CN103459614A

CN103459614A - 胎儿性染色体的非侵入性产前基因分型

Info

Publication number: CN103459614A
Application number: CN2012800108284A
Authority: CN
Inventors: 卢煜明; 赵慧君; 陈君赐; 徐宝贤
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-01-05
Also published as: CA2823618C; CA2823618A1; US20190042693A1; US20140019064A1; EP2661507A1; EP2661507B1; US10152568B2; EP3680909A1; CN103459614B; EP3901955A1; EP2661507A4; EP3680909B1; AU2012204748A1; JP2014507134A; AU2012204748B2; AU2012204748C1; JP6105485B2; WO2012093331A1; EP3901955B1

Abstract

本发明提供了用于分析母本样品，从而确定孕妇的男性胎儿是否继承了母亲的X连锁突变的方法、仪器和系统。获得样品中胎儿DNA的百分率，并确定两种可能性（胎儿继承突变的等位基因或正常的等位基因）的截断值。然后，将X染色体上突变等位基因相对于正常等位基因的比例与截断值相比较，以作出继承了哪个等位基因的分类。备选地，可以将由X染色体上的目标区域得到的等位基因的数量与X染色体上的参照区域的等位基因的数量相比较，从而鉴别缺失或扩增。可以通过计数与胎儿特有的等位基因的反应，并校正数量以说明反应中的统计学分布来计算胎儿DNA的百分率。

Description

胎儿性染色体的非侵入性产前基因分型

相关申请的交叉引用

本发明要求Lo et al.在2011年1月5日提交的题为“NoninvasivePrenatal Genotyping Of Fetal Sex Chromosomes”的美国临时申请No.61/430,032(008300US)、以及Lo et al.在2011年4月14日提交的题为“Noninvasive Prenatal Genotyping Of Fetal Sex Chromosomes”的美国临时申请No.61/475,632(008301US)的优先权，并且为这些申请的非临时申请，为了所有的目的，这些申请的全部内容以引用方式并入本文。

本申请涉及Lo et al.在2008年7月23日提交的题为“Determining aNucleic Acid Sequence Imbalance”的共同拥有的美国专利申请No.12/178,116(005210US)，该申请的公开内容以引用方式全文并入本文。

背景技术

血友病是由于在染色体X上的基因中发生了异源突变所导致的，其中所述的染色体X分别编码了凝血因子VIII(F8)（Kemball-Cook G,Tuddenham EG,Nucleic Acids Res.,25:128-132(1997)）和凝血因子IX(F9)（Giannelli F,Green PM,Sommer SS,et al.,Nucleic Acids Res.,26:265-268(1998)）。对于怀孕的血友病隐性基因携带者而言，在每次怀孕中，都具有25%的几率怀有受影响的男性胎儿。对于患有血友病的家族中的妇女而言，产前诊断是生殖选择的重要方面（Lee CA,Chi C,Pavord SR,et al.,Haemophilia.,12:301-336(2006)）。此外，在分娩过程中，产前诊断对于适当的产科管理而言也是有利的，并且作为滞产的生产、侵入性监测技术以及协助性生产在受影响的胎儿中应该避免从而减少潜在的胎儿和新生儿出血性并发症（Lee CA,Chi C,Pavord SR,et al.,Haemophilia.,12:301-336(2006)）。因此，用于血友病的非侵入性产前诊断方法的研发对于产科医生及血友病家族而言都是有利的。

目前用于性相关疾病的产前诊断方法通常是侵入性的，并且使胎儿处于风险中。在母亲血浆中的无细胞胎儿DNA的发现为非侵入性产前诊断提供了新的机会（Lo YMD et al.,Lancet.,350:485-487(1997);Lo YMD,Chiu RWK,Nat Rev Genet.,8:71-77(2007)）。已经根据对母亲血浆中父本遗传的基因特性的检测来研发大量有前途的临床应用。例如，胎儿性别和RHD状态的非侵入性监测可以用于性相关畸变和RhD不相容性的临床管理（Bustamante-Aragones A et al.,Haemophilia.,14:593-598(2008);Finning K et al.,BMJ.,336:816-818(2008)）。对于诸如软骨发育不全和β-珠蛋白生成障碍性贫血之类的单基因疾病而言，对母亲血浆中父本遗传的突变的存在或缺乏的检测允许人们分别诊断胎儿的常染色体显性疾病，或者排除胎儿的常染色体隐性疾病（Saito H et al.,Lancet.,356:1170(2000);Chiu RWK et al.,Lancet.,360:998-1000(2002);Ding C et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.,101:10762-10767(2004)）。

尽管所述领域的快速研发，仍难以检测由突变携带者的母亲继承得到的胎儿的等位基因。困难是由于在母亲血浆中胎儿和母亲DNA共存所导致的，并且母亲遗传的胎儿等位基因与背景母亲DNA不易区别（LoYMD,Chiu RWK,Nat Rev Genet.,8:71-77(2007)）。

因此，理想的是提供用于确定男性胎儿是否继承了X连锁的突变的精确且有效的方法。

发明概述

本发明提供了用于分析母本样品，以便确定孕妇的男性胎儿是否继承了母亲的X连锁突变的方法、仪器和系统。获得样品中胎儿DNA的百分率，并确定两种可能性（胎儿继承突变的等位基因或正常的等位基因）的截断值。然后，将X染色体上突变等位基因相对于正常等位基因的比例与截断值相比较，以作出继承了哪个等位基因的分类。备选地，可以将由X染色体上的目标区域得到的等位基因的数量与X染色体上的参照区域的等位基因的数量相比较，从而鉴别缺失或扩增。可以通过计数与胎儿特有的等位基因的反应，并校正数量以说明反应中的统计学分布来计算胎儿DNA的百分率。

根据一个实施方案，提供了用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁突变的方法。孕妇在X染色体上的基因座处为突变等位基因和正常等位基因的杂合的。数据得自多个反应，每个反应都涉及由生物学样品得到的一种或多种核酸分子。生物学样品包括由孕妇得到的以及由男性胎儿得到的核酸分子。该数据包括第一组定量数据和第二组定量数据，其中第一组定量数据表明在基因座处的突变等位基因的第一量，第二组定量数据表明在基因座处的正常等位基因的第二量。由第一量和第二量确定参数，其中该参数表示第一量和第二量之间的相对量。获得生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf。计算用于确定胎儿在基因座处是否继承了突变等位基因的第一截断值，其中第一截断值至少衍生自k/(1+k-Pf)的第一比例，其中k为孕妇的突变染色体上的突变等位基因的数量，k为等于或大于1的整数。计算用于确定胎儿在基因座处是否继承了正常等位基因的第二截断值，其中第二截断值至少衍生自[k(1-Pf)]/[1+k-kPf)]的第二比例。将参数与第一截断值和第二截断值中的至少一者相比较，从而确定胎儿是继承了突变等位基因还是正常等位基因的分类。

根据另一个实施方案，提供了用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁突变的方法。孕妇在X染色体上的目标区域处是突变等位基因和正常等位基因杂合的。突变为目标区域的缺失或扩增。收到由多个反应得到的数据。每个反应都涉及由生物学样品得到的一种或多种核酸分子。生物学样品包括由孕妇得到的以及由男性胎儿得到的核酸分子。数据包括第一组定量数据和第二组定量数据，其中第一组定量数据表明由目标区域得到的核酸分子的第一量，第二组定量数据表明由X染色体上的参照区域得到的核酸分子的第二量。由第一量和第二量确定参数，其中该参数表示第一量和第二量之间的相对量。获得生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf。计算用于确定胎儿是否继承了突变的第一截断值。该第一截断值取决于百分率Pf。计算用于确定胎儿是否继承了正常的等位基因的第二截断值。该第二截断值取决于百分率Pf。将参数与第一截断值和第二截断值中的至少一者相比较，从而确定胎儿是继承了突变还是正常等位基因的分类。

根据另一个实施方案，提供了在由怀有胎儿的孕妇得到的生物学样品中获得胎儿的核酸分子的百分率Pf的方法。数据得自多个反应。每个反应都涉及由生物学样品得到的大量的核酸分子，其包括由孕妇得到的以及由胎儿得到的核酸分子。在反应中检测到第一等位基因。第一等位基因在这样的基因座处由母亲和胎儿所共有，其中在该基因座中，孕妇是纯合的，而胎儿是杂合的或半合的。根据对第一等位基因为阳性反应的数量来计算第一等位基因的校正浓度Px，其中Px是针对第一等位基因在多个反应中的预计统计学分布来校正的。在反应中检测到第二等位基因，其中第二等位基因是胎儿特有的。根据对第二等位基因为阳性反应的数量来计算第二等位基因的校正浓度Py。Py是针对第二等位基因在多个反应中的预计统计学分布来校正的。然后，使用[(2Py)/(Px+Py)]来计算胎儿的百分率Pf。

其他实施方案涉及与本文所述的方法相关的系统及计算机可读介质。

参照以下发明详述及附图可以更好地理解本发明的性质和优点。

附图说明

图1为示出了根据本发明的实施方案的方法100的流程图，方法100用于分析母本的生物学样品从而诊断胎儿中X连锁的紊乱。

图2A示出了胎儿继承了突变等位基因或正常等位基因的两种可能性。图2B示出了根据本发明的实施方案使用序列概率比检验（SPRT）所获得的用于分类样品的截断值图250。

图3为示出了根据本发明的实施方案的方法300的流程图，方法300用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁的突变。

图4示出了根据本发明的实施方案的方法400，其用于确定男性胎儿是否继承了X连锁的突变。

图5A示出了表500，其示出了针对染色体X上的突变，突变等位基因与野生型等位基因之间的剂量失衡。图5B示出了当怀孕的受试对象在所关注的基因座处是杂合的时，用于检测扩增的第一方案。图5C示出了当怀孕的受试对象在所关注的基因座处是纯合的时，用于检测扩增的第二方案。

