、溶液中のタンパク質の配座に影響を及ぼすことが示されている。（Ｆｕｒｕｋａｗａ ａｎｄ Ｓａｔｏ， （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）， １４７３ （１）， ｐａｇｅｓ ５４−８６ ａｎｄ Ｈｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ９（８）， ｐａｇｅｓ １７１６−１７２８）。

フコシル化も、分泌前のタンパク質の成熟の一部としてゴルジ体内で起こる。タンパク質がフコシル化される場合、これは典型的には、グリコシル化経路において、ガラクトシル化の前に生じる。しかしながら、フコシル化は、ガラクトシル化が進行するために必要ではない（Ｈｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００９）＿Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９（９）， ｐａｇｅｓ ９３６−９４９）。

治療用糖タンパク質の生体活性、薬物動態、免疫原性、溶解性、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランスに対するグリコシル化の影響によって、生物製剤を製造するための重要なパラメーターであるグリコシル化がモニター及び制御されている。したがって、治療用タンパク質のグリカン含量のレベルを操作する方法は有益であろう。

組換え治療用糖タンパク質のグリカン含量のレベルを操作及び制御することが、医薬品工業において必要とされており、細胞増殖、生存率、及び生産性に著しい影響を及ぼすことなく、そのようなことを達成するための方法は有用であろう。本発明は、細胞培養培地中の銅及びマンガン含有率ならびにｐＨを調節することによって、組換えタンパク質でのフコシル化グリカン含量を操作するための方法を提供する。

Ｆｕｒｕｋａｗａ ａｎｄ Ｓａｔｏ， （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）， １４７３ （１）， ５４−８６頁 Ｈｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ９（８）， １７１６−１７２８頁 Ｈｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００９）＿Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９（９）， ９３６−９４９頁

本発明は、組換えタンパク質でのフコシル化グリカン含量を操作するための方法であって、バイオリアクターに、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を接種すること、宿主細胞を、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で培養するが、その細胞培養培地が、ｐＨ７．０で銅１０〜１００ｐｐｂ及びマンガン５０〜１０００ｎＭを包含すること、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を採取するが、その組換えタンパク質でのアフコシル化グリカンのレベルが、より低いｐＨの同じ細胞培養培地中で得られたアフコシル化グリカンレベルと比較して、上昇することを含む方法を提供する。

一実施形態では、当該方法は、組換えタンパク質でのβ−ガラクトシル化のレベルの上昇をさらに含む。

一実施形態では、銅の濃度は、１００ｐｐｂである。

一実施形態では、マンガンの濃度は、１０００ｎＭである。

一実施形態では、フコシル化グリカン含量を、組換えタンパク質のエフェクター機能に影響を及ぼすように操作する。

一実施形態では、当該方法は、温度シフトをさらに含む。関連実施形態では、温度シフトは、３６℃から３１℃である。別の関連実施形態では、温度シフトを増殖相と産生相との間の移行期で行う。また別の関連実施形態では、温度シフトを産生相中に行う。

一実施形態では、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を、バッチ培養、供給バッチ培養、潅流培養、またはそれらの組合せにおいて培養する。関連実施形態では、培養は、潅流培養である。別の関連実施形態では、潅流は、連続潅流を含む。別の関連実施形態では、潅流速度は一定である。別の関連実施形態では、潅流を、１日当たり１．０作業容積（ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅｓ）以下の速度で行う。また別の関連では、潅流を交互接線流によって達成する。

一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。

一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。

一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。

一実施形態では、バイオリアクターに、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬを接種する。

一実施形態では、無血清の化学的に規定された細胞培養培地は、潅流細胞培養培地である。

一実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。

一実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

一実施形態では、組換えタンパク質は、糖タンパク質である。

一実施形態では、組換えタンパク質を、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群から選択される。

一実施形態では、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を精製し、薬学的に許容される製剤に製剤化する。

一実施形態では、本発明の方法によって産生される組換えタンパク質である。関連実施形態では、本発明による組換えタンパク質を精製する。また別の関連実施形態では、組換えタンパク質を、薬学的に許容される製剤に製剤化する。

積算生細胞密度（１０^６細胞 日／ｍｌ）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（＋を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（＋を伴う灰色の実線）ｐＨ６．８５、１０００Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う灰色の実線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の実線）ｐＨ７．０、１０００Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の実線） ｐＨは、細胞増殖に影響を及ぼす唯一の因子であると考えられる。マンガン及び銅の濃度は、細胞増殖に対して作用を有さないと考えられる。 生存率（％）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（＋を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（＋を伴う灰色の実線）ｐＨ６．８５、１０００Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う灰色の実線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の実線）ｐＨ７．０、１０００Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の実線） １７日目までに、ｐＨ６．８５での培養物は、ｐＨ７．０で実行した培養物と比較して、高い最終生存率を有した。しかしながら、最終生存率は、ｐＨに関わらず、８０％超であった。試験された範囲での銅及びマンガン濃度は、生存率に対して作用を有さなかった。 充填細胞調節された力価（ｇ／Ｌ）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（＋を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（＋を伴う灰色の実線）ｐＨ６．８５、１０００Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う灰色の実線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の実線）ｐＨ７．０、１０００Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の実線） ｐＨは、充填細胞調節された力価に統計的な影響を有さないと考えられ、同様に、銅及びマンガン濃度は、この細胞系及びプロセスに対して作用を有さなかった。 生細胞密度（１０^５細胞 日／ｍｌ）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ、１０Ｃｕ（＋を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ、１００Ｃｕ（＋を伴う灰色の実線）ｐＨ６．８５、１０００Ｍｎ、１０Ｃｕ（中抜きの円を伴う灰色の破線）ｐＨ６．８５、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う灰色の実線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（＋を伴う黒色の実線）ｐＨ７．０、１０００Ｍｎ^２＋、１０Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の破線）ｐＨ７．０、５０Ｍｎ^２＋、１００Ｃｕ^２＋（中抜きの円を伴う黒色の実線） ｐＨ６．８５で実行したリアクターは、ｐＨ７．０で増殖させたリアクターよりも多い、１ｍＬ当たりほぼ１０^６細胞の細胞密度まで増殖した。銅及びマンガンの濃度は、この細胞系及びプロセスのための実験における細胞増殖に対して統計的に有意な作用は有さなかった。ｐＨは、細胞増殖に影響を及ぼす唯一の因子であった。 ＪＭＰ統計用ソフトウェアを使用して生成させたβ−ガラクトシル化（Ａｄｊ．Ｒ^２＝０．９５）予測プロファイラー。プロファイルは、ｐＨ及びマンガン濃度の操作の結果としてのβ−ガラクトシル化の変化の方向性及び規模を図示している。プロファイラーにおけるタームは、統計的に有意ではないタームを除去した後の、統計モデルにおける残りのタームを表している。マンガンの添加は、ベータ−ガラクトシル化のレベルに対して有意な作用を有した；マンガンの濃度が高いほど、ベータ−ガラクトシル化のパーセンテージは高い。ｐＨも、ベータ−ガラクトシル化に対して統計的に有意な作用を有し、ｐＨが上昇するにつれて、マンガンを添加した場合に観察される規模までではないが、ベータ−ガラクトシル化も上昇した。 ＪＭＰ統計用ソフトウェアを使用して生成させたアフコシル化（Ａｄｊ．Ｒ^２＝０．９２）予測プロファイラー。プロファイルは、ｐＨ、マンガン、及び銅濃度の操作の結果としてのアフコシル化の変化の方向性及び規模を図示している。プロファイラーにおけるタームは、統計的に有意ではないタームを除去した後の、統計モデルにおける残りのタームを表している。銅、マンガン、及びｐＨはすべて、アフコシル化レベルに対して統計的に有意な影響を有した。銅及びマンガンのレベルの上昇、さらには、ｐＨの上昇はすべて、アフコシル化の上昇をもたらした。 基礎アフコシル化（４％）、６％アフコシル化、及び８％アフコシル化でのＡＤＣＣ相対的細胞傷害性。 基礎β−ガラクトシル化（２．７％）、２５％β−ガラクトシル化、及び５０％β−ガラクトシル化でのＣＤＣスケールでの用量応答。

細胞培養培地中のマンガンの濃度の変化は、組換え抗体のβ−ガラクトシル化の程度に影響を及ぼし得る。マンガンは、ガラクトシルトランスフェラーゼの活性の変調において、補因子として作用する。ガラクトシルトランスフェラーゼ媒介性反応は、ＵＤＰ−ガラクトースを糖基質として、かつマンガンを補因子として使用する。ガラクトシル化のレベルの変化は、ＵＤＰ−ガラクトース利用性の変化、もしくは酵素活性の変化（例えば、マンガン補因子濃度の変更によって）、またはその両方に起因し得る。

同様に、ＧＤＰ−フコース基質のレベルの変更によって、フコシルトランスフェラーゼの活性を妨害することによって、またはＧＤＰ−フコース輸送体機構を変更することによって、フコシル化を調節してよい。しかしながら、金属イオンは、これらの機構のいずれにおいても、直接的な役割を果たすとは報告されていない。本明細書に記載のとおり、マンガン及び銅のレベルの上昇は、アフコシル化グリカンのレベルを有意に上昇させることによって、組換えタンパク質フコシル化グリカン含量に影響を及ぼすことが見出された。加えて、ｐＨも、グリコシル化パターンの決定において主要な役割を果たすことが見出された。

