JP2017535841A - 非侵襲性出生前検査用デジタルｐｃｒの設計 - Google Patents

Abstract

胎児を宿している女性に由来する血漿試料中の染色体異数性を決定するためのｄＰＣＲ実験の設定を決定する技術が提供される。前記試料に関するデータ、ｄＰＣＲ過程、および所望の確度を用いて前記設定を決定してもよい。そのような設定は、ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数、予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数、および前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数を含んでいてもよい。確度データによって規定された確度を満たすためにこれらの設定を用いてもよい。したがって、前記ｄＰＣＲ実験は、所望の確度を達成しつつ、例えば、必要以上の試料を用いず、かつ必要以上の予備増幅または操作を行わずにコストを低減するように設計してもよい。【選択図】図３

Description

本開示は、一般にデジタルＰＣＲに関し、より具体的には、非侵襲性出生前検査を行うためのデジタルＰＣＲ実験を設計（例えば、予備増幅サイクル数を決定）することに関する。

デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、非侵襲性出生前検査のための簡易、高速、かつ正確な技術である（［１］、［２］、［３］、［４］）。しかしながら、この応用でｄＰＣＲ実験を設計するための統計ツールは未だ確立されていない。いくつかの既存の方法（例えば［１］および［７］）では、この使途に特異的な、重要な量を考慮していない。

例えば、参考文献［１］は、５％の偽陽性率で異数性を検出するために正区画の割合が１／３であると仮定して分割数を推定する方法を提供する。何よりも、この方法では、偽陰性率、および予備増幅工程が考慮されていない。参考文献［７］は、ｄＰＣＲの精度（１％未満の偽陽性率および１％未満の偽陰性率で信頼性のある検出を行うことができる最少濃度差）のための方法を提供する。この方法の要旨は、ＳＮＶ（一ヌクレオチド多様性）の検出およびコピー数の違いにあり、胎児画分を考慮したものではない。また、予備増幅工程も考慮されていない。
したがって、出生前検査用のｄＰＣＲ実験を設計するための改良されたシステムおよび方法が必要とされている。

本発明の実施形態によれば、胎児を宿している女性に由来する血漿試料中の染色体異数性を検出するためのｄＰＣＲ実験の設定を決定する技術が提供される。前記試料のデータ、ｄＰＣＲ過程、および所望の確度を用いて前記設定を決定してもよい。このような設定は、前記ｄＰＣＲ実験の染色体分子の最少入力数、予備増幅手順の染色体分子最小数、および前記予備増幅手順でのＰＣＲサイクル数を制御することを含んでいてもよい。要件によって規定される確度を満たすためにこれらの設定を用いてもよい。よって、前記ｄＰＣＲ実験は、所望の確度を達成しつつ、例えば、必要以上の試料を用いず、かつ必要以上の予備増幅を行わずにコストを低減するように設計してもよい。

一側面では、胎児を宿している女性に由来する血漿試料中のＤＮＡ分子の予備増幅を含む、染色体異数性の検出用デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）実験の設定を決定する方法が提供される。前記方法は、検査対象の染色体および対照の染色体のそれぞれの座位数、前記血漿試料中で測定された胎児ＤＮＡ画分、前記胎児ＤＮＡ画分の測定における胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、未知の予測胎児ＤＮＡ画分と前記血漿由来の推定胎児ＤＮＡ画分との相対誤差が前記胎児ＤＮＡ画分誤差許容範囲内である確率を制御する誤差制御数、検査される異数性の程度、前記血漿試料由来のＤＮＡを増幅する予備増幅手順から得られたＤＮＡ分子のうち、前記ｄＰＣＲ実験に入力される部分を規定する部分制約、予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、および偽陽性率および偽陰性率を含む誤差率基準を含むデータをコンピューターシステムでデータを受信すること、前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、前記ＰＣＲ効率に関するデータ、および前記異数性の程度に基づいて前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を前記コンピューターシステムで算出すること、前記胎児ＤＮＡ画分、前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、および前記誤差制御数に基づいて予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数を前記コンピューターシステムで算出すること、および前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数、前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数、前記予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、前記予備増幅の座位数、および前記部分制約に基づいて前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数を前記コンピューターシステムで推定することを含む。一態様では、前記方法は、前記予備増幅手順に入力されるＤＮＡ分子の最小数に基づいて前記試料のサイズを決定することを更に含む。他の態様では、前記方法は、予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数、前記予備増幅手順の推定ＰＣＲサイクル数、および前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を用いて前記予備増幅手順および前記ｄＰＣＲ実験を行うこと、前記検査対象の染色体および１本以上の対照の染色体に由来するＤＮＡ断片の正分割に基づいて検査基準値（test metric）を得ること、および前記検査基準値をカットオフ値と比較して前記胎児が染色体異数性を有するか否かを決定することを更に含む。態様によっては、前記予備増幅手順に入力される試料サイズは、前記予備増幅手順に入力されるＤＮＡ分子の少なくとも最小数を提供し、前記予備増幅手順は、少なくとも前記ＰＣＲサイクルの推定数を行い、少なくとも前記対照の染色体分子の最少入力数が前記ｄＰＣＲ実験に入力される。態様によっては、前記ＰＣＲ効率に関するデータは、予め規定されたＰＣＲ効率の下限、前記検査対象の染色体および前記対照の染色体の平均ＰＣＲ効率が等しいという仮定、および前記予備増幅手順での検査対象の染色体および対照の染色体のＰＣＲ効率の比率の少なくとも１つを含む。態様によっては、前記方法は、前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、および対照の染色体分子のデジタルＰＣＲ実験への入力数を用いて前記デジタルＰＣＲ実験の検出可能な最少相対差を算出すること、および前記検出可能な最少相対差を用いて、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出することを更に含む。態様によっては、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数の算出は、以下の式によって決定される。
ここで、

ここで、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ｈは前記異数性の程度であり、Ｒは前記ＰＣＲ効率に関するデータであって前記対照の染色体および前記検査対象の染色体の座位での効率の比に対応する。ｇ（１）は、ｈ＝１である場合のｇ（ｈ）の値である。αは偽陽性率であり、βは偽陰性率であり、ｚ_1-αは標準正規分布の１００（１−α）％番目の分位数であり、ｚ_1-βは前記標準正規分布の１００（１−β）％番目の分位数である。これらの態様のいくつかでは、

ここで、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であり、Ｌｔは前記検査対象の染色体の座位数であり、ｐは予備増幅サイクル数であり、ｙは特定の座位での効率である。これらの態様のいくつかでは、Ｒは、

態様によっては、予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数の算出は、以下の式によって決定される。

ここで、ψは前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲であり、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ηは前記誤差制御数であり、かつ
は標準正規分布の
番目の分位数である。

態様によっては、前記予備増幅手順でのＰＣＲサイクル数の推定は以下の式によって決定される。
ここで、
は、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数であり、τは前記部分制約であり、ｙ₀は前記予備増幅手順のＰＣＲ効率の下限であり、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であって、前記検査対象の染色体上の座位数に等しい。
は、前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数である。態様によっては、前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲は０．０５であり、誤差制御数は０．０５であり、部分制約は０．００５である。特定の態様では、１本の対照の染色体のみが用いられ、前記検査対象の染色体および前記対照の染色体上で複数の座位が用いられ、かつ前記検査対象の染色体および前記対照の染色体上で同じ座位数が用いられる。

他の側面では、実行されるとコンピューターシステムを制御して、胎児を宿している女性に由来する血漿試料中のＤＮＡ分子の予備増幅を含む染色体異数性の検出のためのデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）実験の設定を決定する複数の指示を記憶する非一時的コンピューター可読媒体を含むコンピューター製品が提供される。前記指示は、検査対象の染色体および対照の染色体のそれぞれの座位数、前記血漿試料中で測定された胎児ＤＮＡ画分、前記胎児ＤＮＡ画分の測定における胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、未知の予測胎児ＤＮＡ画分と前記血漿に由来する推定胎児ＤＮＡ画分の相対誤差が前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲内にある確率を制御する誤差制御数、検査される異数性の程度、前記血漿試料由来のＤＮＡを増幅する予備増幅手順から得られたＤＮＡ分子のうち、前記ｄＰＣＲ実験に入力される部分を規定する部分制約、予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、および偽陽性率および偽陰性率を含む誤差率基準を含むデータを受信すること、前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、ＰＣＲ効率に関するデータ、および前記異数性の程度に基づいて前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出すること、前記胎児ＤＮＡ画分、前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、および前記誤差制御数に基づいて予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数を算出すること、および前記ｄＰＣＲ実験の対照の染色体分子の最小数最少入力数、前記予備増幅手順の対照の染色体分子、前記予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、前記予備増幅の座位数、および前記部分制約に基づいて前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数を推定することを含む。態様によっては、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数は、以下の式によって決定される。
ここで、
ここで、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ｈは前記異数性の程度であり、Ｒは前記ＰＣＲ効率に関するデータであって、前記対照の染色体および前記検査対象の染色体の座位での効率の比に対応する。ｇ（１）はｈ＝１である場合のｇ（ｈ）の値であり、αは偽陽性率であり、βは偽陰性率である。ｚ_1-αは標準正規分布の１００（１−α）％番目の分位数であり、ｚ_1-βは前記標準正規分布の１００（１−β）％番目の分位数である。態様によっては、
ここで、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であり、Ｌｔは前記検査対象の染色体上の座位数であり、ｐは予備増幅サイクル数であり、ｙは特定の座位での効率である。態様によっては、Ｒは、

態様によっては、予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数の算出は、以下の式によって決定される。
ここで、ψは前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲であり、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ηは前記誤差制御数であり、
は標準正規分布の
番目の分位数である。態様によっては、前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数の推定は、以下の式によって決定される。
ここで、
は前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数であり、τは前記部分制約であり、ｙ₀は前記予備増幅手順のＰＣＲ効率の下限であり、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であって、前記検査対象の染色体上の座位数に等しい。
は前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数である。態様によっては、前記ＰＣＲ効率に関するデータは、予め規定されたＰＣＲ効率の下限、前記検査対象の染色体および前記対照の染色体の平均ＰＣＲ効率が等しいという仮定、および前記予備増幅手順での検査対象の染色体および対照の染色体のＰＣＲ効率の比率の少なくとも１つを含む。態様によっては、前記指示は、前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、および対照の染色体分子のデジタルＰＣＲ実験への入力数を用いて前記デジタルＰＣＲ実験の検出可能な最少相対差を算出すること、および前記検出可能な最少相対差を用いて、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出することを更に含む。

