JP2017532418A - ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液 - Google Patents

Abstract

本発明は、溶媒を含まず揮発性有機化合物の放出が低いので、接着剤や化粧品を含む様々な分野で用いることができる、ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液に関する。ハイブリッド材料として、ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液によって、細かく調整することができ、ポリウレタンとペプチド材料の有利な特性を組み合わせることができる汎用性の高いシステムが提供される。ＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを１つ以上のペプチドを含む連続相に分散させることを含み、それによってペプチドで安定化したポリウレタン粒子を形成する製造方法、それらを含む組成物およびそれらの化粧品および接着剤での使用もまた包含される。

Description

本発明は、溶媒を含まず揮発性有機化合物の放出が低いので、接着剤や化粧品などの様々な分野で用いることができる、ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液に関する。ハイブリッド材料として、ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液によって、細かく調整することができ、ポリウレタンとペプチド材料の有利な特性を組み合わせることができる汎用性の高いシステムが提供される。それらの製造方法、それらを含む組成物および化粧品および接着剤でのそれらの使用もまた包含される。

ペプチド−ポリマー結合体の合成は何年にもわたって研究者たちの限りない興味を湧き立たせている。ペプチドは、他の生体分子との選択的および特異的相互作用、高度に規定された階層構造、および様々な外部刺激に対する応答性などの、合成ポリマーでは得られない独特の特性をもたらす。一方、合成ポリマーは、高い耐劣化性を有し、弾力性、ガラス転移、結晶性、強度などの非常に興味深い膜の熱機械的特性をもたらす。天然および合成ポリマー両方のそれぞれの長所を組み合わせるために、ペプチドおよびタンパク質の精製または実験室合成、所望の特性を有する合成ポリマーの合成、天然および合成ポリマー両方の別のカップリング戦略の開発に対して多くの努力が向けられてきた。

通常、短いペプチドはメリフィールド固相合成法のような方法を用いたアミノ酸の連続付加によって合成されるが、一方長いペプチドは通常組み換え手段により、たいていは組み換え細胞での発現、その後に続く細胞溶解、タンパク質精製および分離によって合成される。これらの一般的な合成経路はともに多くの時間と労力を要し高価であるのでストリンジェントなペプチド構造のコントロールを必要としない多くの用途には適さない。有望な別の選択肢は酵素的開裂または天然に存在する羊毛、トウモロコシ、大豆および他の天然源からのタンパク質の加水分解によってペプチド混合物を得ることにある。これらのペプチドはペプチド−ポリマー結合体から新しい材料を合成するための有望な試薬である。

合成ポリマーに関する限り、多くの異なる種類のポリマーをペプチドに結合させるために研究されてきた。今までのところほとんど研究されていないが、一つの類のポリマー粒子は水性ポリウレタン分散液（ＰＵＤｓ）である。ＰＵＤｓは多種多様のポリオールをポリイソシアネートと反応させて生じる水分散性ポリマーから合成することができ、該水分散性ポリマーで形成された膜は、部分結晶性、および高弾性率などのたいへん興味深い特性を有する。合成の第一工程はほとんどの場合、ポリオールとポリイソシアネートモノマーとの重付加反応でポリウレタンプレポリマーを形成することで構成される。一般的には、荷電基および水膨潤性部分を有するポリオールはいわゆる自己安定構造（すなわち界面活性剤の添加なしに水に分散できる）を生成するために用いられる。アルコール官能価に関してわずかに過剰のイソシアネートを加えることによって、ＮＣＯ末端基を有する適度な分子量のプレポリマーが得られる。これらの末端基は、ポリウレタン鎖の分子量を上げるために分散後の鎖延長および／または所望の機能性をポリマー構造に導入するためにエンドキャップに用いることができる。

ペプチドをナノ粒子に付着させる一般的なカップリング戦略は、単純な吸着、表面「クリック」反応、共重合などを含む。欧州特許出願第０７７３２４６号明細書には、ＮＣＯ末端ポリウレタンをタンパク質、特にカゼインと反応させることによるグラフトポリマーの生成が記載されている。グラフトポリマーは、当業界ではアミンの付加によるポリウレタン合成の停止について知られているように、アミノ基を含むタンパク質のポリウレタン合成反応混合物への付加によって合成される。

欧州特許出願第０７７３２４６号明細書

しかしながら今でもなお、ペプチドで修飾されたポリウレタンポリマー、特にポリウレタン分散液の一般的な代替合成法が当業界では必要である。

本発明は、本発明者らが特に簡単な経路を用いてペプチドコロナが付着したポリウレタン分散液を得る一般的な代替合成法を見出したことに基づく。より具体的には、本発明者らは、ペプチド混合物を用いて反応条件を注意深く制御することで、ペプチドコロナを有しているだけでなくペプチドコロナによって安定化したポリウレタン分散液を得ることができることを立証することができた。従って本発明は概して、せん断力を加えることによって水中でペプチドコロナが付着したＰＵ粒子の分散液を製造する方法に関する。特にペプチドコロナがコロイド安定化に重要な成分である場合は、ペプチドの生物学的機能性によって効果的にポリウレタン分散液特性を総合的に管理できることが期待される。このように、ｐＨ、温度、イオン強度のような弱い外部刺激、または他の分子および特定の表面との相互作用があると、ペプチドの元の状態に影響を及ぼすだけでなく、ペプチド−ＰＵ結合体全体にも影響を及ぼす。実際ペプチドが付着して立体配座状態でポリウレタン分散液安定化の臨界になると、同じ弱い外部刺激で全体のペプチド結合系の刺激−応答に強烈な影響を与えることができる。従ってこの臨界安定性は様々な用途、例えば様々な界面への堆積および付着において非常に有益であると期待される。

本発明は従って、第一の態様において、ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液（ＰＵＤ）を製造する方法であって、
（１）ＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを準備すること、および
（２）前記ＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを連続水相に分散させ、それによってペプチドで安定化した水性ポリウレタン粒子を形成することを含み、前記連続水相が１つ以上のペプチドを含む水溶液である方法に関する。

別の態様において、本発明は本明細書中に記載された方法に従って得られるペプチドで安定化した水性ポリウレタンポリマー分散液に関する。

本発明のさらなる態様は、本明細書中に開示されたペプチドで安定化した水性ポリウレタンポリマー分散液を含む組成物、特に化粧品および接着剤組成物、および該ペプチドで安定化した水性ポリウレタンポリマー分散液の化粧品および接着剤組成物での使用に関する。

本明細書中で用いられる「１つ以上」は少なくとも１で、言及した種の１、２、３、４、５、６、７、８、９以上を含む。同様に、「少なくとも１つ」は１つ以上を意味し、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９以上である。任意の成分に関して本明細書中で用いられる「少なくとも１つ」は化学的に異なる分子の数、すなわち言及した種の異なるタイプの数のことをいうが、分子の総数のことではない。例えば「少なくとも１つのポリオール」は、ポリオールの定義の範囲内に入る少なくとも１種類の分子が使用されることを意味し、この定義の範囲内に入る２つ以上の異なる種類の分子が存在しうることも意味するが、該ポリオールの分子１個が存在していることを意味するものではない。

本明細書中で用いられる「ペプチド」という用語はペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸から成るポリマーのことをいう。ペプチドは好ましくは２つ以上のアミノ酸を含み、たいていは長さが１０００アミノ酸以下、好ましくは６００アミノ酸以下である。好ましい実施形態において、ペプチドは平均分子量が１０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１５００〜７５，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましいのは２０００〜６０，０００ｇ／ｍｏｌである。本明細書中でペプチドの分子量が１００００ｇ／ｍｏｌを超えると言及されている場合、この言及はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって測定される数平均分子量のことをいう。本明細書中でペプチドの分子量が１００００ｇ／ｍｏｌ以下であると言及されている場合、このサイズ制度で選択される分析方法サイズ排除ＨＰＬＣである。

アミノ酸を構成するペプチドは好ましくは天然に存在するタンパク質を構成する２０のアミノ酸のような天然に存在するタンパク質原性のアミノ酸である。該アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、システイン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、およびトリプトファンを含む。様々な実施形態において、ペプチドを構成するアミノ酸は非天然アミノ酸または非タンパク質原性のアミノ酸も含みうる。