ＩｇＧ１抗体でのＮ連結グリコシル化の種類及び規模は、Ｆｃ媒介性エフェクター機能に影響を及ぼすことが公知である。例えば、アフコシル化のレベルは、Ｆｃγ受容体に対する結合親和性を増大させることによって、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を著しく増強する一方で、ガラクトシル化のレベルは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性に影響を及ぼし得る。これによって、治療用タンパク質のグリコシル化の性質及びレベルを理解及び制御することが重要となる。本明細書に記載のとおり、アフコシル化及びガラクトシル化の増強は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクターに対して重大な影響を有した。

細胞培養培地中のｐＨならびにマンガン（Ｍｎ^２＋）及び銅（Ｃｕ^２＋）の濃度を操作することによって、組換えタンパク質でのアフコシル化グリカンのレベルの制御を改善する方法を提供する。細胞培養の性能に影響を及ぼすことなく、アフコシル化及びβ−ガラクトシル化グリカンのレベルを上昇させた。

本発明は、組換えタンパク質でのフコシル化グリカン含量を操作するための方法であって、バイオリアクターに、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を接種すること、宿主細胞を、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で培養するが、その細胞培養培地が、ｐＨ７．０で銅１０〜１００ｐｐｂ及びマンガン５０〜１０００ｎＭを包含すること、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を採取するが、その組換えタンパク質でのアフコシル化グリカンのレベルが、より低いｐＨの同じ細胞培養培地中で得られたアフコシル化グリカンレベルと比較して、上昇することを含む方法を提供する。一実施形態では、当該方法は、組換えタンパク質でのβ−ガラクトシル化のレベルの上昇をさらに含む。一実施形態では、銅の濃度は、１００ｐｐｂである。一実施形態では、マンガンの濃度は、１０００ｎＭである。一実施形態では、フコシル化グリカン含量を、組換えタンパク質のエフェクター機能に影響を及ぼすように操作する。

一実施形態では、当該方法は、温度シフトをさらに含む。関連実施形態では、温度シフトは、３６℃から３１℃へである。別の関連実施形態では、温度シフトを増殖相と産生相との間の移行期で行う。また別の関連実施形態では、温度シフトを産生相中に行う。

一実施形態では、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を、バッチ培養、供給バッチ培養、潅流培養、またはそれらの組合せにおいて培養する。関連実施形態では、培養は、潅流培養である。別の関連実施形態では、潅流は、連続潅流を含む。別の関連実施形態では、潅流速度は一定である。別の関連実施形態では、潅流を、１日当たり１．０作業容積以下の速度で行う。また別の関連では、潅流を交互接線流によって達成する。

一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。一実施形態では、バイオリアクターに、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬを接種する。

一実施形態では、無血清の化学的に規定された細胞培養培地は、潅流細胞培養培地である。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

一実施形態では、組換えタンパク質は、糖タンパク質である。一実施形態では、組換えタンパク質を、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群から選択する。一実施形態では、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を精製し、薬学的に許容される製剤に製剤化する。一実施形態では、本発明の方法によって産生される組換えタンパク質である。関連実施形態では、本発明による組換えタンパク質を精製する。また別の関連実施形態では、組換えタンパク質を、薬学的に許容される製剤に製剤化する。

細胞培養
「細胞培養」または「培養」とは、多細胞生物または組織の外側での細胞の成長及び増殖を意味する。哺乳類細胞での適切な培養条件は、当技術分野で公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｄ． Ｒｉｃｋｗｏｏｄ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）を参照されたい。哺乳類細胞を、懸濁液中で、または固体基質に結合させたままで培養してよい。

本明細書において使用される場合、用語「細胞培養培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）」（「培養培地」、「細胞培養培地」、「組織培養培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」とも呼ばれる）は、細胞、例えば、動物または哺乳類細胞を増殖させるために使用され、かつ一般に、下記からの少なくとも１種または複数種の成分を提供する任意の栄養素溶液を指す：エネルギー供給源（通常、グルコースなどの炭水化物の形態で）；全必須アミノ酸、及び一般に、２０種の塩基アミノ酸、及びシステインの１種または複数種；典型的に低濃度で必要とされるビタミン及び／または他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸；ならびに典型的に非常に低濃度で、通常はマイクロモル範囲で必要とされる微量元素、例えば、無機化合物または天然に存在する元素。

任意選択で、培養する細胞の要求及び／または所望の細胞培養パラメーターに応じて、ホルモン及び他の成長因子、例えば、インスリン、トランスフェリン、表皮成長因子、血清など；塩、例えば、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩、ならびに緩衝剤、例えば、ＨＥＰＥＳ；ヌクレオシド及び塩基、例えば、アデノシン、チミジン、ヒポキサンチン；ならびにタンパク質及び組織加水分解物、例えば、加水分解動物タンパク質（動物副産物から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物、精製ゼラチンまたは植物材料）；抗生物質、例えば、ゲンタマイシン；細胞保護剤または界面活性剤、ポリアミン、例えば、プトレシン、スペルミジン、またはスペルミン（例えば、ＷＩＰＯ公報ＷＯ２００８／１５４０１４を参照されたい）及びピルバート（例えば、米国特許第８０５３２３８号を参照されたい）などの細胞の増殖を最適化するための追加の成分を、栄養素溶液に補充してよい。

非イオン性界面活性剤を、細胞培養培地に添加してもよい。非イオン性界面活性剤の例には、これらだけに限定されないが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、及び非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤が包含される。アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー）、ポリ（ビニルピロリドン）、アルキルポリグルコシド（スクロースモノステアラート、ラウリルジグルコシド、またはソルビタンモノラウレアート、オクチルグルコシド、及びデシルマルトシドなど）、脂肪族アルコール（セチルアルコールまたはオレイルアルコール）、またはコカミド（コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、及びコカミドＴＥＡ）も包含される。

ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーとも称される、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドに基づくブロックコポリマーも包含される。これらの分子は、ポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水鎖を有し、それに、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水鎖が隣接する非イオン性トリブロックコポリマーである。ポリオキシプロピレン７０単位及びポリオキシエチレン鎖それぞれ３０単位を有するものが特に重要である。好ましい実施形態では、ブロックコポリマーは、ポロキサマー１８８（８．４ｋｄの平均分子量を有するＣＡＳ＃９０００３−１１−６、ＢＡＳＦ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ）であり、これは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ−１８８、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、及びＬｕｔｒｏｌ（登録商標）１８８など、様々な販売名で販売されている。そのような非イオン性界面活性剤を５ｇ／Ｌまで、またはそれ以上の濃度で添加してよく、ＡＴＦ潅流条件下で、長時間の培養期間にわたって細胞生存率を維持するように使用してよい。

本発明は、銅１０〜１００ｐｐｂ及びマンガン５０〜１０００ｎＭを含有する細胞培養培地を提供する。一実施形態では、細胞培養培地は、マンガン１００ｐｐｂを含有する。別の実施形態では、細胞培養培地は、マンガン１０００ｎＭを含有する。別の実施形態では、細胞培養培地は、マンガン１００ｐｐｂ及びマンガン１０００ｎＭを含有する。本発明に有用な銅及びマンガン塩には、これらだけに限定されないが、硫酸銅五水和物及び硫酸マンガン一水和物が包含される。

銅及びマンガンを包含する細胞培養培地成分を、完全に微粉砕して粉末培地配合物に入れてもよいか；必要ならば、液体サプリメントと共に部分的に微粉砕して細胞培養培地に添加してもよいか；または細胞培養培地成分を完全に液体形態で、細胞培養物に添加してもよい。

細胞培養培地には、これらだけに限定されないが、細胞のバッチ、拡大バッチ、供給バッチ、及び／または潅流もしくは連続培養などの任意の細胞培養プロセスにおいて典型的に使用されるか、かつ／またはそれと共に使用するために公知のものが包含される。

「基礎」（またはバッチ）細胞培養培地は、細胞培養を開始するために典型的に使用され、細胞培養を支持するために十分に完全である細胞培養培地を指す。

「増殖」細胞培養培地は、指数増殖の期間「増殖相」中の細胞培養において典型的に使用され、かつこの相中の細胞培養を支持するために十分に完全である細胞培養培地を指す。増殖細胞培養培地はまた、宿主細胞系に組み込まれる選択マーカーに、抵抗性及び生存を与える選択薬剤を含有してよい。そのような選択薬剤には、これらだけに限定されないが、ジェネテシン（Ｇ４１１８）、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、メチオニンスルホキシイミン、メトトレキサート、グルタミン非含有細胞培養培地、細胞培養培地非含有グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン、またはチミジンのみが包含される。

「産生」細胞培養培地は、指数増殖が終了しつつあり、タンパク質産生が起こる遷移及び産生相中の細胞培養において典型的に使用され、かつこれらの相中に所望の細胞密度、生存率、及び／または産生力価を維持するために十分に完全である細胞培養培地を指す。

