JP2014507134A - 胎児の性染色体遺伝子型の非侵襲的出生前同定 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、2011年1月5日出願のLo et al.(008300US)による「胎児の性染色体遺伝子型の非侵襲的出生前同定(Noninvasive Pren at al Genotyping Of Fetal Sex Chromosomes)」の名称の米国特許仮出願第61/430,032号;および、2011年4月14日出願のLo et al.(008301US)による「胎児の性染色体遺伝子型の非侵襲的出生前同定(Noninvasive Prenatal Genotyping Of Fetal Sex Chromosomes)」の名称の米国特許仮出願第61/475,632号の非仮出願であり、これら仮出願特許の優先権を主張する。これらの特許の全内容は、あらゆる目的において、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で使われる用語の「生物学的試料」は、対象(例えば、妊婦、等のヒト)から採取したいずれかの試料を指し、1つまたは複数の目的の核酸分子を含む。
伴性遺伝疾患に対する現在の出生前診断法は、典型的な例では、侵襲的で、胎児に危険を及ぼす。母体血漿中の無細胞の胎児DNA分析は、このような妊娠で胎児性別の評価用の非侵襲的手段を提供する。しかし、変異特異的確認分析が行われない場合には、男児胎児の疾患状態は、未知のままである。これに関し、我々は、母親からの伴性遺伝疾患の原因となる変異を胎児が受け継いでいるか否かを診断する非侵襲的検査を開発した。1つの戦略は、相対的変異遺伝子量(RMD)法に基づいている。この方法は、常染色体疾患変異の胎児の変異状態を判定するために以前に確立している。RMD法は、変異体または野性型対立遺伝子の濃度が、ヘテロ接合の男児胎児を有する妊婦の血漿中で不釣り合いに多いかどうかを検出することにより、染色体X上の伴性変異を胎児が受け継いでいるかどうかを推定するために使用される。
図1は、本発明の実施形態に従って、胎児中の母体生物学的試料を分析し、X連鎖障害を診断する方法100を示すフローチャートである。方法100は、非侵襲的であり、母体生物学的試料中で循環するDNAを使用することができる。
方法100のステップ155での分析は、母体試料中のDNA断片を分析する。母体試料は、胎児DNAも含むため、男児胎児のX染色体の遺伝子型も判定できる。染色体X上のいずれの変位に対しても、男児胎児を有するヘテロ接合の女性の血漿中の変異型および野性型対立遺伝子の濃度の間の対立遺伝子不均衡が常に存在する。不釣り合いに多い対立遺伝子は、胎児により受け継がれている対立遺伝子である。一実施形態では、胎児の遺伝子型は、RMD技術により判定でき、この技術は、母体試料中の変異対立遺伝子の数を正常対立遺伝子の数と比較することを含む。
図3は、本発明の実施形態に従って、妊婦の男児胎児がX連鎖変異であるか否かを判定する方法300を示すフローチャートである。妊婦は、X染色体上の座位で変異および正常対立遺伝子のヘテロ接合である。方法300は、相対的量の変異および正常対立遺伝子を使って疾患分類を行う。
上述のように、ディジタルPCRを、変異または正常対立遺伝子を含むDNA断片を特定する方法として使用可能である。ディジタルPCRでは、試料は複数の区画(例えば、ウエルまたはビーズ)に分割される。平均して、各区画は2つの対立遺伝子のいずれか1つ未満を含む。従って、陽性のウエルが対立遺伝子含有断片のただ1つの事例として計数できる。
SPRTは、データが蓄積するに従い、2つの確率的仮説の比較を可能とする方法である。換言すれば、それは、ディジタルPCRの結果を変異または正常対立遺伝子の方向に偏らせることを示唆するようにして、分類する統計的方法である。それは、分析されるウエルの数を最小化して所与の統計的な力と正確さを実現する利点を有する。
上方境界=[(ln8)/N-lnδ]/lnγ
下方境界=[(ln1/8)/N-lnδ]/lnγ
であり、
式中、δ=(1-θ1)/(1-θ2)、
θ1 =1つ目の対立仮説が真の場合(すなわち、胎児が変異対立遺伝子受け継いでいる場合)、変異および正常分子の合計数に対する変異分子の比率;および