本明細書中で合成ポリマーの分子量が言及されている場合、この言及は明示的に別段の定めをした場合を除き数平均分子量Ｍ_ｎのことをいう。数平均分子量Ｍ_ｎは末端基分析（ＤＩＮ５３２４０に準拠したＯＨ数）に基づいて計算でき、またはＤＩＮ５５６７２−１：２００７−０８に準拠したテトラヒドロフランを溶離液として用いたゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定できる。別段の定めのない限り、挙げられた分子量はすべて末端基分析によって測定されるものである。重量平均分子量Ｍ_ｗはＭ_ｎに関して記載されているようにＧＰＣによって測定できる。

本明細書中に挙げられている組成物または製剤に関する百分率はすべて、特に別段の定めのない限り各組成物または製剤の全重量に対する重量百分率に関する。

本発明の様々な実施形態において、水溶液はプレポリマーの全重量に対して１つ以上のペプチドを４重量％以上、好ましくは４〜２０重量％、より好ましくは６〜１０重量％含む。ペプチドの量が少ないと、たいていはポリウレタン粒子に所望の特性を付与するのに十分でない。量が多いとポリウレタン粒子の結合部位が飽和状態に達するので非経済的である。量が７〜１０重量％、好ましくは約８重量％であると４週間を超えて安定した分散液が得られることや、分散液が凝集を防止することが見出されている。加えてこの量によって平均粒径が約２００ｎｍで狭い粒度分布の粒子が得られる。

様々な実施形態において、水溶液はｐＨが１つ以上のペプチドの等電点（ＩＰ）よりも高い。様々な実施形態において、１つ以上のペプチドは１つ以上のペプチドの等電点が７以下、好ましくは６以下であるように選択される。ペプチドがペプチド混合物である場合、ＩＰは該ペプチド混合物の平均ＩＰのことをいう。

概略的に乳化工程を示す図である。 ＦＴＩＲの測定結果を示す図である。 ＢＣＡ分析の結果を示す図である。 ゼータ電位の測定結果を示す図である。 レーザー回折測定の結果を示す図である。 透過電子顕微鏡による粒子形態を示す図である。 示差走査熱量測定の結果を示す図である。

１つ以上のペプチドはペプチドの混合物であってもよい。そのようなペプチドの混合物は天然タンパク質の加水分解によって得ることができる。加水分解は化学的加水分解、例えばプロテアーゼなどのタンパク質加水分解酵素による酵素加水分解であってもよい。ペプチドのもととなる天然タンパク質は任意の天然タンパク質であってもよい。使用することができる典型的なタンパク質としては、例えばトウモロコシや大豆からの植物タンパク質、または、例えば、羊毛、皮膚、毛髪、爪、角、蹄、乳などからの動物タンパク質である。好ましいタンパク質源は不溶性線維性タンパク質であり、例えば、髪、爪、結合組織などに存在するケラチンやコラーゲンである。そのようなタンパク質、特にケラチンを精製および加工し、続いて加水分解を行うことで上記した目的に特に適するペプチド混合物を生成する。そのようなペプチド混合物が異なる組成および分子量を有する様々な異なるペプチドを含有しているのが理解されよう。さらにペプチドの長さ、従って分子量、従って平均長さおよび平均分子量もまた加水分解技法および条件によって制御することができることが理解されよう。好ましいペプチドは平均長が５〜１０００アミノ酸であり、好ましくは１２〜６００アミノ酸である。特に好ましい実施形態では、加水分解羊毛タンパク質が用いられ、該加水分解羊毛タンパク質は約５０，０００Ｄａの平均分子量を有する様々な長さのペプチド混合物から成る。

ペプチドは本来アミノ末端、すなわち遊離ＮＨ_２基、およびカルボキシ末端、すなわちカルボン酸またはカルボキシレート基を有する。さらにペプチドの組成によっては、アミノ酸側鎖はヒドロキシル基（セリン、スレオニン、チロシン）、チオール基（システイン）カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、アミノ基（リシン）、グアニジン基（アルギニン）、カルバモイル基（アスパラギン、グルタミン）、またはイミダゾール基（ヒスチジン）から成る。様々な実施形態において、これらの基の少なくとも１つ、典型的にはアミノまたはヒドロキシル基がペプチドに接触しやすいポリウレタンプレポリマーのＮＣＯ−基と反応してペプチドとポリウレタンプレポリマーとの間の共有結合を形成する。ペプチドとポリウレタンプレポリマーとの間の結合は、ペプチドの機能性および空間的な制約に応じて、１個の共有結合のみ、または２個以上の共有結合によって生じる。別法ではまたは追加として、ペプチドはポリウレタンプレポリマー粒子または小滴の表面に吸着することができる。そのような吸着はたいてい非共役であり、この場合もやはりペプチドの組成に応じて静電または疎水相互作用によってもたらされる。

様々な実施形態において、ポリウレタンプレポリマーの連続水相への分散中または直後のポリウレタンプレポリマーとペプチドとの間の反応によって、通常ペプチドコロナの付着したポリウレタン粒子が生成する。本明細書において「ペプチドコロナ」とは、ポリウレタン粒子はその表面が非共役的または共役的に結合し、従って粒子の表面をコロナの形態で包み込んだペプチドで修飾された状態を意味する。ペプチドが親水性の部分が親水性溶媒にさらされより多くの疎水性部分がペプチド折り畳み中に埋め込まれるまたはポリウレタン粒子に対向して埋められるように構造を選んでもよい。

本発明の様々な実施形態において、工程（１）は
（ａ）好ましくは４００ｇ／ｍｏｌ〜１００００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎを有する少なくとも１つのポリオール、および
（ｂ）少なくとも１つのポリイソシアネート、好ましくは少なくとも１つの脂肪族ジ−および／またはトリイソシアネート
を含む反応混合物からＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを形成することを含み、少なくとも１つのポリイソシアネートを、反応混合物の少なくとも１つのポリオールのヒドロキシ基に対してモル過剰で用いてＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを得る。

少なくとも１つのポリオールは少なくとも１つのポリエステルポリオール、少なくとも１つのポリエーテルポリオール、もしくはポリカルボネートポリオール、または、好ましくは、それらの混合物、特に少なくとも１つのポリエーテルポリオールおよび少なくとも１つのポリエステルポリオールであってもよい。従って２つ以上のポリエステルポリオールおよび／または２つ以上のポリエーテルポリオールの混合物も考えられる。さらにポリエステルポリオールおよびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ポリオールまたはポリエステルポリオール、ポリエーテルポリオール、およびポリジメチルシロキサンポリオールの混合物も考えられる。ポリステルポリオールおよびポリエーテルポリオールまたはポリエステルポリオールおよびポリジメチルシロキサンポリオールの混合物を用いるときは、重量比は約１０：１〜１：１０、好ましくは１：２〜２：１の範囲で変動してもよい。

様々な実施形態において、少なくとも１つのポリオールは、ヒドロキシル基の他に、少なくとも１つの官能化されていないポリオール、すなわちアニオン性またはカチオン性基など（例えば、カルボキシル、スルホニル、アンモニウムなど）の官能基を含まないポリオールを含む。

本明細書中に記載された方法において有用なポリエステルポリオールとしては、重縮合反応においてジカルボン酸をポリオールと反応させることによって得られるものが挙げられる。ジカルボン酸は脂肪族、脂環式または芳香族および／または無水物、エステルまたは酸塩化物などのそれらの誘導体であってもよい。それらの具体例はコハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸またはセバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、トリメリット酸、フタル酸無水物、テトラヒドロフタル酸無水物、グルタル酸無水物、マレイン酸、マレイン酸無水物、フマル酸、二量脂肪酸、およびジメチルテレフタレートである。適当なポリオールの例はモノエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンオール、３−メチルペンタン−１，５−ジオール、ネオペンチルグリコール、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタングリコール、シクロヘキサンジメタノール、２−メチルプロパン−１，３−ジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ジブチレングリコールおよびポリブチレングリコールである。別法として、それらは環状エステル、好ましくはε−カプロラクタムの開環重合によって得てもよい。

様々な実施形態において、ポリエステルポリオールは０℃より高い、好ましくは３０℃より高い、より好ましくは４０℃より高い融点Ｔ_ｍを有しおよび／または
４００〜５０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは５００〜３０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは８００〜２５００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１０００〜２０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎを有する。