「潅流」細胞培養培地は、潅流または連続培養方法によって維持される細胞培養において典型的に使用され、かつこのプロセス中の細胞培養を支持するために十分に完全である細胞培養培地を指す。使用済み培地を除去するために使用する方法に適応するように、潅流細胞培養培地配合物を、基礎細胞培養培地配合物よりも富化または濃縮してよい。潅流細胞培養培地を、増殖及び産生相の両方の間に使用することができる。

細胞培養物に、培養物の産生相の経過中に消費される栄養素及びアミノ酸などの成分を含有する濃縮供給培地を補充することができる。濃縮細胞培養培地は、細胞培養を維持するために必要な栄養素の一部または全部を含有することができ；特に、濃縮培地は、細胞培養の産生相の経過中に消費されると同定されているか、または公知である栄養素を含有することができる。濃縮培地は、ほぼ任意の細胞培養培地配合物に基づいてよい。そのような濃縮供給培地は、細胞培養培地の成分の一部または全部を、それらの正常量の例えば、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、またはなお１０００倍で含有することができる。

特定の実施形態では、細胞培養培地は、無血清であり、かつ／または動物由来の産物もしくは成分を非含有であってよい。特定の実施形態では、細胞培養培地を化学的に規定してよく、化学的成分のすべてが既知である。

実務者であれば分かるとおり、動物または哺乳類細胞を、培養する特定の細胞に適していて、当業者であれば過度の実験を伴わずに決定することができる培地中で培養する。市販の培地を利用することができ、それらには、これらだけに限定されないが、イスコーブ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０、及び最小必須培地アルファ（ＭＥＭ−アルファ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、アルファＭＥＭ、アールＢＳＳを含むイーグル基礎培地、グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース、グルタミンを含まないＤＭＥＭ高グルコース、グルタミンを含まないＤＭＥＭ低グルコース、グルタミンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１、ＧＭＥＭ（グラスゴーＭＥＭ）、グルタミンを含むＧＭＥＭ、グレース完全昆虫培地、ＦＢＳを含まないグレース昆虫培地、グルタミンを含むハムＦ−１０、グルタミンを含むハムＦ−１２、ＨＥＰＥＳ及びグルタミンを含むＩＭＤＭ、ＨＥＰＥＳを含み、グルタミンを含まないＩＭＤＭ、ＩＰ４１昆虫培地、グルタミンもしくはフェノールレッドを含まない１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）（２倍）、グルタミンを含まない１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、マッコイ５Ａ改変培地、培地１９９、グルタミンもしくはフェノールレッド（２倍）を含まないＭＥＭイーグル、グルタミンを含むＭＥＭイーグル−アールＢＳＳ、グルタミンを含まないＭＥＭイーグル−アールＢＳＳ、グルタミンを含まないＭＥＭイーグル−ハンクスＢＳＳ、グルタミンを含むＮＣＴＣ−１０９、グルタミンを含むリヒターＣＭ培地、ＨＥＰＥＳ、グルタミン、及び／もしくはペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０、グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０、グルタミンを含まないＲＰＭＩ１６４０、シュナイダー昆虫培地、または特定の細胞種のために配合された当業者に公知の任意の他の培地が包含される。必要または所望の場合には、かつ公知であり、日常的な技能を使用する当業者によって実行されるであろうとおりに、上述の例示的な培地に、任意選択の成分を包含する補充成分または成分を適切な濃度または量で添加することができる。

細胞培養物に、配合が困難であり得るか、または細胞培養物において急速に枯渇する特定の栄養素の独立した濃縮供給流を補充することもできる。そのような栄養素は、チロシン、システイン、及び／またはシスチンなどのアミノ酸であり得る（例えば、ＷＩＰＯ公報２０１２／１４５６８２を参照されたい）。例えば、チロシンの濃縮溶液を、チロシンを含有する細胞培養培地中で増殖される細胞培養物に独立に供給してよい。チロシン及びシスチンの濃縮溶液を、チロシン、シスチン、及び／またはシステインを欠いた細胞培養培地中で増殖させる細胞培養物に独立に供給してもよい。独立した供給を、産生相の出発前に、または出発時に開始することができる。独立した供給は、同じ日または別の日に、濃縮供給培地として、細胞培養培地への供給バッチによって達成することができる。独立した供給は、同じ日または別の日に、潅流培地として潅流させることもできる。

フィードバック制御を利用しないものなど、哺乳類細胞培養物に連続的に供給するための方法を使用することができる（ＷＩＰＯ公報ＷＯ２０１３／０４０４４４を参照されたい）。

培地処理
バイオリアクター及び／または細胞培養物に添加する前に培地を滅菌または消毒するための方法またはデバイスを使用して、細胞培養培地を処理することができる。細胞培養培地を、高温短時間（ＨＴＳＴ）を使用して処理してよい（例えば、米国特許第７，４２０，１８３号を参照されたい）。濾過と組み合わせてＵＶを使用して、細胞培養培地を処理してもよい（例えば、ＷＩＰＯ公報ＷＯ２００８／１５７２４７；ＷＯ２０１２／１１５８７４；ＷＯ２０１３／０６３２９８及びＷＯ２０１３／１３８１５９を参照されたい）。細胞培養培地をナノ濾過に掛けてよい（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １６：４２５−４３４を参照されたい）。細胞培養培地を、溶媒、界面活性剤、ソラレン、またはベータ−プロピオラクトンなど、ウイルスを不活性化する薬品で処理してよい。

細胞
本発明において使用する細胞系（「宿主細胞」とも称される）は、商業的または科学的に重要なポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている。細胞系は典型的には、時間無制限で培養において維持することができる一次培養から生じる系列に由来する。細胞は、培養プロセスにおいて発現及び産生するためのタンパク質をコードするコード配列、またはその部分を保持するプラスミドなどの、例えば、形質転換、遺伝子導入、感染、または注射を介して導入された発現ベクター（コンストラクト）を含有することができる。そのような発現ベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳のための必須要素を含有する。産生されるタンパク質及びポリペプチド、さらには、適切な転写及び翻訳制御要素をコードする配列を含有する発現ベクターをコンストラクトするために、当業者に周知で、実施されている方法を使用することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが含まれる。そのような技術は、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ． ｏｒ ａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｅｄｉｔｉｏｎｓ； Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ， ｏｒ ａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｅｄｉｔｉｏｎｓ； Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９９０において記載されており、これらはすべて、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

動物細胞、哺乳類細胞、培養細胞、動物または哺乳類宿主細胞、宿主細胞、組換え細胞、組換え宿主細胞などはすべて、本発明のプロセスに従って培養することができる細胞のための用語である。そのような細胞は典型的には、哺乳類から得られるか、またはそれに由来する細胞系であり、本明細書に記載のものなどの適切な栄養素及び／または他の因子を含有する培地中での単層培養または懸濁培養のいずれかに入れた場合に、増殖及び生存することができる。典型的には、タンパク質を発現及び分泌することができるか、または培養培地に、特定のタンパク質、より詳細には、目的の糖タンパク質を大量に発現及び分泌するように、分子操作することができる細胞を選択する。宿主細胞によって産生されるタンパク質は、宿主細胞に内生または同種であり得ることは理解されるであろう。別法では、タンパク質は、宿主細胞に対して異種である、すなわち、外来であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生及び分泌されるヒトタンパク質である。加えて、哺乳類タンパク質、すなわち、哺乳類生体から元々は得られるか、またはそれに由来するものが、本発明の方法によって得られ、細胞によって培養培地に分泌され得る。

本発明の方法を、様々な細胞の培養において使用することができる。一実施形態では、培養細胞は、植物及び／または動物細胞などの真核細胞である。細胞は、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞、または鳥細胞であり得る。培養における増殖に適した広範囲の様々な哺乳類細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）及び他の寄託機関、さらには、市販業者から入手可能である。本発明のプロセスにおいて使用することができる細胞には、これらだけに限定されないが、ＭＫ２．７細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｓｏｍ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．， １２：５５５−５５６； Ｋｏｌｋｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３６：１０９０１−１０９０９；及びＷＯ ０１／９２３３７ Ａ２）、ジヒドロホレートレダクターゼ陰性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ， Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７０）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）；ＨＥＫ２９３細胞、及びＳｐ２／０細胞、５Ｌ８ハイブリドーマ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ＥＬ４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｓｐ２／０細胞、一次上皮細胞（例えば、角質細胞、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、及び網膜上皮細胞）及び樹立細胞系ならびにそれらの株（例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、２９３細胞、または懸濁培養において培養するためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ， １９８０， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７５）；ヒト肝細胞癌細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−５１）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ， １９８２， Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ３８３：４４−６８）；ＭＣＲ５細胞；ＦＳ４細胞；ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫ_１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ_１細胞、ＧＨ_３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ２５６細胞、ＭＨ_１Ｃ_１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、またはその誘導体）、任意の組織または臓器（これらだけに限定されないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、小腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液を包含）、脾臓、及び線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞系（例えば、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ_１細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）；ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ_３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ_１Ｃ_３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃ_ＩＩ細胞、及びＪｅｎｓｅｎ細胞、またはその誘導体）、または当業者に公知の任意の他の細胞種が包含される。