图6为示出了方法600的流程图，方法600用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁的突变。

图7为表700，其示出了针对染色体X上的缺失和重复突变，在目标和参照基因座之间的剂量失衡。

图8为示出了根据本发明的实施方案的方法800的流程图，方法800用于在由怀有胎儿的女性得到的生物学样品中获得胎儿核酸分子的百分率Pf。

图9示出了具有7名怀孕妇女的临床信息的表900，其中所述的怀孕妇女为血友病突变的携带者。

图10为示出了针对等位基因判别法的寡核苷酸序列以及实时PCR条件的表1000。

图11为示出了通过数字RMD在母本血浆中针对rs6528633进行胎儿的基因分型的表1100。

图12示出了使用人工DNA混合物的数字RMD检验的确认。

图13为示出了通过数字RMD来非侵入性地检验母本血浆中胎儿血友病突变的表1300。

图14示出了在母本血浆样品中针对胎儿血友病突变来进行SPRT分析的图。在图表的顶部示出箱号。P_r为包含突变等位基因的阳性孔的比例。

图15示出了针对由正常的孕妇得到的母本血浆样品的数字RMD结果。

图16示出了根据本发明的实施方案的系统和方法可用的计算机系统实例1600的框图。

定义

如本文所用，术语“生物学样品”是指取自受试对象（例如人，如怀孕的妇女）并包含一种或多种所关注的核酸分子的任何样品。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA），及其聚合物。除非具体限定，否则该术语涵盖了包括天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸与参照核酸具有相似的结合性质，并且以与天然形成的核苷酸相同的方式代谢。除非另作说明，否者特定的核酸序列还含蓄地涵盖了其保守修饰的变体（例如简并密码子取代）、等位基因、直向同源物、SNP、互补序列以及清楚指明的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过生成这样的序列来取得，其中在所述的序列中，一个或多个所选的（或所有的）密码子的第三个位置被混合的碱基和/脱氧肌苷残基取代（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);以及Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994)）。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、小分子非编码RNA、microRNA（miRNA）、Piwi-相互作用RNA以及由基因或基因座编码的短发夹RNA（shRNA）交换使用。

术语“基因”是指与生产多肽链相关的DNA的节段。其可以包括编码区域之前及之后的区域（前导区及尾随区），以及单个编码节段（外显子）之间的间隔序列（内含子）。

如本文所用，术语“反应”是指与化学、酶或物理作业有关的任何过程，该过程表明存在或缺乏所关注的特定的多核苷酸序列。“反应”的实例为扩增反应，例如聚合酶链式反应（PCR）。“反应”的另一个实例为通过合成、连接、杂交或降解的测序反应。“信息性反应”是指表明了存在一种或多种所关注的特定多核苷酸序列的一种反应，以及其中仅存在一种所关注的序列的一种情况。如本文所用，术语“孔”是指在限定的结构中，在预定位置处的反应，例如孔形瓶、池、PCR阵列中的室、乳液中的滴、颗粒、纳米孔或者表面上的区域。

如本文所用，术语“过度呈现的核酸序列”是指在所关注的两条序列（例如临床相关的序列以及背景序列）中，比生物学样品中的其他序列更富足的核酸序列。

如本文所用，术语“基于”是指“至少部分基于”，并且指在确定另一个值的过程中使用的一个值（或结果），例如在一种方法的输入与该方法的输出的关系中所形成的。此外，如本文所用，术语“衍生”是指一种方法的输入与该方法的输出的关系，例如在衍生为公式的计算时所形成的。

如本文所用，术语“定量数据”是指由一个或多个反应获得的并提供一个或多个数值的数据。例如，对特定的序列显示出荧光标志物的孔数为定量数据。

如本文所用，术语“参数”是指表征定量数据组和/或定量数据组之间的数量关系的数值。例如，第一核酸序列的第一量与第二核酸序列的第二量之间的比值（或比值的函数）为参数。

如本文所用，术语“基因座”及其复数形式为在基因组中具有变化的任何长度的核苷酸（或碱基对）的位置或地址。术语“等位基因”是指在相同的物理基因组基因座处备选的DNA序列，其可能或不可能得到不同的表现型特征。在任何特定的二倍体有机体中，其各染色体具有两个拷贝（除了男性人类受试对象中的性染色体），各基因的基因型包括出现在该基因座处的成对的等位基因，其在纯合体中是相同的，而在杂合体中是不同的。人群或有机体物种在不同的个体中在各基因座处通常包括多个等位基因。其中在人群中发现多于一个等位基因的基因组基因座被称为多态位点。基因座处等位基因的变化作为存在的等位基因的数量（即，多态性的程度）或者人群中杂合体的比例（即，杂合性的比例）是可测量的。如本文所用，术语“多态性”是指人类基因座中任何个体间的变化，而与其频率无关。此类变化的实例包括但不限于单核苷酸多态性、简单串联重复多态性、插入-缺失多态性、突变（其可能是疾病的原因）及拷贝数的变化。

如本文所用，术语“截断值”是指数值，就生物学样品而言，所述的值用于在两个或多个分类状态（例如疾病及非疾病的）之间进行判断。例如，如果参数大于截断值，则进行定量数据的第一分类（例如疾病状态）；或者如果参数小于截断值，则进行定量数据的不同分类（例如非疾病状态）。

如本文所用，术语“失衡”是指由在临床相关的核酸序列的定量中至少一个截断值与参照定量所定义的任何显著的偏离。例如，参照定量可以为3/5的比例，因此，如果过所测量的比例为1:1，则发生失衡。

如本文所用，术语“测序标签”是指由核酸分子的任何部分或全部测序得到的核苷酸字符串。例如，经测序的标签可以为由核酸片段测序得到的核苷酸的短的字符串、在核酸片段的两个末端处的核苷酸的短的字符串、或者在生物学样品中存在的完整核酸片段的测序。核酸片段为较大核酸分子的任何部分。片段（例如基因）可以与较大的核酸分子的其他部分分开存在（即，未连接）。

发明详述

目前用于性相关疾病的产前诊断通常是侵入性的，并且使胎儿处于风险中。在母本血浆中的无细胞胎儿DNA分析在所述的怀孕中提供了估测胎儿性别的非侵入性手段。但是，如果不实施突变特异性验证分析，则男性胎儿的疾病状态保持未知。在此，我们研发出非侵入性的检验来诊断胎儿是否由其母亲继承了性相关疾病的致病突变。一种策略是基于相对突变剂量（RMD）方法，我们之前已经建立该方法用于针对常染色体疾病突变来确定胎儿的突变状态。RMD方法通过检测突变等位基因或野生型等位基因的浓度是否在携带男性胎儿的杂合型妇女的血浆中过度呈现，来用于推断胎儿在染色体X上是否继承了性相关的突变。

多个实施方案提供了RMD方法在产前诊断X连锁的紊乱（例如血友病）中的应用。针对常染色体疾病和X连锁疾病的RMD分析之间的差异在于针对常染色体的RMD分析存在3种可能的胎儿基因型（即，纯合的正常型、纯合的突变体以及杂合的），而对于X连锁疾病的RMD分析而言，仅存在2种可能的胎儿基因型。在X连锁疾病的情况下，男性胎儿仅具有一条染色体X，因此该染色体为突变基因型或野生型基因型。与常染色体疾病的3个结果相比，对于给定的分析精确度而言，X连锁疾病的2个结果可以使RMD方法更稳健地用于X连锁的疾病。此外，多个实施方案还可以用于其他性相关的疾病，包括但不限于Duchenne型肌营养不良、X连锁的肾上腺脑白质营养不良、Becker型肌营养不良、无脉络膜、II型粘多糖储积症、Lesch Nyhan综合症、Norrie综合症以及鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症。

我们使用血友病，一种X连锁的出血紊乱，作为实例来说明概念。在由处于血友病（一种性相关疾病）风险下的怀孕者（早至怀孕期的第11周开始）获得的全部12例所研究的母本血浆样品中，针对血友病突变，我们正确地检测了胎儿的基因型。对于而言，这种研发可以为处于风险下的家族做出进行较少的创伤和更高的安全性的产前检验的决定。

I.确定性相关的突变

图1为示出了根据本发明的实施方案的方法100的流程图，方法100用于分析母本的生物学样品从而诊断胎儿中X连锁的紊乱。方法100是非侵入性的，并且可以使用在母本的生物学样品中循环的DNA。

在步骤110中，鉴别出在X染色体上具有已知的突变的怀孕受试对象。突变可以为本文所述的任何类型，例如血友病。突变可以以多种方式确定，例如DNA测序、Southern印记分析、PCR（包括等位基因特异性的PCR）、熔融曲线分析等。所述的突变使得怀孕受试对象的仅仅一条X染色体具有突变，即，怀孕受试对象在与突变相关的基因座处是杂合的。此外，多个实施方案还可以用于非侵入性地产前诊断与点突变或序列缺失、重复或倒位有关的其他性相关紊乱，例如无脉络膜或Norrie综合症。

在步骤120中，接收到怀孕受试对象的生物学样品。样品可以为包含胎儿核酸的任何生物学样品，例如血浆、尿、血清和唾液。例如，可以由接受产科护理的怀孕携带者收集得到的母本血浆样品。

在步骤130中，确定胎儿的性别。可以通过检测X和Y染色体来确定性别。通过检测母本血浆中染色体Y的DNA序列，从怀孕期的第7周开始，能够以高于97%的精确性鉴别男性胎儿。对于女性胎儿而言，可以避免不必要的侵入性检验，这是因为女性胎儿是不受影响的或者是疾病的携带者。

在步骤140中，胎儿被确定为女性，然后在145中未实施其他的分析。女性胎儿被影响为携带者，除非像偏斜的X染色体失活的较少的方案。

在步骤150中，胎儿被确定为男性，然后再步骤155中，分析X染色体上的DNA片段。在一个实施方案中，通过相对突变（RMD）技术来实施胎儿的突变检测，其在下文中更详细的描述。在另一个实施方案中，通过将在目标区域（在母亲中，该区域包括突变）处的等位基因的量与在参照区域（在母亲中，该区域是正常的）处的等位基因的量相比较来检测缺失或扩增的胎儿突变。

在步骤157中，可以确定胎儿未继承母亲受试对象的突变的X染色体。在步骤159中，可以确定胎儿未继承母亲受试对象的突变的X染色体。如果需要，可以通过在怀孕者后期取得的第二母本血浆样品来证实分类，此时胎儿的DNA百分率较高（Lun FMF et al.,Clin Chem.,54:1664-1672(2008)），从而允许更稳健的检验。

II.正常者与突变体之间的分类

在方法100的步骤155中进行的分析分析了母本样品中的DNA片段。由于母本样品中还包含胎儿DNA，所以可以确定男性胎儿的X染色体的基因型。就染色体X上的任何突变而言，在携带男性胎儿的杂合型妇女的血浆中，突变等位基因浓度与野生型等位基因浓度之间总是存在等位基因的失衡。过度呈现的等位基因为胎儿继承的基因。在一个实施方案中，可以通过RMD技术来确定胎儿的基因型，其可以包括将母本样品中突变等位基因的数量与正常等位基因的数量相比较。

图2A示出了胎儿继承了突变等位基因或正常等位基因的两种可能性。针对X染色体上的特定基因座示出母本DNA210。基因座215为作为正常N的一个等位基因（野生型）与作为突变M的其他等位基因的杂合的。突变可以为多种类型，例如不同的序列、缺失、插入和倒位。在基因座215处，这些突变的每一个都可以鉴别为不同于正常等位基因的等位基因。