θ2 =2つ目の対立仮説が真の場合(すなわち、胎児が正常対立遺伝子を受け継いでいる場合)、変異および野性型分子の合計数に対する変異分子の比率
である。
ディジタルPCRを使った一実施形態では、平均濃度/ウエル(反応または反応混合物)が決定され、その配列を示すウエルの予想数が計算される。この量は、パーセンテージ、分数値、または整数値として表現できる。一実施態様では、例えば、ディジタルPCR等の測定方法のウエルの反応混合物の中で、正常な(N)対立遺伝子、または変異対立遺伝子に対しポアソン分布が仮定される。他の実施態様では、二項分布、等の他の分布関数が使われる。
mr=−ln(1−参照対立遺伝子に対し陽性であるウエルの比率)。
この手法は、ディジタルPCR実験に使われるDNA試料中のmrの直接的で、正確な推定を与える。
図5Aは、本発明の実施形態に従って、染色体X上の変位に対する変異および野性型対立遺伝子の間の遺伝子量不均衡を説明する表500を示す。計算を説明するために、合計100ゲノム当量(GE)の10%胎児DNAを有するDNAを含む母体血漿試料を使用した。母体ゲノムに対しては、1GEは、2コピーの対立遺伝子、すなわち、MおよびN対立遺伝子それぞれを1コピー含む。これは、90コピーの各変異および正常対立遺伝子を与える。胎児ゲノムに対しては、1GEは、X連鎖対立遺伝子の1コピー、すなわち、変異体(M)または正常な(N)対立遺伝子のいずれかの1コピーを含む。これは、どちらの対立遺伝子を胎児が受け継いでいるかに応じて、各対立遺伝子の0または10コピーを与える。
方法300および400は、標準的SNP以外の、追加の状況で適用できる。実施形態は、例えば、大きなDNAセグメントの欠失、拡大(例えば、重複)、挿入、および反転、等の胎児変異の非侵襲的検出にさらに適用できる。このような変異の例は、X連鎖疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーおよびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、に関連する。手法は、拡大(例えば、重複)DNAセグメントの間の、または反転および隣接正常DNAセグメントの間の、欠失の再結合配列の接合部のターゲティングにより変異対立遺伝子を検出することである。胎児遺伝子型は、正常および変異対立遺伝子の間の遺伝子量不均衡から、本明細書記載の方法を使って推測することができる。
上述のRMD法では、変異が欠失、拡大、挿入、または反転である場合、異なる接合部が対立遺伝子として使用できる。欠失および拡大(例えば、重複)変異に適用可能な別の手法は、標的領域(すなわち、欠失または拡大領域)から生じる分子の量を、参照領域から生じる分子の量と比較することである。欠失(または拡大)のない染色体X上のいずれのゲノム座位、例えば、欠失または拡大がない場合のZFX遺伝子も、参照座位/領域として使用可能である。
上方境界 = [(ln 8)/N - ln δ]/ln γ;
下方境界 = [(ln 1/8)/N - ln δ]/ln γ
式中、δ = (1 - θ1)/(1 - θ2);
θ1 =1つ目の対立仮説が真の場合(すなわち、同じ変異を有する非妊婦のRの値と比較して、R1が増加する場合)の参照分子に対する標的分子の比率(R1)
θ2 =2つ目の対立仮説が真の場合(すなわち、同じ変異を有する非妊婦のRの値と比較して、R2が減少する場合)の参照分子に対する標的分子の比率(R2)
である。
θ1は、(3−Pf)/(2−Pf)であると判断される。正常な(N)対立遺伝子を受け継いでいる男児胎児を有する妊婦から試料を入手したと仮定して、θ2が計算される。θ2は、(3−2xPf)/(2−Pf)であると判断される。どのレベルの拡大にも適応できる一般化された式は:θ1が、(n+2−Pf)/(2−Pf)、およびθ2が、[n+2−Pf(n+1)]/(2−Pf)であり、式中、nは、拡大されたセグメントの追加コピーの数である。
上述のように、特定の対立遺伝子(例えば、染色体Xに特異的および胎児特異的配列)の確率P(n)を使って、試料中の胎児DNAのパーセンテージ(Pf)を調節できる。この調節されたPfを使って、次に、変異または野性型対立遺伝子が受け継がれているか否かを判定するためのカットオフ値を計算できる。