細胞は、付着、単層、または懸濁培養、遺伝子導入、及びタンパク質、例えば、抗体の発現に適していてよい。細胞を、バッチ、供給バッチ、及び潅流または連続培養方法で使用することができる。

細胞培養の種類
限定ではないが、理解を目的として、タンパク質産生のための細胞培養及び培養の実行には、３種の一般的種類；すなわち、バッチもしくは拡大バッチ培養、供給バッチ培養、潅流培養、またはそれらの組合せが包含され得ることは当業者には分かるであろう。バッチ培養では、細胞を初めに、培地中で培養し、この培地を除去、交換、または補充しない、すなわち、細胞は、培養実行中、またはその終了前に、新鮮な培地を「供給」されない。所望の産物を、培養実行の終了時に採取する。

供給バッチ培養では、培養実行時間は、実行中に、培養培地に１回または複数回（または連続的に）、新鮮な培地を補充することによって増大する、すなわち、細胞は、培養期間中に新たな培地（「供給培地」）を「供給」される。供給バッチ培養は、様々な供給レジメン及び時間、例えば、毎日、１日おき、２日おきなど、１日１回超、または１日１回未満などを包含し得る。さらに、供給バッチ培養に、供給培地を連続的に共有することができる。次いで、所望の産物を、培養／産生実行の終了時に採取してよい。

ときに連続培養と称される潅流培養は、実行中に、細胞培養物が新鮮な潅流培地を受け取り、使用済み培地がバイオリアクターから除去されるものである。細胞培養物への新鮮な培地の潅流及び使用済み培地の除去は、連続的、段階的、間欠的、またはこれらのいずれか、もしくはすべての組合せであり得る。潅流速度は、１日当たり１作業容積未満から、１日当たり数作業容積までの範囲であり得る。

用語「潅流流速」は、バイオリアクターを通過する（それに添加され、除去される）培地の量であり、典型的には、所与の時間における作業容積の数分の１、または数倍として表される。潅流流速は、細胞培養実行期間の間に変動してよい。「作業容積」は、細胞培養のために使用されるバイオリアクター容積の量を指す。一実施形態では、潅流流速は、１日当たり１作業容積以下である。潅流供給培地を、潅流栄養素濃度を最大にし、潅流速度を最小にするように配合することができる。

好ましくは、細胞は培養物中に保持され、除去される使用済み培地は、細胞を実質的に含有しないか、または培養物よりもかなり少ない細胞を有する。細胞培養によって発現された組換えタンパク質を、後で採取するために培養物中に保持することもできるし、または使用済み培地と共に除去することもできる。

潅流は、遠心、沈降、または濾過を包含するいくつかの手段によって達成することができ、例えば、Ｖｏｉｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （２００３）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８２：７５１−６５を参照されたい。一実施形態では、濾過法を使用する。フィルターには、膜フィルター、セラミックフィルター、及び金属フィルターが包含され、それらは、渦巻形または管状またはシートの形態を包含する任意の形状であってよい。１つまたは複数のフィルターを、流体的に連絡して一緒に、または独立に、一列に、または平行にバイオリアクターに接続することができる。

哺乳類細胞潅流培養において、細胞及び／または組換えタンパク質保持のために、中空線維フィルターを使用してよい。細胞培養培地、細胞（全体及び溶解済み）、可溶性の発現組換えタンパク質、宿主細胞タンパク質、老廃産物などを包含する細胞培養物がフィルターに導入されると、空孔サイズまたは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）に応じて、中空線維材料は、中空線維材料の空孔サイズまたは分子量カットオフに基づき、ある種の細胞培養成分をルーメン側（内部）に保持し、ある種の成分のフィルター通過（透過物）を可能にし得る。保持される材料（保持物）は、バイオリアクターに戻される。新鮮な潅流細胞培養培地をバイオリアクターに添加し、透過物を、所定の間隔で、または連続的にフィルターから取り出して、所望か、または一定のバイオリアクター容積を維持する。透過物を、廃棄するか、保持タンク、バッグ、もしくはトートバッグ内で貯蔵するか、または濾過、凝集、遠心、及び／もしくは他の下流精製法などの他のユニット操作に直接移動させることができる。精密濾過のための中空繊維は典型的には、０．１μｍ〜５〜１０μｍの範囲の空孔サイズ、または５００ｋＤａ以上の分子量カットオフを有し、タンパク質を通過させて透過物に入れるために使用することができる。限外濾過用中空繊維は典型的には、０．０１μｍ〜０．１μｍの空孔サイズ範囲または３００ｋＤａ以下の分子量カットオフを有し、所望のタンパク質を保持物中に保持し、それをバイオリアクターに戻すために使用することができる。これは、例えば、採取のために、組換えタンパク質産物を濃縮するために使用することができる。そのようなフィルターは、市販されており、Ｘａｍｐｌｅｒ ＵＦＰ−７５０−Ｅ−４ＭＡ、Ｘａｍｐｌｅｒ ＵＦＰ−３０−Ｅ−４ＭＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）及びＭｉｄｉｋｒｏｓ ＴＣ Ｍｏｄｕｌｅｓ Ｔ０２−Ｅ０３０−１０、Ｔ０２−０５０−１０、Ｔ０２−Ｅ７５０−０５、Ｔ０２−Ｍ１０Ｕ−０６（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）などである。

細胞培養物を、ポンプシステムによってバイオリアクターから取り出し、フィルターに入れてよく、そのポンプシステムは、細胞培養物を中空繊維のルーメン側に通す。細胞ポンプシステムの例には、ぜん動ポンプ、二重ダイアフラムポンプ、低せん断ポンプ（Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ（登録商標）ポンプ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及び交互接線流システム（ＡＴＦ（商標）、Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｎｅ Ｂｒｏｏｋ、ＮＪ、例えば、米国特許第６，５４４，４２４号；Ｆｕｒｅｙ（２００２）Ｇｅｎ． Ｅｎｇ． Ｎｅｗｓ． ２２（７）、６２−６３を参照されたい）が包含される。透過物を、ぜん動ポンプの使用によってフィルターから取り出してよい。好ましい実施形態では、潅流を、交互接線流システムの使用によって達成する。

細胞培養プロセス
細胞培養を、動物または哺乳類細胞培養のために従来使用されている培養容器及び／または培養装置を使用して、組換えタンパク質の小規模から大規模生産のための条件下で実施することができる。当業者であれば分かるとおり、組織培養皿、Ｔ−フラスコ、及びスピナーフラスコは典型的には、実験室用ベンチの規模で使用される。大規模培養では、これらだけに限定されないが、発酵槽型タンク培養デバイス、エアリフト型培養デバイス、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、撹拌タンクバイオリアクターシステム、充填床型培養デバイス、及び１回使用使い捨てバッグ、または当業者に公知の任意の他の適切なデバイスなどの装置を使用することができる。ローラーボトルまたは撹拌タンクバイオリアクターシステムと共に、マイクロ担体を使用してよい。システムは、バッチ、供給バッチ、または潅流／連続モードで操作することができる。加えて、培養装置またはシステムは、フィルター、重力、遠心力などを使用する細胞分離器などの追加の装置を備えていてよい。

組換えタンパク質の生産を、多相培養プロセスにおいて行うことができる。多相プロセスでは、細胞を２つ以上の別個の相において培養する。例えば、細胞を初めに、細胞増殖及び生存率を最大化する環境条件下の１つまたは複数の増殖相において培養し、次いで、タンパク質産生を最大化する条件下の産生相に移してよい。哺乳類細胞によって組換えタンパク質を生産するための商業的なプロセスでは一般に、最終産生培養に先行して、異なる培養容器（Ｎ−ｘ〜Ｎ−１）において起こる複数の、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の増殖相が存在する。増殖及び産生相は、１つまたは複数の移行相の後であってよいか、またはそれらによって分離されてよい。産生相は、大規模に行うことができる。

細胞培養の用語「増殖相」は、細胞が一般に急速に分化する指数細胞増殖の期間（すなわち、対数期）を指す。細胞を、約１日間、または約２日間、または約３日間、または約４日間、または４日超にわたって増殖相に維持する。細胞を増殖相で維持する期間は、例えば、細胞種及び／または細胞増殖速度及び／または培養条件に基づき変動するはずである。

用語「移行相」は、増殖相及び産生相の間の期間を指す。一般に、移行相は、その間に、増殖相から産生相へのシフトを支持するように培養条件を制御し得るときである。制御し得る様々な細胞培養パラメーターには、これらだけに限定されないが、温度、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度、ビタミン、アミノ酸、糖、ペプトン、アンモニウム、塩などの１種または複数が包含される。