ポリエーテルポリオールはポリアルキレングリコールホモ−またはコポリマー、好ましくはポリプロピレングリコールホモ−またはコポリマー、ポリエチレングリコールホモ−またはコポリマー、ポリテトラメチレングリコールホモ−またはコポリマー、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーであってもよい。

様々な実施形態において、ポリエーテルポリオールは１０００〜４０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは１０００〜３０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する。

適当なポリカーボネートは炭素酸誘導体、例えばジフェニルカーボネート、ジメチルカーボネート、またはホスゲンとジオールとの反応によって得てもよい。そのようなジオールの適当な例としてはエチレングリコール、１，２−および１，３−プロパンジオール、１，３−および１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、ネオペンチルグリコール、１，４−ビスヒドロキシメチルシクロヘキサン、２−メチル−１，３−プロパンジオール、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ジブチレングリコール、ポリブチレングリコール、ビスフェノールＡ、テトラブロモビスフェノールＡ、およびラクトン変性ジオールが挙げられる。ジオール成分は好ましくは４０〜１００重量％ヘキサンジオール、好ましくは１，６−ヘキサンジオールおよび／またはヘキサンジオール誘導体を含む。より好ましくは、末端ＯＨ基に加えてエーテルまたはエステル基を含むジオール成分が挙げられる。

ヒドロキシルポリカーボネートは、実質上直鎖であるべきである。しかしながら必要に応じて、ヒドロキシルポリカーボネートは、多官能成分、特に低分子量ポリオールの組み込みにより、わずかに分枝していてもよい。適当な例としては、グリセロール、トリメチロールプロパン、１，２，６−ヘキサントリオール、１，２，４−ブタントリオール、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、キニトール、マンニトール、およびソルビトール、メチルグリコシド、１，３，４，６−ジアンヒドロヘキサイトが挙げられる。

適当なポリカーボネートはデスモフェン（登録商標）Ｃ３２００（バイエル）およびクラレ（登録商標）Ｃ２０５０（ポリ（３−メチル−１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール）カーボネート；クラレ）であるがこれらに限定されない。

様々な実施形態において、反応混合物は、
（ａ）４００ｇ／ｍｏｌ〜５０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎ、少なくとも２０％、好ましくは３５％、より好ましくは５０％の結晶化度、および３０℃〜１５０℃、好ましくは４０℃〜１２０℃、より好ましくは４０〜８０℃の範囲の融点Ｔ_ｍを有し、結晶化度および融点はＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定される少なくとも１つの結晶性または半結晶性ポリオール、好ましくはポリエステルポリオール、および場合により、
（ｂ）４００ｇ／ｍｏｌ〜５０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎ、１０％未満の結晶化度、および−６０℃〜４０℃、好ましくは−４０℃〜３０℃の範囲のガラス転移温度Ｔ_ｇを有し、結晶化度およびガラス転移温度はＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定される少なくとも１つの非結晶性ポリオール、好ましくはポリエーテルポリオールを含み、ポリオール（ｂ）に対するポリオール（ａ）のモル比が１：１０〜１０：１の範囲である。

本明細書中に記載された実施形態に従って用いることができる非結晶性ポリオールは好ましくはポリエーテルポリオールであり、特にポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはプロピレングリコールとポリエチレングリコールとの共重合体であり、および／または４００ｇ／ｍｏｌ〜５０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは５００〜３０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは８００ｇ／ｍｏｌ〜２５００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１０００〜２０００の範囲の数平均分子量Ｍ_ｎを有する。

本明細中で（ポリエステル）ポリオールに関して用いられる「非結晶性」とは、ＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定される結晶化度が少なくとも１０％、好ましくは5％未満、より好ましくは２％未満であることを意味する。非結晶性（ポリエステル）ポリオールはさらに先と同様にＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定されるガラス転移温度Ｔ_ｇが−６０℃〜４０℃、好ましくは−４０℃〜３０℃の範囲を有する。ガラス転移温度以下では、非結晶性ポリマーは脆く硬い。この特性は「凍結」ポリマー鎖の不動性によるものである。ガラス転移温度を超えると、分子鎖は互いに移動可能となり、ポリマーは軟化する。軟化の度合いはポリマーの種類、ポリマーの分子量および温度に依存する。（半）結晶性ポリマーと比較して、非結晶性ポリマーはＩＳＯ１１３５７に準拠したＤＳＣ測定においてより脆く、硬い状態からよりやわらかい状態への遷移の間ガラス段階のみを示す。ポリマーの半結晶性を示す溶融ピークはＤＳＣ測定において発生しない。

結晶性または半結晶性ポリオールは好ましくはポリエステルポリオールであり、４００ｇ／ｍｏｌ〜５０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは５００ｇ／ｍｏｌ〜３０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは８００〜２５００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１０００〜２０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎを有してもよい。本明細書中で（ポリエステル）ポリオールに関して「結晶性」とは、ＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定される結晶化度が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％以上であることに関する。同様に本明細書中で（ポリエステル）ポリオールに関して「半結晶性」とは（ポリエステル）ポリオールの結晶化度が少なくとも２０％以上、好ましくは３５％以上、より好ましくは５０％以上、９０％未満の範囲を有することを意味する。従って半結晶質（ポリエステル）ポリオールは結晶性および結晶性でない（すなわち非結晶性）領域を含む。

上記した混合物において有用な結晶性および半結晶性（ポリエステル）ポリオールは、先と同様にＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定される融点Ｔ_ｍが３０℃〜１５０℃、好ましくは４０〜１２０℃、より好ましくは４０〜８０℃の範囲を有していてもよい。

非結晶性（ポリエーテル）ポリオールおよび結晶性／半結晶性（ポリエステル）ポリオールを組み合わせて用いる実施形態では、（ポリエステル）ポリオールに対する（ポリエーテル）ポリオールのモル比は１：１０〜１０：１、好ましくは１：３〜５：１、より好ましくは１：２〜２：１の範囲であってもよい。

反応混合物はさらにポリオール、特にジオールを含んでいてもよい。そのようなジオールは１，４−ブタンジオールなどの単量体ジオールであってもよい。

反応混合物はさらにヒドロキシ官能化ポリマー、例えばヒドロキシ官能化シロキサンを含んでもよい。用いることができる典型的なシロキサンとしては、特にテゴマー（登録商標）Ｈ−Ｓi２３１１（エボニック、ドイツ）の商品名で市販されているもののような、分子量Ｍ_ｎ約２０００ｇ／ｍoｌの液状ヒドロキシ官能化ポリジメチルシロキサンがある。様々な実施形態において、これらは上述の半結晶性／結晶性ポリエステルポリオールと組み合わせておよび／または上述の非結晶性ポリオールに加えてまたは代えて用いてもよい。適当なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ポリオールは、例えば米国特許明細書第６７９４４４５号に記載されている。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）はポリオールの全重量を基準にして６０重量％以下で用いてもよく、通常は、例えば−１５０〜−１００℃の範囲の低いＴ_ｇ値を有する。

いくつかの実施形態において、反応混合物はさらに少なくとも１つの安定剤を含んでもよく、該安定剤は用いるペプチドとは異なるものである。しかしながら、安定効果は水相への分散時にペプチドによってもたらされるので、反応混合物はそのような安定剤を含まないのが好ましい。

本明細書中で用いられる「安定剤」という用語は水性（水中油、ｏ／ｗと略される）分散液またはエマルション中の疎水性の液滴を安定させる、すなわち凝固または癒着を防止することができる分子の類に関する。安定剤分子は液滴表面に結合、付着または会合することができる。本発明の様々な実施形態において、ペプチドは安定剤分子、好ましくは唯一の安定化分子として働く。本明細書中で用いられる「安定剤」という用語は、好ましくはグリフィンによるＨＬＢ値が１０より大きい、好ましくは１２より大きい、より好ましくは１５より大きい分子および／または水溶性が１０ｇ／Ｌより大きい、好ましくは５０ｇ／Ｌより大きい、より好ましくは１００ｇ／Ｌより大きい、最も好ましくは１５０ｇ／Ｌより大きい分子に関する。さらに、ｐＨ３（±１）〜ｐＨ１１（±１）の水中で電荷を運ぶことができる種類は安定剤と考えられる。例としてはアニオンまたは潜在的アニオン部を含む分子、例えば、硫酸、スルホン酸、リン酸、ホスホン酸またはカルボン酸基であるが、これらに限定されない。加えて第４級または第３級アミン基のようなカチオンまたは潜在的カチオン部を含む分子もまた用語「安定剤」に包含されるが、これらに限定されない。

