JP2017529531A - カテプシンｓ阻害をモニタリングするための方法 - Google Patents

カテプシンｓ阻害をモニタリングするための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、動物の組織試料においてカテプシンS阻害剤活性をモニタリングするための方法に関し、本方法は、（a）カテプシンS阻害剤が投与されている動物の組織試料を準備するか、または、インビトロでカテプシンS阻害剤と接触させた動物の組織試料を準備する工程であって、該組織試料が白血球を含む、工程、（b）工程（a）の組織試料の白血球におけるli p10ペプチドレベルを、フローサイトメトリーにより測定する工程、および（c）白血球におけるli p10ペプチドレベルをカテプシンS阻害剤用量に関連づける工程であって、カテプシンS阻害剤が白血球におけるli p10ペプチドのレベルの増大をもたらす、工程を含む。

Description

本発明は、li p10ペプチドに対する抗体、およびカテプシンS阻害をモニタリングするための方法におけるその使用を提供する。
カテプシンSは、インバリアント鎖シャペロン分子のタンパク質分解性消化、それにともなう、主要組織適合複合体（MHC）クラスII分子によるCD4＋ T細胞に対するまたはCD1分子を介したNK1.1+ T細胞に対する抗原提示の制御における、その決定的な機能について周知である。カテプシンSはまた、MHCクラスIIによるCD4＋ T細胞に対する提示のための外来性抗原の直接プロセシング、またはMHCクラスI分子によるCD8＋ T細胞に対する交差提示に関与するようにも見られる。加えて、カテプシンSは、その分泌形態において、細胞外マトリクスの分解に関係しており、関節炎、アテローム性動脈硬化症、および慢性閉塞性肺疾患を含む、数多くの疾患の病理に寄与し得る。そのため、カテプシンSの阻害は、様々な適応症についての新規治療法の開発のための有望な標的である。
MHCクラスII分子は、抗原性ペプチドを、CD4＋ヘルパー細胞による認識のために抗原提示細胞（APC）の細胞表面上にクラスII-ペプチド複合体として結合および提示する。クラスII-ペプチド複合体の形成および細胞表面上の抗原の提示をもたらす分子機構は、小胞体におけるクラスIIαβヘテロ二量体の合成で始まる。これらのαβヘテロ二量体は、生合成中に、II型膜タンパク質であるインバリアント鎖liのアイソフォームと会合して、αβliの九量体複合体を形成する。αβli複合体は、ゴルジ装置を横切り、細胞内区画に送達される。これらの酸性区画において、liは分解され、最終的にαβli複合体から遊離して、クラスII分子が抗原性ペプチドに結合することを可能にする。liのタンパク質分解性プロセシングは、より短い断片を結果として生じる。システインプロテアーゼであるカテプシンSは、APCにおけるliのプロセシングにおいて鍵となる役割を果たす。カテプシンSは、クラスII-li複合体からインバリアント鎖liを分解し、クラスII-CLIPを生成する。したがって、カテプシンSの阻害は、CLIPペプチドの減少、および前駆断片、すなわちインバリアント鎖li分解ペプチドp10（li p10）の蓄積をもたらす。
EP 1 315 966（特許文献1）は、カテプシンS阻害剤のインビボ投与の効果をモニタリングするための方法を開示している。方法は、カテプシンS阻害剤で処置した対象の血液試料からの白血球の精製、精製白血球の全細胞溶解物の調製、およびインバリアント鎖liのli p10断片の存在についての全細胞溶解物の解析を含む。この方法は、約10〜30 mlの血液試料を必要とし、大きな労働力を要する（白血球の単離および全細胞溶解物の調製）。li p10の検出は、ELISAまたはウエスタンブロットによって行われる。
EP 1 315 966
本発明の目標は、先行技術の方法の欠点の少なくともいくつかを克服する、カテプシンS阻害をモニタリングするためのアッセイを提供することである。
第1の目的において、本発明は、動物の組織試料においてカテプシンS阻害剤活性をモニタリングするための方法を提供し、本方法は、
（a）カテプシンS阻害剤が投与されている動物の組織試料を準備するか、または、インビトロでカテプシンS阻害剤と接触させた動物の組織試料を準備する工程であって、該組織試料が白血球を含む、工程、
（b）工程（a）の組織試料の白血球におけるli p10ペプチドレベルを、フローサイトメトリーにより測定する工程、および
（c）白血球におけるli p10ペプチドレベルをカテプシンS阻害剤用量に関連づける工程であって、カテプシンS阻害剤が白血球におけるli p10ペプチドのレベルの増大をもたらす、工程
を含む。