細胞培養の用語「産生相」は、細胞増殖が平坦になっている期間を指す。対数細胞増殖は典型的には、この相の前か、またはその間に終了し、タンパク質産生が続く。供給バッチ及び潅流細胞培養プロセスは、所望の細胞密度、生存率、及び産物力価をこの段階で達成及び維持するように、細胞培養培地に補充するか、または新鮮な培地を提供する。産生相は、大規模に行うことができる。大規模細胞培養を、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットルの容積で維持することができる。本発明の一実施形態では、産生相を、５００Ｌ、１０００Ｌ及び／または２０００Ｌバイオリアクター内で行う。

典型的には、最終産生培養に先行する細胞培養は、２つの先行相、すなわち、播種及び接種物列を通過する。播種列相（Ｎ−Ｘ）を小規模で行い、その際、細胞は急速に数を拡大する。接種物列相（Ｎ−１）では、細胞をさらに拡大して、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬの接種物など、産生バイオリアクターのための接種物を生成する。播種及びＮ−１列は、任意の培養方法、典型的には、バッチ細胞培養によって生産することができる。≧０．５×１０^５細胞／ｍＬのＮ−１細胞密度が、産生バイオリアクターに播種するために典型的である。より高いＮ−１細胞密度は、産生バイオリアクター内で所望の細胞に達するために必要な時間を減少させるか、または除去さえし得る。より高いＮ−１細胞密度を達成するための好ましい方法は、交互接線流濾過を使用する潅流培養である。交互接線流濾過を使用する潅流プロセスによって増殖させたＮ−１細胞培養物は、細胞を＞９０×１０^６細胞／ｍＬ以上の密度などの任意の所望の密度でもたらし得る。Ｎ−１細胞培養物は、単回ボーラス接種培養物を生成するために使用することができるか、または多数の産生バイオリアクターに接種するために維持されるローリング播種ストック培養物として使用することができる。接種密度は、産生される組換えタンパク質のレベルに対してプラスの影響を有し得る。接種密度の上昇に伴って、産物レベルが上昇する傾向がある。力価の改善は、より高い接種密度に結び付けられるだけでなく、産生の状態に置かれている細胞の代謝及び細胞周期状態によって影響を受ける可能性もある。本発明の一実施形態では、細胞培養物を、バイオリアクターに少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬを接種することによって樹立する。

用語「細胞密度」は、培養培地の所与の容積における細胞の数を指す。「生細胞密度」は、標準的な生存率アッセイ（トリパンブルー色素排除法など）によって決定されるとおりの、培養培地の所与の容積における生細胞の数を指す。「充填細胞容積パーセント」（％ＰＣＶ）とも称される用語「充填細胞容積」（ＰＣＶ）は、細胞培養物の全容積に対する、細胞によって占められている容積の比であり、パーセンテージとして表される（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． Ｄｅｃ ２０：９５（６）：１２２８−３３を参照されたい）。充填細胞容積は、細胞密度及び細胞直径の関数であり；充填細胞容積の増大は、細胞密度もしくは細胞直径またはそれらの両方の増大から生じ得る。充填細胞容積は、細胞培養物中の固体レベルの尺度である。

細胞培養制御
本発明の方法に適した細胞培養条件は、細胞のバッチ、供給バッチ、もしくは潅流（連続）培養、またはそれらの任意の組合せのために典型的に使用され、かつ公知であるものであり、ｐＨ、溶解酸素（Ｏ_２）、及び二酸化炭素（ＣＯ_２）、撹拌及び湿度、ならびに温度に注意が払われる。組換えタンパク質産生中に、細胞を所望の時間にわたって、または所望の密度まで増殖させ、次いで、細胞の生理学的状態を、増殖が制限または停止された高産生状態（その状態では、細胞は、細胞密度を増大させるために有利であるように、エネルギー及び基質を、組換えタンパク質を産生するために使用する）にスイッチさせる制御システムを有することが望ましい。商業的規模の細胞培養及び生物学的治療薬の製造では、細胞増殖を制限または停止することができること、及び産生相中に、増殖が制限または停止された状態に細胞を維持することができることが、非常に望ましい。そのような方法には、例えば、温度シフト、タンパク質産生の化学的誘導因子の使用、栄養素制限または飢餓、及び細胞周期阻害物質が単独で、または組み合わせで包含される。

増殖を制限または停止させるためのそのような機構の１つは、細胞培養中に温度をシフトさせることである。温度シフトを、細胞培養中の任意の時に行ってよい。増殖相は、産生相よりも高温で行ってよい。細胞培養を、約３５℃〜約３８℃までの第１の温度セットポイントで実行し、次いで、温度を約２９℃〜約３７℃まで、任意選択で約３０℃〜約３６℃まで、または約３０℃〜約３４℃までの第２の温度セットポイントへとシフトさせてよい。一実施形態では、温度シフトを増殖相及び産生相の間の移行期中に行ってよい。別の実施形態では、温度シフトを産生相中に行ってよい。

温度セットポイントのスイッチングは、手動で行ってよいか、またはバイオリアクター制御システムを使用することによって自動的に行うこともできる。温度セットポイントを、所定の時間で、または細胞密度、力価、または１種もしくは複数種の培地成分の濃度などの１つまたは複数の細胞培養パラメーターに応じてスイッチしてよい。そのような方法の１つは、所望の細胞密度が達成されたときに温度セットポイント変化を開始するために、バイオリアクター制御システムに集積されたオンラインバイオマスモニタリングツールを使用する。例えば、オンライン細胞密度推定のために、キャパシタンスをベースとするバイオマスプローブを使用してよく、バイオリアクター温度においてシフトを開始するために、オンライン測定からのデータを使用することができる。そのようなキャパシタンスをベースとするプローブには、Ｆｏｇａｌｅキャパシタンスセンサ（ＤＮ１２−２００）（Ｎｉｍｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）が包含される。

カフェイン、ブチラート、及び／またはヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質産生の化学的誘導因子を、温度シフトとは独立に、またはそれと同時に、その前に、もしくはその後に添加してよい。誘導因子を温度シフトの後に添加するならば、それらを、温度シフトの１時間から５日後に、任意選択で温度シフトの１〜２日後に添加することができる。次いで、細胞が所望のタンパク質（複数可）を産生しながら、細胞培養を数日、さらに数週間にわたって維持することができる。

細胞を所望の生理学的状態に維持するための別の方法は、低Ｌ−アスパラギン条件に細胞培養物を曝露することによって、細胞増殖停止を導入することである（例えば、ＷＩＰＯ公報ＷＯ２０１３／００６４７９を参照されたい）。細胞増殖停止は、限定濃度のＬ−アスパラギンを含有する培養培地、及び細胞培養物中で低濃度のＬ−アスパラギンを維持することによって達成及び維持され得る。細胞を増殖停止状態に維持するために、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度の維持を使用することができる。

細胞周期の進行ならびにこれに関連する転写、ＤＮＡ修復、分化、老化、及びアポトーシスの関連プロセスを調節することが公知であるか、そのように考えられている化合物である細胞周期阻害物質も、細胞増殖停止を誘導するために有用である。ＡＫＴ、ｍＴＯＲなどの他の経路からのタンパク質、及び細胞周期に直接的または間接的に影響を及ぼす他の経路と相互作用する分子と同様に、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）などの細胞周期機構と相互作用する細胞周期阻害物質は有用である。

採取及び精製
発現される組換えタンパク質は、培養培地中に分泌され得、そこから、回収及び／または収集することができる。次いで、組換えタンパク質を、採取、精製、内毒素及び／もしくはウイルス不活性化／濾過、ならびに／または限外濾過／透析濾過を包含する１種または複数種のプロセシングステップに掛けてよい。

発現される組換えタンパク質を採取透過物中に捕捉してよい。当技術分野で公知であり、かつ／または市販業者から入手可能なプロセス及び市販の製品を使用して、タンパク質を採取透過物から精製、または部分的に精製してよい。そのような方法には、他の利用可能な方法のなかでも、凝集；遠心；沈殿；深層濾過などの濾過法；アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを包含するクロマトグラフィー法が包含される。

次いで、精製されたタンパク質を「製剤化する」ことができ、これは、緩衝剤交換し、滅菌し、大量包装し、かつ／または最終使用者のために包装することを意味する。医薬組成物に適した製剤は、当技術分野で公知であり、それらには、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ． １９９５， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡにおいて記載されているものが包含される。

プロセス分析技術
組換えタンパク質の特徴及び産生プロセスを定量的に、かつ／または定性的にモニターするために、細胞培養及び精製プロセス中に採取したサンプルをモニター及び評価するプロセス分析技術及び方法を利用することができる。必要に応じてプロセスを適時に決定及び変更するために、このリアルタイムまたはインライン情報を使用して、力価、細胞密度などの産物及び産生パラメーター；翻訳後修飾などの産物の品質特性；不純物などの産物またはプロセス変動性などをモニター及び／または制御することができる。

特定の産物の品質特性（ＰＱＡ）の量についての情報を得、かつ事前設定された標的及び範囲でこのＰＱＡを制御するために、上流細胞培養プロセスまたは下流精製プロセスの各ステップをモニターしてよい。

サンプルを間欠的に、所望の頻度で、または連続的に採取してよい。サンプルを、リアルタイムで、もしくはほぼリアルタイムで分析してよいか、または後続の分析のために保存してよい。この情報は、上流及び下流プロセス中に変化させるために使用することができる。

