JP2017534281A - 潰瘍性大腸炎に特異的な診断および予後予測のバイオマーカーとしてのmir−214ならびに潰瘍性大腸炎治療のためのmir−214阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に記載される本発明は、潰瘍性大腸炎(UC)にmiR−214が予想外にも特異的に発現することに基づく。本発明はさらに、アンチセンスmiR−214の大腸内投与によってUCが減少し、その効果および特異性は高レベルであり、毒性も認められないことが明らかになったことに基づく。データは、miR−214がUCにおける重要なメディエーターであり、治療標的であることを示す。本発明は、潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別するのに用いることができる方法を提供するという点で特に有利である。
本願で使用される科学用語および技術用語はいずれも、特に明記されない限り、当該技術分野で一般的に用いられる意味を有する。以下の語および語句については、本願で使用する場合、明記する意味を有する。
本発明は、対象中の潰瘍性大腸炎(UC)またはUC関連異形成を検出する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象から採取した検体を、配列:5’−TGTCTGTGCCTGCTG−3’(配列番号1)を有するオリゴヌクレオチドであるmiR−214についてアッセイすることを含む。さらなる実施形態では、この方法は、ホスファターゼおよびテンシンホモログ(PTEN)ならびにPDZおよびLIMドメインタンパク質2(PDLIM2)を含む2つ、3つ、またはそれより多いマーカーについて検体をアッセイすることを含む。アッセイは通常、検体をmiR−214、PTEN、および/またはPDLIM2に特異的な試薬と接触させることと、検体中に存在するmiR−214、PTEN、および/またはPDLIM2の量を測定することとを含む。このようなアッセイに適した代表的な試薬については、のちの実施例に記載する。例えば、定量的リアルタイムPCRを用いて発現レベルを決定できる。のちの実施例では、miR−214発現レベルをU6低分子核RNA(203904;Exiqon社)のレベルに対して正規化した。当業者であれば、発現レベルの正規化に用い得る適切な代替法を理解できるであろう。
本明細書に記載される診断用途に使用されるものとして、キットも本発明の範囲内に含まれる。このようなキットは、それぞれがこの方法に使用する別個の要素のうちの1つを含む1つまたは複数の容器、例えばバイアル、チューブなどが入るよう区切られた運搬容器、包装または容器を含み得る。キットの抗体、プローブ、プライマー、および他の試薬は、凍結形態、凍結乾燥形態、またはTBSもしくはPBSなどの薬学的に許容される緩衝液中を含む任意の適切な形態で提供され得る。キットはまた、試薬をin vitroまたはin vivoで使用するのに必要な他の試薬、例えば緩衝液(すなわち、TBS、PBS)、ブロッキング剤(脱脂粉乳、正常血清、Tween−20界面活性剤、BSA、またはカゼインを含む溶液)、および/または検出試薬(すなわち、ヤギ抗マウスIgGビオチン、ストレプトアビジン−HRPコンジュゲート、アロフィコシアニン、B−フィコエリトリン、R−フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、蛍光物質(すなわち、DyLight、Cy3、Cy5、FITC、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 647)、ならびに/あるいは染色キット(すなわち、Pierce社のABC Staining Kit))を含み得る。ヌクレオチドプローブは検出用に標識されていてよい。キットはまた、他の試薬および/または上記のよく用いられるアッセイ、例えばフローサイトメトリー解析、ELISA、イムノブロッティング(すなわち、ウエスタンブロット)、in situ検出、免疫細胞化学、免疫組織化学などで抗体および他の試薬を使用するための説明書を含み得る。
本明細書に記載される材料および方法を用いることによって、NFKB活性を調節する新規な標的および化合物を特定できる。具体的には、本発明では、ヒト大腸細胞でNFKB活性を調節している新規なマイクロRNA標的および阻害剤を特定する。NFKB経路は、多数の様々な種類の癌ならびに自己免疫疾患および炎症性疾患で活性化されることが見出されており、これらの阻害剤を用いてNFKBリン酸化を抑制することにより、上記の疾患を治療できる。