血友病のキャリアであり、男児胎児を有する妊婦である7人の女性(3人は、血友病Aのキャリア、4人は、血友病Bのキャリア)をRoyal Free Hospital、London、UKから集めた。我々は、また、それぞれ単生児の健康な男児胎児を有する20人の妊婦(血友病ノンキャリア)を集めた。その内の10人は、Royal Free Hospital、London、UKから、残りは、Prince of Wales Hospital、Hong Kongから集めた。本件の臨床情報を図9の表900に示すが、この表は、血友病変異のキャリアである7人の妊婦の臨床情報である。
RMD法の可能性を評価するために、我々は、染色体X上のSNP(rs6528633)を調査した。このSNPは、例示目的で選択されたが、他のSNPも使用可能である。胎児と母体のSNP遺伝子型が、それぞれ、胎盤および母体バフィコート試料由来のDNAを使って決定された。以前記載のように、MassARRAY homogenous MassEXTEND(hME)アッセイ(Sequenom)を使って、遺伝子型同定を行った(Tsui NBY、Chiu RWK、Ding C、et al.、Clin Chem.、51:2358−2362(2005);Tsui NBY、Chiu RWK、Ding C、et al.、Clin Chem.、51:2358−2362(2005))。血友病キャリア妊婦の末梢血試料から得たゲノムDNAを使って、血友病変異検出を行った。コード領域、イントロン/エキソン境界、プロモーターおよび3’UTRを含む全エキソンに対しPCRを行った。Big Dye Terminators V1.1(Applied Biosystems)を使ってサイクルシーケンス法を行い、Applied Biosystems 3100 Avant Genetic Analyserで解析した。
ディジタルRMDの実験ワークフローは、本発明の特定の実施形態に従って、図4で説明されている。我々は、以前記載のディジタルZFY/Xアッセイを使って、母体血漿試料中の胎児DNA濃度比率を測定した。このアッセイは、染色体YおよびX上に位置する、それぞれ、相同ZFYおよびZFX遺伝子座位を定量化した(Lun FMF et al.、Clin Chem.、54:1664−1672(2008);Lun FMF、Tsui NBY、Chan KCA、et al.、Proc Natl Acad Sci USA.、105:19920−19925(2008))。rs6528633SNPに対しては、2つの対立遺伝子特異的TaqManプローブ(Applied Biosystems)を使ったリアルタイムPCRアッセイを設計し、2つのSNP対立遺伝子を識別した。血友病の危険がある妊婦の場合の変異に対しては、それぞれの変異に対し、対立遺伝子識別のためのリアルタイムPCRアッセイを設計した。各アッセイには、変異および野性型対立遺伝子用の2つの対立遺伝子特異的TaqManプローブを含めた。プライマーおよびプローブ配列は、図10の表1000に列挙した。この表は、対立遺伝子判別可能アッセイ用のオリゴヌクレオチド配列およびリアルタイムPCR条件を示す。他の実施形態では、胎児DNA濃度比率は、母体血漿中の胎児および母体DNAの間で異なるようにメチル化された配列を使うことにより測定できる(例えば、Chim SS et al.、Proc Natl Acad Sci USA.、102:14753−14758(2005);Chan KCA et al.、Clin Chem.、52:2211−2218(2006)、を参照)。
X連鎖多形のためのディジタルRMDの原理
実施形態は、男児胎児を有するヘテロ接合の妊婦の血漿中の変異および野性型対立遺伝子の合計量(母体+胎児由来)の間の濃度差を測定するディジタルPCRを使用できる。男児胎児は、単一の染色体Xを有するので、野性型および変異対立遺伝子の間の相対的濃度は、常に遺伝子量不均衡状態にある(図2A)。変異対立遺伝子の過剰または過小発現量は、罹患または正常な胎児を、それぞれ表す。我々は、遺伝子量不均衡の試験にSPRTを使用した。1対のSPRT曲線を生成した(図2B)。上方曲線を越える、または下方曲線より小さいデータポイントの試料は、罹患または正常として、それぞれ、分類された。2つの曲線の中間のデータポイントの試料は、不十分な統計的検出力のために分類されず、追加のディジタルPCRが行われるであろう。