第2の目的において、本発明は、カテプシンS阻害剤の特定のための方法を提供し、本方法は、
（a）非ヒト動物を試験化合物で処置する工程、
（b）白血球を含む工程（a）の動物の組織試料を準備する工程、
（c）工程（b）の組織試料の白血球におけるli p10ペプチドレベルを測定する工程
を含み、無処置の動物の組織試料中の白血球におけるli p10ペプチドのレベルと比較した、工程（a）の試料中の白血球におけるli p10ペプチドのレベルの増大は、カテプシンS阻害剤を示す。
本発明の方法の好ましい態様において、組織試料は血液である。
本発明の方法のさらに好ましい態様において、白血球は、抗原提示細胞（APC）であり、好ましくは、APCは、B細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞から選択され、より好ましくは、B細胞および単球から選択される。
本明細書において使用される抗原提示細胞（APC）という用語は、抗原性ペプチドを（MHC）クラスII-抗原性ペプチド複合体としてその表面上に提示する細胞を指す。APCは、樹状細胞、単球、マクロファージ、およびB細胞を含む。
第3の目的において、本発明は、
SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含むCDR2、SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むCDR3配列を含むVHドメイン、および、SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含むCDR2、SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含むCDR3配列を含むVLドメイン
を含む抗li p10抗体を提供する。
本発明の特定の態様において、抗li p10抗体のVHドメインは、SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含み、抗li p10抗体のVLドメインは、SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含む。
本発明の抗li p10特異的抗体は、7B8ネオエピトープ抗体と本明細書において呼ばれ、アナウサギ（Oryctologous cuniculus）が起源である。この抗体は、SEQ ID NO：4〜11に開示されているCDRおよびVH、VL配列を特徴とする。
カテプシンSという用語は、パパインスーパーファミリーの中のシステインプロテアーゼを指す。ヒトカテプシンSのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：1に示される。
「インバリアント鎖li」という用語は、主要組織適合複合体のインバリアントポリペプチドまたはCD74を指す。ヒトインバリアント鎖liのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2に示される。
li p10ペプチドという用語は、クラスII会合liペプチドを指す。ヒトli p10のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：3に示される。
本明細書において使用される「MHC IIポリペプチド」という用語は、MHC II複合体を構成するα鎖およびβ鎖を指す。
本明細書において使用される動物という用語は、ヒト、ならびに、例えば、サル、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモット、およびげっ歯類などの非ヒト動物を含む。
「化合物」という用語は、本発明のアッセイと関連して記載される「試験化合物」または「薬物候補化合物」の文脈において、本明細書中で使用される。そのように、これらの化合物は、合成に由来するか、または天然供給源由来の、有機または無機化合物を含む。化合物は、相対的に低い分子量を特徴とする、ポリヌクレオチド、脂質、またはホルモン類似体などの、無機または有機化合物を含む。他の生体高分子有機試験化合物は、約2〜約40アミノ酸を含むペプチド、および、抗体または抗体コンジュゲートなどの、約40〜約500アミノ酸を含むより大きなポリペプチドを含む。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、li p10ペプチドを白血球において検出できることを見出した。本発明の方法は、組織試料、好ましくは全血を、白血球の単離を伴うことなく直接アッセイできるという、先行技術に記載されている方法と比較した利点を有する。本発明の方法においては、本発明の方法中で加工処理することができるために、全血試料からの例えば白血球の単離の必要がない。アッセイが、多数の試料を加工処理しなければならない臨床設定において使用される場合、これは非常に重要である。本発明の方法は、先行技術の方法よりも少ない組織試料、好ましくは血液試料を必要とする。