その他の態様は、本明細書に記載される方法に関連するシステム、持ち運び可能な消費者装置、およびコンピューター可読媒体に関する。

以下の詳細な記述および添付図面を参照することで本発明の態様の性質および利点の理解が深まる。

検査試料が正常である場合および検査試料が本発明の態様による異数性を有する場合の検定統計量の分布図１００を示す。 予備増幅手順への対照の染色体分子の入力数が本発明の態様による推定胎児画分の標準誤差に及ぼす影響を示す。 予備増幅手順への対照の染色体分子の入力数が本発明の態様による推定胎児画分の標準誤差に及ぼす影響を示す。 予備増幅手順への対照の染色体分子の入力数が本発明の態様による推定胎児画分の標準誤差に及ぼす影響を示す。 標準正規分布の９７．５％番目の分位数を示す。 本発明の態様による胎児を宿している女性に由来する血漿試料中のＤＮＡ分子の予備増幅を含むデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）実験の設定を決定する方法３００のフローチャートである。 本発明の態様による予備増幅への入力分子数の導出である。 本発明の態様による異なる胎児画分での予備増幅手順に対する対照の染色体分子の最少入力数を示す表である。 本発明の態様によるＴ２１を検出するためのｄＰＣＲ実験に必要な対照の染色体分子の最少入力数を示す表である。 本発明の態様による予備増幅（図５）に対する対照の染色体分子の最小数からｄＰＣＲ実験（図６）に入力される対照の染色体分子の最小数を得るために予備増幅に必要なＰＣＲサイクルの最小数を示す表である。 異なるＦＰ（偽陽性）率およびＦＮ（偽陰性）率での、分子の予測数Δμ_p/μ_pc（黒色実線）と対照の染色体分子数μ_pcとの検出可能な最少相対差の関係を示す表である。各色の線は、異なる胎児画分の予測分子数の相対差である。 異なるＦＰ（偽陽性）率およびＦＮ（偽陰性）率での、分子の予測数Δμ_p/μ_pc（黒色実線）と対照の染色体分子数μ_pcとの検出可能な最少相対差の関係を示す表である。各色の線は、異なる胎児画分の予測分子数の相対差である。 異なるＦＰ（偽陽性）率およびＦＮ（偽陰性）率での、分子の予測数Δμ_p/μ_pc（黒色実線）と対照の染色体分子数μ_pcとの検出可能な最少相対差の関係を示す表である。各色の線は、異なる胎児画分の予測分子数の相対差である。 本発明の態様によるシステムおよび方法で用いることができるコンピューターシステム１０の一例のブロック図を示す。 本発明の方法を実施するのに用いられるソフトウェア資源とハードウェア資源の関係を示す概略ブロック図の一例である。 デジタルＰＣＲ装置とコンピューターシステムの関係を例示する概略ブロック図の一例である。

定義
予測分子数の相対差により、患者の血漿（無細胞胎児ＤＮＡの特定の画分を含む）中の正常な染色体分子よりもどの程度多く異数性染色体分子が、指定された入力変数に基づく予備増幅の後のｄＰＣＲ実験に入力されているかを平均で定量化する。この相対差は、胎児ＤＮＡ画分、異数性の程度など、様々な値に依存している可能性がある。

予測分子数の検出可能な最少相対差は、指定された偽陽性率および偽陰性率の範囲内で信頼性を持って検出することができる予備増幅後の異数性染色体と正常な染色体のＤＮＡ分子の予測数の相対差に対応する。この差は、他の染色体に対するある染色体の異なる座位数の結果として乗数を含んでいる可能性がある。

検定統計量は、観察されたデータが検査対象の染色体が正常であるという帰無仮説に対してどれくらい多くの証拠を提供するかを測定するための観察データに基づいて算出された量である。検定統計量としては、例えば、前記検査対象の染色体および前記対照の染色体に由来する分子数の差または比率を含む。

予備増幅に入力される分子数は、予備増幅に入力される母親の血漿中の半数体ゲノム数に相当する。入力されるＤＮＡ体積によりこの数を決定することができるが、無細胞ＤＮＡの断片化された小片は血漿中にある。予備増幅前の各座位での無細胞ＤＮＡ数は、予備増幅に入力される分子数と同じである。予備増幅への入力分子数が同じであっても、予備増幅の座位が多い程、予備増幅に入力される無細胞ＤＮＡも多くなる。複数の座位に渡る分子数が同じであると仮定すると、分子の最小数は、各座位での分子の最小数に対応する。したがって、座位が多い程、入力される分子も多い。

ｄＰＣＲ実験に入力される分子数は、予備増幅から生成されｄＰＣＲ実験に入力される無細胞ＤＮＡ数に相当する。これは予備増幅への入力分子数とは異なる。

本態様は、非侵襲性出生前検査用のデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）実験のための統計フレームワークを提供する。このような出生前検査では、妊婦に由来する試料中に見られることがある胎児由来の無細胞ＤＮＡを利用する。例えば、胎児の無細胞ＤＮＡは母親の血漿中に見られることがある。

非侵襲性出生前検査でのｄＰＣＲ実験の応用と他のｄＰＣＲ用途との大きな違いは、胎児の無細胞ＤＮＡは前者の設定では非常に限られているという点である。異数性染色体と正常な染色体の小さな差を検出する能力を得るため、これらの態様では、ｄＰＣＲ実験を行う前に複数の座位で検査対象の染色体に予備増幅を行う。これらの態様を用いて、ｄＰＣＲ実験の特定の設定を決定して、所望の確度を得てもよい。設定としては、例えば、用いる母親の試料の量（例えば、予備増幅手順のための対照の染色体分子の最小数によって決定される）、予備増幅サイクル数、および（例えば、ｄＰＣＲ実験のための対照の染色体分子の最少入力数により決定される）ｄＰＣＲ実験に入力されるＤＮＡ量などが挙げられる。

Ｉ．導入
これら態様では、実際のｄＰＣＲ実験の前に予備増幅を行う。（例示目的で）１個の座位および少量の母親の試料を用いる簡単な例において、この母親の試料が染色体１上の第１の座位に由来する１００個のＤＮＡ分子と、染色体２１上の第２の座位に由来する１０５個のＤＮＡ分子（５％の胎児の無細胞ＤＮＡ）を有すると仮定する。正常試料では、幾分かの測定変動性はあるものの、ＤＮＡ分子数は同じであるはずである。ここで、両ＤＮＡ分子の差は５個のＤＮＡ分子であるが、検出が困難である可能性がある。

これら２０５個のＤＮＡ分子を予備増幅手順に入力して、前記第１の座位に由来する７９４９６．１５個のＤＮＡ分子、および前記第２の座位に由来する８３４７０．９６個のＤＮＡ分子を得る（予備増幅中、いずれの染色体についてもＰＣＲ効率が０．９５、 ＰＣＲサイクルが１０サイクルと仮定する）。ここで、両ＤＮＡ分子の差は、３９７４．８１個のＤＮＡ分子となり、より容易に検出することができる。

複数の座位を用いて、より少ないＰＣＲサイクルで所望量のＤＮＡ分子を得られるだけでなく、これら座位に渡るＰＣＲ効率と胎児画分の不均衡をならすことができる。これは重要なことである。というのは胎児の無細胞ＤＮＡ量は限定されているからである。また、所望の能力で異数性を検出するために、十分な量の分子を入力しなければならない。さらに、前記ｄＰＣＲ実験は、例えば、誤差率基準（例えば、偽陽性率および偽陰性率）によって定義される所望の確度を得るために注意深く設計しなければならない。また、予備増幅を過剰なサイクルで行うことは望ましくない。というのも、増幅不均衡または誤取り込みなどのＰＣＲノイズが過剰に導入される可能性があるからである。

Ａ．予備増幅を用いたデジタルＰＣＲ実験
予備増幅の課題の一つに、胎児画分が非常に少ない血漿の一部を採取して予備増幅する場合、採取した血漿の胎児画分の標準誤差は非常に大きくなる可能性がある。前記予備増幅への入力分子数を確実に十分な大きさにして、採取した血漿中の胎児画分の量が十分に正確になるようにする必要がある。

これらの態様は、以下の疑問について対応することができる。（１）ｄＰＣＲ実験に入力される異数性染色体と正常な染色体との予測分子数の検出可能な最少相対差、および特定の偽陽性率および偽陰性率で信頼性をもって異数性を検出するためにｄＰＣＲ実験に入力しなければならない対照の染色体分子の総数、（２）許容可能な程度に胎児画分の標準誤差を制御するために入力しなければならない分子の総数、（３）予備増幅に必要なＰＣＲサイクル。

これらの態様は、予備増幅後の異数性染色体と正常な染色体の予測分子数の相対差を計算する第１の計算によってこれらの疑問に対応することができる。一実施では、この予測分子数の相対差は、生体試料中の胎児ＤＮＡ画分、ＰＣＲサイクル数、およびＰＣＲ増幅効率を組み込んでいる。一態様では、検査対象の染色体および対照の染色体の平均ＰＣＲ効率は同じであると仮定してもよく、したがって、ＰＣＲサイクル数およびＰＣＲ効率はｄＰＣＲ実験への入力分子数を推定するのに必要ではない。

予測分子数の相対差を用いて、予測分子数の検出可能な最少相対差を推定してもよい。この予測分子数の検出可能な最少相対差は、他の染色体に対するある染色体に由来するＤＮＡ分子の最少差である。この最少相対差は、指定された偽陽性率および偽陰性率で信頼性をもって検出することができる。分散安定化変換による検定統計量を用いてこの差を決定してもよい。

指定された偽陽性率および偽陰性率で異数性を検出するために、予測分子数の相対差を用いてｄＰＣＲ実験に必要な分子の最少総数を得てもよい。これらの態様はさらに、胎児ＤＮＡ画分の標準誤差を許容可能な程度に制御するために、予備増幅に入力される分子の必要総数を推定する方法を提供する。

これらの態様は、ｄＰＣＲ実験に入力するのに必要な分子の最少総数および予備増幅に入力するのに必要な分子の総数を前提として、予備増幅に必要なＰＣＲサイクル数を推定することができる。結果（以下に示す）から、胎児画分が３％と少なくても、１％の偽陽性率および１％の偽陰性率で異数性を検出することが可能であることが示された。胎児画分が少ない程、予備増幅に入力するのに必要な分子の総数は多くなる。偽陽性率および偽陰性率が高い程、あるいは胎児画分が少ない程、異数性を検出するためにｄＰＣＲ実験に入力するのに必要な分子の総数は多くなる。ｄＰＣＲ実験に入力される分子が特定の数である場合、胎児ＤＮＡ画分が多い程、異数性を検出することができる傾向が高くなる。予備増幅の座位数が多い程、必要なＰＣＲサイクル数は少なくなる。

Ｂ．検定統計量
試料を分析して胎児の異数性が存在するか否かを決定する場合、その試料の検定統計量を得る。検定統計量とは、検査対象の染色体が異数体である証拠の量を測定する、この試料のｄＰＣＲ出力データから算出される量である。例えば、前記検査対象の染色体に由来するＤＮＡ分子の第１の数、および１本以上の対照の染色体に由来するＤＮＡ分子の第２の数を用いて検定統計量を決定してもよい。次いで、この検定統計量をカットオフ値と比較して、例えば、異数体または正常な染色体として試料を分類してもよい。あるいは、２個のカットオフ値を用いる場合は、未分類としてもよい。検定統計量の一例は、差、または比率である。差を用いる場合は、検定統計量が差の標準誤差を組み込むように正規化を行ってもよい。

カットオフ値の選択は、偽陽性率および偽陰性率に影響を及ぼす。１個のカットオフ値を用いる例では、カットオフ値が大きい程、偽陽性率は低下するが、偽陰性率は増加する。カットオフ値が低い程、偽陰性率は低下するが、偽陽性率は増加する。