本発明の好ましい実施形態では、ペプチドは安定化に必須であり、および／または唯一の安定剤分子として働く。このことはポリウレタン分散液が本質的に他の安定剤分子を含まないことを意味してもよく、本方法ではペプチド以外に安定剤を用いない。

本文脈中で「安定剤」または「安定化に必須」とは水中のポリウレタン（プレ）ポリマー系にコロイド安定化をもたらすペプチドの特性に関し、ポリウレタン（プレポリマー）は、ペプチドがない場合は、たとえ（より小さい粒子径を可能にすることによって、従って浮力効果を下げることによって安定化プロセスを後押しできる）高せん断力を加えても水中でコロイド状に安定しない。

従って、様々な実施形態において、ペプチドを安定化する種類はさておき、追加の安定剤の使用は、ペプチドがない場合には、たとえ高せん断力を加える場合でもコロイド安定性を有するポリウレタン系ｏ／ｗエマルションまたは分散液を得るのに十分でない量に制限されている。

本明細書中で用いられる用語「コロイド安定性」は２８日間にわたる保存で平均粒径の変化が１００％を上回らない、好ましくは５０％以下、より好ましくは２５％、最も好ましくは１０％以下であるエマルションまたは分散液に関する。保存条件は撹拌せずに、直接光に当てずに室温であり、固形分は少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは３０％より多い。乳化後ｐＨおよびイオン強度は変化せず、他の成分、特に安定化のための表面活性成分、レオロジー剤または溶媒を追加しない。しかしながら、必要であれば、適用除外として、保存の際に殺生物剤を０．５％以下の濃度で添加してもよい（例えば、アクティサイドＭＢＳ、Ｔｏｈｒ社）。粒径測定には、下記の原稿に記載されたレーザー回折（ＬＤ）測定を適用することができる。別法として、当初粒径が５００ｎｍ以下の場合、ＩＳＯ２２４２：２００８に従ったｚ−平均によって規定される動的光散乱（ＤＬＳ）を用いることができる。

一般的に、従来技術において知られている安定剤分子は親水性部分と疎水性部分を含み、親水性部分が液滴と相互に作用し疎水性部分は溶媒にさらされる。一般的に用いられる安定剤は界面活性剤であり、電荷を担うことができ、例えばそれらはアニオン性界面活性剤もしくはカチオン性界面活性剤、または非イオン性であってもよい。

しかしながら、外部の界面活性剤の使用を避けるために、そして得られる安定性が増すため、最近では撹拌下、例えば高せん断下で（自己）乳化型エマルションを生成し、または外部の乳化剤の補助なしに水中で安定な分散液を自然発生的に形成するので、（プレ）ポリマー形成時にポリウレタンポリマーに組み込まれる反応性安定剤化合物がより一般的になっている。

これらの反応性安定剤は、ポリウレタン構造に組み込まれるようにイソシアネート反応性官能基を含む、またはイソシアネート反応性官能基で構成される。好ましい種類はポリオールであり、最も好ましくはジオール、または異なるポリオールおよび／またはジオールの混合物である。非イオン性高分子安定剤は知られており、数平均分子量Ｍ_ｎは約４０００ｇ／ｍｏｌ以下、好ましくは約３０００ｇ／ｍｏｌ以下、より好ましくは約１０００ｇ／ｍｏｌ以下である。適当な非イオン性エチレングリコール／プロピレングリコール安定剤は、例えばＢＡＳＦからプルロニック（登録商標）という商品名で市販されているプルロニック（登録商標）ＰＥ３５００といったものである。様々な実施形態において、非イオン性安定剤は６〜２０、好ましくは１０より大きいＨＬＢ（親水性親油性バランス）値を有する。ＨＬＢ値はアルキレンオキシドなどの分子の親水性部分の分子量を分子の総分子量で割ることによって分子の親水性部分を計算し、得られた百分率を５で割ることによって計算される。

上記した安定剤は非イオン性であるが、それらはアニオン基またはカチオン基によって修飾されていてもよい。このような荷電基が存在することによって、分散されたポリマー液滴または粒子の安定性を増すことができる。適当なアニオン基としては、カルボン酸基またはスルホン酸基などの酸性基およびそれらのそれぞれの塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意味でアニオン性安定剤として適当な化合物の具体例は２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（ジメチロールプロピオン酸、ＤＭＰＡ）および分子量Ｍ_ｗが１０００ｇ／ｍｏｌ以下、好ましくは５００ｇ／ｍｏｌ以下のスルホン化ポリジオールである。そのようなスルホン化ポリジオール、例えば分子量Ｍ_ｗが約４３０ｇ／ｍｏｌのプロポキシル化１−メチル−２−メチロール−３−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネートがＧＳ−７Ｑ（Ｙｅｄａｎｇ Ｇ＆Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）という名前で市販されている。

適当なカチオン基としては特に第４級アンモニウム基が挙げられるが、アンモニウム基に限定されない。特に好ましいのはアルコキシル化、好ましくはエトキシル化ココアルキルメチルアンモニウムメタンスルホネートなどのエトキシル化またはプロポキシル化ジアルキルアンモニウムジオールである。そのような化合物はＥｖｏｎｉｋからＲｅｗｏｑｕａｔ（登録商標）という商品名で市販されている。

しかしながら、そのようなポリウレタン粒子の自己乳化を生じるイオン性安定剤は本発明の反応混合物においては用いないのが好ましく、少なくともペプチドがない場合に効果的なコロイド安定化を可能にする量を用いないのが好ましい。

本明細書中で用いられる「反応混合物」という用語は、ポリオールとポリイソシアネートの混合物に関する。本明細書中でポリオールを含む混合物に関して用いられる「ポリオール混合物」とは少なくとも１つのポリオールおよび任意選択で、存在してもよい様々な種類のポリヒドロキシ変性ポリマーなどの任意の追加のポリオール含んでもよい混合物に関する。

ポリオール混合物は有機溶媒や界面活性剤、およびさらなる添加剤を含まず、すなわち、ポリオールのみ、好ましくは上記したもので構成されるのが好ましい。

様々な実施形態において、ポリオール混合物は、ポリオール混合物の重量に対して、約２０〜約１００重量％、好ましくは３０〜１００重量％の少なくとも１つのポリオール、好ましくは異なるポリオール、例えばポリエステルポリオールとポリエーテルポリオール、の混合物を含む。存在する場合、安定剤は、ポリオール混合物の重量に対して約１〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％含まれる。

ポリウレタンプレポリマーの形成に用いられるその他の反応物質はポリイソシアネートである。少なくとも２つのイソシアネート基を含む化合物はどれも本発明の意図する範囲内である。しかしながら、ポリイソシアネートはジイソシアネートであることが好ましい。２より高い官能価のイソシアネート、特にトリイソシアネートを少量混合することも意図され、ある状況下においてはより一層有利である。そのようなポリイソシアネートは架橋剤として働くことができる。ポリイソシアネートが架橋剤として働くこの場合、ヘキサメチレンジイソシアネートに基づくポリイソシアネートが好ましい。適当なジイソシアネートとして、以下に限定されないが、メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）、トルエン−２，４−ジイソシアネート（ＴＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、重合性ジフェニルメタンジイソシアネート（ＰＭＤＩ）、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、メチレン−４，４−ビス（シクロヘキシル）ジイソシアネート（Ｈ１２ＭＤＩ）およびこれらの混合物が挙げられる。脂肪族および芳香族ポリイソシアネートのどちらも本発明の意図する範囲内であるが、ポリイソシアネートは脂肪族ポリイソシアネートであることが好ましい。従って特に好ましい実施形態ではポリイソシアネートは脂肪族ジイソシアネートである。特に好ましい脂肪族ジイソシアネートは、イソホロンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、およびそれらの混合物である。適当なポリイソシアネートは、例えば、Ｂａｙｅｒ社（ドイツ）からＤｅｓｍｄｕｒ（登録商標）という登録商標名で市販されている。