以下の実施例は、本発明を説明し、当業者が本発明を製造し使用する際の一助となるよう提供するものである。これらの実施例は、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
潰瘍性大腸炎(UC)とクローン病(CD)とからなる炎症性腸疾患(IBD)は、炎症性応答の活性化を特徴とし、罹患が長期間にわたる患者では結腸直腸癌が発現するリスクが高い。このため、UCおよびUC関連異形成に対する治療的可能性のある新規な分子標的を特定することは極めて重要である。潰瘍性大腸炎ではマイクロRNAは調節解除されているが、その機構的役割および治療上の価値については未だ推測の域を出ていない。本実施例では、ヒトマイクロRNAomeのハイスループットな機能的抑制因子スクリーニングを用いて、miR−214が核因子カッパベータ(NF−κB)の主要な調節因子であることを明らかにした。miR−214は、活動性で長期間にわたるUCの患者の大腸組織で特異的に増幅され、大腸炎関連結腸直腸癌(CAC)では過剰発現する。バイオインフォマティクスおよび全ゲノムプロファイリングによる解析を統合することにより、miR−214は、フィードバックループ回路を介して、PDZおよびLIMドメイン2(PDLIM2)ならびにホスファターゼおよびテンシンホモログ(PTEN)遺伝子を抑制することによって増幅されることが明らかになった。UC患者からの大腸生検では化学的阻害剤がex vivoでこの回路を障害し、マウスでは大腸内投与がUCおよびCACを治療的に抑制した。以上を考え合わせると、miR−214は疾患活動性および結腸直腸癌への進行と相関し、その阻害は、UC患者にもCAC患者にも新規な治療選択肢を提供する。
この試験は、各研究施設の施設内審査委員によって承認されたものである。UCLAで組織試料を採取した全患者が書面でのインフォームドコンセントを提出している。患者試料は、ライデン大学メディカルセンター(Leiden University Medical Center)にて、LUMC医療倫理委員会の指示およびガイドラインに従い、ヘルシンキ宣言に則り、採取したものである。
既に記載されている通りに12、96ウェルプレートにNCM460不死化上皮細胞を播き、348種類のマイクロRNA阻害剤と2種類の陰性対照マイクロRNA(100nM)からなるマイクロRNA阻害剤ライブラリー(Dharmacon社)をトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後に、細胞をIL6で24時間処理し、Phospho−RelA/NFKB p65(S536)Cell−Based ELISA(KCB7226、R&D社)によりNFKBのリン酸化を評価した。NFKBのリン酸化を50%超阻害したマイクロRNA阻害剤を陽性ヒットとした。
LeverアルゴリズムおよびPhylCRMアルゴリズムを用いて、マイクロRNAの5kb上流および2kb下流の領域にSTAT3結合モチーフを確認した。
situハイブリダイゼーションによるmiR−214検出用のDouble−DIG標識miRCURY LNA Detectionプローブ(38494−15、Exiqon社)を、修正を施して既に記載されている通りに8用いた。対照、潰瘍性大腸炎、および結腸直腸癌の切片をキシレンで脱パラフィンし(5分間、3回)、次いで、段階希釈のエタノールで処理し(100%で3回、96%で2回、70%で3回)、DEPC−PBSを2回交換した。次いで、組織をプロテイナーゼK(15mg/ml)で30分間、37℃で消化し、DEPC−PBSで3回洗浄した。切片を70%、96%、および100%のエタノールで2回脱水し、空気乾燥させ、マイクロRNA ISH緩衝液で希釈したhsa−miR−214(40nM)(90000、Exiqon社)と1時間、60℃でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を5×SSCで2回、1×SSCで2回、0.2×SSCで3回、それぞれ60℃で5分間洗浄し、PBSで洗浄した。スライドをブロッキング溶液(11585762001、Roche社)で15分間、次いで2%ヒツジ血清中の抗DIG抗体(1:800)(013−000−121、Jackson Immunoresearch社)ブロッキング溶液で1時間、室温でインキュベートした。