質量分析法、ＵＶ及び／または質量分光検出を用いる液体クロマトグラフィー、ならびに毛細管電気泳動などを使用して、産物の品質特性の検出を行ってよい。

これらのプロセスは、指定の産物の品質特性のレベルによって決定されるとおりの供給物、温度、プロセス期間などの手動または自動プロセス調節と共に、連続的なモニタリングに適合可能である。

サイズ排除モードで運転され、ＥＳＩ−ＭＳに接続されているポリヒドロキシエチルアスパルトアミドカラムを使用して、アミノ酸プロセシング及びグリコシル化などの翻訳後修飾の存在を検出するための完全な質量分析を行ってよい（Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏ， １９： ５０２−５０９）。

レーザー光散乱検出器及びＵＶ吸光度を使用して、各画分での正規化ＬＳ／ＵＶ比をモニターすることによる、イオン交換クロマトグラフィーからの溶離液のリアルタイムモニタリング、米国特許出願公開第２０１３−０３０３７３２号を参照されたい。

Ｓｅｑｕｅｓｔ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（Ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）またはＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）などの様々なデータベース及び検索プラットフォームを使用して、タンデム型ＭＳデータを検索し、かつ特徴づけるために、多重特性法は、単一の液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を使用する。サンプルを、高ｐＨで、または二硫化物アイソフォームを維持し、かつスクシンイミド変異体を保護するために、低ｐＨで変性してよい。次いで、サンプルを還元及びアルキル化し、続いて、トリプシンで消化する。次いで、サンプルを、ＭＳに注入し（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡなど）、分析を、Ｐｉｎｐｏｉｎｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行う。同定、定量化、及びモニターすることができる特性には、異性化、脱アミノ化、二硫化物還元、宿主細胞タンパク質汚染、変異、取込み誤り、ヒドロキシリシン、チオエーテル、非グリコシル化重鎖、Ｃ末端アミド化、残留プロテインＡが含まれ、それらは、グリカンを特徴づけ、分子アイデンティティをもたらす。モニターされる各特性での質量確度は、予測質量の５ｐｐｍ未満に設定することができる。ペプチド／特性の同定を、ＭＳ２断片化及び直交特性決定法（例えば、グリコシル化ではＨＩＬＩＣ−ＭＳ）によって確認する。実験的同位体分布は、理論同位体分布と比較した場合に、０．９５よりも良いドット積スコアを有する必要がある。保持時間ウィンドウを各特性について設定し、各特性でのすべての検出可能な荷電状態を、定量化のために考慮する。特性の変化を検出するであろう判定基準を定義する。例えば、脱アミノ化値（脱アミノ化ペプチド及び未変性親ペプチドの合計で脱アミノ化ペプチドを割って、１００を掛ける）を決定することによって、脱アミノ化をモニターすることができる。それぞれ特定のグリカンをすべての検出可能なグリカンの合計と比較することによって、グリコシル化をモニターすることができる。

タンパク質
本明細書において使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書を通じて互換的に使用され、ペプチド結合によって相互に結合している２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質はまた、これらだけに限定されないが、糖タンパク質をもたらすグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰ−リボシル化を包含する修飾を包含する。

本明細書において使用される場合、用語「糖タンパク質」は、マンノース残基を包含する少なくとも１個のオリゴ糖側鎖を有するペプチド及びタンパク質を指す。糖タンパク質は、宿主細胞と同種であってよいか、または利用される宿主細胞と異種、すなわち、外来であってよく、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生されるヒト糖タンパク質などである。そのような糖タンパク質は一般に、「組換え糖タンパク質」と称される。特定の実施形態では、宿主細胞によって発現される糖タンパク質は、培地に分泌される。

タンパク質は、科学的または商業的に重要であり得、それには、タンパク質ベースの薬物が包含される。タンパク質には、特に、抗体及び融合タンパク質が包含される。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を、細胞培養法を使用して組換え動物細胞系によって生産してよく、それらは、「組換えペプチド」、「組換えポリペプチド」、「組換えタンパク質」、「組換え糖タンパク質」と称され得る。発現されるタンパク質（複数可）は、細胞内で産生されるか、培養培地に分泌され得、そこから、回収及び／または収集することができる。

本発明の方法によって有利に生産され得る哺乳類タンパク質の非限定的例には、次のタンパク質の１種の全部または一部と同一であるか、または実質的に類似であるアミノ酸配列を含むタンパク質が包含される：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１）、エリスロポエイチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｔｉｎ）、トロンボポエイチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｉｔｉｎ）、カルシトニン、ＩＬ−２、アンギオポイエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３２２）： ５５−６０）、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のためのリガンド（ＲＡＮＫＬ、ＷＯ０１／３６６３７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＷＯ９７／０１６３３）、胸腺間質由来リンホポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許第５８８８１９号）、肥満細胞成長因子、幹細胞成長因子（米国特許第６，２０４，３６３号）、表皮成長因子、角質細胞成長因子、巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｔｅ）成長及び発生因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノーゲン様２タンパク質（ＦＧＬ２；ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＭ＿００６８２；Ｒｕｅｇｇ ａｎｄ Ｐｙｔｅｌａ （１９９５）， Ｇｅｎｅ １６０：２５７−６２）成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、及びコンセンサスインターフェロンを包含するインターフェロン（米国特許第４，６９５，６２３号及び同第４，８９７４７１号）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１−５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、白血病阻害因子、及びオンコスタチン−Ｍ。本発明の方法に従って生産することができるタンパク質の記載は、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ： Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ａｌｌ ｖｏｌｕｍｅｓ （Ａｇｇａｒｗａｌ ａｎｄ Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ， ｅｄｓ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， １９９８）； Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＭｃＫａｙ ａｎｄ Ｌｅｉｇｈ， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３）；及びＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｖｏｌｓ． １ ａｎｄ ２ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｔｚｅ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ２００３）において見出され得る。

加えて、上述のタンパク質のいずれかのための受容体、上述のタンパク質のいずれかのためのそのような受容体に対するアンタゴニストのアミノ酸配列の全部もしくは一部を含むタンパク質、及び／またはそのような受容体もしくはアンタゴニストに実質的に類似のタンパク質を生産するために、本発明の方法は有用であろう。これらの受容体及びアンタゴニストには、腫瘍壊死因子受容体の両方の形態（ｐ５５及びｐ７５と称されるＴＮＦＲ、米国特許第５，３９５，７６０号及び米国特許第５，６１０，２７９号）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型及びＩＩ型；欧州特許第０４６０８４６号、同第４，９６８，６０７号、及び米国特許第５，７６７，０６４号）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２号）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害薬（米国特許第５，９８１，７１３号、同第６，０９６，７２８号、及び同第５，０７５，２２２号）ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０ ３６７ ５６６号及び米国特許第５，８５６，２９６号）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血病阻害因子のための受容体、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、ＷＯ０１／３６６３７及び米国特許第６，２７１，３４９号）、オステオプロテゲリン（米国特許第６，０１５，９３８号）、ＴＲＡＩＬのための受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４を包含する）、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が含まれる。

本発明を使用して生産することができる他のタンパク質には、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）もしくはそれらのリガンドのアミノ酸配列の全部もしくは一部を含むタンパク質、またはこれらのいずれかと実質的に類似のタンパク質が包含される。そのような抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ， Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｋｏｂｅ， Ｊａｐａｎ， １９９６）において開示されている。同様のＣＤタンパク質は、その後のワークショップにおいて開示されている。そのような抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、及びそれらのリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドなど）が包含される。当該ＣＤ抗原のうちの数種は、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、これらにはまた、４１ＢＢ及びＯＸ４０が包含される。リガンドは多くの場合に、４１ＢＢリガンド及びＯＸ４０リガンドであるように、ＴＮＦファミリーのメンバーである。

酵素活性なタンパク質またはそれらのリガンドも、本発明を使用して生産することができる。例には、次のタンパク質もしくはそれらのリガンドの１種の全部または一部を含むタンパク質、またはこれらの１種に実質的に類似のタンパク質が包含される：ＴＮＦ−アルファ変換酵素を包含するジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインファミリーメンバー、様々なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、上述の酵素のいずれかのためのリガンド、ならびに多数の他の酵素及びそれらのリガンド。

用語「抗体」は、別段の指定がない限り、ヒト、ヒト化、キメラ、多重特異性、モノクローナル、ポリクローナル、及びオリゴマーもしくはその抗原結合性断片を包含する、任意のアイソタイプもしくはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方に対する、または特定の結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合性領域に対する言及を包含する。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、二重特異性抗体、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ、一本鎖抗体分子、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及び標的ポリペプチドへの特異的な抗原結合をもたらすために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドなどの抗原結合性断片または領域を有するタンパク質も包含される。用語「抗体」は、これらだけに限定されないが、抗体を発現するように遺伝子導入された宿主細胞から単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるものを包含する。