胎儿DNA220显示具有2种可能性。由于男性胎儿仅具有1条X染色体，所以母本DNA210的唯一1条X染色体将继承给男性胎儿。可能性222显示男性胎儿继承了突变等位基因M。可能性224显示男性胎儿继承了正常的等位基因M。此外，对于每一种可能性而言，还显示出小于X染色体的Y染色体。

根据胎儿是否继承了突变等位基因或正常等位基因，母本样品（例如血浆）230具有不同的突变等位基因与正常等位基因的比例。就可能性222而言，由于男性胎儿继承了突变等位基因M，所以母本样品将具有更多的突变等位基因M。这是由于在分析了具有统计学意义的量的DNA时，胎儿DNA仅贡献了突变等位基因M，而母本DNA贡献了大致相等部分的突变等位基因M和正常的等位基因N。就可能性224而言，由于男性胎儿继承了正常的等位基因N，所以母本样品将具有更多的正常的等位基因N。

可以以多种方式计数显示出正常和突变等位基因的DNA片段的数量，例如数字PCR、测序（包括Sanger测序、大规模平行测序和单一分子测序）、以及允许分析单一DNA分子或扩增的DNA分子组的其他方法（例如在固体表面上的簇）。一旦计数N和M等位基因的数量，便可以使用多种计数来进行分类，例如受影响的或未受影响的（例如胎儿是否患有血友病或者为正常的诊断）。例如，可以由N和M等位基因的数量来确定参数（例如比例或差异），并可以将参数与一个或多个截断值相比较。通过多种统计技术来获得截断值，例如序列概率比检验（SPRT）（ZhouW,Galizia G,Lieto E,et al.,Nat Biotechnol.,19:78-81(2001);Zhou W,Goodman SN,Galizia G,et al.,Lancet.,359:219-225(2002)）。

图2B示出了根据本发明的实施方案使用SPRT所获得的用于分类样品的截断值图250。Y轴示出了突变的等位基因的比例P_r（参数的实例）。X轴示出了对于所计数的基因座215而言，等位基因的数量。2条曲线对应于用于确定胎儿是否具有突变（例如血友病）、为正常或者为不可分类的截断值。突变等位基因的比例（P_r）高于上边界且低于下边界的样品分别被分类为突变的和野生型的。P_r在2条曲线之间的样品是不可分类的，并且需要额外的数字分析（例如由额外的PCR孔得到的数据）。

待使用的特定截断值取决于所计数的等位基因的数量。当仅计数少量的等位基因时，它们可以为较大的统计学变化，因此截断值需要极端的P_r值来确信地将样品分类为突变的或正常的。如下文中更加详细描述的那样，可以使用数字PCR（其中Y轴可以为包含突变等位基因的阳性孔的比例，而X轴可以为阳性孔的数量）。曲线在Y轴上的位置可以根据如何计算参数而变化，例如如果参数为N等位基因的数量除以M等位基因的数量，则不可分类的区域将集中在1.0。

在另一个实施方式中，其中突变为缺失或扩增，在目标区域（例如基因座215）（其中1条母本X染色体具有缺失/扩增）和参照区域（不具有扩增或缺失）处的片段的数量之间的比较可以用于鉴别缺失/扩增。此类实施方式并非取决于杂合的基因座的鉴别，因此怀孕的受试对象在目标区域处可以是纯合的。就缺失而言，人们预计由目标区域得到的片段比由参照区域得到的片段少。就扩增而言，人们预计由目标区域得到的片段比由参照区域的倒的片段多。此外，还可以使用SPRT或相似的技术来确定截断值。

III.RMD方法

图3为示出了根据本发明的实施方案的方法300的流程图，方法300用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁的突变。孕妇在X染色体的基因座处是突变等位基因与正常等位基因的杂合的。方法300使用了突变等位基因和正常等位基因的相对量以便进行疾病的分类。

在步骤310中，收到了由多个反应得到的数据。每个反应都涉及由生物学样品得到的一种或多种核酸分子，其中所述的生物学样品包含由孕妇得到的以及由男性胎儿得到的核酸分子。反应可以为多种类型，例如在多个孔中的数字PCR反应。其他实施方案可以使用其他反应，例如测序反应（例如通过大规模平行测序平台，包括但不限于Illumina GenomeAnalyzer、Roche454、Life Technologies SOLiD、Pacific Biosciences单一分子实时测序或Ion Torrent）、引物延伸反应、质谱、使用纳米孔的分析、光学方法或者与荧光或其他探针杂交。因此，数据可以包括由数字PCR孔得到的荧光信号、由测序孔中DNA分子的至少一部分而获得的测序标签、或者由此类反应得到的其他数据。

由反应得到的数据包括第一组定量数据和第二组定量数据，其中第一组定量数据表明在基因座处的突变等位基因的第一量，第二组定量数据表明在基因座处的正常等位基因的第二量。可以以多种方式测量基因座处特定等位基因的量，例如，通过特定等位基因为阳性的孔的总数，计数包含特定等位基因并与基因座比对（使用参照基因组）的测序标签的数量，以及测序核苷酸（碱基对）的数量或者测序核苷酸（碱基对）的累积长度，其中所述的核苷酸包括特定的等位基因并与基因座比对。

在步骤320中，由第一量和第二量确定参数。参数表上第一量和第二量之间的相对量。参数可以为例如第一量与第二量的简单的比值，或者第一量与第二量加上第一量的比值。在一个方面中，各个量可以为函数或分离函数的自变量，其中比值可以取自这些分离函数。本领域的技术人员将理解不同的合适参数的数量。例如，参数可以为血浆样品中突变等位基因的数量与突变等位基因和野生型等位基因的总数的比值，表示为P_r。

在步骤330中，获得生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf。百分率Pf提供了在母本样品中相对于母本DNA有多少胎儿DNA的量度。如果百分率Pf较高，则继承的等位基因的过度表达将变得更多。百分率可以表示为0至1之间的分数，其中1为100%。

在步骤340中，计算用于确定胎儿在基因座处是否继承了突变等位基因的截断值。第一截断值至少衍生自1/(2-Pf)的第一比例。根据由步骤320得到的参数的公式化的方式，如果突变等位基因是继承的，则比例1/(2-Pf)可以等于预计的第一量与第二量的比值。可以将预计值输入统计学函数中，从而确定截断值。可以使用许多不同类型的方法来确定截断值，例如SPRT、假阳性率、置信度区间以及受试者操作特征（ROC）曲线分析。

在步骤350中，计算用于确定胎儿在基因座处是否继承了正常的等位基因的第二截断值。第二截断值至少衍生自(1-Pf)/(2-Pf)的第二比例。

在步骤360中，将参数与第一截断值和第二截断值中的至少一者相比较，从而确定胎儿是否继承了突变等位基因或正常等位基因的分类。如上文所述，分类可以包含受影响的（继承突变）和未受影响的（继承正常），并且还可以包含未分类的。此外，分类还可以包含精确性的可能性，例如可以通过多少参数超过（高于或低于）截断值来确定精确性。在一个实施方式中，分类可以为得分，该得分将在后期由例如医生来解释。

显示等位基因的量的数据可以得自相连的等位基因。与突变等位基因或正常等位基因相连的等位基因可以用于替代正常的和突变等位基因。例如，在与突变核酸序列连锁的多态位点处的等位基因可以为与突变核酸序列位于相同的母本单倍型上的等位基因，其中多态位点和突变核酸序列之间的重组概率低于某值，例如1%。因此，多态位点可以提供相同或相似的定量数据作为直接测量突变等位基因。另一个实例，在与正常核酸序列连锁的多态位点处的等位基因可以为与正常核酸序列位于相同的母本单倍型上的等位基因，其中多态位点和突变核酸序列之间的重组概率低于某值，例如1%。

A.使用了PCR和血浆的实例

如上文所提及，数字PCR可以用作用于鉴别DNA片段的方法，其中所述的DNA片段包含突变的等位基因或正常的等位基因。在数字PCR中，样品被分成多个区间（例如孔和珠）。平均起来，每个区间包含不到一个等位基因（两个等位基因的任一者）。因此，阳性孔可以计数为单一的，而非包含等位基因的片段。

图4示出了根据本发明的实施方案的方法400，其用于确定男性胎儿是否继承了X连锁的突变。数字PCR用于确定突变等位基因的比例和胎儿DNA的百分率。胎儿DNA百分率用于确定突变等位基因的比例待比较的截断值，因此，提供了男性胎儿是否继承了突变的分类。由于突变等位基因的比例被确定，所以这些实施方案可以称为RMD方法。

如所示，对于各个母本血浆DNA样品而言，通过数字PCR确定突变DNA比例（P_r）和胎儿DNA百分率Pf，但是可以使用能够鉴别某些序列的其他反应。在左侧（方法401）提供了用于确定P_r的步骤，而在右侧（方法402）为用于确定胎儿DNA浓度份数Pf的步骤。如所示，使用靶向母本携带的突变的实时PCR检验来确定P_r，而对于同源的ZFY和ZFX基因区域，使用实施PCR检验来确定胎儿DNA百分率Pf。

在步骤410中，制备PCR混合物。如所示，就两种测量而言，混合物是不同的。对于P_r测量（方法401）而言，混合包含PCR引物，从而在包含待测试的基因座的X染色体上扩增区域。此外，混合物还包含用于鉴别具有野生型等位基因的DNA片段的存在情况的荧光探针，以及用于鉴别具有突变等位基因的DNA片段的存在情况的荧光探针。对于Pf测量（方法402）而言，混合物包含用于ZFY和ZFX基因区域的引物。此外，混合物还包含用于鉴别DNA片段（包含得自ZFX基因的序列）的存在情况的荧光探针，以及用于鉴别DNA片段（包含得自ZFY基因的序列）的存在情况的荧光探针。

在步骤420中，将反应混合物加载到PCR仪中。在一个实施方案中，在微流体数字阵列(Fluidigm)中实施数字PCR，所述的阵列由12个平板构成，每个平板进一步分隔成765个反应室。使用6个平板（即，765x6=4590个室）分析各个DNA样品（即，一个样品用于Pr，一个样品用于Pf）。PCR混合物首先可以人工加入到各个平板的进样口中。然后，通过Integrated Microfluidics Circuit Controller(Fluidigm)，在各个平板中以自动化的方式将混合物等分至765个室中。各个室均的最终反应体积为6nL。母本血浆中的无细胞DNA浓度通常极低，使得平均每个室中存在不到1个模板分子。因此，模板分子在室中的分布满足泊松分布。对其他样品而言，人们可以必须在分析之前稀释DNA样品。此外，对于本领域的技术人员而言显而易见的是可以使用本领域的技术人员所公知的方法来实施数字PCR，例如微流体芯片、纳升PCR微板系统、乳液PCR（包含RainDance平台）、polony PCR、滚环扩增、引物衍生以及质谱。