PBS−T(PBS、0.1%Tween−20)で3回洗浄した後、暗所にてスライドをAP基質緩衝液(0.2mMレバミソール[31742、Fluka社]10ml中のNBT−BCIPタブレット[11697471001、Roche社])で2時間、30℃でインキュベートした。AP停止液(50mMトリス−HCl、150mM NaCl、10mM KCl)で2回洗浄し、水で2回洗浄して反応を停止させた。組織をNuclear Fast Redで1分間対比染色し、水で洗浄した。最後に、切片を70%、96%、および100%のエタノールで2回脱水し、カバーガラスでEukitt封入剤(361894G、VWR社)中に封入した。Nikon Digital Sight DS−Fi1カラーカメラを備えたNikon 80i Upright Microscopeで、NIS−Elements画像取得ソフトウェアを用いて画像を捕捉した。画像はいずれも、同じ設定を用いて捕捉および処理した。
ホスホ−NFKB、ホスホ−AktおよびKi67の組織免疫染色には、化学的miR−214阻害剤または陰性対照で処理したAOM−DSSマウスからの大腸組織のFFPE切片をキシレン(3×5分間)で脱パラフィンした後、段階希釈のエタノールで処理し(100%、100%、95%および95%でそれぞれ10分間)、ddH2Oを2回交換した。スライドを10mMクエン酸ナトリウム(pH6.0)中で10分間煮沸(95〜99℃)することにより、抗原のアンマスキングを実施した。切片をddH2Oで3回洗浄し、3%H2O2に20分間浸漬し、ddH2Oで2回およびTBS−T(TBS、0.1%Tween−20)で1回洗浄し、ブロッキング溶液(TBS−T中の5%正常ヤギ血清[5425、Cell Signaling Technology社])で1時間ブロックした。ホスホ−P65(Ser536)(SAB4300009、Sigma−Aldrich社)、ホスホ−Akt(Ser473)(4060、Cell Signaling Technology社)およびKi67(12202,Cell Signaling Technology社)抗体をSignal Stain抗体希釈液(8112、Cell Signaling Technology社)でそれぞれ1:200、1:50および1:400に希釈し、切片と4℃で一晩インキュベートした。抗体とインキュベートした後、切片をTBS−Tで3回、それぞれ5分間洗浄し、SignalStain Boost([HRP、ウサギ]8114または[HRP、マウス]8125、Cell Signaling Technology社)と室温で1時間インキュベートした。切片をTBS−Tで3回、それぞれ5分間洗浄し、DAB Peroxidase Substrate Kit(SK−4100、Vector Laboratories社)で30分間染色し、洗浄し、ヘマトキシリンQS(H−3404、Vector Laboratories社)で対比染色した。最後に、組織を脱水し、Eukitt封入剤中に封入した。NIS−Elements画像取得ソフトウェアを用いる、Nikon Digital Sight DS−Fi1カラーカメラを備えた顕微鏡。画像はいずれも、同じ設定を用いて捕捉および処理した。
リアルタイムPCRを実施して、ヒトの大腸癌および大腸組織中のmiR−214の発現レベルを決定した。Trizol(15596−026、Invitrogen社)を用いてRNAを単離した。Universal cDNA合成キット(203300)を用いて逆転写を実施した。CFX384 Real Time PCR検出システム(BioRad社)でSYBR Greenマスターミックス(203450)およびmiR−214(204510、Exiqon社)のプライマーを用いて、リアルタイムPCRを三重反復で実施した。MIR214発現レベルをU6 snRNA(203907、Exiqon社)のレベルに対して正規化した。
PTEN−F:5’−cccagacatgacagccatc−3’(配列番号5)
PTEN−R:5’−tctgcaggaaatcccatagc−3’(配列番号6)
PDLIM2−F:5’−atggccacgattatgtctcc−3’(配列番号7)
PDLIM2−R:5’−gcccatcatggtgactaagg−3’(配列番号8)
Β−ACTIN−F:5’−cccagcacaatgaagatcaa−3’(配列番号9)
Β−ACTIN−R:5’−acatctgctggaaggtggac−3’(配列番号10)
GAPDH−F:5’−atgttcgtcatgggtgtgaa−3’(配列番号11)
GAPDH−R:5’−ggtgctaagcagttggtggt−3’(配列番号12)