第１のカットオフ値が第２のカットオフ値未満である場合は、２個のカットオフ値を用いてもよい。例えば、検定統計量が第１のカットオフ値より低い場合、この試料は正常と同定することができる。検定統計量が第２のカットオフ値より高い場合、この胎児は異数性を有すると同定することができる。検定統計量が第１のカットオフ値と第２のカットオフ値の間である場合、この試料は中間である可能性がある。第１のカットオフ値を低くして偽陰性率を低下させる、かつ／または第２のカットオフ値を高くして偽陽性を低下させる場合、中間の試料数が増加するが、これも問題である。特定の検定統計量および誤差率については以下で記載する。

図１は、本発明の態様による正常試料および異数体試料の検定統計量の分布を示す図１００である。横軸１０１は、検定統計量Ｊの異なる値に対応する。縦軸１０２は、特定の検定統計量が観察された回数の割合に対応しており、密度として標識されている。この例では、検定統計量Ｊは、検査対象分子（すなわち、検査対象の染色体由来）の検査数と制御分子（すなわち、対照の染色体由来）の対照数の差に対応し、この差の標準誤差によって標準化されている。したがって、１本の対照の染色体を用いるこの例では、正常試料は、ＤＮＡ分子数が同じであるので、検定統計量の値がゼロであることが予測される。異数体試料は、検定統計量Ｊの値が高いことが予測される。

分布１１０は、正常試料の検定統計量の確率分布を示す。ＤＮＡ分子が偶然試料中に存在したなどの天然の多様性により、正常試料によっては検査対象分子が対照分子よりも多く、あるいは少なく正常試料に含まれていることがある。しかしながら、最も可能性の高い値は、確率分布１１０のピークであるゼロである。この分布は正規分布に従っており、本明細書では例示のために示す。

分布１２０は、異数体試料の検定統計量の確率分布を示す。分布１２０のピークはΔ１２５に対応する。Δ１２５の値は、実験の分子数に依存している。ｄＰＣＲ実験に入力される分子が多い程、Δの値は大きくなる。Δ１２５の値はまた、試料中の胎児ＤＮＡ画分に依存している。胎児ＤＮＡ画分が多い程、検査対象分子が多くなり（すなわち、これらの試料は異数性を有するので）、検定統計量の値は大きくなる。

図１００では、カットオフ値１３０を用いて偽陽性率αおよび偽陰性率βを示す。カットオフ値１３０より大きい分布１１０の値が、誤って異数性を有すると分類されることがあり、したがって、偽陽性である。カットオフ値１３０未満の分布１２０の値が、誤って正常と分類されることがあり、したがって偽陰性である。

したがって、これらの態様は、偽陽性率をα以下に制御するために、Ｊがｚ_1-αとして標識されるカットオフ値１３０より大きい場合には帰無仮説を却下することができる。この例の場合、対立仮説（すなわち、異数性）では、検定統計量Ｊは平均Δおよび標準偏差１を有する正規分布を有する。カットオフ値ｚ_1-αを前提として、偽陰性率はβ以下である。換言すれば、上記能力は少なくとも１−βである。入力される対照の染色体分子数はΔに影響を及ぼす。すなわち、分子が多い程、Δは０から離れる。したがって、分子が多い程、分布１１０と分布１２０の重なりが小さくなり、偽陰性率が低下する。態様によっては、Ｊは分散安定化変換による検定統計量であるので、分子数が増加しても２本の正規曲線の幅は一定である。

自明であるが、カットオフ値１３０の選択により偽陽性率および偽陰性率を指示する。偽陰性率を下げる方法の一つは、ｄＰＣＲ実験に入力される分子数を増加させることであり、これによりΔ１２５が高くなる。分布１１０および分布１２０の幅は同じであるので、この２つの分布の重なる量は少なくなり、偽陰性率が低下する。しかしながら、実験のための分子数が増加することで追加のコストおよび時間がかかる。これらの態様では、ｄＰＣＲ実験に対する入力分子の最小数を決定して、所望の誤差率を達成することができる。このメモ値を用いて時間およびコストを最小化しつつ、所望の誤差率を達成することができる。

一態様では、ＰＣＲサイクル数ｐの予備増幅後の検査対象の染色体２１（他の検査対象の染色体を用いてもよい）に由来するＤＮＡ分子の検査数をＷ_p21と標識し、対照の染色体に由来するＤＮＡ分子の対照数をＷ_pcと標識する。単一体積ｄＰＣＲ実験は、ｄＰＣＲ装置のすべての分割が同じ体積である場合に対応する。複数体積ｄＰＣＲ実験は、分割が異なる体積である場合に対応する。

単一体積ｄＰＣＲ実験では、態様によっては、ポアソン補正を行ってもよい。ポアソン方程式を用いて分子の推定総数Ｗ_p21およびＷ_pcを算出する。
および
ここで、ｑ₂₁およびｑ_cは、それぞれ、特定のｄＰＣＲ実験での染色体２１チャネルおよび対照の染色体チャネルでの正分割の割合であり、Ｎは総分割数である。これら２つの割合は、各チャネルの分割を正分割および負分割に分けるいずれかの方法を用いて算出してもよい。

一態様では、ｑ₂₁およびｑ_cを算出するために、二次元空間ですべての分割の強度をクラスタ化してもよく、両チャネルの正分割数を計測する。これらの計測値を総分割数Ｎで除してもよい。複数体積ｄＰＣＲ実験の場合、１ｍＬあたりの染色体２１および対照の染色体分子の推定数
および
について、それぞれ、参考文献［１１］の式（８）を解いて計測値を推定してもよい。以下の式
および
を用いてこれらの濃度をＷ_p21およびＷ_pcに変換する。ここで、参考文献［１１］に定義されているように、Ｖ_iはｉ番目のウェル体積（ｍＬ）であり、ｎ_iはウェル体積Ｖ_iでの分割数であり、ｍは異なるウェル体積の総数である。
Ｃ．胎児のＤＮＡ画分の測定

上述のように、胎児が異数性を有する場合、胎児ＤＮＡ画分は検査対象の染色体上の検査対象のＤＮＡ分子数に影響を及ぼす。この胎児ＤＮＡ画分は、例えば、以下で記載する様々な方法で測定することができる。測定には特定の程度の誤差が含まれ、所望の偽陰性率に影響を及ぼす場合がある。というのは、胎児画分が過大に推定されると、ｄＰＣＲ実験に入力されるＤＮＡ分子量が不十分になるからである。上記の例では、このような過大推定により予測値Δは０に向かってシフトして、偽陰性率が高くなる。

胎児画分が過小に推定されると、ｄＰＣＲ実験に入力される分子量が必要以上に多くなり、偽陰性率は低下するものの、実験コストは増加する。したがって、胎児画分を測定する代わりに、十分な資源が利用できる場合は、単に胎児画分の下限を用いて十分な統計能力を確保し、異数性を検出してもよい。これらの態様では、例えば、予備増幅手順の対照ＤＮＡ分子の最小数を決定するために、胎児ＤＮＡ画分の測定における誤差許容範囲を得ることができる。

胎児のＤＮＡ画分は典型的には、母親のＤＮＡではなく胎児のＤＮＡ上にのみ存在する遺伝子マーカーを用いて測定して、胎児の分子と母親の分子を識別する。通常予備増幅の前に、前記胎児に特異的な遺伝子マーカーを含む少なくとも１個の座位および胎児および母親の両方に共通する少なくとも１個のマーカーについてＰＣＲサイクルを用いて抽出された母親の血漿の一部を増幅する。胎児のＤＮＡマーカーを用いて胎児のＤＮＡ分子数を計測し、共通座位を用いて総ＤＮＡ分子数を計測し、胎児のＤＮＡの計測数を総ＤＮＡ数で除した比率により胎児ＤＮＡ画分が提供される。また、その座位で胎児の１個のアレルが母親のアレルと同じであることを説明するためにこれら２つの因子を導入してもよい。

この方法には異なる２種類の胎児のマーカーを用いることができる。第１のマーカーは、胎児のＤＮＡに対してのみ特定の形態で存在するエピジェネティックマーカーである。特定のプライマー配列のみが、元々非メチル化されていた、またはメチル化されていたＤＮＡを増幅するように、このエピジェネティックマーカーを差別的に増幅可能な形態に生化学的に転化することができる。例えば、非メチル化ｄＣ残基をｄＵに転化する重亜硫酸ナトリウムを用いた処理が挙げられる。胎児画分を測定するためにこの方法に用いることができる別のマーカーは、男児を妊娠した場合にのみ用いられる。胎児が男児である場合、染色体Ｙを用いて胎児の分子数を測定してもよい。

図２Ａ〜図２Ｃは、予備増幅手順に入力される対照の染色体分子数の、本発明の態様による入力血漿中の胎児画分の標準誤差に及ぼす影響を示している。シミュレーションを行って、胎児画分の標準誤差に影響を及ぼす、予備増幅に入力される対照の染色体分子数を示した。

患者から抽出された全血漿が１００μｌであり、７５００個の対照の染色体分子を含み、これら分子の５％が胎児のＤＮＡであると仮定する。予備増幅のため、前記全血漿から３つの異なる部分（それぞれ、合計で１８７５個、３７５個、および７５個の分子を含む２５μｌ、５μｌ、および１μｌ）を採取すると仮定する。体積毎にこれらの下位試料をランダムに１０００回抽出する。これら３つの異なる体積の胎児画分分布を図２Ａ〜図２Ｃにプロットする。ここで、図２Ａは２５μｌに対応し、図２Ｂは５μｌに対応し、図２Ｃは１μｌに対応する。図２Ａ〜図２Ｃから、より多くの分子を採取する程、胎児画分の標準誤差が小さくなることが分かる。したがって、試料中のＤＮＡ分子が多い程、より正確な胎児画分が得られる。

図２Ｄは、胎児ＤＮＡ画分の確度に関する正規分布のプロットを示している。誤差制御数（ここでは標識η）は、相対誤差が許容誤差の特定の範囲内にある確率を制御する。以下に記載する式（３２）の値
は、標準正規分布の
番目の分位数である。例えば、η＝０．０５であると、
は標準正規分布の９７．５％番目の分位数であり、図２Ｄでは１．９６である。

一般に、標準正規分布のｘ％分位数は、釣鐘曲線の下の左からこの点までの面積がｘ％である値である。誤差制御数ηは、全血漿中の未知の真の（予測）胎児画分と採取した血漿に由来する胎児画分の相対誤差が許容誤差の特定の範囲内にある確率を制御する。誤差制御数ηは、ユーザによって設定することができ、胎児ＤＮＡ画分が上記誤差許容範囲内である確率が満たされるように予備増幅手順に入力されるＤＮＡ分子の最小数に影響を及ぼす。誤差制御数ηの値としては、例えば０．０１、０．０５、および０．１である。
ＩＩ．設定を得る