抗体の例には、これらだけに限定されないが、上述のタンパク質及び／または下記の抗原（これらだけに限定されない）を包含するタンパク質のいずれか１種または組合せを認識するものが包含される：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ３５サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニット、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３共有ｐ４０サブユニット、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ−β及びその類似体（米国特許第５，２７２，０６４号及び同第５，１４９，７９２号を参照されたい）、Ｂ７ＲＰ−１、Ｂ７ＲＰ−２、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ｃ−ｆｍｓ、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号を参照されたい）、ＣＧＲＰ受容体、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、ＦＧＦ２１、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンガンマ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂリンパ球刺激物質（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、及びｚＴＮＦ４としても公知；Ｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ （２００２）， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． １３（１）： １９−２５を参照されたい）、ＳＴ２、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現される遺伝子産物である）、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸及び／または膵臓癌を有する患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺、及び／もしくは腎臓癌細胞で、ならびに／または黒色腫、膠腫、もしくは神経芽細胞腫細胞で発現される癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死核、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＳＬＰ、ＩＦＮγ、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮性細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、アンギオポイエチン１（Ａｎｇ１）、アンギオポイエチン２（Ａｎｇ２）、ロイコインテグリン付着素、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害物質）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原である）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ−１）、プログラム細胞死リガンド２（ＰＤＬ−２）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ３）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ−セレクチン、呼吸系発疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、及びＳｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。本発明の方法を使用して生産することができる公知の抗体の具体的な例には、これらだけに限定されないが、アダリムマブ、アリロクマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、デュピリルマブ（ｄｕｐｉｌｉｌｕｍａｂ）、エクリズマブ、ゲムツズマブ・グセルクマブ、オゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イクセキズマブ（ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、イピリムマブ、チウキセタン、ラベツズマブ、レブリキズマブ、マパツムマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ニボルマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ペムブロリズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、ロベリズマブ、リロツムマブ、チルドラキズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ウステキヌマブ、ベドリゾマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｏｍａｂ）、ザルツムマブ、及びザノリムマブが包含される。

本発明はまた、例えば、上述のタンパク質のいずれかを含む組換え融合タンパク質を生産するために使用することができる。例えば、上述のタンパク質の１種と、ロイシンジッパー、多重コイル、免疫グロブリンのＦｃ部分、または実質的に類似のタンパク質などの多量化ドメインとを含む組換え融合タンパク質を、本発明の方法を使用して生産することができる。例えば、ＷＯ９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８−１２９３； Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−０５； Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０−８３； Ｈａｋａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：２５５−６４を参照されたい。具体的には、そのような組換え融合タンパク質のうちには、エタネルセプト（ｐ７５ ＴＮＦＲ：Ｆｃ）、及びベラタセプト（ＣＴＬＡ４：Ｆｃ）など、受容体の一部が抗体のＦｃ部分に融合しているタンパク質が包含される。上述のタンパク質及びポリペプチドのいずれかのキメラタンパク質及びポリペプチド、さらには、断片もしくは部分、または突然変異体、変異体、または類似体も、本発明の方法によって生産することができる適切なタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドのうちに包含される。これには、トレバナニブ、アンギオポイエチン（Ａｎｇ）１及び２中和性ぺプチボディが包含される。選択的に作用を発揮し、かつヒト免疫系を指向して腫瘍細胞に作用する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）も包含される。そのようなＢｉＴＥのうちで、ブリナツモマブなどのＣＤ１９を標的とするものが具体的には包含される。他の分子には、アフリベルセプトが包含される。

本出願において使用する専門用語は、当技術分野内では標準であるが、明確性と、特許請求の範囲における意味への限定とを保証するために、特定の用語の定義を本明細書において提供している。単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳＩ承認された形態で示され得る。本明細書において列挙されている数値範囲は、その範囲を定義する数値を包含し、その定義された範囲内の各整数を包含し、それらの支持となる。本明細書に記載の方法及び技術を一般に、当技術分野で周知であり、かつ別段に示さない限り、本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的、かつより具体的な参照文献において記載されているとおりの従来の方法に従って行う。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９９０）を参照されたい。これらだけに限定されないが、特許、特許出願書、論文、書籍、及び学術論文を包含する、本出願において引用したすべての文書、または文書の一部は、参照によって本明細書に明らかに組み込まれる。本発明の一実施形態において記載したことは、本発明の他の実施形態と組み合わせることができる。

本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲を制限されることはなく、それらの実施形態は、本発明の個別の態様の唯一の説明として意図されており、機能的に同等の方法及び成分は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書に図示及び記載したものに加えて、本発明の様々な変更形態が、上述の記載及び添付の図から、当業者には明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に該当することが意図されている。

細胞培養
０日目に、組換え抗ＴＮＦα抗体を発現するＣＨＯ細胞を９．０×１０^６生細胞／ｍＬで、無血清の化学的に定義された基礎培地１５００ｍｌの作業容積で３Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に接種した。培養物を３６℃、３０ｍｍＨｇでのＤＯ、４００ＲＰＭでの撹拌で維持した。細胞培養をバッチモードで開始し、潅流を、３０ｋＤａ ＮＦＷＣ ＧＥ ＲＴＰ Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）を備えたＡＴＦ−２（商標）交互接線流濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して３日目に開始した。培地は、硫酸マンガン一水和物及び硫酸銅五水和物を包含し、表１に記載するとおりのｐＨの無血清の化学的に規定された潅流培地であった。実験を２連で実行した。

潅流速度は、細胞培養の実行の間に０．３から１．０作業容積／日に徐々に上昇した。日目に、温度を３１℃にシフトさせ、培養物を１７日目に採取した。グルコースを４〜８ｇ／Ｌの間に維持した。

培養物を評価するために、サンプルを毎日採取した。ｐＨならびにＣＯ_２（ｐＣＯ_２）及びＯ_２（ｐＯ_２）の分圧を、Ｒａｐｉｄ Ｌａｂ １２６０血液ガス分析装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を使用して測定し；グルコース及びラクタートの濃度を、ＮｏｖａＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定した。重量モル浸透圧濃度をＭｏｄｅｌ ２０２０ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ）によって決定した。温度、ｐＨ、溶解酸素、及び撹拌を、Ａｐｐｌｉｋｏｎ ＡＤＩ１０１０制御装置を使用して制御した。

７、１０、１３、１５及び１７日目に、産物の品質分析のために、培養物のサンプル５０ｍＬをバイオリアクターから取り出した。サンプルを室温で３０分間にわたって３０００ｒｐｍで遠心し（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、上清を、０．２μｍチューブトップフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を通して濾過した。次いで、無細胞上清を、凍結するまで−２０℃で冷凍し、産物の品質分析の前に、プロテインＡ精製した。１７日間の産生が完了したら、残りの培養物をバイオリアクターから取り出した。細胞を４℃での３０分間にわたる３０００ｒｐｍでの遠心によって上清から分離し、条件培養培地を、０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）カートリッジフィルターを使用してＮａｌｇｅｎｅボトル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に滅菌濾過し、次いで、プロテインによって精製し、中和された溶離液を上記のとおり試験した。

生細胞密度及び細胞生存率を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）によって決定した。積算生細胞密度（ＩＶＣＤ）を、産生の全期間にわたる累積生細胞密度として計算した。力価を、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して測定した。力価を上清で決定し、次いで、それを、細胞によって占められた容積について調節して、これが、細胞培養液の所与の容積において実際に存在するものを表すようにした。充填細胞容積は、総容積に対するパーセントとして表されるので、ＰＣＶ調節力価は常に、上清における力価よりも低い。

異なるＮ−グリカン種を親水性−相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって分析し、混合グリカンの総ピーク面積に対するパーセントとして示す。抗体含有サンプルを収集し、プロテインＡによって精製した。精製サンプルをＰＮＧａｓｅ−Ｆで処理し、３７℃で２時間にわたってインキュベートし、Ｎ連結グリカンを放出した。酵素によって放出されるグリカンを、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）で８０℃で７５分間にわたって標識した。次いで、過剰な２−ＡＡ標識をＧｌｙｃｏｃｌｅａｎ Ｓカートリッジで除去した。サンプルを終夜蒸発させ、得られた乾燥ペレットを、ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用するその後のＨＩＬＩＣ分析のために水で再構成した。グリカンを注入し、高有機条件でカラムに結合させ、ギ酸アンモニウム緩衝剤水溶液の漸増勾配で溶離した。蛍光検出を使用して、グリカン溶離をモニターし、メジャー及びマイナーなグリカン種の相対的パーセンテージを計算した。β−ガラクトシル化レベルには、Ａ１Ｇ１Ｆ、Ａ２Ｇ１Ｆ、Ａ２Ｇ２Ｆ、及び類似のアフコシル化形態が包含される。アフコシル化形態には、Ａ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ１Ｇ１、Ａ２Ｇ１、及びＡ２Ｇ２が包含される。マンノース５及びマンノース７も決定した。

それぞれの主な因子（銅、マンガン、及びｐＨ）の作用及び２元相互作用を規定するために、この実験を設計した。実験は、主効果及び二元相互作用を規定するための３因子２レベル（２^３）完全要因設計であり、中心点を包含しなかった。研究は、１．２５のシグナル・ノイズ比を使用して約０．８のパワー値を送達するように意図されていた。ＪＭＰ統計用ソフトウェア及び予測プロファイラー（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して、プロファイルを生成した。