マウス試験は、カリフォルニア大学(University of California)動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって承認され、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に従った。大腸炎関連大腸癌(CAC)のマウスモデルで、miR−214阻害の治療的可能性を検討した。第1日に12.5mg/kgアゾキシメタン(AOM)を投与した後、第8日、29日および50日での3%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の反復経口投与によってCACを誘導する。本発明者らの治療プロトコルに従って、AOM−DSS処理したマウスにmiR−NC阻害剤またはmiR−214化学的阻害剤(12mg/kg)の大腸内投与を週1回、4サイクル(第64日、70日、77日、84日)実施した。第91日に、マウスを屠殺し、腫瘍量を評価した。miR−214阻害剤はmiR−214配列5’−TGTCTGTGCCTGCTG−3’(配列番号1)を標的とした。
サンドイッチELISA法を用いて、対照大腸組織および潰瘍性大腸炎患者および大腸炎関連癌患者からの試料におけるSTAT3タンパク質のチロシン705のリン酸化状態、AOM−DSS処理マウス由来の大腸腫瘍における切断カスパーゼ−3のレベル、Aktタンパク質のセリン473のリン酸化状態、NFKBタンパク質のセリン536のリン酸化状態および大腸細胞系でのIL6分泌を評価した。BioPlex FlexMap3D(Bio−Rad社)分析器でBioPlex Managerソフトウェアを用いてデータを解析した。
MIR214のプロモーターを含むホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を大腸上皮細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼベクターをトランスフェクトした後、細胞をIL6で24時間処理した。24時間後に、細胞抽出物を調製し、Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega社、ウィスコンシン州、米国)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。3’UTRアッセイには、PTENまたはPDLIM2の3’UTRを保有するレポーターベクターを細胞にトランスフェクトした。24時間後に、細胞にmiR−214(またはmiRスクランブル)をトランスフェクトし、48時間後に、Dual Luciferase Reporter Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
miR−214もしくはアンチmiR−214またはそれぞれの対照をトランスフェクトしてから24時間後に、大腸上皮細胞系で浸潤アッセイを実施した。BDBioCoat増殖因子減少マトリゲル浸潤チャンバ(PharMingen社)を標準化条件で用いることにより、マトリゲルでの浸潤を実施した。アッセイは、化学誘引物質として2%FBSを用い、製造業者のプロトコルの通りに実施した。播種から16時間後に、浸潤せずに膜の上側にあった細胞を除去し、浸潤した細胞を固定して4’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、Vector Laboratories社)で染色した。いずれのアッセイでも、1インサート当たり10個の視野をスコア化し、標準誤差を算出した。
大腸上皮細胞にmiR−214もしくはアンチmiR−214またはそれぞれの対照をトランスフェクトした。次いで、各細胞系の細胞105個の三つ組み試料を、増殖培地中の2.0%アガロースと4:1(v/v)で混合し、アガロースの最終濃度を0.4%にした。増殖培地中の0.8%アガロースの凝固層の上に細胞混合物を播いた。12日後にコロニー数をカウントした。
クロマチン免疫沈降を既に記載されている通り8に実施した。簡潔に述べれば、未処理大腸上皮細胞およびIL6処理大腸上皮細胞に由来するクロマチンフラグメントをSTAT3に対する抗体6μugで免疫沈降させた。QIAGEN Purification Kitを用いてDNA抽出を実施した。以下のプライマー:順方向:5’−GGGCTTGAGTCCATCAGCTT−3’(配列番号13)および逆方向:5’−GTTCAGCAGGACAGGTCTCA−3’(配列番号14)(産物サイズ:94bp)を用いて、miR−214プロモーター中のSTAT3結合部位のリアルタイムPCR解析を実施した。