ｄＰＣＲ実験を様々な設定により定義することができる。ある設定は、予備増幅手順のためのＤＮＡ分子数である。このＤＮＡ分子数は、対照の染色体に由来する対照ＤＮＡ分子数について定義することができる。他の設定は、予備増幅手順でのサイクル数（例えば、ＰＣＲサイクル）である。他の設定は、ｄＰＣＲ実験のＤＮＡ分子の最少入力数である。このＤＮＡ分子数はまた、対照の染色体に由来する対照ＤＮＡ分子数について定義することができる。

Ａ．入力
様々なデータを用いてｄＰＣＲ実験の設定を決定することができる。例えば、試料に関するデータを用いることができる。そのような試料のデータは、血漿試料中で測定された胎児ＤＮＡ画分を含んでいてもよい。この胎児ＤＮＡ画分は、検査対象の染色体に由来する分子量に対する対照の染色体に由来する分子量に影響を及ぼし、よって、必要とする最少分子数に影響を及ぼす。胎児画分が多い程、対照の染色体と検査対象の染色体との差が大きくなり、必要な分子数が少なくなる。

また、ｄＰＣＲ実験の物理過程に関するデータを用いてもよい。このような過程のデータは、検査対象の染色体および１本以上の対照の染色体のそれぞれの座位数を含んでいてもよい。ｄＰＣＲ過程データの例を以下に示す。座位数は、予備増幅工程で増幅される座位数に対応する。この座位数は、ｄＰＣＲ実験に入力される最少対照分子数を得るための予備増幅サイクル数に影響を及ぼす。予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータは、ＰＣＲサイクル数に影響を及ぼす可能性がある。このようなデータは、例えば、予め規定されたＰＣＲ効率の下限、検査対象の染色体および対照の染色体の平均ＰＣＲ効率が等しいという仮定、および検査対象の染色体および対照の染色体の予備増幅手順のＰＣＲ効率の比率など、様々な形態を取る可能性がある。

他の過程データの例として、ｄＰＣＲ実験により検査される異数性の程度が、正常な染色体と検査される異数性の予測数の相対差に影響を及ぼす（例えば、四染色体性は三染色体性よりもその差が大きいことが予測される）。また、部分制約は、予備増幅手順から得られるＤＮＡ分子のうち、ｄＰＣＲ実験に入力される部分を指定することができる。予備増幅手順に由来するＤＮＡ分子の部分が多く用いられる程、分子の最小数を得るのに必要な予備増幅のサイクルは少なくなる。

また、ｄＰＣＲ実験の所望の確度に関するデータを用いることができる。所望の確度は、外的要件（例えば、規制上の要件）または内的要件に基づいて決定してもよい。前記確度データとしては、例えば、胎児ＤＮＡ画分の測定における胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲が挙げられる。誤差許容範囲が大きい程、予備増幅手順に必要な対照の染色体分子は少なくなる。誤差制御数は、未知の予測胎児ＤＮＡ画分と血漿に由来する推定胎児ＤＮＡ画分の相対誤差が胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲内にある確率を制御することができる。誤差制御数が小さい程、予備増幅手順に必要な対照の染色体分子は多くなる。確度データはまた、誤差率基準（例えば、偽陽性率および偽陰性率）を含んでいてもよい。

Ｂ．方法
図３は、本発明の態様による、胎児を宿している女性に由来する血漿試料中のＤＮＡ分子を予備増幅することを含む、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）実験の設定を決定する方法３００のフローチャートである。このｄＰＣＲ実験は、染色体異数性を検出するためのものである。方法３００は、コンピューターシステムによって実行してもよい。

工程３１０でデータを受信する。このデータは、上記のデータを含んでいてもよい。例えば、受信されたデータは、試料データ、ｄＰＣＲ過程データ、および確度データを含んでいてもよい。

工程３２０で、前記受信データの少なくとも一部に基づいてｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出してもよい。例えば、誤差率基準、胎児ＤＮＡ画分、ＰＣＲ効率に関するデータ、および異数性の程度を用いて対照の染色体分子の最少入力数を算出してもよい。一態様では、以下に記載する式（２９）を用いてｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出してもよい。他の態様では、例えば、所定の誤差率に対する予測数の検出可能な相対差が胎児ＤＮＡ画分の値に一致する場合に同定するなど、予測数の検出可能な最少相対差を用いてｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出してもよい。

工程３３０で、受信データの少なくとも一部に基づいて予備増幅手順に対する対照の染色体分子の最小数を算出してもよい。例えば、前記胎児ＤＮＡ画分、前記胎児ＤＮＡ画の誤差許容範囲、および前記誤差制御数を用いてもよい。一態様では、式（３４）が用いられる。図４では、用いることができる様々な態様を記載している。

工程３４０では、受信データの少なくとも一部に基づいて予備増幅手順のＰＣＲサイクル数を推定してもよい。例えば、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数、前記予備増幅手順に対する対照の染色体分子の最小数、前記予備増幅手順に対するＰＣＲ効率に関するデータ、前記予備増幅の座位数、および前記部分制約を用いてもよい。一態様では、式（３７）が用いられる。

工程３５０では、前記予備増幅手順に対する対照の染色体分子の最小数に基づいて前記試料のサイズを決定する。１体積あたりのＤＮＡ量を用いて前記試料のサイズを決定してもよい。例えば、予備適用手順への最小分子数に基づいて、試料のサイズを試料のＤＮＡ濃度に基づいて決定してもよい。一態様では、ＤＮＡおよび血漿の濃度を１ミリリットルあたり約１，５００ゲノム当量（ＧＥ）、あるいは１ナノグラムあたり約３１５ＧＥと仮定してもよい。

工程３６０では、前記ｄＰＣＲ実験を行う。前記ｄＰＣＲ実験は、対照の染色体上の複数の座位のいずれか１個に由来するＤＮＡ断片について正である第１の分割数、および検査対象の染色体上の複数の座位のいずれか１個に由来するＤＮＡ断片について正である第２の分割数を提供することができる。これらの数を用いて検査基準値を決定し、カットオフ値と比較して、胎児が検査している特定の染色体異数性を有するか否かを検出してもよい。

ＩＩＩ．デジタルＰＣＲに必要なＤＮＡ量
本項では、様々な態様により所望の誤差率を達成するためにｄＰＣＲ実験に入力されるＤＮＡの必要量の決定について記載する。異なる誤差率およびその他の潜在的な入力は、ＤＮＡの必要量に影響を及ぼす可能性がある。ＤＮＡの必要量は、例えば、試料全体中のすべてのＤＮＡ分子の総量または対照の染色体の対照ＤＮＡ分子数など、様々な方法で定量化することができる。さらに、予測分子数の相対差を算出してもよく、これを用いてｄＰＣＲ実験に入力されるＤＮＡの必要量を決定してもよい。

本明細書では、予備増幅の後、任意の異数性の程度に対する予測分子数の相対差のための一般式を算出する。本発明者らは、染色体２１の異数性に注目したが、この式はいずれの染色体の異数性にも適用される。

Ａ．表記
ここで、本発明者らは、予備増幅手順に関連し、特定の計算を例示するのに用いられる表記を導入する。
Ｌ_i：染色体ｉの座位数（ここで、ｉ＝１，．．．，２３）。

：座位ｌでの染色体ｉの１サイクルあたりの予備増幅におけるＰＣＲ効率（ここで、ｉ＝１，．．．２３，ｌ＝１，．．．，Ｌ_i、ここで染色体２３は性染色体を指す）。

：予備増幅に入力される座位ｌの染色体ｉの胎児の分子数（ここで、ｉ＝１，．．．２３，ｌ＝１，．．．，Ｌ_i）。

：予備増幅に入力される座位ｌの染色体ｉの母親の分子（ここで、ｉ＝１，．．．２３，ｌ＝１，．．．，Ｌ_i）。

：以下の理想的な状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた座位ｌの染色体ｉの胎児の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３，ｌ＝１，．．．，Ｌ_i。

：以下の理想的な状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた座位ｌの染色体ｉの母親の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３，ｌ＝１，．．．，Ｌ_i。

：以下の実際の状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた座位ｌの染色体ｉの胎児の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３，ｌ＝１，．．．，Ｌ_i。

：以下の実際の状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた座位ｌの染色体ｉの母親の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３，ｌ＝１，．．．，Ｌ_i。

：以下の理想的な状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた染色体ｉの胎児の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３。

Ｚ_pmi：以下の理想的な状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた染色体ｉの母親の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３。

Ｘ_pfi：以下の実際の状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた染色体ｉの胎児の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３。

Ｘ_pmi：以下の実際の状況でＰＣＲサイクル数ｐで予備増幅して得られた染色体ｉの母親の分子数
ここで、ｉ＝１，．．．２３。

Ｂ．予測分子数の相対差
予測分子数の相対差により、患者の血漿（無細胞胎児ＤＮＡの特定の画分を含む）中の正常な染色体分子よりもどの程度多く異数性染色体分子が、指定された入力変数に基づく予備増幅の後のｄＰＣＲ実験に入力されているかを平均で定量化する。この相対差は、胎児ＤＮＡ画分、異数性の程度など、様々な値に依存している可能性がある。以下の考察では検査対象の染色体である染色体２１に重点を置くが、この考察は他の検査対象の染色体を用いた場合にも同様に当てはまる。

１．仮説および予備増幅
説明を簡便にするため、様々な仮説を立てる。実際の算出にこれらの仮説を用いてもよく、あるいは明確な値を得てもよい。一側面では、予備増幅への入力分子数が、染色体上の複数の座位に渡って等しいと仮定することは妥当である。理想的な増幅では、ある座位の分子数は各増幅サイクルで二倍になる。ある座位の胎児の分子の開始数と得られた胎児の分子数の関係を以下の式で表す。
実際の（非理想的な）増幅では、この関係は
したがって、理想的な増幅と実際の増幅との関係は以下の通りである。

以下についても同じ関係が当てはまる。
および

母親および胎児の特定の染色体上の総分子数を、特定の染色体上の各座位の値の合計として求めてもよい。座位と染色体に特異的な分子数との関係は以下の通りである。
ここで、

表記を簡便にするため、また本発明者らのモデルの特殊な場合として、Ｌ_i＝Ｌ，∀iであるようにすべての染色体に対して同じ座位数を仮定してもよい。染色体２１を除くすべての胎児の染色体が正常であり、母親の染色体の全てが正常であると仮定すると、以下の関係が得られる。

式（３）および（４）が成り立つ場合、染色体２１以外の染色体を対照の染色体として用いることができる。

２．予備増幅前の胎児の画分
本項では、予備増幅を行う前に、母親の全血漿由来の血漿部分を用いて胎児画分の推定値を決定することについて記載する。予備増幅ではなく、胎児画分を測定するために母親の全血漿に由来する血漿の個別の部分を用いる。というのは、胎児画分の測定に用いられる遺伝子マーカーは、予備増幅過程で破壊されることがあるためである。この胎児画分を測定するための血漿の個別の部分にｓ回のＰＣＲサイクルを行い、このＰＣＲ生成物の胎児画分が予備増幅に入力される、遺伝子マーカーを含む同じ座位の血漿の他の部分と同じであると仮定する。ｆ_i（ｉ≠２１）は、予備増幅前の第１の方法を用いて染色体ｉに基づいて推定された胎児画分を示す。