如P_r测量所示，包含具有野生型等位基因的DNA片段的孔（室）以蓝色显示，而包含具有突变等位基因的DNA片段的孔以红色显示。不包含模板DNA分子（即，不具有探针所适用的等位基因）的孔简单以白色显示。相似地，对于Pf测量而言，包含ZFX基因的孔以蓝色显示，而包含ZFY基因的孔以红色显示。

在步骤430中，例如，在BioMark System(Fluidigm)上实施实时PCR。通过扩增DNA区域的一系列循环来处理各个孔，其中在相应的混合物中所述的DNA区域与引物相应。由于大部分的室包含0或1个模板DNA分子，所以由孔得到的扩增产物来源于1个模板DNA分子。

在步骤440中，计数阳性PCR扩增的室的数量。就方法401而言，可以计数野生型等位基因为阳性的室的数量，并且可以计数突变等位基因为阳性的室的数量。就方法402而言，可以计数ZFX基因为阳性的室的数量，并且可以计数ZFY基因为阳性的室的数量。此外，在各个方法中，还可以鉴别两种等位基因均为阳性的室的数量。可以以多种方式进行阳性室的检测，例如检测荧光信号（例如每个等位基因将发出不同的颜色信号）。例如，包含ZFX基因的室可以发出蓝色荧光信号，而包含ZFX基因的孔可以发出红色荧光信号。

在步骤450中，使用在步骤440中计数的相应数量来计算突变DNA比例（P_r）和胎儿DNA百分率Pf。例如，突变等位基因的比例可以计算为突变等位基因为阳性的室的数量除以阳性孔的总数。另一实例，分母可以为仅对一个等位基因是阳性的室的总数。不适用于计数的大致数量有关的比值，所述的值可以为它们本身的浓度，从而有效地将分子和分母除以上述任何一个值。相似的值可以用于使用等式[(2Y)/(X+Y)]*100%的来计算胎儿DNA百分率，其中Y为ZFY基于的测量量（例如阳性室的计数或阳性室的比例），而X为ZFX基于的测量量。

由于每个反应孔中存在少于1个的模板分子，所以分布到各反应室中的模板分子的实际数量满足泊松分布。因此，可以使用等式[-ln((N-P)/N)]*N来泊松校正任何等位基因的室的数量，其中N为所分析的反应室的总数量，P为等位基因阳性的室的数量，而ln为自然对数。然后，按照与上文所述相似的方式来使用Poission校正的值，从而确定比例P_r和胎儿DNA百分率Pf。

在步骤460中，突变DNA比例（P_r）和胎儿DNA百分率Pf用于实施男性胎儿是否继承了突变或者未继承的分类。如方法300所述，可以由胎儿DNA百分率Pf来确定截断值，例如在步骤340和350中。此外，截断值还可以衍生自（其包括等于）平均参照模板浓度（m_r），例如对野生型等位基因为阳性的室的经验测量百分率可以用于确定在步骤460中使用的截断值。该策略可以进一步减少在可以进行可靠的分类之前所需要的测试的量。这与血浆核酸分析是特别相关的，其中在所述的分析中，模板的量通常是有限的。

B.SPRT

SPRT为一种在数据累积时允许两种概率性的假设被比较。换言之，其为一种统计学方法，从而将数字PCR的结果显示为对突变等位基因或正常等位基因的相位差来进行分类。该方法具有减少待分析的孔的数量的优点，从而得到给定的统计能力和精确性。

在示例性的SPRT分析中，试验结果对2种备选的假说进行检验。当突变等位基因过度呈现时，第一备选假说被接收。当突变等位基因呈现不足时，第二备选假说被接收。测量的P_r将与2个截断值中的至少一者相比较，从而接受第一或第二备选假说。如果没有假说被接受，则样品被标记为未分类的，其意味着所观察的数字PCR结果不足以以所需的统计置信度将样品分类。可以收集更多的数据来获得所需的统计置信度。

一对曲线（其取决于所收集的数据的量）可以定义用于接收或拒绝假设的概率边界（截断值）（Zhou W,Galizia G,Lieto E,et al.,NatBiotechnol.,19:78-81(2001);Zhou W,Goodman SN,Galizia G,et al.,Lancet.,359:219-225(2002)）。对于用于分类胎儿基因型的给定总数量的阳性反应（x-轴）而言，SPRT曲线描绘了所需的P_r（y-轴）。如果试验P_r落入上边界以上则接受假设（i），或者如果试验P_r落入下边界以下，则接受假设（ii）。可以使用水平改变的统计置信度（例如调节至阈值概率比为8）来确定用于计算SPRT边界的等式。在一个方面中，SPRT曲线的截断值是样品特异性的。截断值取决于上文所述的胎儿DNA浓度份数（胎儿DNA百分率）。此外，对于给定组数的反应，截断值还可以取决于每个PCR孔的平均参照模板浓度（m_r）（Lo YMD et al.,Proc Natl AcadSci U S A.2007;104:13116-13121(2007);Lun FMF,Tsui NBY,Chan KCA,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.,105:19920-19925(2008)）。参照模板可以指在样品中显示出较少的阳性扩增计数的等位基因。

SPRT可以提供这样的优点，对于给定水平的置信度而言，需要比其他统计学方法更少量的测试。实际上，一旦所需量的数据已经被累积，SPRT允许接受或拒绝任一种假设，因此减少了不必要的额外的分析。这种特征与血浆核酸的分析是特别相关的，血浆核酸的分析通常以低浓度呈现，其中可利用的模板分子的数量是有限的。除了严格的分类以外，分类还可以包括精确度。例如，通过与极端值相比较而得到的分类可以提供：样品以某一百分率显示核酸序列失衡的可能性，或者相当地提供：所确定的失衡精确至某一百分率或其他值。

对于使用SPRT的实施方案而言，人们可以使用El Karoui at al的用于计算SPRT曲线的上边界和下边界的等式（El Karoui N,Zhou W,Whittemore AS,Stat Med.25:3124-3133(2006)）。此外，可以通过调节等式中阈值概率比来改变优选用于接受第一或第二假设的统计置信度水平。阈值概率比为8显示在癌症检测方面提供了区别具有等位基因失衡和不具有等位基因失衡的令人满意的性能。因此，在一个实施方案中，用于计算SPRT曲线的上边界和下边界的等式为：

上边界=[(ln8)/N–lnδ]/lnγ

下边界=[(ln1/8)/N–lnδ]/lnγ

其中δ=(1–θ₁)/(1–θ₂)；

ln为表示自然对数的数学符号，即log_e；N=分子的总数量（即，所分析的突变分子和正常分子的总量），

如果第一备选假设是真实的（即，胎儿继承了突变等位基因），则θ₁=突变分子与突变分子和正常分子的总数量的比例；并且

如果第二备选假设是真实的（即，胎儿继承了正常的等位基因），则θ₂=突变分子与突变分子和野生型分子的总数量的比例。

就用于接受第一备选假设的θ₁的确定而言，假定样品得自携带男性胎儿的怀孕妇女，其中男性胎儿继承了突变（M）等位基因。θ₁被确定为1/(2-Pf)，其中Pf为样品中胎儿DNA的百分率。如本文所述，可以对统计学分布校正Pf，例如泊松分布。

就用于接收第二备选假设的θ₂的确定而言，假定样品得自携带男性胎儿的怀孕妇女，其中男性胎儿继承了正常的（N）等位基因。θ₂被确定为(1-Pf)/(2-Pf)。

在试验确定突变分子和野生型分子的数量之后，可以计算突变分子与突变分子和野生型分子的总数量的比例（P_r）。然后，可以将P_r值与截断值相比较，从而确定突变等位基因或野生型等位基因在母本血浆中是否是过度呈现的。

C.截断值的泊松校正

在使用数字PCR的一个实施方案中，确定每个孔的平均浓度（反应或反应混合物），并可以计算显示出所述的序列的所预计的孔的数量。该量可以表示为百分率、份数值或整数值。在一个实施方式中，在测量过程（例如数字PCR）的孔的反应混合物中，对正常（N）等位基因或突变等位基因的分布假定泊松分布。在其他实施方式中，使用其他分布函数，例如二项式分布。

泊松等式为：

其中n=每个孔中的模板分子的数量；P（n）=在特定的孔中n个模板分子的可能性；而m=在特定的数字PCR试验中，在一个孔中模板分子的平均数量。因此，在平均正常等位基因

因此，任何包含正常等位基因的至少1个分子的孔的可能性为：1–0.6065=0.3935。因此，预计～39%的孔包含正常等位基因的至少1个分子。在一个实施方案中，可以由试验得出的阴性孔的比例（例如使用数字PCR）来确定突变的或野生型的P(0)。然后，可以使用P(0)来计算每个孔中分子的平均数量（m）。接着，可以由每个孔中分子的平均数量来计算参数，例如突变平均值除以突变等位基因和正常等位基因的平均总数。考虑到阳性孔的数量与分子的数量之间的这种关系，备选的是校正阳性孔的数量，从而提供分子的数量（如上文所述，通过等式[-ln((N-P)/N)]*N进行，其中N为所分子的反应室的总数量，而P为等位基因为阳性的室的数量）。

可以通过本领域的技术人员已知的或者将要知道的多种机制来进行m_r的测量。在一个实施方案中，在数字PCR分析的试验方法中确定m_r值。由于m_r值与参照等位基因为阳性的孔的总数量之间的关系可以受到分布（例如泊松分布）的控制，所以可以使用下式由参照等位基因为阳性的孔的数量来计算m_r：

m_r=─ln(1-参照等位基因为阳性的孔的比例)

该方法为用于数字PCR试验的DNA样品中的m_r提供了直接且精确的评估。

所述的方法可以用于取得所需的浓度。例如，可以将所提取的样品核酸稀释成特定的浓度，例如每个反应孔1个模板分子。在使用泊松分布的实施方案中，不具有模板的孔的预计比例可以计算为e^-m，其中m为每个孔中模板分子的平均浓度。例如，在每个孔中平均浓度为1个模板分子的情况下，不具有模板分子的孔的预计比例给定为e^-1，即，0.37(37%)。剩余的63%的孔将包含1个或多个模板分子。通常，然后计数数字PCR运行中阳性孔的数量。信息性孔的定义以及数字PCR数据的解释的方式取决于应用。