ポリイソシアネートは、反応混合物中の全ポリオールのＯＨ基に対しモル過剰で用いられ、ＯＨ／ＮＣＯ等量比は好ましくは１：１．１〜１：４、より好ましくは１：１．２〜１：１．３である。反応混合物中の少なくとも１つのポリイソシアネートの量は反応混合物に対して一般的に１０〜２０重量％である。反応混合物の残りは上記したようにポリオール混合物で構成されてもよい。

ポリオール混合物を準備することはポリオールを混合し該混合物を加熱する工程を含んでいてもよい。加熱は使用するポリオールが常温で固体であって、溶かしてポリオール混合物を形成する必要がある場合は必須である。好ましい実施形態において、ポリオールを合わせて真空下該混合物を撹拌しながら７０〜９５℃、例えば約７５℃に熱し乾燥する。混合後、該混合物を６０℃に冷却しイソシアネートを追加してもよい。

ポリオール混合物は続いて反応混合物中の少なくとも１つのポリイソシアネートに結合しプレポリマーを形成する。プレポリマー反応は通常約７０℃〜約９５℃、より好ましくは約８０℃の昇温で１〜２時間に亘って生じる。反応は通常、添加される触媒、好ましくはスズ、ビスマスまたは亜鉛系触媒、より好ましくは、ジメチルジネオデカノエートスズ、例えばＦｏｍｅｒｅｚ ＵＬ２８の商品名（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ 社、ドイツ）で市販されている触媒の存在下で行われる。別の高反応性の触媒はＢｏｒｏｃｈｉＫａｔ３１５およびＢｏｒｏｃｈｉＫａｔ０７６１の商品名（ＯＭＧ Ｂｏｒｃｈｅｒｓ 社、ドイツ）で市販されているビスマス−ネオデカノエートおよびＺｎ−ネオデカノエートである。本発明の好ましい実施形態では、反応混合物は従ってさらに上記の触媒を含む。

反応は遊離イソシアネート分がジブチルアミンでの標準滴定により測定された計算値に達するまたは非常に近づくまで続く。プレポリマー中の遊離イソシアネート分の好ましい値は混合物中の安定剤、およびポリイソシアネートを含むポリオール全量に対して０．２〜３重量％、好ましくは１〜２重量％である。

本明細書中で用いられる「約」はそれが言及する数値の±１０％、好ましくは±５％に関する。従って約７０℃とは７０±７、好ましくは７０±３．５℃に関する。

先に述べたように、ポリウレタンプレポリマー形成反応において、ポリイソシアネートはヒドロキシル基と完全に反応するのに必要な化学量論濃度を超えた濃度で反応する。用いる過剰量は１：１．１〜１：４のＯＨ／ＮＣＯ等量比を含んでもよい。好ましくは、ポリイソシアネートの量はヒドロキシル基と完全に反応するのに必要な化学量論濃度を超えた２０％〜１５０％である。

ひとたび遊離イソシアネート分が所定の値に達すると、上記のように温度は６０℃まで下がる。続いて形成されたプレポリマーはアセテートまたはアセトンなどの適当な溶媒に溶解してもよいが、これに限定されない。

様々な実施形態において、プレポリマーは数平均分子量Ｍ_ｎ３０００〜１２０００、好ましくは４０００〜６０００ｇ／ｍｏｌである。

様々な実施形態において、プレポリマーは、例えば結晶化度が２０％以上、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも５０％の結晶性セグメントを含む。結晶化度は上記のように、例えばＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で加熱率１０Ｋ／分で測定される。結晶化度を試験する場合、乳化前および／または鎖延長前の低分子のプレポリマーを用いて行うべきである。プレポリマーはこの目的のために適当な末端キャップ剤、例えばジブチルアミンで末端キャップするのが好ましい。結晶化度の結果は適用したポリオールの文献値と比較すべきであり、またはＸ線測定により確認するのがより好ましい。所与のポリマーの半結晶化度は熱履歴に依存しているため、重合性および半結晶性材料を少なくとも２４時間、好ましくはＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計で定義されるそれぞれの融点以下の５ケルビンの温度で１週間保持しなければいけない。

様々な実施形態において、必要であればこの段階でプレポリマーを適当な中和剤で中和してもよい。一般的に、これはイオン性安定剤を用いる場合にのみ必要である。例えば、アニオン性酸安定剤を用いる場合、トリエチルアミンなどのアミン塩基を中和に用いてもよい。

このように形成されたプレポリマーはその後ペプチドを含む連続水相に分散する。連続水相は、溶媒として、好ましくは主に（５０体積％より多い、好ましくは８０体積％より多い、より好ましくは９０体積％より多い）、またはもっぱら（すなわち１００体積％）の水を含む、すなわち他の溶媒を含まない。しかしながら、水相は他の溶質、特にペプチドを含んでもよく、所望であれば塩および緩衝物質も含んでもよい。

分散は激しい撹拌下で達成することができる。様々な実施形態において、プレポリマーは有機溶媒の溶液の形態で用いられ、溶液はその後水に乳化させる。分散工程は常温または昇温、例えば約２０〜６０℃の範囲、例えば約４０℃で行うことができる。分散工程は機械的撹拌のみによって、または高圧ホモジナイザー、微細流動化装置などの分散機、またはULTRA-TURRAX（登録商標）分散機などのロータ／ステータ分散機によって行ってもよい。

分散工程は液状のポリウレタンプレポリマーを連続水相、好ましくは水に乳化させプレエマルションを形成し、プレエマルションを均質化して安定なミニエマルションを形成する。ミニエマルションを形成するためのプレエマルションの均質化は、例えば高圧ホモジナイザーによって、せん断力の作用、好ましくは高せん断力下で達成することができる。ホモジナイザーのエネルギー入力はエマルション１リットル１秒当たり１０^３〜１０^５の範囲である。

一般的に分散工程、好ましくは、均質化工程は高せん断プロセスで行ってもよい。好ましくは、高せん断プロセスは高いせん断力を加えることに関し、高せん断プロセスは、（ａ）少なくとも１００００００／ｓのせん断速度、および／または
（ｂ）エマルション１リットル１秒当たり少なくとも１０^３ジュールの１回当りのエネルギー入力を加えるものと理解される。

分散工程のために、プレポリマーは好ましくは液状で用いる。すなわちプレポリマーが室温で液体または、室温で固体の場合、プレポリマーは、アセトンまたはエチルアセテートなどであるがこれに限定されない適当な有機溶媒に溶解または融解する。有機溶媒を用いる場合、有機溶媒は後で既知の手段、例えば回転式蒸発器により分散液から取り除いてもよい。

本明細書中で用いられる「ミニエマルション」または「エマルション」という用語は水中油（Ｏ／Ｗ）エマルション、すなわち水が過剰に用いられて連続媒体になっているエマルションに関する。上記したプロセスにおいて、一般的に５０〜５００ｎｍの範囲の大きさを有するペプチドコロナの付いたポリウレタンプレポリマーの安定な液滴／粒子が得られる。図１に概略的に乳化工程を示す。

ペプチドとの反応に加えて、プレポリマーの残りのイソシアネート末端基は、少なくとも２つの末端ＮＣＯ反応基を含む、例えばヒドラジンなどのジアミン、アルキレンジアミンまたはシクロアルキレンジアミン、好ましくはエチレンジアミン、イソホロンジアミン、ピペラジン、またはポリエタノールアミンを含む適切な鎖延長剤と反応させてもよい。１，４ブタンジオールおよび２−ブチル−２−エチル−１，３−プロパンジオールを含むがこれに限定されないアルキルジオールなどのジオール、または水も用いることができる。鎖延長反応は本質的にイソシアネート基の完全な転換まで行ってもよい。すなわち、遊離イソシアネート基がもはや検出不可能になるまで鎖延長剤を継続的に加える。一般的に鎖延長反応はイソシアネート基が完全に転換するまで行うのが好ましい。転換は当業界で確立した技法、例えば赤外分光法によって監視することができる。しかしながら好ましい実施形態では、多数の部位でポリウレタンプレポリマーと共有結合的に反応することができる安定化ペプチドを唯一の鎖延長剤として用いる。これによって確実にポリウレタン粒子表面はペプチド部分で飽和する。触媒が存在していることや高温であることも必要である。

本発明のプロセスはさらに（３）未反応のペプチドからペプチドで安定化したポリウレタンポリマー粒子を分離する工程を含んでもよい。この工程は例えば透析またはクロマトグラフィーなどの他の適当な技法によって達成してもよい。