数学的には、
ここで、
は、ｓ回のＰＣＲサイクルの後、胎児画分を測定するための血漿の部分中に遺伝子マーカーを含む座位の（胎児および母親の）分子数であり、
は、胎児画分を測定するための血漿の同じ部分に遺伝子マーカーを含む座位の（胎児および母親の）初期分子数である。式（５）の２つ目の等式は、胎児画分を測定するための血漿の部分中の胎児画分が、予備増幅に入力される血漿の他の部分中の胎児画分と同じであるという仮定から派生している。この仮定を満たすため、胎児画分の測定に予備増幅のための血漿と同じ量の血漿を用いる。

式（３）、（４）、および（５）は、すべてのｆ_iが同じであることを暗示している。すなわち、
である。したがって、

男児を妊娠した場合もまた、染色体Ｙの分子数を染色体ｉの総分子数（ここで、ｉ≠２１）で除した２倍まで予備増幅のための血漿から分離した血漿の部分
を用いて胎児の分子の画分を測定してもよい。数学的には、

女子の胎児の場合、全ての
は、∀ｉ，ｉ≠２１に等しい。
と表す。以下の考察では胎児ＤＮＡ画分について１つの表記を用いる。

３．予備増幅の効果
予備増幅サイクルの効率は、各染色体上の各座位によって異なっていてもよい。また、座位数は、検査対象の染色体および対照の染色体で異なっていてもよい。以下の考察では、異なる座位での異なる効率について記載する。それらの効率を平均してある染色体上の分子の実数を得る。胎児または母親の分子の開始数と胎児または母親の分子の終止数の関係を式（８）で表す。式（８）は、予備増幅手順の後に、所定の染色体の複数の座位に渡る効率を効果的に平均し、その平均値を上記染色体上の理想分子数で乗ずる。

ｃを対照の染色体の指標とする。以下の関係が得られる。

Ｌ₂₁は染色体２１上の座位数である。Ｌ_cは対照の染色体上の座位数である。参考文献［９］および［１０］に記載されたように各座位の効率を測定してもよい。

４．異数性の程度
異数性の程度ｈは、検査される異数性の種類に対応する。この異数性の程度は、三染色体性の場合は１より大きく、一染色体性の場合は１未満である。三染色体性より大きい異数性は、三染色体性よりも高い異数性の程度を有する。異数性の程度は、図１の予測値Δ１２５の位置に影響を及ぼす。というのは、異数性の程度が高い程、予測値Δ１２５が大きくなるからである。

一態様では、異数性の程度ｈは、ある座位の胎児の染色体２１分子の入力数の、胎児の対照の染色体の入力数に対する比として定義される。

換言すれば、三染色体性の場合、ｈ＝１．５であり、正常な場合、ｈ＝１であり、一染色体性の場合、ｈ＝０．５である。
５．母親の対照および胎児検査の関係

一旦、異数性の程度が定義されると、理想的な予備増幅の検査対象の染色体の分子数と対照の染色体の分子数の関係を定義することができる。以下の式が成り立つ。

第１の部分は、対照の染色体の胎児の終止分子数に対する染色体２１の胎児の終止数分子の関係を示している。ここで、各染色体の座位数は異なっていてもよい。第２の部分は、対照の染色体の母親の終止分子数と、胎児ＤＮＡ画分ｆに依存する対照の染色体上の胎児の終止分子数との関係を示している。この第２の部分は、関係Ｚ_pfc＝ｆ／（１−ｆ）Ｚ_pmcにより定義される。

非理想的な予備増幅の対照の染色体の母親の分子数と検査対象の染色体上の胎児の分子数の関係は、以下のようにして決定してもよい。式（８）から、
ここで、

６．ｄＰＣＲ実験への入力
態様によっては、例えば、入力されるＤＮＡ体積について装置特有の制約、および予備増幅手順の出力を希釈する必要があるため、予備増幅手順から得られた分子の画分のみをｄＰＣＲ実験に入力する。ｄＰＣＲ実験は、特定の数の分割を有し、それぞれが体積の最大量まで収容することができる。したがって、体積の制限があり、例えば、予備増幅手順からの試薬（例えば、プライマー）を希釈するなど、予備増幅の出力を希釈する必要がある場合はその制限はより強くなる。一例として、１０倍前後あるいは少なくとも１０倍の希釈を行ってもよい。

本明細書では、画分τは予備増幅手順から得られてｄＰＣＲ実験に入力される分子の画分に対応する。τの値は、本明細書に記載の算出の前に選択してもよい。例示としての値は、０．００５である。したがって、τは予備増幅手順から得られてｄＰＣＲ実験に入力されるＤＮＡ分子の部分を規定する部分制約である。

式（１１）の両辺にτを乗じて、両辺で予測を行うと、式（１３）から、ｄＰＣＲ実験に入力される胎児の染色体２１分子の予測数の式が得られる。

母親の場合、
であるので、式（８）はＸ_pmc＝ＲＸ_pm21であり、これはさらに以下の式を暗示する。

したがって、ｄＰＣＲ実験に入力される染色体２１分子の予測数は、式（１５）となる。

同様に、ｄＰＣＲ実験に入力される胎児の対照の染色体分子の予測数は以下の通りである。

式（１５）および（１６）から、それぞれ、ｄＰＣＲ実験に入力される染色体２１（μ_p21）および対照の染色体（μ_pc）の予測分子数が得られる。

７．予測分子数の相対差
ｄＰＣＲ実験に入力される染色体２１および対照の染色体の予測分子数の差Δμ_p＝μ_p21−μ_pcを定義する。したがって、予測分子数の相対差は以下の通りである。

男児を妊娠した場合、胎児のＤＮＡ画分ｆ^*をｆの代わりに測定してもよい。ｆ^*＝ｆであることを示すことができる。したがって、胎児が男児である場合は単にｆをｆ^*で置き換えてもよい。式（１９）は以下の式になる。

式（１９）および（２０）に基づいて、例示を簡便にするために因子Ｒを落として、染色体２１の三染色体性がある場合に胎児画分が６０％、５０％、４０％、および３０％に対して、それぞれ比率μ_p21/μ_pcが１．３、１．２５、１．２、および１．１５である。式（１９）の相対差は、以下に記載する検出可能な最少相対差を定義する補助となり得る。

Ｃ．ｄＰＣＲ実験に入力される対照の染色体分子の最小数
本項では、統計的仮説検定のフレームワークを用いて、偽陽性率および偽陰性率を特定の値に制御した場合のｄＰＣＲ実験に必要な対照の染色体分子の最小数、および予測分子数の検出可能な最少相対差を推定する。ｄＰＣＲ実験からのデータは、２つ以上の異なるチャネルの信号強度を含む（少なくとも１つはすべての分割から検査される染色体の強度を測定し、少なくとも１つは対照の染色体の強度を測定する）。ｄＰＣＲでは、ある分割の強度の大きさは、その分割の分子数を決定しない。信号のみが、ある分割が任意の分子種を含む（すなわち、特定の座位である可能性がある特定のチャネルに対応する）か否かを伝える。したがって、検証分析に利用できるデータは二値、すなわち、各分子の種類が正または負の分割である。

本明細書では、Ｗ_p21およびＷ_pcは、正分割の観察された割合から算出した染色体２１および対照の染色体分子の推定数を指す。これらの数は、上述のように算出してもよい。例えば、単一体積実験では、それぞれ手段μ_p21/Ｎおよびμ_pc/Ｎ（ここでＮは分割数）を有するポアソン分布を用いて分子数を決定してもよい。他の態様では、分子数として正分割数を用いてもよい。

ｄＰＣＲ実験に入力される染色体２１および対照の染色体の予測分子数（μ_p21およびμ_pc）を比較して、試料の分類、例えば、正常な染色体または異数性を決定してもよい。例として、差、２つの値の比率、そのような関数の組み合わせ、または入力としてこれらの予測値を有する関数の差または比率を取ることで２つの予測数を互いに比較してもよい。Ｈ₀：ｈ＝１（正常）およびＨ_l：ｈ＞１（例えば、三染色体性、四染色体性、または五染色体性）に相当する帰無仮説および対立仮説は以下の通りである。

以下の考察では、検査対象の染色体の余剰コピーの異数性に注目する。同様の議論は、Ｈ_l：ｈ＝０．５で置き換えた対立仮説を有する一染色体性にも当てはまる。ｆ、
の値を固定したとして、関数ｇ（ｈ）はμ_p21＝ｇ（ｈ）μ_pcであるようなｈの単調増加関数であり、式（１９）により以下のように定義される。

各染色体由来の分子数の比率または差（例えば、Ｗ_p21／Ｗ_pc、Ｗ_p21−Ｗ_pc、およびＷ_p21／（Ｗ_pc＋Ｗ_p21））を検定統計量として用いてもよいが、他の検定統計量を用いてもよい。例えば、参考文献［６］の検定統計量Ｗ１−Ｗ４を用いてもよい。２つのポアソン率を比較するために、簡便で、保存的、および高能力の分散安定化変換による検定統計量を用いる。非侵襲性出生前検査では偽陰性率の制御は、偽陽性率の制御よりも重要である場合があるため、他の検定統計量よりも高い能力（より低い偽陰性率）を得るために以下の検定統計量を用いる。この検定統計量は以下の通りである。
ここで、ρ＝ｇ（ｌ）＝１／Ｒである。［５］および［６］により、Ｊ（Ｗ_p21，Ｗ_pc）は標準正規分布に従う。

この記述の残りでは、Ｊ（Ｗ_p21，Ｗ_pc）は単にＪと示す。偽陽性率をα以下に制御するために、以下の関係が成り立つ必要がある。

βでの偽陰性率を制御するために、以下の関係が成り立つ必要がある。

参考文献［６］に示すように、式（２５）および（２６）が成り立つためには、関数ｖ（ｈ，μ_pc）が０以上でなければならない。ここで、
ここで、ｚ_1-αおよびｚ_1-βは、それぞれ、標準正規分布の１００（１−α）％番目および１００（１−β）％番目の分位数である。一染色体性の場合では、関数ｖ（ｈ，μ_pc）は０以下でなければならない。なお、分子が多い程、対立仮説を支持する予測値は、帰無仮説を支持する予測値から離れてゆき、これによって偽陰性率が低くなる。式（２７）が≧０となるためには、誤差率がより厳密であり、ｚ_1-αおよびｚ_1-βがより大きく、μ_pcがより大きくならなければならない。換言すれば、所望の誤差率を得るためにはより多くの分子を入力しなければならない。異なる検査基準値を用いる場合は他の式となる。

この関係は、実験の設計目的には有用である。μ_pcと仮定すると、ｖ（ｈ，μ_pc）を用いて、偽陽性率および偽陰性率を特定の率に制御する予測分子数の検出可能な最少相対差を決定してもよい。予測分子数の検出可能な最少相対差は、μ_pcを特定の値に固定して、ｈ＞１かつｖ（ｈ，μ_pc）≧０であるように最少のｈを見つけて式（２７）から算出してもよい。

第二に、ｈ，ｈ＞１（例えば、Ｔ₂₁の場合はｈ＝１．５）と仮定すると、特定の偽陽性率および偽陰性率で異数性を検出するために、
と仮定して以下の不等式を用いてｄＰＣＲ実験に入力される対照の染色体分子の必要数を決定してもよい。
ここで、