在其他实施方案中，通过另一种定量方法来测量每个孔的平均浓度m_r，例如，定量实时PCR、半定量竞争性PCR以及使用质谱方法的实时-竞争性PCR。

在一个实施方式中，可以使用校正的浓度来计算突变等位基因与正常等位基因的比例。可以按照上文所述来计算各个等位基因的浓度m。然后可以确定各个等位基因的浓度，并且浓度的比例P_r可以用作试验得出的且分布校正的比例，从而与各个假设（例如继承突变的或野生型的）的预计比例相比较。例如，可以使用等式：（突变等位基因的浓度）/（突变等位基因+野生型等位基因的浓度）来计算测试样品的试验确定的P_r。在另一个实施方式中，使用了用于各个等位基因的孔的数量的比例。此外，还可以基于统计学分布来校正所预计的比例（截断值）。

D.说明

图5A示出了根据本发明的实施方案的表500，其示出了针对染色体X上的突变，突变等位基因与野生型等位基因之间的剂量失衡。为了说明所述的计算，使用了包含总量为100的基因组当量DNA（具有10%的胎儿DNA）的母本血浆。就母本基因组而言，1个GE包含2个拷贝的等位基因，即，1个拷贝具有1个M和1个N等位基因。这提供了90个拷贝突变等位基因和90个拷贝的正常等位基因。就胎儿基因组而言，1个GE包含1个拷贝的X连锁等位基因，即，1个拷贝具有1个突变等位基因（M）或正常（N）等位基因。这提供了0或10个拷贝的各种等位基因，而这取决于哪个等位基因被胎儿所继承。

在表500中，上面一行对应于继承了正常等位基因的胎儿，因此突变等位基因与正常等位基因的比值小于1。在下面一行中，胎儿继承了突变等位基因，因此突变等位基因与正常等位基因的比值大于1。

E.缺失、扩增、插入和倒位

方法300和400可以在除了标准的SNP以外的其他情况下使用。实施方案可以进一步应用于非侵入性地检测与缺失、扩增（例如重复）、插入和倒位有关的胎儿突变，例如大的DNA节段。此类突变的实例与X连锁的疾病有关，例如Duchenne型肌营养不良、Becker型肌营养不良以及鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症。所述的方法将通过靶向在扩增的（例如重复的）DNA节段之间或者在倒位的和相邻的正常DNA节段之间的缺失序列重新加入后的连接来检测突变等位基因。然后，使用本文所述的方法通过正常与突变等位基因之间的剂量失衡来推断胎儿的基因型。

图5B示出了当怀孕的受试对象在所关注的基因座处是杂合的时，用于检测扩增的第一方案。就第一染色体上的扩增而言，其中扩增的等位基因B不同于未扩增的等位基因A，对于扩增的等位基因B的多个拷贝B1和B2，将存在不同的连接。这是因为扩增的拷贝B1和B2将位于第一染色体上的不同位置处。如果其中的一种连接是独特的（例如，在B的开始或者在B2的末端处的连接是独特的，而在B-B1和B1-B2之间的连接是相同的），则独特的连接可以用作用于与其他染色体上的正常等位基因相比较的突变等位基因。按照这种方式，可以按照与步骤340和350中相同的方式来衍生截断值。备选地，可以使用扩增的等位基因B（即，为B、B1和B2）的所有例子，而与在第一染色体中的位置无关。在此类实施方案中，θ₁=(1+n)/(2+n-Pf)，而θ₂=[(1+n)(1-Pf)]/[2+n-Pf(1+n)]，其中n为额外拷贝的数量（如所示，n=2），其中n为等于或大于0的整数。此外，这些公式还可以写为θ₁=k/(1+k-Pf)和θ₂=[k(1-Pf)]/[1+k-kPf)]，其中k为突变染色体上的突变等位基因（其可以为新形成的连接）的拷贝数量，其中k为等于或大于1的整数。

此外，对于常染色体上的突变而言，还可以以与用于RMD分析相似的方式使用连接，但是必须调节θ₁和θ₂的值。例如，如果胎儿继承了扩增突变，则样品具有与母亲相同的比值，前体条件是由父亲继承的染色体为正常的染色体。在这种方案中，θ₁值为k/(k+1)，其中k为通过扩增突变连接的额外的连接数量，并且额外的连接用作突变等位基因（因此，对于重复或缺失而言，存在1个突变等位基因，而对于三倍扩增而言，存在2个突变等位基因等等）。如果胎儿由母亲继承了正常的染色体，则θ2值为k(1-Pf)/[k+1+(1-k)Pf]。

图5C示出了当怀孕的受试对象在所关注的基因座处是纯合的时，用于检测扩增的第二方案。当扩增的等位基因和非扩增的等位基因相同（如所示为A）时，2个连接510将是相同的（对于正常位置处的2个等位基因而言），而额外拷贝的等位基因的额外（新的）连接520将是不同的，这是因为这些额外的等位基因将在不同的基因组位置处。这些额外的连接可以用作突变等位基因，而正常的连接510可以用作正常的等位基因基因。对于额外的等位基因而言，人们可以使用额外连接520的仅仅一个连接（对于重复而言，仅存在1个额外的连接）。在此类实施方案中，θ₁=1/(3-Pf)；而θ₂=(1-Pf)/(3-2Pf)。注意，由于仅仅使用了1个额外的连接，所以在此类公式中未使用额外拷贝的量。

如果存在多于1个额外拷贝的A，则所使用的额外连接应该选择是独特的（例如，在A的最后扩增的拷贝之后的连接）。或者，人们可以总计所有的（或者多于1的一些数量）额外的连接，并与正常位置处的2个等位基因的连接相比较。在此类实施方案中，θ₁=n/(n+2-Pf)；而θ₂=n(1-Pf)/[n+2-Pf(n+1)]，其中n为所使用的新连接520的数量。注意，由于仅仅使用了多于1个的额外的连接，所以在此类公式中使用额外拷贝的量。此外，对于常染色体上的突变而言，可以以与用于RMD分析相似的方式使用连接，但是必须调节θ₁和θ₂的值。例如，如果胎儿继承了扩增突变（扩增），则样品具有与母亲相同的比值（例如对于重复而言为1:2），前体条件是由父亲继承的染色体不具有突变。在这种方案中，θ₁值为n/(n+2)，其中n为通过扩增突变连接的额外的连接数量。如果胎儿由母亲继承了正常的染色体，则θ₂值为n(1-Pf)/(n+2-nPf)。用于检测缺失和扩增的另一个方法如下文所述。

IV.目标区域与参照区域

在上文所述的RMD方法中，当突变为缺失、扩增、插入或倒位时，不同的连接可以用作等位基因。另一种方法（其适用于缺失和扩增(例如重复)突变）为将由目标区域（即，被缺失或扩增的区域）形成的分子的量与由参照区域形成的分子的量相比较。如果未被缺失或扩增，则未受缺失（或扩增）影响的染色体X上的任何基因组基因座可以用作参照基因座/区域，例如，ZFX基因。

由目标区域得到的分子的数量与由参照区域得到的分子的数量的比值（R）（或者表示相对量的一些其他参数）可以用于确定突变是否是继承的。在携带缺失突变的未怀孕妇女中，由于仅一半的X染色体（携带正常等位基因的那些染色体）贡献了血浆中目标分子的量，所以R的预计值为0.5。当携带这些缺失突变的妇女怀有男性胎儿时，由于由男性胎儿的1个特别X染色体对DNA的贡献，所以R的预计值偏离0.5。预计的R的偏离取决于突变是否为缺失或扩增。

图6为示出了方法600的流程图，方法600用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁的突变。孕妇在X染色体上的目标区域处为突变和正常等位基因杂合的。突变为目标区域的缺失或扩增。

在步骤610中，收到由多个反应得到的数据。该数据可以与在方法300的步骤310中收到的相同的类型。各个反应均涉及由生物学样品得到的一种或多种核酸分子，所述的生物学样品包含由孕妇得到的以及由男性胎儿得到的核酸分子。该数据包括第一组定量数据和第二组定量数据，其中第一组定量数据表明得自目标区域的核酸分子的第一量，第二组定量数据表明由在X染色体上的参照区域得到的核酸分子的第二量。可以以多种方式计算所述的量，例如如上文步骤310中所述。

在步骤620中，由第一量和第二量确定参数。该参数表示第一量和第二量之间的相对量。在一个实施方案中，参数为第一量与第二量的比值T。其他实施方案可以按照本文所述来使用参数，例如第一量除以第一量与第二量的总和。

在步骤630中，获得生物学样品中的胎儿核酸分子的百分率Pf。可以按照本文所述来计算百分率Pf。此外，可以由用于计数胎儿特有的分子的分布校正值（例如泊松校正的）来确定百分率Pf。

在步骤640中，计算用于确定胎儿是否继承了突变的第一截断值。第一截断值取决于百分率Pf。用于计算第一截断值的特定等式取决于突变是否为缺失或扩增。

在步骤650中，计算用于确定胎儿是否继承了正常的等位基因的第二截断值。第二截断值取决于百分率Pf。用于计算第一截断值的特定等式取决于突变是否为缺失或扩增。

在步骤660中，将参数与第一截断值和第二截断值中的至少一者相比较，从而确定胎儿是否继承了突变的等位基因或正常的等位基因的分类。分类可以与步骤360为相同的类型，例如受影响的、未受影响的或者未分类的（原始得分）。

图7为表700，其示出了针对染色体X上的缺失和重复突变，在目标和参照基因座之间的剂量失衡。表700示出了等位基因失衡程度的计算。当与携带相同的缺失突变的未怀孕妇女的R相比较时，R的升高或降低分别表示正常胎儿或受影响的胎儿。相反，在携带部分扩增（例如如表700中所示的重复）的未怀孕妇中，由于由突变等位基因贡献的二倍剂量的目标分子，R的预计值为1.5。当携带这种重复的妇女是怀孕的，则当与携带相同重复突变的未怀孕妇女的R相比较时，R的升高或降低分别表示受影响的或正常的胎儿。

在各种方案中，R的升高或降低的程度取决于样品中胎儿DNA浓度份数（Pf）。在一个实施方案中，SPRT分析可以用于确定与携带相同突变的未怀孕妇女相比，R是否为统计学显著升高或降低。用于计算SPRT的上边界和下边界（截断值）的等式可以具有相似的结构：

上边界=[(ln8)/N–lnδ]/lnγ;

下边界=[(ln1/8)/N–lnδ]/lnγ

其中δ=(1–θ₁)/(1–θ₂)；

ln为表示自然对数的数学符号，即log_e；N=突变分子和参照分子的总数量，

如果第一备选假设是真实的（即，胎儿继承了突变等位基因），则θ₁=目标分子与参照分子的比值（R1）（即，当与携带相同突变的未怀孕妇女的R值相比较时，R1是升高的）；