特に明記されない限り、いずれの実験も三重反復で実施した。Originソフトウェア(バージョン8.6)およびSAS統計パッケージ(バージョン9.4)を用いて統計解析を実施した。スチューデントt検定を用いて、対照大腸組織と様々な腸病態から得た検体との間で、活動性UC検体と不活動性UC検体との間でおよび疾患継続期間に基づいて分類したUC検体間について、miR−214発現の統計学的差を検討した。年齢の比較にクラスカル・ウォリス検定および多重検定用に有意レベルのボンフェローニ補正を加えた事後2標本ウィルコクソン検定を用い、雌雄間の比較にカイ二乗検定を用い、腫瘍ステージ間の比較にフィッシャー直接検定を用いた。スピアマンとパールソンの相関解析により相関有意性を決定した。処理の異なる細胞群およびマウス群の間の比較にはスチューデントt検定を用いた。P値が0.05以下であれば統計的有意性があることを示すとみなした。
1.Eaden,J.A.,et al.Gut 48,526−535(2001).
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23.Dekker,E.,et al.Endoscopy 39,216−221(2007).
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上の実施例1に記載した通り、12mg/kgのmiR−214阻害剤の大腸内投与が慢性DSSマウスモデルで潰瘍性大腸炎を抑制する効果を評価した(図2i)。図14A〜14Bは、慢性DSSマウスモデルに適用した治療プロトコルを示す。miR−214阻害の治療的可能性を探るため、慢性大腸炎のマウスモデルを用いた。このモデルでは、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の反復経口投与によって大腸炎を誘発する。(図14A)第8日からDSS処理マウスにmiR−214阻害剤または陰性対照を(2日毎に)4サイクル大腸内投与した。(図14B)各マウス群(未処理、miR−214阻害剤またはmiR−NC阻害剤)の疾患活動性スコアの評価に用いた基準。この実験デザインから、12mg/kgのmiR−214阻害剤が潰瘍性大腸炎の疾患活動性を50%減少することがわかった(図2i)。
miR−214発現レベルを抑えるmiR−阻害剤の特異性を評価するため、miR−214発現レベルを評価し、miR−214阻害剤(大腸内投与)がmiR−214発現レベルを95%超抑えることを見出した。これらの所見の特異性を検討するため、他のマイクロ(miR−133a、miR−210、miR−21)の発現レベルを検討した。miR−214阻害剤は、上記の無作為に選択したマイクロRNAの発現レベルに影響を及ぼさず、miR−214のみを標的とする特異性を有することがわかった。以上の結果を図21に示す。
miR−214阻害剤の大腸内投与がマウスにおける肝機能および腎機能に何らかの毒性作用を有するかどうかを検討した。具体的には、マウス(マウス3匹/グループ)を18mg/kgのmiR−214で処理し、治療から48時間後に、肝酵素ALTおよびASTのレベルを尿素レベルとともに測定した。図22A〜22Cのグラフに示すように、未処理マウス(対照)、miR−NC阻害剤処理マウスおよびmiR−214阻害剤処理マウスの間でALT、ASTおよび尿素のレベルの統計的有意差はみられなかった。
Claims (23)
- 対象中の潰瘍性大腸炎(UC)の検出、診断、または予後予測のための方法であって、
(a)前記対象から採取した検体をマイクロRNA−214(miR−214)についてアッセイするための試薬と接触させることと、
(b)前記検体中に存在するmiR−214の量を対照試料と比較して測定することと、
(c)前記対照試料と比較して前記検体中に増大した量のmiR−214が存在する場合UCの存在またはリスクを決定することと
を含む、方法。 - 前記検体が腸生検組織または腸液である、請求項1に記載の方法。