一染色体性の場合では、式（２９）はｈを０．５で置き換えても成り立つ。

式（２９）から、ｄＰＣＲ実験に入力される対照の染色体（対照分子とも言う）に由来するＤＮＡ分子の最小数が得られ、所望の誤差基準が得られる。対照分子の最小数は、様々な方法、例えば、予備増幅手順に入力される対照分子数を多くする、用いる染色体上の座位を多くする、および予備増幅手順でのサイクルを多くして予備増幅を行うなどで得てもよい。一実施では、μ_pcを特定の値に固定して、ｈ＞１かつｖ（ｈ，μ_pc）≧０であるように最も小さいｈを見つけることで分子数の検出可能な最少相対差を式（２７）から算出してもよい。

したがって、一態様では、誤差基準αおよびβ、異数性の程度ｈ、予備増幅効率に関するデータ（例えば、Ｒまたは前記効率の下限で表すようなデータ、あるいは単に平均効率が等しいという仮定により
）、および胎児ＤＮＡ画分ｆを用いて対照の染色体に由来するＤＮＡ分子の最小数を決定してもよい。

誤差率が小さいほど、ｚ_1-αおよびｚ_1-βの値は大きくなり、したがって、より多くの分子を入力することが必要になる。というのは誤差率が低い程、分布を分離させるのにより多くの分子が必要になるためである。ｇ（ｈ）（ｈ＞１）の値が大きい程、必要な分子数は少なくなる。胎児ＤＮＡ画分が多い程、この２つの分布の分離は大きくなる。また、異数性が高い程、この２つの分布の分離は大きくなる。

ＩＶ．予備増幅に入力される対照の染色体分子の最小数
採取した血漿中の予備増幅に入力される胎児画分の標準誤差を制御するために、これらの態様では、全血漿中の未知の予測胎児画分（ｆ₀）と採取した血漿に由来する胎児画分（ｆ）との間の式（３０）で定義される相対誤差をψ以下になるように制御することができる。

式（３０）は以下の等式に相当する。
ψは胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲である。したがって、ψは、採取した血漿中の胎児ＤＮＡ画分が実際の胎児画分にどの程度近いかを規定する。ψの一例としての値は１％（すなわち、０．０１）である。これは、実際の胎児ＤＮＡ画分に対する試料血漿中の胎児ＤＮＡ画分の相対誤差の１％以下に対応する。ψが小さい程、採取した血漿中の胎児画分はより正確である。

相対誤差がψ以下である確率が少なくとも１００（１−η）％であるように制御するために、本態様では、予測胎児画分の１００（１−η）％の信頼区間（ＣＩ）の幅がｆから２ψ短いことが要求される。
ここで、
は、標準正規分布の
番目の分位数である。ηの一例としての値は５％である。これにより、採取した血漿中の胎児画分が許容誤差内にある確率が９５％となる。したがって、ηは、未知の予測胎児ＤＮＡ画分と血漿に由来する胎児ＤＮＡ画分との相対誤差が胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲ψ内にある確率を制御する誤差制御数である。

したがって、予備増幅に入力される対照の染色体分子の総数は以下の不等式を満たさなければならない。
ここで、

式（３４）から、予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数が得られる。したがって、一態様では、予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数は、胎児ＤＮＡ画分ｆ、胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲ψ、および誤差制御数ηに基づいて決定してもよい。ここで、胎児画分ｆは、全血漿に由来する血漿の個別の部分を用いて測定する。予備増幅のための血漿量と同じ血漿量を胎児画分の測定に用いて、測定した胎児画分の確度が確実に妥当な範囲内にあるようにする。

確率１００（１−η）％が高い程、最小数は小さくなる。というのは、誤差許容範囲内にある確率をより高くするためにはより多くの分子が必要であるためである。また、誤差許容範囲が小さい程、最小数は大きくなる。これは、分子数が小さい程、変動が大きくなるためである。また、胎児ＤＮＡ画分が少ない程、より多くの分子が必要になる。というのは、より正確な胎児ＤＮＡ画分を得るには、十分な胎児のＤＮＡ分子を得るためにより多くの分子が必要であるためである。

図４は、本発明の態様による予備増幅への入力分子数の派生を示す。これにより、全血漿中の未知の予測胎児画分について（１００−η）％の信頼区間（ＣＩ）をカバーするように式（３１）の区間を選択すると、この区間が全血漿中の未知の予測胎児画分を含む確率は少なくとも（１００−η）％であることが示される。このことを理解するため、予備増幅のために採取した血漿中の胎児画分が５．０１％であると仮定する。式（３１）でψを１％に設定して、対応する区間は［４．９６，５．０６］（赤色の縦の破線４１０および４２０）である。

図４で２本の黒色の縦の直線４３０および４４０は９５％ＣＩの上限および下限であると仮定する。赤色の縦の破線４１０および４２０によって形成される区間が黒色の縦の直線４３０および４４０によって形成される区間をカバーするように破線４１０および４２０を置くことで、予測胎児画分が位置（１）、（２）、および（３）にあるという３つの可能性がある。予測胎児画分が（１）にある場合、９５％のＣＩおよび式（３１）からの区間の両方がこの予測胎児画をカバーする。予測胎児画分が（２）にある場合、式（３１）からの区間のみがこの予測胎児画をカバーする。予測胎児画分が（３）にある場合、いずれの区間もこの予測胎児画をカバーしない。したがって、式（３１）からの区間が予測胎児画分をカバーする確率は少なくとも９５％である。最後に、式（３１）からの区間がＣＩをカバーするという要件から、式（３２）が導かれる。

他の態様では、座位数が多く、ｄＰＣＲ装置の体積が十分に大きい場合、予備増幅工程を省略することも可能である。

Ｖ．ＰＣＲサイクルの算出
したがって、これらの態様では、式（２９）および（３４）に基づいて、以下の不等式を用いて予備増幅に必要なＰＣＲサイクル数を算出してもよい。

実際には、式（３５）は、ＰＣＲ効率に下限ｙ₀を付与することで以下の閉形式の式を用いて解くことができ、したがって
である。
ここで、

式（３５）は、（合計を座位数で除した）対照の染色体の効率の平均率で乗じた予備増幅に入力される分子数から、対照分子の出力数が得られ、対照分子の出力数は、部分制約τによって低減されるが、ｄＰＣＲ実験に必要な最少入力数よりも大きくなければならないという要件から派生させることができる。

したがって、予備増幅手順のＰＣＲサイクル数は、ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数、予備増幅手順に対する対照の染色体分子の最少入力数、予備増幅手順のＰＣＲ効率の下限、予備増幅の座位数、および部分制約に基づいて決定してもよい。

ＶＩ．結果
本項で記載するすべての結果は、すべてのＰＣＲ効率が０．９５に等しく、誤差許容範囲に対する胎児画分がψ＝０．０５、胎児画分の誤差制御数がη＝０．０５、ｄＰＣＲ実験に入力される予備増幅の体積の部分がτ＝０．００５であることを前提としている。検査対象の染色体および対照の染色体の座位数が等しいことを前提とし、座位数が必要なＰＣＲサイクル数にどのように影響を及ぼすかを調べるために３つの異なる座位数（１個、１２個および９６個の座位）を試した。特定の偽陽性率および偽陰性率を仮定して、まず、式（２９）を用いてｄＰＣＲ実験に入力される対照の染色体分子の必要数を推定した。胎児画分を仮定して、式（３４）を用いて予備増幅に入力される対照の染色体分子の必要数を推定した。次いで、これら２つの数に基づいて予備増幅に必要なＰＣＲサイクル数を推定した。このＰＣＲサイクルの最少必要数を用いて、予測分子数の検出可能な最少相対差を算出してプロットした。検出可能な最少相対差は有用である。なぜなら、臨床試料中のＤＮＡ濃度範囲が分かっており、（予備増幅せずに）ｄＰＣＲに入力される分子を定義するからである。あるいは、予備増幅を行う場合は、予備増幅のサイクル数および初期入力数に基づいてどの程度の数をｄＰＣＲに入力するかを制御することができるからである。

図５は、本発明の態様による異なる胎児画分５２０で予備増幅手順に対する対照の染色体分子の最少入力数４１０を示す表５００である。表５００から、対照の染色体分子の最少入力数５１０が得られる。この最少入力数は、本発明の態様により、全血漿中の未知の予測胎児画分と採取した血漿に由来する推定胎児画分の相対誤差（胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲）が５％以下である確率が、少なくとも９５％（誤差制御数により規定）であることを制御することと一貫している。表５００の最小数は式（３４）を用いて決定する。

図６は、ＦＰ率（６５０）、ＦＮ率（６６０）本発明の態様による胎児画分の異なる状況でＴ₂₁を検出するために、ｄＰＣＲ実験に入力するのに必要な対照の染色体分子の最少総数６１０〜６４０を示す表６００である。染色体分子の最少総数６１０〜６４０は、ｈ＝１．５の時、式（２９）に基づいて算出する。示すように、胎児画分が３％と低い場合に、少なくとも４９，６８３個の対照の染色体分子を予備増幅に入力し、少なくとも１９４，５９０個の対照の染色体分子をｄＰＣＲ実験に入力すれば、１％のＦＰ率および１％のＦＮ率で三染色体性を検出することが可能である。

予測されるように、ＦＰ率およびＦＮ率の値を固定すると、胎児画分が多い程、ｄＰＣＲ実験に必要な分子の総数は少なくなる。胎児画分の値を固定すると、ＦＰ率およびＦＮ率が厳密になる程、ｄＰＣＲ実験に必要な分子の総数は多くなる。

図７は、本発明の態様による異なる状況で予備増幅に必要なＰＣＲサイクルの最小数７１０〜７４０を示す表７００である。これら異なる状況としては、予備増幅に必要な対照の染色体分子の総入力数（表５００）からｄＰＣＲ実験に入力される対照の染色体分子の必要数（表６００）を得るための座位数、ＦＰ率７５０、ＦＮ率７６０、および胎児画分が挙げられる。表７００のサイクル数は式（３７）を用いて決定する。

ＦＰ率およびＦＮ率が１％であり、胎児画分が３％と低く、座位が１個のみの例では、（すなわち、ｄＰＣＲ実験に入力される予備増幅の出力分子の画分の部分制約が０．００５であると仮定すると）ｄＰＣＲ実験に入力する１９４，５９０個の対照の染色体分子を得るための４９，６８３個の対照の染色体分子の予備増幅では、少なくとも１０回のＰＣＲサイクルが必要である。この場合、座位数が１２に増えると、必要なＰＣＲサイクル数は減って７になる。同じ場合に、座位数がさらに増えて９６になると、必要なＰＣＲサイクル数はさらに減って４になる。

ｄＰＣＲ装置が異なれば体積も変化するので、体積に関する制約はプラットフォームに渡って変化する。本明細書では、体積に関する制約は０．００５であると仮定して算出を行った。プラットフォームの体積に関する制約が大きい程、ＰＣＲサイクル数はさらに少なくなる。したがって、座位数（例えば９６個）が大きく、ｄＰＣＲプラットフォームの体積が大きい場合、予備増幅工程を省略することが可能である。これは実験ノイズを低減する補助となる。しかしながら、プライマー−２量体問題のために多数のアッセイを設計することが非常に困難な場合がある。所望の座位数を達成することができない場合は、予備増幅工程が必要である。