如果第二备选假设是真实的，则θ₂=目标分子与参照分子的比值（R2）（即，当与携带相同突变的未怀孕妇女的R值相比较时，R2是升高的）。

θ₁描述了这样的情况，其中当与携带相同突变的未怀孕妇女的相应比值相比较时，目标分子的量与参照分子的量的比值是升高的，例如，对于缺失突变而言，所述的比值为正常的情况，或者对于重复突变而言，所述的比值为突变的情况。相似的，θ₂可以描述这样的情况，其中当与携带相同突变的未怀孕妇女的相应比值相比较时，目标分子的量与参照分子的量的比值是升高的，例如，对于缺失突变而言，所述的比值为突变的情况，或者对于重复突变而言，所述的比值为正常的情况。

在一个实施方案中，对于缺失突变而言，当样品被假定为得自携带继承了正常（N）等位基因的男性胎儿的怀孕妇女时，计算θ₁。θ₁被确定为1/(2-Pf)。当样品被假定为得自携带继承了突变（例如，具有缺失突变的染色体X）的男性胎儿的怀孕妇女时，计算θ₂。θ₂被确定为(1-Pf)/(2-Pf)。

在另一个实施方案中，对于重复突变而言，当样品被假定为得自携带继承了突变（即，具有重复突变的染色体X）的男性胎儿的怀孕妇女时，计算θ₁。θ₁被确定为(3-Pf)/(2-Pf)。当样品被假定为得自携带继承了正常（N）等位基因的男性胎儿的怀孕妇女时，计算θ₂。θ₂被确定为(3-2xPf)/(2-Pf)。用于任何水平的扩增的通式为：θ₁为(n+2-Pf)/(2-Pf)，而θ₂为[n+2-Pf(n+1)]/(2-Pf)，其中n为扩增阶段的额外拷贝数量。

V.确定胎儿的百分率

如上文所提及，某些等位基因（例如是染色体X特有的、以及胎儿特有的序列）的可能性P(n)可以用于调节样品中的胎儿DNA的百分率（Pf）。然后，这种经调节的Pf可以用于计算用于确定突变等位基因或野生型等位基因是否是继承的截断值。

图8为示出了根据本发明的实施方案的方法800的流程图，方法800用于在由怀有胎儿的女性得到的生物学样品中获得胎儿核酸分子的百分率Pf。生物学样品包含由孕妇得到的以及由胎儿得到的核酸分子。

在步骤810中，收到由多个反应得到的数据。各个反应均涉及由生物学样品得到的多种核酸分子。在一个方面中，反应可以为任何类型，其中如果一个或多个等位基因存在于反应中，则对于特定的等位基因而言，所述的反应被认为是阳性的。

在步骤820中，在反应中检测第一等位基因。第一等位基因由母亲和胎儿在基因座处所共有，其中孕妇是纯合的，而胎儿是杂合的或半合的。在一个实施方案中，第一等位基因为X染色体。

在步骤830中，根据大量的第一等位基因的阳性反应来计算第一等位基因的校正浓度Px。在多个反应中，对第一等位基因的预计统计学分布来校正Px。例如，可以根据泊松分布来校正Px。在一个实施方案中，计算第一等位基因的第一校正浓度，其中所述的第一等位基因由母亲和胎儿所共有，其中母亲是纯合的，而胎儿是杂合的或半合的，例如[-ln((N-P1)/N)]*N，其中N为所分析的反应室的总数量，P1为对第一等位基因为阳性的室的数量，而ln为自然对数。

在步骤840中，检测胎儿特有的第二等位基因。在一个实施方案中，第二等位基因位于Y染色体上，其中胎儿为男性胎儿。在另一个实施方案中，胎儿特有的等位基因是父本遗传的常染色体上的等位基因。在另一个实施方案中，胎儿特有的等位基因包含胎儿特有的甲基化标志物。

在步骤850中，根据大量的第二等位基因的阳性反应来计算第二等位基因的校正浓度Py。在多个反应中，对第二等位基因的预计统计学分布来校正Px。例如，可以根据泊松分布来校正Px。例如，可以根据泊松分布来校正Py。在一个实施方案中，可以按照[-ln((N-P1)/N)]*N来计算胎儿特有的等位基因（其中胎儿是杂合的或半合的）的第二校正浓度，其中N为所分析的反应室的总数量，P2为对胎儿特有的等位基因为阳性的室的数量，而ln为自然对数。

在步骤860中，使用[(2Py)/(Px+Py)]来计算生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf，所述的等式可以提供份数值。可以使用等式[(2P2)/(P1+P2)]*100%来计算胎儿DNA百分率。

VI.实施例

由the Royal Free Hospital,London,UK募集到血友病携带者且怀有男性胎儿的7名妇女（3名位血友病A携带者，4名位血友病B携带者）。此外，我们还募集到20名怀孕妇女（非血友病携带者），每位都怀有单独的健康男性胎儿。其中的10名妇女是由the Royal Free Hospital,London,UK募集到的，而另外10名妇女是由the Prince of Wales Hospital,HongKong募集到的。多种情况的临床信息示于图9的表900中，其示出了7名血友病突变携带者的怀孕妇女的临床信息。

所有妇女均募集由知情同意书。伦理学批准由各个机构委员会同意。将由怀孕妇女得到的10毫升外周血样品收集到EDTA中。对于5名怀孕的血友病携带者而言，在她们怀孕期间在2次场合下取得外周血样品（表900）。在本研究中，怀孕的血友病携带者均未具有侵入性的产前检验。在生产后证实胎儿性别和血友病的状态。此外，对于在Hong Kong募集的10名未受影响的怀孕妇女而言，在生产后收集胎盘组织。

在4℃、在1600g下，我们将血液样品离心10min。在4℃、在16000g下，将血浆部分再次离心10min。将母本血浆和白细胞层样品储存在-20℃下，直到进一步处理。对在UK中收集的所有样品进行处理并就地冷冻储存，然后在干冰上船运至香港。我们使用QIAamp DSP DNA BloodMini Kit(Qiagen)，根据制造商提供的说明书由母本血浆提取DNA。使用Illustra DNA Extraction Kit(GE Healthcare)，根据制造商提供的说明书提取白细胞层DNA。

rs6528633SNP和血友病突变的基因分型

为了估测RMD方法的可行性，我们研究了染色体X上的SNP(rs6528633)。选择该SNP是为了达到说明的目的，并且可以使用其他SNP。分别使用由胎盘和母本白细胞层样品得到的DNA来确定胎儿和母本SNP基因型。根据之前所述，使用MassARRAY同源MassEXTEND(hME)检验(Sequenom)来进行基因分型（Tsui NBY,Chiu RWK,Ding C,etal.,Clin Chem.,51:2358-2362(2005);Tsui NBY,Chiu RWK,Ding C,et al.,Clin Chem.,51:2358-2362(2005)）。由怀孕的血友病携带者的外周血样品获得的基因组DNA用于血友病突变检测。对覆盖编码区的所有外显子、内含子/外显子边界、启动子和3'UTR进行PCR。使用Big Dye TerminatorsV1.1(Applied Biosystems)进行循环测序，并在Applied Biosystems3100Avant Genetic Analyser上进行分析。

用于母本血浆分析的数字RMD反应

根据本发明的某些实施方案，数字RMD的试验工作流程示于图4中。我们使用了之前所述的数字ZFY/X检验测量了母本血浆中胎儿DNA浓度的份数，所述的检验分别对位于染色体Y和X上的同源ZFY和ZFX基因座进行了定量（Lun FMF et al.,Clin Chem.,54:1664-1672(2008);LunFMF,Tsui NBY,Chan KCA,et al.,Proc Natl Acad Sci U SA.,105:19920-19925(2008)）。对于rs6528633SNP而言，设计具有2个等位基因特异性的TaqMan探针(Applied Biosystems)的实时PCR检验来区别2个SNP等位基因。对于处于血友病风险下的怀孕情况的突变而言，针对各个突变设计用于等位基因却别的实时PCR检验。各个检验均包含用于突变等位基因和野生型等位基因的2个等位基因特异性的TaqMan探针。引物和探针序列列于图10的表1000中，其示出了用于等位基因区别性检验的寡核苷酸序列和实时PCR。在其他实施方案中，可以通过使用在母本血浆中胎儿DNA和母本DNA之间具有差异性甲基化的序列来确定胎儿DNA浓度的份数（例如参见Chim SS et al.,Proc Natl Acad SciUSA.,102:14753-14758(2005);Chan KCA et al.,Clin Chem.,52:2211-2218(2006)）。

我们使用12.765Digital Arrays(Fluidigm)在BioMark System(Fluidigm)上实施数字PCR分析（Lun FMF et al.,Clin Chem.,54:1664-1672(2008)）。在上，12个面板上的6个面板用于各种DNA样品，其相应于4590个单个的PCR。使用2X TaqMan Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)建立用于1个样品（6个面板）的反应，反应体积为52μL。根据制造商的方案，使用图10的表1000中所列的引物和探针组合物来建立反应。各种反应混合物包含18.2μL的DNA样品。通过NanoFlex IFCController(Fluidigm)，反应混合物自动地加载到Digital Array上。在BioMark System(Fluidigm)上实施反应。开始反应：在50℃下持续2分钟，然后在95℃下持续10分钟，在95℃下持续15秒并进行45个循环，以及在检验特异性的退火温度（图10的表3）下持续1分钟。对于通过RMD使用得自4590孔数字PCR组的数据仍保持未分类的样品而言，实施额外的4590孔数字PCR组，直到进行基因型读取（genotype call）。

结果

用于X连锁的多态性的数字RMD的原理

多个实施方案可以使用数字PCR来测量在携带男性胎儿的杂合型怀孕妇女的血浆中突变等位基因和野生型等位基因的总量（母亲+胎儿衍生的）之间的浓度差异。由于男性胎儿具有单一的染色体X，则野生型和突变等位基因之间的相对浓度总是剂量失衡的（图2A）。突变等位基因的过度呈现或呈现不足分别表示受影响的或正常的胎儿。我们使用SPRT来检验剂量失衡。构建一对PSRT曲线（图2B）。具有在上方曲线以上或下方曲线以下的数据点的样品分别被分类为受影响的或正常的。由于不足的统计能力，具有两条曲线之间的数据点的样品未被分类，并实施额外的数字PCR。