すでに上述したように、ペプチドで安定化したポリウレタンポリマー粒子はペプチドコロナが付いたポリウレタン粒子である。ポリウレタンプレポリマーは荷電モノマーや構成成分なしに合成することができ、分散液も追加の安定剤を含まないので、安定化はもっぱら粒子表面に結合／吸着したペプチド部分、すなわちペプチドコロナによって得ることができる。従って、様々な実施形態において、ポリウレタンプレポリマーは本質的に荷電基や荷電単量体単位を含まない。ペプチドコロナによる安定化およびプレポリマーにおいて安定化剤ユニットの使用省略が見込まれることで、上記のようにある程度の結晶化度を有するプレポリマーも使うことができる。

本文脈で用いられる「本質的に含まない」または「本質的にない」は分散液および／または組成物が５重量％未満、好ましくは２重量％未満、より好ましくは１重量％の所与の成分を含む。

形成された水性ポリウレタン分散液は固形分が５〜７０重量％、好ましくは１５〜６０重量％、より好ましくは２０〜５５％、最も好ましくは３０〜５０％である。

すでに先に言及したように、上記プロセスによって得られるペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液もまた本発明の一部をなす。

ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液は化粧用、治療用製品および組成物、接着用途および防食などの様々な分野で用いることができるこれらに限定されない。接着用途は皮（靴）および木材など基材の張り合わせ用途を含む。そのような組成物はさらなる成分を含むことができるが、そのすべては当分野において周知である。従ってそのような使用および組成物自体、特に頭髪用化粧品などであるがこれに限定されない化粧用組成物もまた本発明に含まれる。

本プロセスおよび方法に関して本明細書中に開示されたすべての実施形態は、開示された分散液、組成物、および使用に同様に適用でき、その逆も同様であることが理解されよう。

すべての引用文献は本明細書中にその全体において参照として組み込まれる。

以下の実施例を挙げて本発明を説明する。これらの実施例は例示目的のみのために挙げられているので、本発明がこれらの実施例に限定されると解釈すべきではない。

材料および方法
化学薬品
ポリ（オキシプロピレン／オキシエチレン）グリコール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｌ−６１， Ｍ ＝ ２１１７ ｇ／ｍｏｌ）をカナダのダウ・ケミカル・カナダ社から得た。ポリエステル樹脂（Ｒｅａｌｋｙｄ ＸＴＲ ２０１１２，Ｍ＝２１１７ｇ／ｍｏｌ）をイタリアのアルケマ・コーティング・レジン社から得た。アルコール末端ポリジメチルシロキサン（Ｔｅｇｏｍｅｒ Ｈ−Ｓｉ ２３１１，Ｍ＝２２００ｇ／ｍｏｌ）をドイツ、エッセンのエボニック社から得た。イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ，Ｍ＝２２２．２９ｇ／ｍｏｌ）をドイツのシグマアルドリッチケミー社から得た。スズ系触媒（Ｆｏｍｒｅｚ ＵＬ−２８）をドイツのＭｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社から得た。加水分解したペプチド混合物ケラテックＩＦＰ ＰＥはドイツのクローダ社より供給され、使用前に凍結乾燥した。消泡剤Ｆｏａｍａｓｔｅｒ ２２３をドイツのコグニス社から得た。エチルアセテート（ＥＡ）をドイツのシグマ−アルドリッチケミー社から得て、分子篩で乾燥した。他のすべての薬品は得たものをそのまま用いた。

ＦＴＩＲ
ＦＴＩＲ測定
ドイツ、ＥｔｔｌｉｎｇｅｎのＢｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｋ社のＡＬＰＨＡ ＦＴ−ＩＲスペクトロメータを用いてＦＴＩＲ測定を行った。スペクトロメータをプラチナＡＴＲ単一反射ダイヤモンドＡＴＲモジュールで操作を行った。測定に先立って取り出した各試料は真空オーブン中室温で３０分間乾燥し、水を除去した。

ＢＣＡ分析
ＢＣＡ分析を行うために、各合成（０重量％、４重量％、６重量％、および８重量％ペプチド）の各バッチからの（１．５ｈ、３ｈ、１８ｈ、４２ｈ、６６ｈ、１６６ｈ）の１０ｍＬの透析用水試料を凍結乾燥し、１００μＬの脱イオン水に再溶解した。同じことを１．２５×１０^−３重量％、２．５０×１０^−３重量％、７．５０×１０^−３重量％、１．５×１０^−２重量％、３．０×１０^−２重量％、７．５０×１０^−２重量％、および１．０×１０^−１重量％ペプチドの脱イオン水溶液を含む対照試料を用いて行った。ＢＣＡ希釈標準溶液を２５ｍＬの試薬１および５００μＬの試薬２を加えることによって調整した。分析する各溶液から、２５μＬを３回採り、９６穴プレートに入れた。２００μＬの希釈標準溶液を加え、該プレートを用いて４０℃で１時間培養した。これをまた、比較のために、２５μＬの脱イオン水を用いて３回行った。蛍光強度をスイス、Ｍaeｎｎｅｄｏｒｆのテカングループ社のＴｅｃａｎ Ｍ１０００ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）プレートリーダーを用いて波長５９０ｎｍで測定した。

ゼータ電位
ゼータ電位測定を英国、マルバーンのマルバーン・インストゥルメント社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて行った。付着していないペプチドによる干渉を避けるため、透析後の試料を測定した。ペプチドの付着していない試料だけは合成後安定ではないので、合成してすぐに測定した。

レーザー回折（ＬＤ）
レーザー回折測定は、ドイツ、ＨａａｎのＲｅｔｓｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＨｏｒｉｂａ ＬＡ−９５０粒子分析器を用いて行った。合成された各試料（０重量％、４重量％、６重量％、および８重量％ペプチドを使用）を合成後１か月間毎週３回測定した。

透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
ＴＥＭ試料の調整には８重量％ペプチドを含む希釈分散液を一滴炭素被覆したグリッドに塗布した。水をフード下、室温で蒸発させた。ＴＥＭ画像はドイツ、フランクフルト、ＦＥＩ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ社のＴｅｃｎａｉ Ｆ２０を用いて加圧電圧２００ｋＶで測定した。

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＤＳＣ実験については、膜を０重量％、４重量％、６重量％、および８重量％ペプチドおよび分散前のプレポリマーで作成した。結晶性ドメインの融解、結晶核形成および成長をそれぞれ可能にするために、膜は７０℃で１時間保存し、その後５度で１時間、および４０℃で３日保存した。

実施例１： ＰＵＤｓの合成
ＰＵプレポリマーの合成
Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｌ−６１（１２．５０ｇ、５．９０５ｍｍｏｌ）、Ｒｅａｌｋｙｄ ＸＴＲ ２０１１２（３５．２１ｇ、１６．６３ｍｍｏｌ）、およびＴｅｇｏｍｅｒ Ｈ−Ｓｉ ２３１１（６２．５０ｇ、２８．４１ｍｍｏｌ）を８０℃まで熱して溶融した。その後真空（Ｐ＜０．１ｍｂａｒ）を１時間適用し微量の水を除去した。Ｎ_２をフラスコに送り込み温度を７０℃まで低下させた。ＩＰＤＩ（１４．７９５ｇ、６６．５５７ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気および還流下、Ｆｏｍｒｅｚ−ＵＬ−２８（０．０１ｇ）を加えることで反応に触媒作用を及ぼした。最初の温度上昇後、反応は８０℃で行った。ＮＣＯ含量を逆滴定法で理論残存率が１．０５％に達するまで（２時間）３０分毎に確認した。

ペプチド混合物ケラテックＩＦＰ ＰＥの特徴化
ペプチド混合物中の異なるアミノ酸残基のＰＵのＮＣＯ末端基への反応性を確保するために、ペプチド混合物を等電点電気泳動法（ＩＥＦ−ＰＡＧＥ）で分析した。加水分解したペプチド混合物は、等電点が３．９、６．０のペプチドおよび等電点が４．２〜４．８のペプチドで構成されていると判断される。確実に多量の残渣が利用可能で、ポリマー中のＮＣＯ末端基と反応するように、ペプチド混合物の最も高い等電点を優に上回るｐＨ、すなわち６．５〜６．８のｐＨが分散水には選択される。加水分解したペプチドを追加の酸または塩基を加えないように水中に溶解するとこれらのｐＨ値に到達した。