図８Ａ〜８Ｃは、本発明の態様による様々なＦＰ率およびＦＮ率での予測分子数の検出可能な最少相対差（黒色実線）と対照の染色体分子μ_pcの予測総数の関係を示すプロットを示す。図８Ａでは、μ_pcが増加すると、検出可能な最少相対差８１０（例えば、式（２７）により決定）は小さくなる。というのは、分子が多い程、（例えば、胎児ＤＮＡ画分が少なくなるため）検出される差が小さくなるためである。線８１１〜８１４（式（１９）により決定）は、それぞれ、３％、５％、１０％、および１５％の異なる胎児ＤＮＡ画分を示す。検出可能な最少相対差８１０と青色の実線８１３が交わったμ_pcは、胎児画分が１０％である場合にＴ₂₁を検出するのに必要な最小μ_pcである。

したがって、（すなわち、式（２７）〜（２９）の代わりに）図８Ａのような分析を用いても分子の最少必要数を決定することができる。図８Ａ〜８Ｃは、μ_pcおよび誤差率が検出可能な最少相対差にどの程度影響を及ぼすかを示している。図６もまた、誤差率を上げることで分子の最少必要数を減らすことができることを示している。予備増幅が必要か否かを決定するために図６を用いてもよい。臨床試料の入力ＤＮＡの範囲が分子の最少必要数より下にある（すなわち前記範囲が黒色の線および色付きの線が交わるμ_pcより下にある）と仮定すると、特定の誤差率で異数性を検出するためには予備増幅を必要とする。これに対して、上記範囲が分子の最少必要数より上にある場合は、予備増幅を省略してもよい。

図８Ａは、１％の偽陽性率および偽陰性率に対応する。図８Ｂは、２．５％の偽陽性率および偽陰性率に対応する。図８Ｃは、５％の偽陽性率および１％の偽陰性率に対応する。これは、偽陽性率および偽陰性率が異なる例である。自明であるが、図８Ｂの検出可能な最少相対差８２０は、図８Ａの検出可能な最少相対差８１０よりも前に５％の胎児ＤＮＡ画分と交わっている。このことは、図８Ａがより厳密な誤差率を有することから予測される。図８Ｃの検出可能な最少相対差８３０は、図８Ｂとほぼ同じ対照分子数で５％の胎児ＤＮＡ画分と交わっている。これは、偽陽性率が高く、偽陰性率が低いことの結果である。

要約すれば、本態様は、非侵襲性出生前検査のためのｄＰＣＲ実験を設計する統計フレームワークを提供する。具体的には、これらの態様は、特定の偽陽性率および偽陰性率での異数性を検出するための検査対象の染色体と対照の染色体の予測分子数の検出可能な最少相対差およびｄＰＣＲ実験に入力するのに必要な対照の染色体分子の最少総数、採取した血漿中の胎児画分の相対誤差を特定の値に制御するために予備増幅に入力するのに必要な対照の染色体分子の最少総数、および予備増幅に必要なＰＣＲサイクルの最小数を決定するツールを提供することができる。本発明者らは、胎児画分が３％と低い場合に、１％のＦＰ率および１％のＦＮ率で三染色体性を検出することが可能であることを示した。

態様によっては、ＰＣＲ効率、ＰＣＲサイクル数、および胎児画分を統合するコンピューターシステムにより、予測分子数の相対差を算出して、この相対差を用いて、検査される患者が異数体の胎児を宿しているか否かについて統計的仮説検定を行ってもよい。また、この相対差から、検出可能な最少相対差およびｄＰＣＲ実験に必要な対照の染色体分子の最少総数が得られる。また、予備増幅の前に胎児画分を測定する様々な方法を考察した。

本発明の様々な態様の利点としては、例えば、以下のものが挙げられる。一つ目は、予備増幅工程を含む実験の作業流れでの予測分子数の相対差の算出である（例えば、相対差はＰＣＲ効率、ＰＣＲサイクル数、異数性の程度、および胎児画分を統合する）。胎児の無細胞ＤＮＡの量が限定されているため、この用途では予備増幅工程が必要であることを示した。二つ目は、異数性の検出は、分割数に依存するのではなく、入力分子の総数に依存することである。したがって、ＤＮＡ分子を十分な精度で計測できる限り、これらの態様をｄＰＣＲ装置以外の技術（例えばＮＧＳ技術）にも用いてもよい。三つ目は、参考文献［５］、［８］、および［６］に示唆されているように、２つのポアソン率（μ_pcおよびμ_p21）を比較する検定統計量は、他の既存の方法よりも強力であることである。四つ目は、実験の作業流れに特定の対象の量、すなわち、予測分子数の検出可能な最少相対差、予備増幅およびｄＰＣＲ実験に必要な対照の染色体分子の最少総数、および予備増幅に必要なＰＣＲサイクルの最小数を追加して用いることである。つまり、これらの態様は、非侵襲性出生前検査のためのｄＰＣＲ実験を計画するのに用いる重要な量を提供する。

ＶＩＩ．コンピューターシステム
本明細書で記載のコンピューターシステムのいずれも、任意の好適な数の下位システムを利用してもよい。そのような下位システムの例を図９にコンピューター装置１０として示す。態様によっては、コンピューターシステムは、単一のコンピューター装置を備え、上記下位システムは、上記コンピューター装置の構成要素であってもよい。他の態様では、コンピューターシステムは、複数のコンピューター装置を備えていてもよく、各コンピューター装置は内部構成要素を有する下位システムである。

図９に示す下位システムは、システムバス７５により相互に接続されている。プリンター７４、キーボード７８、記憶装置７９、モニター７６（ディスプレイアダプター８２に接続されている）など、追加の下位システムが示されている。周辺装置および入出力（Ｉ／Ｏ）装置は、Ｉ／Ｏ制御部７１に接続されており、入出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））など、当該分野で周知の任意の数の手段によりコンピューターシステムに接続することができる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インタフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、Ｗｉ−Ｆｉなど）を用いて、コンピューターシステム１０を広域ネットワーク（例えば、インターネットなど）、マウス入力装置、またはスキャナに接続してもよい。システムバス７５による相互接続により、中央制御装置７３は各下位システムと通信して、システムメモリ７２または記憶装置７９（例えば、ハードディスクまたは光学ディスクなどの固定ディスク）からの指示の実行を制御することができる。また、下位システム間で情報を交換することができる。システムメモリ７２および／または記憶装置７９はコンピューター可読媒体として体現されてもよい。本明細書で記載のデータのいずれも、ある構成要素から他の構成要素に出力されて、ユーザに出力されてもよい。

上記コンピューターシステムは、例えば、外部インタフェース８１または内部インタフェースによって接続された複数の同じ構成要素または下位システムを備えていてもよい。態様によっては、コンピューターシステム、下位システム、または装置はネットワークを介して通信してもよい。このような例では、あるコンピューターをクライアント、他のコンピューターをサーバーと見なしてもよく、それぞれが、同じコンピューターシステムの一部であってもよい。クライアントおよびサーバーは、それぞれ、複数のシステム、下位システム、または構成要素を備えていてもよい。

自明であるが、本発明の態様のいずれかをハードウェア（例えば特殊目的半導体またはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）を用いた制御論理の形態および／または一般にプログラム可能な中央演算処理装置でコンピューターソフトウェアを用いてモジュールあるいは集積した形で実施してもよい。本明細書で用いられる中央演算処理装置は、単一コア中央演算処理装置、同一の集積チップ上のマルチコア中央演算処理装置、または単一の回路基板またはネットワーク化された回路基板上の複数の処理単位を含む。当業者には自明であるが、本明細書で提供される開示および教示に基づいてハードウェアおよびハードウェアとソフトウェアの組み合わせを用いて本発明の態様を実施する他のやり方および／または方法がある。

本願に記載されるソフトウェアの構成要素または機能の何れかは、例えば、従来の技術またはオブジェクト指向技術を用いた任意の好適なコンピューター言語（例えば、Ｒ、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔ）またはスクリプト言語（例えば、ＰｅｒｌまたはＰｙｔｈｏｎ）を用いる中央演算処理装置によって実行されるソフトウェアのコードとして実施してもよい。ソフトウェアのコードは、記憶および／または送信のためのコンピューター可読媒体上に一連の指示またはコマンドとして記憶されていてもよい。好適な媒体としては、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取りメモリ（ＲＯＭ）、磁性媒体（例えば、ハードディスクドライブまたはフロッピーディスク）、または光学媒体（例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）またはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク））、フラッシュメモリなどが挙げられる。コンピューター可読媒体は、このような記憶装置または送信装置の任意の組み合わせであってもよい。

また、このようなプログラムは、各種試験規約（インターネットを含む）に従う有線、光学、および／または無線ネットワークを介する送信に適合したキャリア信号を用いて符号化または送信されてもよい。したがって、本発明の態様によるコンピューター可読媒体は、このようなプログラムで符号化されたデータ信号を用いて作製してもよい。プログラムコードで符号化されたコンピューター可読媒体は、互換性のある装置と共に梱包されていてもよく、あるいは（例えば、インターネットからのダウンロードにより）他の装置から個別に提供されてもよい。そのようなコンピューター可読媒体はいずれも、単一のコンピューター製品（例えば、ハードディスクドライブ、ＣＤ、またはコンピューターシステム全体）上または内にあり、かつシステムまたはネットワーク内の異なるコンピューター製品上または内に存在してもよい。コンピューターシステムは、モニター、プリンター、または本明細書で記載の結果の何れかをユーザに提供するためのその他の好適なディスプレイを含む。

本明細書に記載の方法の何れかは、その全体または部分を１つ以上の中央演算処理装置を含むコンピューターシステムにより実行してもよい。前記１つ以上の中央演算処理装置は、複数の工程を実行するように構成されていてもよい。したがって、これらの態様は、異なる構成要素が各工程または各工程群を実行することが可能な、本明細書に記載の方法の何れかの工程を実行するように構成されたコンピューターシステムに関していてもよい。工程に番号を付けて示したが、本明細書の方法の工程は、同時または異なる順序で実行してもよい。また、これらの工程の一部を他の方法の他の工程の一部と共に用いてもよい。また、工程の全てあるいは一部は任意であってもよい。また、前記方法の何れかの工程の何れかをモジュール、回路、またはこれらの工程を実行するための他の手段により実行してもよい。