针对染色体X上的SNP，非侵入性地确定胎儿的基因型

我们使用染色体X上的SNP（rs6528633(A/T多态性)）作为模型来估测用于确定染色体X上基因座的胎儿基因型的RMD方法的实践可行性。当前RMD分析与处于风险下的怀孕情况（即，对染色体X上的突变而言是杂合的并携带男性胎儿的怀孕妇女）有关。因此，我们研究了由10名怀孕妇女得到的血浆样品，其中所述的妇女对染色体X上的SNP而言是杂合的，并且携带男性胎儿。我们研发出等位基因差异数字实时PCR检验来测量各个样品中A-和T-等位基因的浓度。我们使用XFY/X检验进一步测量了胎儿DNA浓度的份数。数字RMD结果示于图11的表1100中，所述的表格示出了通过数字RMD得到的在母本血浆中对rs6528633的胎儿基因分型。

对于所有的情况而言，胎儿SNP基因型与SPRT分类是一致的。胎儿DNA浓度份数（在表1100中为胎儿%）在5%至24%的范围内。由此，结果证实数字RMD策略的可行性。

在DNA混合物中用于血友病突变检测的数字RMD

接着，我们使用用于血友病突变检测的数字RMD方法。我们研发出7种二重数字实时PCR检验方法来检验F8基因中的3个突变、F9基因中的4个突变以及它们相应的野生型对应物。我们通过构建人工DNA混合物来评估数字PCR检验的性能，其中所述的混合物模拟了母本血浆样品的组成，其中少部分的男性胎儿DNA成分处于大部分的母本DNA背景中。我们将由未受影响的男性胎儿得到的10%或20%的胎盘DNA与就相应突变而言为杂合的妇女得到的血细胞DNA相混合。图12示出了使用人工DNA混合物进行数字RMD检验的效果。人工混合物被构建为模拟了母本血浆中的胎儿和母本DNA的组成。如图12的表1200中所示，通过数字RMD分析在所有的DNA混合物中正确地检测到了胎盘DNA（其模仿了母本血浆中的胎儿DNA）的基因型。

母本血浆中胎儿血友病突变的检测

我们通过母本血浆DNA分析测试了针对血友病突变来检测胎儿基因型的数字RMD方法。我们对12份血浆样品实施数字PCR，其中所述的样品得自就致病突变而言是杂合的7名怀孕妇女（表900）。所有的情况都与男性胎儿相关。此外，我们还通过ZFY/X检验测量了母本血浆样品中的胎儿DNA浓度份数。数字RMD结果示于图13的表1300中，其显示了通过数字RMD非侵入性地检测母本血浆中的胎儿血友病突变。

在所有研究的情况中，通过SPRT算法正确地对胎儿基因型进行了分类（图14）。对于其中的3种情况(H26a,H25a和H12a)而言，胎儿DNA的比例低于10%。因此，突变等位基因和野生型等位基因之间的定量差异的长度太小，以至于不能使用由1个4590孔数字PCR组得到的数据进行分类。因此，实施额外的4590孔数字PCR组，直到可以进行分类。

此外，作为对照，我们还使用各种突变特异性的检验方法来研究由正常怀孕妇女得到的5份母本血浆样品。图15示出了由正常怀孕者得到的母本血浆样品的数字RMD结果。如图15的表1500所示，在大多数的情况下未检测到突变等位基因。对于35种所研究的母本血浆情况中的6种情况而言，包含突变等位基因的阳性孔占试验中阳性孔总数量的不到0.3%。这些阳性信号可能得自PCR过程中荧光探针的交叉杂交。然而，如此少数量的突变体阳性孔并不能将突变等位基因和野生型等位基因之间的等位基因比值歪曲到会改变SPRT的RMD分类的程度。

讨论

在本研究中，我们研发出了非侵入性产前诊断策略来直接检测在处于X连锁疾病（使用血友病作为实例）风险下的怀孕者中男性胎儿所携带的致病突变。通过使用用于染色体X上的基因座的数字RMD方法，在由7名怀孕的血友病携带者得到的所有12份所研究的母本血浆样品中，我们精确地鉴别出男性胎儿所继承的突变等位基因或野生型等位基因（表1300）。胎儿基因型可以早在怀孕期的第11周检测出来（表900），从而证明所述方法的早期诊断用途的潜力。此外，还可以使用利用了染色体X上的目标区域和参照区域的方法。

这种非侵入性产前突变检测方法可以与现有的非侵入性胎儿性别确定测试相结合，从而进一步减少需要侵入性诊断测试的处于风险下怀孕情况的数量。此外，受影响的胎儿的鉴别还有助于对不需要考虑侵入性产前测试的怀孕妇女进行的随后的产科管理。30%至40%的患有血友病的婴儿在分娩及生产过程中会发生出血性并发症（Kulkarni R,Lusher JM.,J Pediatr Hematol Oncol.,21:289-295(1999)）。滞产的生产以及困难的协助性生产对于所述的并发症而言是主要的风险因素（Kadir RA et al.,Haemophilia.,6:33-40(2000);Chi C et al.,Haemophilia.,14:56-64(2008)），并且应该避免受影响的胎儿的生产（Lee CA,Chi C,Pavord SR,et al.,Haemophilia.,12:301-336(2006)）。此外，推荐在具有附属血友病中心的三级单位生产受影响的胎儿，从而确保必要的专家和资源可利用于它们的管理（Lee CA,Chi C,Pavord SR,et al.,Haemophilia.,12:301-336(2006)）。近来，建议通过晚期妊娠羊膜腔穿刺进行产前诊断来帮助不愿意接受与早期产前测试有关的胎儿损失风险的父母适当地计划生产的方式和地点（Chi C,Kadir RA.,Obstetric Management.In:Lee CA,Kadir RA,Kouides PA,eds.Inherited Bleeding Disorders in Women,Chichester,WestSussex,UK:Wiley-Blackwell,122-148(2009)）。如果胎儿是未受影响的，则可以在地方妇产科单位中不具有任何限制的条件下来管理分娩和生产。然而，晚期妊娠羊膜腔穿刺也是侵入性的过程，并且与潜在的风险和并发症有关（Hodor JG,Poggi SH,Spong CY,et al.,Am J Perinatol.,23:177-180(2006);O'Donoghue K et al.,Prenat Diagn.,27:1000-1004(2007)）。在怀孕的妊娠晚期，胎儿DNA浓度是最高的（Lun FMF et al.,ClinChem.,54:1664-1672(2008)），因此，多个实施方案可以提供妊娠晚期羊膜腔穿刺的精确非侵入性备选方法来达到所述的目的。

VII.计算机系统

本文提及的任何计算机系统可以使用任何合适数量的亚系统。此类亚系统的实例示于图16的计算机仪器1600中。在一些实施方案中，计算机系统包括单一的计算机仪器，其中亚系统可以为计算机仪器的部件。在其他的实施方案中，计算机系统可以包括多个计算机仪器（每个为亚系统）以及内部部件。

图16所示的亚系统通过系统总线1675相互连接。示出与显示适配器1682偶联的其他亚系统，例如打印机1674、键盘1678、硬盘1679、监控器1676等。外部和输入/输出（I/O）装置（其与I/O控制器1671偶联）可以通过本领域已知的任意数量的手段（例如串行端口1677）与计算机系统连接。例如，串行端口1677或外部界面1681可以用于将计算机系统1600与诸如Internet、滑鼠输入装置或扫描器之类的广域网路连接。通过系统总线1675的相互连接允许中央处理器1673与各个亚系统连通，并由系统储存器1672或硬盘1679控制指令的执行，以及亚系统之间的信息交换。系统储存器1672和/或硬盘1679可以表现为计算机可读介质。本文提及的任何值都可以由一个部件输出至另一个部件，并可以输出给用户。

计算机系统可以包括例如通过外部界面1681或通过内部界面连接在一起的多个相同的部件或亚系统。在一些实施方案中，计算机系统、亚系统或仪器可以在网络上连通。在这种情况下，一个计算机可以被认为是一个客户端及另一个计算机的服务器，其中它们均可以为同一计算机系统的部件。客户端和服务器均可以包括多个系统、亚系统或部件。

应该理解的是，本发明的任意实施方案均可以使用硬件和/或使用计算机软件以模块或集成的方式以控制逻辑的形式实施。基于本文所提供的公开和教导，本领域的普通技术人员将了解并领会使用硬件以及硬件和软件的组合来实施本发明的实施方案的其他方式和/或方法。

本申请中所描述的任意软件部件或功能都可以作为使用例如传统或面向对象的技术、使用任何合适的计算机语言（例如Java,C++或Perl）通过处理器执行的软件编码来实施。软件编码可以在用于储存和/或传输的计算机可读介质上以一系列指令或命令的形式储存，合适的介质包括随机储存器（RAM）、只读储存器（ROM）、磁介质（例如硬盘机或软盘）、或光学介质（例如光盘(CD)或DVD(数字通用光盘)）、闪存等。计算机可读介质可以为此类储存或传输装置的任意组合。

此外，此类程序还可以使用适用于通过有线、光学和/或无线网络（遵守多种协议，包括Internet）传输的载波信号来编码和传输。由此，可以使用由此类程序编码的数字信号来创建根据本发明的实施方案的计算机可读介质。使用程序编码所编码的计算机可读介质可以使用相容的装置包装，或者由其他装置分开提供（例如通过Internet下载）。任意此类的计算机可读介质可以属于或者在单一的计算机程序产品（例如硬盘机、CD或整个计算机系统）内，并且可以在系统或网络内的不同计算机程序产品上或该产品内存在。计算机系统可以包括监控器、打印机或用于向用户提供本文所提及的任意结果的其他合适的显示器。

本文所述的任何方法可以使用计算机系统（包括处理器）全部或部分实施，所述的系统可以被配置成实施多个步骤。因此，多个实施方案可以定向于计算机系统，该系统被配置成潜在地使用实施各个步骤或各组步骤的不同部件来实施本文所述的任意方法的步骤。尽管本文所述的方法以编号的步骤呈现，但是这些方法的步骤可以同时或以不同的次序实施。此外，这些步骤的一部分可以与其他方法的其他步骤的一部分一起使用。此外，步骤的全部或一部分可以是任选的。此外，任意方法的任意步骤可以使用模块、电路或用于实施这些步骤的其他手段来实施。

在不脱离本发明实施方案的精神和范围的条件下，特定实施方案的具体详情可以以任何合适的方式结合。但是，本发明的其他实施方案可以定向于与各单一的方面或这些单一方面的特定组合有关的特定实施方案。

为了进行说明和描述，已经呈现本发明的示例性实施方案的上述描述。无意于穷举或将本发明限定于所述的精确形式，并且根据上文的教导，许多修改和变体也是可行的。选择并描述多个实施方案，以便最好地说明本发明的原理及其实践应用，由此使本领域的技术人员能够在各种实施方案以及各种修改（其适用于所考虑的特定用途）中最好地利用本发明。