我々は、染色体X上のSNP:rs6528633(A/T多型)をモデルとして使用して、染色体X上の座位の胎児遺伝子型測定に対するRMD法の実用上の可能性を評価した。現在のRMD分析は、危険性のある妊婦、すなわち、染色体X上の変異に対しヘテロ接合で、男児胎児を有する妊婦の場合に適する。従って、我々は、染色体X上のSNPに対しヘテロ接合で、男児胎児を有する10人の妊婦由来の血漿試料を調査した。我々は、対立遺伝子判別可能ディジタルリアルタイムPCRアッセイを開発し、各試料中のA−およびT−対立遺伝子の濃度を測定した。我々は、さらに、胎児DNA濃度比率をZFY/Xアッセイで測定した。ディジタルRMDの結果を図11の表1100に示す。この表は、ディジタルRMDによる、母体血漿中のrs6528633の胎児遺伝子型同定を示す。
次に、我々は、ディジタルRMD法を血友病変異検出に適用した。我々は、F8遺伝子中の3つの変異、F9遺伝子中の4つの変異およびそれらの対応する野性型カウンターパートを検出するための7種のデュプレックスディジタルリアルタイムPCRアッセイを開発した。我々は、大部分の母体DNA背景中の少数の男児胎児DNA成分を含む母体血漿試料の組成を模擬した人工DNA混合物を形成することにより、ディジタルPCRアッセイの性能を評価した。我々は、対応する変異に対しヘテロ接合の女性から入手した血液細胞DNAを有する非罹患男児胎児由来の10%または20%の胎盤のDNAを混合した。図12は、人工DNA混合物を使ったディジタルRMDアッセイの検証を示す。人工混合物は、母体血漿中の胎児および母体DNA組成物をシミュレートするように作成された。図12の表1200に示すように、全てのDNA混合物で、ディジタルRMD分析により、母体血漿中の胎児DNAを模倣した胎盤DNAの遺伝子型が正しく検出された。
我々は、母体血漿DNA分析による血友病変異の胎児遺伝子型の検出用にディジタルRMD法を試験した。我々は、原因である変異に対しヘテロ接合の7人の妊婦から入手した12の血漿試料でディジタルPCRを行った(表900)。全ケースとも、男児胎児を含んでいた。我々は、また、ZFY/Xアッセイにより、母体血漿試料中の胎児DNA濃度比率を測定した。ディジタルRMD結果を図13の表1300に示す。この表は、ディジタルRMDによる母体血漿中の胎児血友病変異の非侵襲的検出を示す。
この調査で、我々は、血友病を一例として使って、X連鎖疾患の危険のある妊娠の男児胎児に保有されている原因変異を直接検出する非侵襲的出生前診断法を開発した。染色体X上の遺伝子座位に対しディジタルRMD手法を使用することにより、我々は、7人の血友病キャリア妊婦(表1300)由来の12の調査母体血漿試料の全てで、男児胎児が受け継いでいる変異または野性型対立遺伝子を正確に同定した。胎児遺伝子型は、妊娠の11週目(表900)の早期に検出できる可能性があり、この方法が早期診断への適用に有望であることを証明した。染色体X上の標的領域および参照領域を使う方法も利用できる。
本明細書に記載のいずれのコンピュータシステムでも、どのような適切な数のサブシステムの利用も可能である。このようなサブシステムの例を、図16のコンピュータ装置1600に示す。一部の実施形態では、コンピュータシステムは、単一コンピュータ装置を含み、この場合、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素でありうる。他の実施形態では、コンピュータシステムは、複数のコンピュータ装置を含み、それぞれが内部構成要素を含むサブシステムであってもよい。
Claims (32)
- X染色体上の座位で、変異および正常対立遺伝子に対しヘテロ接合である妊婦の男児胎児がX連鎖変異を有するか否かを判定する方法であって、
複数の反応それぞれが生物学的試料由来の1つまたは複数の核酸分子を含み、その生物学的試料が妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含み、データが:
その座位の変異対立遺伝子の第1の量を示す第1の定量的データセット;および