特定の側面では、本発明はまた、デジタルＰＣＲシステムを提供する。例示的なデジタルＰＣＲシステムが、図１０および図１１に示されている。図１０は、本明細書で開示する方法を実施するために用いてもよいソフトウェア資源およびハードウェア資源の関係を説明する概略ブロック図を示す。図１１に示すデジタルＰＣＲシステムは、ｄＰＣＲ装置内に配置されてもよいｄＰＣＲ分析モジュール、およびコンピューターシステムの一部であるインテリジェンスモジュールを含む。ネットワーク接続または非接続により、データ集合を分析モジュールからインテリジェンスモジュール、あるいはその逆に転送する。例えば、図３に示したフローチャートに従ってデータ集合を処理してもよい。このフローチャートは、例えば、図１０に示すこのフローチャートによるコンピューターシステムのハードウェアに記憶されたソフトウェアにより便利な方法で実施されてもよい。図１０を参照して、コンピューターシステム（１００）は、例えば、ｄＰＣＲ過程データおよび確度データなどの任意の試料データを受信するための受信手段（１１０）、ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出するための第１の算出手段（１２０）、予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数を算出する第２の算出手段（１３０）、および予備増幅手順のＰＣＲサイクル数を推定するための推定手段（１４０）を含んでいてもよい。特定の態様では、前記システムはまた、結果をコンピューターの画面上に表示するための表示手段を含んでいてもよい。図１１は、ｄＰＣＲ装置とコンピューターシステムの相互作用を示している。前記システムは、ｄＰＣＲ装置内に配置されてもよいｄＰＣＲ分析モジュール、およびコンピューターシステムの一部であるインテリジェンスモジュールを含む。ネットワーク接続または非接続により、データ集合を分析モジュールからインテリジェンスモジュール、あるいはその逆に転送する。データ集合は、図１０に従って中央演算処理装置上で実行され、インテリジェンスモジュールの記憶装置に記憶されるコンピューターコードにより処理してもよい。上記データ集合は、処理後に次の何れかの処理が行われる。すなわち、（１）上記データ集合は、ｄＰＣＲ分析モジュールの記憶装置に転送されて、そこから表示装置に表示されてもよく、あるいは上記データ集合を用いてｄＰＣＲ装置でｄＰＣＲ実験を実施してもよい。あるいは、（２）上記データ集合をコンピューターシステムの記憶媒体に記憶させて、そこからデータを表示装置に表示させてｄＰＣＲ実験を行うための基礎を形成してもよい。態様によっては、インテリジェンスモジュールはまた、ｄＰＣＲ装置上で実施されてもよい。

特定の態様の具体的な詳細を任意の好適な方法で組み合わせてもよい。しかしながら、本発明の他の態様は、個々の側面のそれぞれ、またはこれら個々の側面の特定の組み合わせに関する特定の態様に向けられてもよい。

上記の本発明の例示的な態様の説明は、例示および記載の目的で示されたものである。これらの態様は、本発明の原理およびその実際の用途を最もよく説明するために選択され、記載された。これにより、他の当業者は本発明を様々な態様で、また想起される特定の用途に適した様々な修正により最もよく利用することができる。

「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、特に断りがなければ「１つ以上」を意味することを意図する。「ｏｒ」の使用は、特に断りがなければ「包含的なｏｒ」であって「排他的なｏｒ」を意味するものではない。

Claims (20)

1. 胎児を宿している女性に由来する血漿試料中のＤＮＡ分子の予備増幅を含む、染色体異数性の検出のためのデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）実験の設定を決定する方法であり、前記方法は、
   検査対象の染色体および対照の染色体のそれぞれの座位数、
   前記血漿試料中で測定された胎児ＤＮＡ画分、
   前記胎児ＤＮＡ画分の測定における胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、
   未知の予測胎児ＤＮＡ画分と前記血漿に由来する推定胎児ＤＮＡ画分の相対誤差が前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲内にある確率を制御する誤差制御数、
   検査される異数性の程度、
   前記血漿試料に由来するＤＮＡを増幅する予備増幅手順から得られたＤＮＡ分子のうち、前記ｄＰＣＲ実験に入力される部分を規定する部分制約、
   予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、および
   偽陽性率および偽陰性率を含む誤差率基準を含むデータ
   をコンピューターシステムで受信すること、
   前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、前記ＰＣＲ効率に関するデータ、および前記異数性の程度に基づいて、ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を前記コンピューターシステムで算出すること、
   前記胎児ＤＮＡ画分、前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、および前記誤差制御数に基づいて、前記コンピューターシステムで予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数を算出すること、および
   前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数、前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数、前記予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、前記予備増幅の座位数、および前記部分制約に基づいて、前記前記コンピューターシステムで前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数を推定することを含む、方法。
2. 前記予備増幅手順に入力されるＤＮＡ分子の最小数に基づいて前記試料のサイズを決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数、前記予備増幅手順の推定ＰＣＲサイクル数、および前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を用いて前記予備増幅手順および前記ｄＰＣＲ実験を行うこと、
   前記検査対象の染色体および１本以上の対照の染色体に由来するＤＮＡ断片の正分割に基づいて検査基準値を得ること、および
   前記検査基準値をカットオフ値と比較して前記胎児が染色体異数性を有するか否かを決定することを更に含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記予備増幅手順に入力される試料サイズは、少なくとも前記予備増幅手順に入力されるＤＮＡ分子の最小数を提供し、前記予備増幅手順は少なくとも前記ＰＣＲサイクルの推定数を行い、少なくとも前記対照の染色体分子の最少入力数が前記ｄＰＣＲ実験に入力される、請求項２または３の方法。
5. 前記ＰＣＲ効率に関するデータは、
   予め規定されたＰＣＲ効率の下限、
   前記検査対象の染色体および前記対照の染色体の平均ＰＣＲ効率が等しいという仮定、および
   前記検査対象の染色体および対照の染色体の予備増幅手順のためのＰＣＲ効率の比率の少なくとも１つを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
6. 前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、および対照の染色体分子のデジタルＰＣＲ実験への入力数を用いて、前記デジタルＰＣＲ実験の検出可能な最少相対差を算出すること、および
   前記検出可能な最少相対差を用いて、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出することを更に含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
7. 前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数の算出は、以下の式によって決定され、
   ここで、
   ここで、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ｈは前記異数性の程度であり、Ｒは前記ＰＣＲ効率に関するデータであって前記対照の染色体および前記検査対象の染色体の座位での効率の比率に対応し、ｇ（１）はｈ＝１である場合のｇ（ｈ）の値であり、αは前記偽陽性率であり、βは前記偽陰性率であり、z_1-αは標準正規分布の１００（１−α）％番目の分位数であり、ｚ_1-βは前記標準正規分布の１００（１−β）％番目の分位数である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
8. であり、ここで、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であり、Ｌｔは前記検査対象の染色体上の座位数であり、ｐは予備増幅サイクル数であり、ｙは特定の座位での効率である、請求項７に記載の方法。
9. Ｒは、
   である、請求項７に記載の方法。
10. 前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数の算出は、以下の式によって決定され、
    ここで、ψは前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲であり、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ηは前記誤差制御数であり、
    は前記標準正規分布の
    番目の分位数である、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
11. 前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数の推定は、以下の式によって決定され、
    ここで、
    は前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数であり、τは前記部分制約であり、ｙ₀は前記予備増幅手順のＰＣＲ効率の下限であり、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であって、前記検査対象の染色体上の座位数に等しく、
    は前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
12. 前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲は０．０５であり、前記誤差制御数は０．０５であり、前記部分制約は０．００５である、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
13. １本の対照の染色体のみが用いられ、前記検査対象の染色体および前記対照の染色体上で複数の座位が用いられ、前記検査対象の染色体および前記対照の染色体上で同じ座位数が用いられる、請求項３〜１２の何れか一項に記載の方法。
14. 実行されるとコンピューターシステムを制御して、胎児を宿している女性に由来する血漿試料中のＤＮＡ分子の予備増幅を含む染色体異数性の検出のためのデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）実験の設定を決定する複数の指示を記憶する非一時的コンピューター可読媒体を含むコンピューター製品であって、前記指示は、
    検査対象の染色体および対照の染色体のそれぞれの座位数、
    前記血漿試料中で測定された胎児ＤＮＡ画分、
    前記胎児ＤＮＡ画分の測定における胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、
    未知の予測胎児ＤＮＡ画分と前記血漿に由来する推定胎児ＤＮＡ画分の相対誤差が前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲内にある確率を制御する誤差制御数、
    検査される異数性の程度、
    前記血漿試料に由来するＤＮＡを増幅する予備増幅手順から得られたＤＮＡ分子のうち、前記ｄＰＣＲ実験に入力される部分を規定する部分制約、
    予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、および
    偽陽性率および偽陰性率を含む誤差率基準を含むデータ
    を受信すること、
    前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、前記ＰＣＲ効率に関するデータ、および前記異数性の程度に基づいて、ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出すること、
    前記胎児ＤＮＡ画分、前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲、および前記誤差制御数に基づいて予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数を算出すること、
    前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数、前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数、前記予備増幅手順のＰＣＲ効率に関するデータ、前記予備増幅の座位数、および前記部分制約に基づいて、前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数を推定することを含む、コンピューター製品。
15. 前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数の算出は、以下の式で決定され、
    ここで、
    ここで、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ｈは前記異数性の程度であり、Ｒは前記ＰＣＲ効率に関するデータであって前記対照の染色体および前記検査対象の染色体の座位での効率の比率に対応し、ｇ（１）はｈ＝１である場合のｇ（ｈ）の値であり、αは前記偽陽性率であり、βは前記偽陰性率であり、z_1-αは標準正規分布の１００（１−α）％番目の分位数であり、ｚ_1-βは前記標準正規分布の１００（１−β）％番目の分位数である、請求項１４に記載のコンピューター製品。
16. であって、
    ここで、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であり、Ｌｔは前記検査対象の染色体上の座位数であり、ｐは予備増幅サイクル数であり、ｙは特定の座位での効率である、請求項１５に記載のコンピューター製品。
17. 前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数の算出は、以下の式によって決定され、
    ここで、ψは前記胎児ＤＮＡ画分の誤差許容範囲であり、ｆは前記胎児ＤＮＡ画分であり、ηは前記誤差制御数であり、
    は前記標準正規分布の
    番目の分位数である、請求項１４〜１６の何れか一項に記載のコンピューター製品。
18. 前記予備増幅手順のＰＣＲサイクル数の推定は、以下の式によって決定され、
    ここで、
    は前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数であり、τは前記部分制約であり、ｙ₀は前記予備増幅手順のＰＣＲ効率の下限であり、Ｌ_cは１本以上の対照の染色体上の座位数であって、前記検査対象の染色体上の座位数に等しく、
    は前記予備増幅手順の対照の染色体分子の最小数である、請求項１４〜１７の何れか一項に記載のコンピューター製品。
19. 前記ＰＣＲ効率に関するデータは、
    予め規定されたＰＣＲ効率の下限、
    前記検査対象の染色体および前記対照の染色体の平均ＰＣＲ効率が等しいという仮定、および
    前記検査対象の染色体および対照の染色体の予備増幅手順のためのＰＣＲ効率の比率の少なくとも１つを含む、請求項１４〜１８の何れか一項に記載のコンピューター製品。
20. 前記指示は、前記誤差率基準、前記胎児ＤＮＡ画分、および対照の染色体分子のデジタルＰＣＲ実験への入力数を用いて、前記デジタルＰＣＲ実験の検出可能な最少相対差を算出すること、および
    前記検出可能な最少相対差を用いて、前記ｄＰＣＲ実験に対する対照の染色体分子の最少入力数を算出することを更に含む、請求項１４〜１９の何れか一項に記載のコンピューター製品。