ペプチドをＰＵポリマーに反応性ＮＣＯ末端基を用いてカップリングする場合、ＮＣＯ基が一般的にありとあらゆる種類の、水を含む求核原子と反応可能であるので、ｐＨを注意深く管理することは根本である。従ってＰＵがペプチドの水溶液と接触する場合、ペプチド中の反応基は水分子と競争してイソシアネート基と反応する。ＮＣＯ基のペプチドの求核原子との反応を水分子との反応よりも有利にするために、カップリングをペプチドが全体的に負の電荷を有する６．５〜６．８のｐＨで行った。さらに以下に記載されるように、利用する高せん断力がさらに大きな、おそらく立体障害ペプチドのＮＣＯ基との反応に有利に働くカップリングは（分散液がすでに形成された後で行うのとは対照的に）分散工程中に直接行われた。

分散
乾燥エチルアセテート（１２５ｇ）を激しい撹拌および還流下でプレポリマーに加えた。プレポリマー溶液から各３５．５ｇを４バッチ取り出した。それぞれの溶液に消泡剤を１滴加えた。０．７０９８ｇ、１．０６４７ｇ、および１．４１９６ｇのペプチド（ＰＵプレポリマーに対して４、６、および８ｗｔ．％にそれぞれ相当）を含む３つの溶液を調整し、各々に脱イオン水を加えて全重量を７０．０ｇにした。陰性対照には７０．０ｇの脱イオン水を用意した。連続相の量は、分散後、系中の最初のＮＣＯの濃度が０．１７５重量％であるように選択した。プレポリマー溶液およびペプチド溶液を４０℃に熱した。その後１３０００ｒｐｍで１０分間作動するＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸを用いて４つの分散液を形成した。その後各分散液をホモジナイザーに４回通した。

透析
付着していないペプチドを分散液から分離するために、分散後透析を行った。製造者情報によると、ペプチドはかなり大きな分子量（５００００ｇ／ｍｏｌ以下）の断片を含むとのことである。従って透析膜は分画分子量（ＭＷＣＯ）が１００ｋＤａのセルロースエステルでできた透析膜をドイツ、ＫａｒｌｓｒｕｈｅのＣａｒｌ Ｒｏｔｈ社から得た。透析に先立って、透析膜を約２５センチ長さの４つの断片に切断し、これらを保存剤の除去のために脱イオン水に３０分間浸した。各膜片を４０．００ｇの分散液（０重量％、４重量％、６重量％、および８重量％ペプチド含有）の１つで充填しクランプで閉じた。４０００．００ｇの脱イオン水を含む４つの透析浴を準備し合計で１週間透析を行った。この透析用水は１．５時間、３時間、１８時間、４２時間、６６時間、および１６８時間後に替えた（１週間）。流れ出たペプチドを定量することができるように透析水の試料は取っておいた。

実施例２：ＰＵＤの分析
ペプチドの付着形態の調査および付着ペプチドの定量
ＩＥＦ調査および６．５〜６．８のｐＨ動作範囲の同定後、ＰＵポリマーを合成し、エチルアセテートに溶解し、実施例１に記載したようにプレポリマーに関して濃度の異なるペプチド（０重量％、４重量％、６重量％、および８重量％）に分散した。

どのくらいのペプチド混合物が共有結合的にＰＵＤに結合したか、どのくらいがポリウレタン粒子に吸着したか、およびどのくらいが全く作用しなかったかを評価するためにＦＴＩＲ測定およびＢＣＡ分析を行った。

ＦＴＩＲ測定のために、分散前のＰＵプレポリマーのエチルアセテート溶液のおよび分散後の加水分解ペプチドの量が異なるＰＵＤ分散液の試料を直接真空乾燥し、直ちに２３００ｃｍ^−１付近のＮＣＯバンドのピークを分析することによって測定した。乳化前のＰＵとペプチドなしで乳化したＰＵＤとの間にＮＣＯピークの有意な減少は無く、乳化時のＮＣＯ基の水との副反応は無視できることがわかる。また、ペプチドなしで形成した分散液に関して、はっきりとしたＮＣＯピークの低下がペプチドを含むすべての分散液に見られた。この通常の減少はペプチド混合物とＮＣＯ基との反応が生じているためである。異なる量のペプチドを用いた乳化では特筆すべきＮＣＯピークの違いは検出できなかった。ＦＴＩＲ測定の結果を図２に示す。

この分析を補うために、吸着量および反応現象を定量するために、分散液を透析し、透析用水バッチをＢＣＡ分析を用いて分析した。この分析はペプチドとアルカリ性Ｃｕ^２＋とが反応して紫色の錯体を得るビューレット反応に依存するものである。錯体の強度は存在するペプチドの量に比例して増加することが示されている。付着したペプチドの正確な量を定量することができるように、異なる量の加水分解ペプチドの参照測定も行われた。５９０ｎｍで測定した相対蛍光強度はペプチド濃度に対して直線的に増加した。図３はＢＣＡ分析の結果を示す。値は３回の独立した実験の平均を表す。

図３ａはどのくらいのペプチドが透析中の異なる時点で分散液から流されたかを示しているが、図３ｂは異なる試料についてポリウレタン粒子に付着したペプチドの総量を示す。図３ｂは付着したペプチドの総量を示す。ペプチドの存在量が増加するにつれて付着したペプチドの量が増加することがわかる。この観察結果は界面がまだペプチドで飽和していなかったことを示している。ＮＣＯ基と共有結合できるペプチドの量に関しては、全ての試料でまだ反応性ＮＣＯ基が残っているので、ここに見られる観察結果は当然である（図２参照）。ポリウレタン粒子に吸着するペプチドの量に関しては、粒子／水界面はまだペプチドで飽和しておらず、すなわち一層大きなペプチドコロナを可能にするためにさらに多くのペプチドが吸着できそうだ。

粒子安定性および形態
他の側面はペプチドによるポリウレタン分散液の安定化についての調査であった。実験については、ペプチドとの電荷相互作用を避けるために、ポリウレタン粒子に静電的安定化を付与することができる部分を含まないポリウレタンバックボーン構造が選択された。先に述べたように、合成される大部分のポリウレタン分散液は、通常安定性に非常に重要なスルホン酸基またはペンダントカルボン酸基のために負電荷を含む。しかしながら、ペプチド成分による安定化によってポリウレタン分散液に追加特性を付与することもできる。すなわちｐＨ、温度、イオン強度などのほんのわずかな変化によって沈殿する刺激応答性ペプチドを用いることによって、この応答性をポリウレタン粒子へ移動できるかもしれない。

等電点の低いペプチドの混合物を用いると、アニオン安定化が付与されることが示されている。従って透析後の粒子のゼータ電位を測定した。結果を図４に示す。ポリウレタン分散液に付着したペプチドが粒子に負電荷を付与するのに対して、ペプチドがない粒子は実質的に変化がないことがはっきりとわかる。さらに、ペプチドで被覆された粒子はゼータ電位が−２９ｍＶ〜−４０ｍＶであり、これらの電位は粒子の最初のアニオン安定化には十分であることを示している。厳密値の差はペプチドとポリウレタンとの相互作用が複雑で分散溶液の濃度に大きく依存しているという事実を示しており、このことはコロイド安定性のような特性、界面の組成などが適合するように系をさらに意のままに調整できることを示している。

レーザー回折測定（ＬＤ）を用いて粒子安定性も調査した。系の中で時間と共に形成されるより大きな粒子および凝集物をより正確に測定するために動的光散乱（ＤＬＳ）ではなくこの手法が用いられた。測定は毎週１か月にわたって行われた。結果を図５に示す。

ペプチドがないと、不安定でほとんど間をおかずに直径約１ｍｍの非常に大きい凝集物が生じることがわかった。図５ａは４重量％加水分解ペプチドでは、最初は中位径が約９００ｎｍのやや広い粒度分布の粒子を合成することができ、１週間凝集物を形成することなく安定した状態を保った。１４日後、３つの異なる粒径ピークが測定された。そのうちの１つは大変大きな粒径（＞１０μｍ）であり、粒子が不安定になり凝集が生じたことを示している。この三峰性の粒度分布は次の測定でも見られた。さらに、最大径のピークは２つのサブミクロンピークの崩壊に比例して広がり、１４日後には安定した分散液はもはや存在しないことを示している。６重量％加水分解ペプチドを合成に用いた場合（図５ｂ）、当初の粒径は４００ｎｍに減少しているが、粒度分布はむしろ広く７日目で測定時に凝集が見られる。しかしながら８重量％ペプチドを用いた場合（図５ｃ）、中位径が２００ｎｍに減少し粒度分布が狭い（図５ｃ）。この小さな粒径と狭い粒度分布が１月後でさえも変わりがないことに注目することも非常に興味深い。