その座位の正常対立遺伝子の第2の量を示す第2の定量的データセット、
を含む複数の反応からのデータの入手;
第1と第2の量の間の相対量を表すパラメータの、第1の量および第2の量からの決定;
生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージPfの取得;
胎児がその座位で変異対立遺伝子を受け継いでいるか否かの判定用の第1のカットオフ値が少なくとも第1の比率:k/(1+k−Pf)(kは、妊婦の変異染色体上の変異対立遺伝子の数、kは1以上の整数)から算出される計算;
胎児がその座位で正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの判定用の第2のカットオフ値が少なくとも第2の比率:[k(1−Pf)]/[1+k−kPf)]から算出される計算;および
胎児が変異対立遺伝子または正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの分類を決定するための、パラメータの第1および第2のカットオフ値の内の少なくとも1つとの比較、
を含む方法。 - パラメータが第1および第2のカットオフ値と比較される、請求項1に記載の方法。
- 分類が、疾患状態、非疾患状態、および分類不能を含む、請求項2に記載の方法。
- パーセンテージPfの取得が、
実験的に得た生物学的試料中の胎児核酸分子パーセンテージの、複数の反応に対し予想される統計的分子分布による補正を含む、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - パーセンテージPfの取得が、
妊婦がホモ接合で、胎児がヘテロ接合または半接合である座位で母親および胎児で共有される第1の対立遺伝子の、反応における検出;
式[−ln((N−P1)/N)]*Nによるポアソン補正された濃度Pxの計算(Nは、分析された反応の合計数、P1は、第1の対立遺伝子に対する陽性の反応の数、およびlnは、自然対数);
反応における胎児特異的な第2の対立遺伝子の検出;さらに
式[−ln((N−P2)/N)]*Nによるポアソン補正された濃度Pyの計算(Nは、分析された反応の合計数、およびP2は、第2の対立遺伝子に対し陽性の反応の数)、
を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の対立遺伝子が染色体Y上にある、請求項5に記載の方法。
- 第1の対立遺伝子が染色体X上にある、請求項5に記載の方法。
- 胎児特異的対立遺伝子が、常染色体上の父性系遺伝性対立遺伝子である、請求項5に記載の方法。
- 胎児特異的対立遺伝子が、胎児に特異的なメチル化マーカーを含む、請求項5に記載の方法。
- Pfの[(2Py)/(Px+Py)]*100%としての計算をさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 第1および第2のカットオフ値が、逐次確率比検定(SPRT)を使って決定され、胎児が変異または正常核酸配列を受け継いでいるか否かが判定される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 変異核酸配列に連鎖した多形部位の対立遺伝子が、変異核酸配列と同じ母体ハプロタイプ上に位置する対立遺伝子であり、多形部位と変異核酸配列との間の組換えの確率が1%未満である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 正常な核酸配列に連鎖した多形部位の対立遺伝子が、正常な核酸配列と同じ母体ハプロタイプ上に位置する対立遺伝子であり、多形部位と変異核酸配列の間の組換えの確率が1%未満である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 反応が、下記の内のいずれか1つまたは複数を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法:
シーケンシング反応、光学的分析、および蛍光プローブを使ったハイブリダイ