- 前記腸生検組織が大腸を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記測定することがポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたはin situハイブリダイゼーションを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試薬が配列番号1に特異的に結合するプローブを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象にUCまたはUC関連異形成のための治療的処置を実施することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 対象中のUCの治療の効果をモニタリングするための方法であって、
(a)初回の時点で前記対象から採取した検体をmiR−214についてアッセイするための試薬と接触させることと、
(b)2回目の時点で前記対象から採取した検体をmiR−214についてアッセイするための試薬と接触させることであって、前記対象が前記2回目の時点の前にUCのための治療を受けていることと、
(c)前記初回の時点および前記2回目の時点で採取した検体中に存在するmiR−214の量を測定することと、
(d)前記初回の時点で採取した検体と比較して2回目の時点で採取した検体中に減少した量のmiR−214のが存在するかどうかを決定することと
を含み、減少した量のmiR−214がUCの有効な改善を表す、方法。 - 前記検体が腸生検組織または腸液である、請求項7に記載の方法。
- 前記腸生検組織が大腸を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記測定することがポリメラーゼ連鎖反応アッセイを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記試薬がTGTCTGTGCCTGCTG(配列番号1)に特異的に結合するプローブを含む、請求項7に記載の方法。
- 対象中のUCを治療する方法であって、前記対象に治療有効量のmiR−214の阻害剤を投与することを含む、方法。
- 前記投与することが大腸内投与または静脈内投与である、請求項12に記載の方法。
- 前記miR214の阻害剤がアンチセンスmiR−214オリゴヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオアート結合を含むロックト核酸アンチセンスmiR−214オリゴヌクレオチドである、請求項13に記載の方法。
- レンチウイルスベクターを介して前記アンチセンスmiR−214オリゴヌクレオチドが投与される、請求項14に記載の方法。
- 炎症性腸疾患に罹患している患者がUCを有するかどうかを決定する方法であって、請求項1または請求項7に記載の方法を実施することを含み、対照試料に比して増大した量のmiR−214がUCを表す、方法。
- 対象中の大腸癌を治療する方法であって、前記対象に治療有効量のロックト核酸アンチセンスmiR−214オリゴヌクレオチドを投与することを含む、方法。
- 前記投与することが大腸内投与、腫瘍内投与、または静脈内投与である、請求項18に記載の方法。
- 前記miR−214の阻害剤がアンチセンスmiR−214オリゴヌクレオチドである、請求項18に記載の方法。
- 対象中の潰瘍性大腸炎(UC)の検出、診断、または予後予測のための方法であって、
(a)前記対象から採取した検体をマイクロRNA−214(miR−214)、PTEN、および/またはPDLIM2についてアッセイするための試薬と接触させることと、
(b)前記検体中に存在するmiR−214、PTEN、および/またはPDLIM2の量を対照試料と比較して測定することと、
(c)前記対照試料と比較して前記検体中に増大した量のmiR−214が存在する場合、あるいは前記対照試料と比較して前記検体中に減少した量のPTEN量および/またはPDLIM2が存在する場合UCの存在またはリスクを決定することと
を含む、方法。 - 潰瘍性大腸炎またはクローン病の診断が未だ決定されていない、請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- 対象中の潰瘍性大腸炎の状態を決定するための方法であって、
(a)前記対象から採取した検体をマイクロRNA−214(miR−214)についてアッセイするための試薬と接触させることと、
(b)前記検体中に存在するmiR−214の量を対照試料と比較して測定することと、
(c)前記対照試料と比較して前記検体中に増大した量のmiR−214が存在する場合活動性潰瘍性大腸炎の存在を決定し、前記検体中に存在するmiR−214の量が前記対照試料と有意に異ならない場合寛解を決定することと
を含む、方法。
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