粒子形態を調査するためにＴＥＭを行った。例として８重量％ペプチドを含む試料の結果を図６に示す。図６は総合的な粒子形態を示しており、ＬＤ測定で見られたやや広い粒度分布と一致する。また粒子の全体の形は、ポリウレタンの硬質セグメントの通常は室温以下のガラス転移温度に由来する。興味深いことに粒子内ではラメラ構造が視認でき、これらのラメラ構造は図６ｂにより詳細に描写されている。これらのラメラ構造はたぶんポリエステルリッチなセグメントの結晶化の第一段階である。

熱的特性
ペプチドで機能化した分散液の熱特性をさらに明らかにするために、各膜の示唆走査熱量測定を行った（図７、結果は２回の測定の平均値として示している。エラーバーは標準誤差を表す。）これに先立って、均一な熱履歴を作成しそれによって結晶化を制御するために膜を加熱および冷却プロトコルに付した。図７ａは温度の関数としての熱流量を示す。際立ってプレポリマーが最も顕著なそして最も狭い溶融ピークを有する（Ｔ_ｍが５０℃）が、これはたぶん短鎖ポリウレタンプレポリマー鎖は膜中で最も可動性が高いので、形成される晶子の大きさが極めて揃っているという事実によるものである。一方、ペプチドなしに分散した試料は低温（３９℃および４８℃）で２つの溶融ピークを示し、このことはもとをたどれば分散した試料が完全に加水分解された事実にたどりつくことができる。長いポリウレタン鎖の可動性がより低いのは、（加水分解中に形成された）尿素結合の存在によって増加した効果である。ウレタン結合に関連するウレア結合によって形成されたより強い水素結合のために、膜の可動性はさらに低下し、結晶の大きさや形態の変動を予想することができる。結果として溶融ピークは多数で溶融ピーク幅がより広くなる。この一般的な観察結果はペプチドを有する試料でも得ることができるが、その場合効果はあまりはっきりしない。興味深いことに、溶融エンタルピーの低下が分散中存在するペプチドの量と共に増加するが、このことはさらにペプチドの共有結合が生じていることを示している。ペプチドがさらにいっそう結晶化を妨害し、尿素結合およびこの効果は明らかに付着したペプチドの量と共に増加するということが結論づけられる。この傾向はさらに図７ｂに示す溶融エンタルピー値によってさらに強調される。プレポリマーに関しては、測定されたエンタルピーは３９Ｊ／ｇであり、この値は分散試料では１６Ｊ／ｇに低下する。ペプチドを含む試料の値も同様で、ペプチドの量が増加するとともに６〜６Ｊ／ｇに低下する。重ねて、これらの結果はおそらく共有結合したペプチドの増加による膜の可動性の低下を強調するものである。

Claims (16)

1. ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液（ＰＵＤ）を製造する方法であって、
   （１）ＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを準備すること、および
   （２）前記ＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを連続水相に分散させ、それによってペプチドで安定化した水性ポリウレタン粒子を形成することを含み、前記連続水相が１つ以上のペプチドを含む水溶液である、方法。
2. 前記水溶液が、プレポリマーの全重量に対して１つ以上のペプチドを４重量％以上、好ましくは４〜２０重量％、より好ましくは６〜１０重量％の量で含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記水溶液が、１つ以上のペプチドの等電点より高いｐＨを有し、１つ以上のペプチドの等電点は場合により７以下である、請求項１または２に記載の方法。
4. １つ以上のペプチドが、場合により天然タンパク質の加水分解により得られるペプチド混合物である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 工程（１）が、
   （ａ）好ましくは４００ｇ／ｍｏｌ〜１００００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎを有する少なくとも１つのポリオール、および
   （ｂ）少なくとも１つのポリイソシアネート、好ましくは少なくとも１つの脂肪族ジ−および／またはトリイソシアネート
   を含む反応混合物からＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを形成することを含み、少なくとも１つのポリイソシアネートを、反応混合物の少なくとも１つのポリオールのヒドロキシ基に対してモル過剰で用いてＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーを得る、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 少なくとも１つのポリオールが、
   （ａ）ポリエーテルポリオール、および／または
   （ｂ）ポリエステルポリオール、および／または
   （ｃ）ポリジメチルシロキサンポリオール
   を含む、請求項５に記載の方法。
7. 反応混合物が、
   （ａ）４００ｇ／ｍｏｌ〜５０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎ、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも５０％の結晶化度、および３０℃〜１５０℃、好ましくは４０℃〜１２０℃、より好ましくは４０〜８０℃の範囲の融点Ｔ_ｍを有し、結晶化度および融点はＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定される少なくとも１つの結晶性または半結晶性ポリオール、好ましくはポリエステルポリオール、および場合により、
   （ｂ）４００ｇ／ｍｏｌ〜５０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量Ｍ_ｎ、１０％未満の結晶化度、および−６０℃〜４０℃、好ましくは−４０℃〜３０℃の範囲のガラス転移温度Ｔ_ｇを有し、結晶化度およびガラス転移温度はＩＳＯ１１３５７に準拠して示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定される少なくとも１つの非結晶性ポリオール、好ましくはポリエーテルポリオールを含み、
   ポリオール（ｂ）に対するポリオール（ａ）のモル比が１：１０〜１０：１の範囲である、請求項５または６に記載の方法。
8. （１）少なくとも１つのポリイソシアネートが、組み合わされるポリオールのヒドロキシ基に対してモル過剰で用いられ、ＯＨ／ＮＣＯ等量比が好ましくは１:１．１〜１：４であり、および／または、
   （２）少なくとも１つのポリイソシアネートが、好ましくはイソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、ＩＰＤＩまたはＨＤＩに基づく重合ポリイソシアネート、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのジイソシアネートまたはトリイソシアネートである、
   請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
9. ＮＣＯ末端ポリウレタンプレポリマーが、
   （ａ）有機溶媒の溶液の形態で用意され、および／または、
   （ｂ）３０００〜１２０００、好ましくは４０００〜６０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有し、および／または、
   （ｃ）結晶性部分を含み、および／または、
   （ｄ）荷電基または単量体単位を本質的に含まない、
   請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 工程（２）が、
    （ａ）連続水相でポリウレタンプレポリマーを乳化してプレエマルションを形成すること、および、
    （ｂ）プレエマルションを均質化して安定なミニエマルションを形成すること
    を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 分散工程（２）、好ましくは均質化工程が、
    （ａ）高せん断プロセス、好ましくは（ｉ）少なくとも１，０００，０００／ｓのせん断速度および／または（ｉｉ）１回あたりのエネルギー付加がエマルション１リットル１秒当たり少なくとも１０^３ジュールの高せん断プロセスで行われ、および／または、
    （ｂ）プレポリマーまたはプレポリマー溶液をせん断力の付加下で連続水相に分散させて液滴直径が５０〜５００ｎｍ、好ましくは１００〜４００ｎｍのエマルションを得ることを含む、
    請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. さらに、工程（３）ペプチドで安定化したポリウレタンポリマー粒子を未反応のペプチドから分離すること、好ましくは透析を含む、
    請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. （ａ）ペプチドで安定化したポリウレタンポリマー粒子がペプチドコロナを有するポリウレタン粒子であり、および／または、
    （ｂ）該ペプチドとは異なる追加の安定剤分子が本質的に用いられず、または、そのような追加の安定剤の使用量が、高せん断力を加える場合であっても、ペプチドの非存在下でコロイド安定性を有するポリウレタン系水中油型（ｏ／ｗ）エマルションまたは分散液を得るのに必要な量よりも少ない、
    請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により得られる、ペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液。
15. 請求項１４に記載のペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液を含む組成物、好ましくは化粧品または接着剤組成物。
16. 化粧品または接着剤組成物における請求項１４に記載のペプチドで安定化した水性ポリウレタン分散液の使用。

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