ゼーション、またはナノポアシーケンシング。 - 反応が増幅反応である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 反応が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項15に記載の方法。
- 平均濃度が、反応当たり1テンプレート分子未満であり、ポアソン分布が、生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージPfの決定に使われる、請求項17に記載の方法。
- 生物学的試料が、妊婦由来の血漿、血清、または全血である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 妊婦の男児胎児がX連鎖変異であるか否かを判定する方法であって、
複数の反応のそれぞれが生物学的試料由来の1つまたは複数の核酸分子を含み、生物学的試料が妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含み、
X染色体上の座位で対立遺伝子に対しホモ接合である妊婦が、変異X染色体上の対立
遺伝子の拡大変異を有し、変異体X染色体がその座位の対立遺伝子の正常なコピー
および1つまたは複数の対立遺伝子の追加のコピーを有し、さらに、その座位の対
立遺伝子の正常なコピーの正常なX染色体を有し、
データが、
1つまたは複数の追加の対立遺伝子のコピーにより生成された第1の量の追加の
接合部を示す第1の定量的データセット;および
両X染色体上の対立遺伝子の正常なコピーにより生成された正常な接合部の第2
の量を示す第2の定量的データセット、
を含む、複数の反応からのデータの入手;
第1の量および第2の量から、第1と第2の量の間の相対量を表すパラメータの決定;
生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージPfの取得;
少なくとも第1の比率:n/(n+1−Pf)から算出される、胎児が変異X染色体を受け継いでいるか否かを判定のための第1のカットオフ値の計算(nは、対立遺伝子の追加のコピー数、nは、1以上の整数);
少なくとも第2の比率:[n(1−Pf)/[n+2−Pf(n+1)]から算出される、胎児が正常なX染色体と受け継いでいるか否かの判定のための第2のカットオフ値の計算;さらに
胎児が変異体X染色体または正常なX染色体を受け継いでいるか否かの分類を決定するための、パラメータの第1および第2のカットオフ値の内の少なくとも1つとの比較、
を含む方法。 - X染色体上の標的領域で変異および正常対立遺伝子に対しヘテロ接合であり、その変異が、標的領域の欠失または拡大である妊婦の男児胎児がX連鎖変異を有するか否かを判定する方法であって、
複数の反応のそれぞれが生物学的試料由来の1つまたは複数の核酸分子を含み、生物学的試料が妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含み、
データが、
標的領域由来の核酸分子の第1の量を示す第1の定量的データセット;および
X染色体上の参照領域由来の核酸分子の第2の量を示す第2の定量的データセッ
ト、
を含む複数の反応からのデータの入手;
第1と第2の量の間の相対量を表すパラメータの、第1の量および第2の量からの決定;
生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージPfの取得;
胎児が変異を受け継いでいるか否かを判定するための、パーセンテージPfに依存する第1のカットオフ値の計算;
胎児が正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの判定のための、パーセンテージPfに依存する第2のカットオフ値の計算;および
胎児が変異または正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの分類を決定するための、パラメータの第1および第2のカットオフ値の内の少なくとも1つとの比較、
を含む方法。 - 変異が拡大であり、
第1のカットオフ値が、同じ拡大変異を有する非妊婦の第2の量に対する第1の量の比率と比べて、対応する比率が増加するという仮定に基づいて決定され、また、
第2のカットオフ値が、同じ拡大変異を有する非妊婦の第2の量に対する第1の量の比率と比べて、対応する比率が減少するという仮定に基づいて決定される、