除非特异作出相反的说明，描述“a”、“an”或“the”意指“一个或多个”。

就所有的目的而言，上文提及的所有专利、专利申请、公开和描述在此以引用方式全文并入本文。这些文件均未确认为现有技术。

Claims

1.一种用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁突变的方法，其中所述孕妇在所述X染色体的基因座处是突变等位基因和正常等位基因杂合的，所述方法包括：

接收由多个反应得到的数据，每个反应都涉及由生物学样品得到的一种或多种核酸分子，所述生物学样品包括由所述孕妇得到的以及由所述男性胎儿得到的核酸分子，其中所述数据包括：

第一组定量数据，其表明所述基因座处的所述突变等位基因的第一量；以及

第二组定量数据，其表明所述基因座处的所述正常等位基因的第二量；

由所述第一量和所述第二量确定参数，其中所述参数表示所述第一量和所述第二量之间的相对量；

获得所述生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf；

计算用于确定所述胎儿在所述基因座处是否继承了所述突变等位基因的第一截断值，其中所述第一截断值至少衍生自k/(1+k-Pf)的第一比例，其中k为所述孕妇的突变染色体上的突变等位基因的数量，k为等于或大于1的整数；

计算用于确定所述胎儿在所述基因座处是否继承了所述正常等位基因的第二截断值，其中所述第二截断值至少衍生自[k(1-Pf)]/[1+k-kPf)]的第二比例；以及

将所述参数与所述第一截断值和第二截断值中的至少一者相比较，从而确定所述胎儿是继承了所述突变等位基因还是所述正常等位基因的分类。

2.如权利要求1所述的方法，其中将所述参数与所述第一截断值和第二截断值相比较。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述分类包括疾病状态、非疾病状态和不可分类的。

4.如权利要求1至3的任意一项所述的方法，其中获得所述百分率Pf包括：

使用在所述多个反应中分子的预计统计学分布来校正所述生物学样品中胎儿核酸分子的试验得出的百分率。

5.如权利要求1至4的任意一项所述的方法，其中获得所述百分率Pf包括：

在所述反应中检测第一等位基因，其中所述第一等位基因在这样的基因座处由母亲和胎儿所共有，其中在该基因座处，所述孕妇是纯合的，而所述胎儿是杂合的或半合的；

使用等式[-ln((N-P1)/N)]*N来计算泊松校正的浓度Px，其中N为所分析的反应的总数量，P1为对所述第一等位基因为阳性反应的数量，而ln为自然对数；

在所述反应中检测第二等位基因，其中所述第二等位基因是所述胎儿特有的；以及

使用等式[-ln((N-P2)/N)]*N来计算泊松校正的浓度Py，其中N为所分析的反应的总数量，而P2为对所述第二等位基因为阳性反应的数量。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第二等位基因在染色体Y上。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述第一等位基因在染色体X上。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述胎儿特有的等位基因为常染色体上父本遗传的等位基因。

9.如权利要求5所述的方法，其中所述胎儿特有的等位基因包括胎儿特有的甲基化标志物。

10.如权利要求5所述的方法，进一步包括：

按照[(2Py)/(Px+Py)]*100%计算Pf。

11.如权利要求1至10的任意一项所述的方法，其中使用序列概率比检验（SPRT）来确定所述第一和第二截断值，从而确定所述胎儿是继承了所述突变核酸序列还是所述正常核酸序列。

12.如权利要求1至11的任意一项所述的方法，其中在与所述突变核酸序列连锁的多态位点处的等位基因为与所述突变核酸序列位于相同的母本单倍型上的等位基因，并且其中所述多态位点与所述突变核酸序列之间的重组概率低于1%。

13.如权利要求1至11的任意一项所述的方法，其中在与所述正常核酸序列连锁的多态位点处的等位基因为与所述正常核酸序列位于相同的母本单倍型上的等位基因，并且其中在所述多态位点与所述突变核酸序列之间的重组概率低于1%。

14.如权利要求1至13的任意一项所述的方法，其中所述反应包括以下反应的任意一种或多种：测序反应、光学分析、使用荧光探针的杂交或者纳米孔测序。

15.如权利要求1至13的任意一项所述的方法，其中反应为扩增反应。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述反应包括聚合酶链式反应。

17.如权利要求17所述的方法，其中所述平均浓度低于每个反应1个模板分子，并且其中泊松分布用于确定所述生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf。

18.如权利要求1至17的任意一项所述的方法，其中所述生物学样品为来自孕妇的血浆、血清或者全血。

19.一种用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁突变的方法，所述方法包括：

接收由多个反应得到的数据，每个反应都涉及由生物学样品得到的一种或多种核酸分子，所述生物学样品包括由所述孕妇得到的以及由所述男性胎儿得到的核酸分子，

其中所述孕妇对于所述X染色体上的基因座处的等位基因是纯合的，在突变X染色体上具有所述等位基因的扩增的突变，以及具有在所述基因座处具有正常拷贝的所述等位基因的正常X染色体，所述突变X染色体具有在所述基因座处正常拷贝的所述等位基因以及一个或多个额外拷贝的等位基因，

其中所述数据包括：

第一组定量数据，其表明由所述一个或多个额外拷贝的等位基因产生的额外连接的第一量；以及

第二组定量数据，其表明在2条X染色体上由所述正常拷贝的等位基因产生的正常连接的第二量；

获得所述生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf；

计算用于确定所述胎儿是否继承了所述突变X染色体的第一截断值，其中所述第一截断值至少衍生自n/(n+1-Pf)的第一比例，其中n为所述等位基因的额外拷贝的数量，n为等于或大于1的整数；

计算用于确定所述胎儿是否继承了所述正常X染色体的第二截断值，其中所述第二截断值至少衍生自[n(1-Pf)/[n+2-Pf(n+1)]的第二比例；以及

将所述参数与所述第一截断值和第二截断值中的至少一者相比较，从而确定所述胎儿是继承了所述突变X染色体还是所述正常X染色体的分类。

20.一种用于确定孕妇的男性胎儿是否具有X连锁突变的方法，其中所述孕妇在所述X染色体的目标区域处是突变和正常等位基因杂合的，其中所述突变是所述目标区域的缺失或扩增，所述方法包括：

第一组定量数据，其表明由所述目标区域得到的核酸分子的第一量；以及

第二组定量数据，其表明由所述X染色体上的参照区域得到的核酸分子的第二量；

获得所述生物学样品中胎儿核酸分子的百分率Pf；

计算用于确定所述胎儿是否继承了所述突变的第一截断值，所述第一截断值取决于所述百分率Pf；

计算用于确定所述胎儿是否继承了所述正常等位基因的第二截断值，所述第二截断值取决于所述百分率Pf；以及

将所述参数与所述第一截断值和第二截断值中的至少一者相比较，从而确定所述胎儿是继承了所述突变还是所述正常等位基因的分类。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述突变为扩增，其中所述第一截断值是基于这样的假定来确定的，所述假定为当与携带所述相同扩增突变的未怀孕妇女的所述第一量与所述第二量的比值相比较时，该相应的比值升高，并且所述第二截断值是基于这样的假定来确定的，所述假定为当与携带所述相同扩增突变的未怀孕妇女的所述第一量与所述第二量的比值相比较时，该相应的比值降低。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述突变为缺失，其中所述第二截断值是基于这样的假定来确定的，所述假定为当与携带所述相同缺失突变的未怀孕妇女的所述第一量与所述第二量的比值相比较时，该相应的比值升高，并且所述第一截断值是基于这样的假定来确定的，所述假定为当与携带所述相同缺失突变的未怀孕妇女的所述第一量与所述第二量的比值相比较时，该相应的比值降低。

23.如权利要求20所述的方法，其中所述突变为缺失，其中所述第二截断值至少衍生自1/(2-Pf)的第一比例，并且其中所述第一截断值至少衍生自(1-Pf)/(2-Pf)的第二比例。

24.如权利要求20所述的方法，其中所述突变为重复，其中所述第二截断值至少衍生自(3-Pf)/(2-Pf)的第一比例，并且其中所述第一截断值至少衍生自(3-2Pf)/(2-Pf)的第二比例。

25.如权利要求20至24的任意一项所述的方法，其中获得所述百分率Pf包括：

26.一种在由怀有胎儿的孕妇得到的生物学样品中获得胎儿核酸分子的百分率的方法，所述方法包括：

接收由多个反应得到的数据，每个反应都涉及由生物学样品得到的大量核酸分子，所述生物学样品包括由所述孕妇得到的以及由所述男性胎儿得到的核酸分子；

基于对所述第一等位基因为阳性反应的数量来计算所述第一等位基因的校正浓度Px，其中Px是针对所述第一等位基因在所述多个反应中的预计统计学分布来校正的；

在所述反应中检测第二等位基因，其中所述第二等位基因是所述胎儿特有的；

基于对所述第二等位基因为阳性反应的数量来计算所述第二等位基因的校正浓度Py，其中Py是针对所述第二等位基因在所述多个反应中的预计统计学分布来校正的；以及

使用[(2Py)/(Px+Py)]来计算Pf。

27.如权利要求26所述的方法，其中Pf等于[(2Py)/(Px+Py)]*100%。

28.如权利要求26和27的任意一项所述的方法，其中所述统计学分布为泊松，并且其中所述泊松校正的浓度Px使用等式[-ln((N-P1)/N)]*N，其中N为所分析的反应的总数量，P1为对所述第一等位基因为阳性的孔的数量，以及ln为自然对数，并且其中所述泊松校正的浓度Py使用等式[-ln((N-P2)/N)]*N，其中N为所分析的反应的总数量，而P2为对所述第二等位基因为阳性的孔的数量。

29.如权利要求26至28的任意一项所述的方法，其中所述数据包括：

第一组定量数据，其表明在与所述突变核酸序列连锁的多态位点处所述突变核酸序列或等位基因的第一量；以及

第二组定量数据，其表明在与所述正常核酸序列连锁的多态位点处所述正常核酸序列或等位基因的第二量，所述方法进一步包括：

由所述两组数据确定参数；

确定用于确定所述胎儿是否继承了突变核酸序列的第一截断值，其中所述第一截断值是基于所述百分率Pf来确定的；

确定用于确定所述胎儿是否继承了正常核酸序列的第二截断值，其中所述第二截断值是基于所述百分率Pf来确定的；

将所述参数与所述第一和第二截断值中的至少一者相比较；以及

基于所述比较，确定所述胎儿是继承了所述突变核酸序列还是所述正常核酸序列的分类。

30.一种包含非瞬时性计算机可读介质的计算机程序产品，其中所述介质储存了大量用于控制处理器来执行操作的指令，所述指令包括上述方法的任意一种。

31.一种系统，该系统包括：

一个或多个处理器，其被配置用于实施上述方法的任意一种。

32.一种包括模块的系统，所述模块被配置用于实施上述方法的任意一种。