結果
潅流培地中の銅及びマンガンの濃度は、細胞培養性能または生産性に影響を及ぼさなかった。ｐＨは、細胞増殖または生産性に影響を及ぼさず、ｐＨ６．８５は、最終生存率を約１０％低下させた（ｐ＜０．００１）、図１〜４。

高マンノースグリカン
ｐＨは、高マンノースレベルに対して有意な作用を有した唯一の因子であった。ｐＨが上昇するにつれて、高マンノースのレベルも上昇した。表２を参照されたい。

β−ガラクトシル化
マンガンの添加は、β−ガラクトシル化を増強した。マンガンの濃度が高くなるほど、β−ガラクトシル化のパーセンテージは高くなった。ｐＨも、β−ガラクトシル化に対して統計的に有意な作用を有した。ｐＨの上昇は、β−ガラクトシル化を増大させたが、マンガンを添加した場合の上昇と比較すると、低い規模であった。図５を参照されたい。β−ガラクトシル化に対する銅の作用は、些少であった。

アフコシル化
銅、マンガン、及びｐＨはすべて、アフコシル化レベルに対して統計的に有意な影響を有した。銅及びマンガンの濃度が高いほど、かつｐＨが高いほど、アフコシル化のレベルは高かった。図６を参照されたい。

重要なグリカンはすべて、ｐＨによって有意な影響を受けた。β−ガラクトシル化は、マンガン濃度の上昇によって有意な影響を受けた。統計モデリングによって決定すると、その最高レベルまでのマンガンの上昇は、同じｐＨで試験された基線の最低レベルの銅及びマンガンを上回る約１４％のβ−ガラクトシル化の上昇をもたらした。アフコシル化は、銅及びマンガン濃度の両方の上昇によって有意な影響を受けた。銅及びマンガンのレベルの上昇は、基線値を上回り、アフコシル化のレベルを約１．３％増強した。高濃度の銅及びマンガンの添加が細胞培養性能に影響を有さなかった一方で、それらは、産物の品質には影響を及ぼした。表２及び３を参照されたい。

グリコシル化は、組換えタンパク質薬物の治療効力に影響を及ぼし得る。Ｆｃグリコシル化の変化がＦｃ−媒介性エフェクター機能に影響を及ぼし得ることは周知である。アフコシル化及び高マンノースグリカンは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を増強し得る。ＡＤＣＣアッセイにおける使用では、アフコシル化及びフコシル化組換え抗ＴＮＦα抗体物質を、供給バッチプロセスを使用して別々に生産した。アフコシル化抗体を、フコシルトランスフェラーゼ阻害物質を添加することで作製した。得られた組換え抗体は、約８５％アフコシル化された。次いで、アフコシル化抗体物質を、完全フコシル化抗体物質と混合して、最終抗体混合物において特定レベルのアフコシル化を生成した。次いで、抗体物質を様々なレベルのアフコシル化でＡＤＣＣ活性のレベルを測定するために使用して、ＡＤＣＣ応答の感度を決定した。

膜貫通ＴＮＦαのＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）耐性型を安定発現するＣＨＯ Ｍ７細胞を標的細胞として使用する細胞ベースのアッセイにおいて、抗体混合物のＡＤＣＣ活性を評価した。ヒトＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ）を安定的に遺伝子導入されたＮＫ９２−Ｍ１細胞を、エフェクター細胞として使用した。簡単には、ＮＫ９２−Ｍ１／ＣＤ１６エフェクター細胞と共に同時インキュベーションする前に、標的細胞を漸増濃度（０．１４３ｎｇ／ｍＬから４０ｎｇ／ｍＬ）の抗体でオプソニン処理した。ＡＤＣＣに媒介されて標的細胞が溶解すると、細胞内酵素アデニル酸キナーゼが細胞培養培地に放出された。ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）を使用して、放出されたアデニル酸キナーゼの量を測定した。ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）は、４パラメーターデータ分析及び用量反応データへの拘束モデル曲線フィットを行うためであった。試験試料応答を参照標準で得られた応答と比較することによって、試験試料活性を決定し、相対的細胞傷害性パーセントとして報告した。

補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイにおいて使用するために、β−ガラクトシル化物質を、クロマトグラフィーによって濃縮された組換え抗ＴＮＦα抗体の画分から得た。濃縮抗体を使用して、特定レベルのβ−ガラクトシル化を有する溶液を調製した。次いで、様々なレベルのβ−ガラクトシル化でのＣＤＣ活性のレベルを、ＣＤＣ応答の感度を立証するために測定した。

抗体によって誘発されたＣＤＣ活性の程度を機能性細胞ベースのアッセイにおいて評価した。ＣＨＯ Ｍ７細胞を、２０μＭカルセイン−ＡＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に事前インキュベートした。カルセイン−ＡＭは細胞内に入り、非特異的エステラーゼによって切断されて、蛍光性になり、インタクトな細胞膜内に捕捉される。カルセイン負荷された標的細胞を、種々の容量濃度の抗体（１．５６３ｎｇ／ｍＬから２００ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、続いて、第２のインキュベーションのために、補体を添加した（２．５％最終濃度）。

補体インキュベーションの後に、上清を除去し、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して蛍光を測定した。蛍光強度は、細胞溶解の量に正比例した。ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、４パラメーターデータ分析及び用量応答データへの拘束モデル曲線フィットを行った。試験試料応答を参照標準で得られた応答と比較することによって、試験試料活性を決定し、相対的細胞傷害性パーセントとして報告した。

僅か２％のアフコシル化のレベルの上昇が、ＡＤＣＣ活性に対して実際的な影響を有した（図７）。ＣＤＣ活性も、β−ガラクトシル化のレベルの上昇によって明らかな影響を受けたが、その応答は、感度がかなり低かった（図８）。

ＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能は、治療用タンパク質の臨床的活性のための重要な因子であり得、特定のグリカンでの所望の標的値の実現は、所望の臨床的終点に達するための鍵であり得る。アフコシル化の僅かな変化が、糖タンパク質のＡＤＣＣ活性に対して多大な影響を有し得る。銅及びマンガンの変更によって、これらのエフェクター機能を担うグリカンのレベルを制御し、産物の品質を指示することが可能である。

Claims (28)

1. 組換えタンパク質におけるフコシル化グリカン含量を操作するための方法であって、
   バイオリアクターに、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を接種すること、
   前記宿主細胞を、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で培養すること、ここで、前記細胞培養培地は、ｐＨ７．０で銅１０〜１００ｐｐｂ及びマンガン５０〜１０００ｎＭを包含する、
   前記宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を採取すること、ここで、前記組換えタンパク質におけるアフコシル化グリカンのレベルが、より低いｐＨの同じ細胞培養培地中で得られたアフコシル化グリカンレベルと比較して、上昇している
   を含む、前記方法。
2. 前記組換えタンパク質におけるβ−ガラクトシル化のレベルの上昇をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記銅の濃度が１００ｐｐｂである、請求項１に記載の方法。
4. 前記マンガンの濃度が１０００ｎＭである、請求項１に記載の方法。
5. 前記フコシル化グリカン含量を、前記組換えタンパク質のエフェクター機能に影響を及ぼすように操作する、請求項１に記載の方法。
6. 温度シフトをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記温度シフトが３６℃から３１℃への変化である、請求項６に記載の方法。
8. 前記温度シフトを増殖相と産生相との間の移行期に行う、請求項６に記載の方法。
9. 前記温度シフトを前記産生相中に行う、請求項６に記載の方法。
10. 前記組換えタンパク質を発現する宿主細胞を、バッチ培養、供給バッチ培養、潅流培養、またはそれらの組合せにおいて培養する、請求項１に記載の方法。
11. 前記培養が潅流培養である、請求項１０に記載の方法。
12. 潅流が連続潅流を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 潅流速度が一定である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記潅流を１日当たり１．０作業容積以下の速度で行う、請求項１１に記載の方法。
15. 前記潅流を交互接線流によって達成する、請求項１１に記載の方法。
16. 前記バイオリアクターが少なくとも５００Ｌの容量を有する、請求項１に記載の方法。
17. 前記バイオリアクターが少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する、請求項１に記載の方法。
18. 前記バイオリアクターが少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する、請求項１に記載の方法。
19. 前記バイオリアクターに、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬを接種する、請求項１に記載の方法。
20. 前記無血清の化学的に規定された細胞培養培地が、潅流細胞培養培地である、請求項１に記載の方法。
21. 前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
22. 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の方法。
23. 前記組換えタンパク質が糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
24. 前記組換えタンパク質が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
25. 前記宿主細胞によって産生された組換えタンパク質が、精製され、薬学的に許容される製剤に製剤化される、請求項１に記載の方法。
26. 請求項１に記載の方法によって生産された組換えタンパク質。
27. 精製されている、請求項２６に記載の組換えタンパク質。
28. 薬学的に許容される製剤に製剤化された、請求項２６に記載の組換えタンパク質。

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