請求項20に記載の方法。 - 変異が欠失であり、
第2のカットオフ値が、同じ欠失変異を有する非妊婦の第2の量に対する第1の量の比率と比べて、対応する比率が増加するという仮定に基づいて決定され、また、
第1のカットオフ値が、同じ欠失変異を有する非妊婦の第2の量に対する第1の量の比率と比べて、対応する比率が減少するという仮定に基づいて決定される、
請求項20に記載の方法。 - 変異が欠失であり、
第2のカットオフ値が少なくとも第1の比率:1/(2−Pf)から算出され、
第1のカットオフ値が少なくとも第2の比率:(1−Pf)/(2−Pf)から算出される、
請求項20に記載の方法。 - 変異が重複であり、
第2のカットオフ値が少なくとも第1の比率:(3−Pf)/(2−Pf)から算出され、
第1のカットオフ値が少なくとも第2の比率:(3−2Pf)/(2−Pf)から算出される、
請求項20に記載の方法。 - パーセンテージPfの取得が、複数の反応における予測統計的分子分布を使った生物学的試料中の胎児核酸分子の実験パーセンテージの補正を含む、請求項20〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 胎児を有する妊婦由来の生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージPfを取得する方法であって、
複数の反応それぞれが生物学的試料由来の複数の核酸分子を含み、生物学的試料が妊婦由来および胎児由来の核酸分子を含む複数の反応からのデータの入手;
妊婦がホモ接合で、胎児がヘテロ接合または半接合である座位で母親および胎児により共有される第1の対立遺伝子の、反応における検出;
第1の対立遺伝子に対する陽性の反応の数に基づいて、複数の反応における第1の対立遺伝子の予測統計分布により補正される、第1の対立遺伝子の補正濃度Pxの計算;
胎児に特異的である第2の対立遺伝子の、反応における検出;
第2の対立遺伝子に対する陽性の反応の数に基づいて、複数の反応における第2の対立遺伝子の予測統計分布により補正される、第2の対立遺伝子の補正濃度Pyの計算;さらに
[(2Py)/(Px+Py)]を使ったPfの計算;
を含む方法。 - Pfが[(2Py)/(Px+Py)]*100%に等しい、請求項26に記載の方法。
- 統計分布がポアソン分布であり、
ポアソン補正される濃度Pxが、式[−ln((N−P1)/N)]*N(Nは、分析する反応の合計数、P1は、第1の対立遺伝子に対する陽性のウエルの数、およびlnは、自然対数)を使用し、また、
ポアソン補正される濃度Pyが、式[−ln((N−P2)/N)]*N(Nは、分析する反応の合計数、P2は、第2の対立遺伝子に対する陽性のウエルの数)を使用する、
請求項26および27のいずれか1項に記載の方法。 - データが、
変異核酸配列に連鎖した多形部位の変異核酸配列または対立遺伝子の第1の量を示す第1の定量的データセット;および
正常な核酸配列に連鎖した多形部位の正常な核酸配列または対立遺伝子の第2の量を示す第2の定量的データセット、
を含み、
2つのデータセットからパラメータの決定;
胎児が変異核酸配列を受け継いでいるか否かの判定用の、パーセンテージPfに基づく第1のカットオフ値の決定;
胎児が正常な核酸配列を受け継いでいるか否かの判定用の、パーセンテージPfに基づく第2のカットオフ値の決定;
パラメータの、第1および第2のカットオフ値の内の少なくとも1つとの比較;および
比較に基づく、胎児が変異または正常な核酸配列を受け継いでいるか否かの分類の決定、
をさらに含む、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。 - プロセッサが操作を行うのを制御するための複数の命令を保存する非一時的コンピュータ可読メディアを含み、命令が上記方法のいずれかを含むコンピュータプログラム製品。
- 上記方法のいずれかを実行するように構成されている1つまたは複数のプロセッサを含むシステム。
- 上記方法のいずれかを実行するように構成されているモジュールを含むシステム。
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