生物学的試料におけるポリペプチドの検出および／または測定のための方法は、当技術分野において周知であり、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ELISAもしくはRIA、または種々のプロテオミクス技術を含むが、これらに限定されない。li p10ペプチドまたはその断片を認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、例えば、精製タンパク質でウサギを免疫化することによって、ポリペプチドもしくはペプチド断片を検出する目的で生成することができるか、または、ポリペプチドもしくはペプチド断片を認識する公知の抗体を使用することができるかのいずれかである。例えば、ポリクローナル抗体などの、変性タンパク質に結合することができる抗体を、ウエスタンブロットにおいてLI P10ペプチドまたはMHCIIポリペプチドを検出するために使用することができる。ポリペプチドを測定する方法についての例は、ELISAである。このタイプのタンパク質定量は、特異的な抗原を捕捉することができる抗体、および、捕捉した抗原を検出することができる二次抗体に基づく。抗体の調製および使用のための方法、ならびに本明細書において前に述べたアッセイは、Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
li p10ペプチドの検出のための好ましい方法は、フローサイトメトリーである。フローサイトメトリー法は、Handbook of Flow Cytometry Method, J. Paul Robinson (Editor); Flow Cytometry - A Basic Introduction, Michael G Ormerod (2008)およびCurrent Protocols in Cytometry (2010), Wileyに記載されている。この方法において、タンパク質は変性せず、その天然形態に保存されている。
国際公開公報第2010/121918号は、本発明の方法において試験することができるカテプシンS阻害剤を開示している。
ネオエピトープ抗体を用いた、B細胞およびT細胞上のIi p10発現の検出。健常ドナー（R213）の献血から単離したPBMCを、増大する濃度のカテプシンS阻害剤1またはビヒクルと20時間インキュベートした。B細胞（CD20+）およびT細胞（CD3+）上のIi p10検出を、異なるネオエピトープ抗体7B8（黒色）を用いてフローサイトメトリーにより決定した。 ネオエピトープ抗体を用いた、B細胞上のIi p10発現の検出。健常ドナー（R172）の献血から単離したPBMCを、増大する濃度のカテプシンS阻害剤1またはビヒクルと20時間インキュベートした。B細胞（CD20+）およびT細胞（CD3+）上のIi p10検出を、2種の異なるネオエピトープ抗体、すなわち7B8（黒色）および13C4（灰色）を用いてフローサイトメトリーにより決定した。染色指数＝平均蛍光強度（MFI）B細胞／MFIT細胞。 図3A：Ii p10は、カテプシンS阻害剤での処置時にB細胞中に蓄積する。11人の健常ドナー（R39；R185；R198；R204；R209；R140；R154；R175；R213；R4；R214）の献血から単離したPBMCを、増大する濃度のカテプシンS阻害剤1またはビヒクルと20時間インキュベートした。B細胞（CD20+）およびT細胞（CD3+）上のIi p10検出を、7B8ネオエピトープ抗体を用いてフローサイトメトリーにより決定した。染色指数＝MFIB細胞／MFIT細胞。図3B：Ii p10は、カテプシンS阻害剤での処置時にB細胞中に蓄積する。11人の健常ドナー（R39；R185；R198；R204；R209；R140；R154；R175；R213；R4；R214）の献血から単離したPBMCを、増大する濃度のカテプシンS阻害剤2またはビヒクルと20時間インキュベートした。B細胞（CD20+）およびT細胞（CD3+）上のIi p10検出を、7B8ネオエピトープ抗体を用いてフローサイトメトリーにより決定した。染色指数＝MFIB細胞／MFIT細胞。 カテプシンS阻害剤のIC50濃度。11人の健常ドナー（R39；R185；R198；R204；R209；R140；R154；R175；R213；R4；R214）の献血から単離したPBMCを、増大する濃度のカテプシンS阻害剤1、カテプシンS阻害剤2、またはビヒクルと20時間インキュベートした。B細胞（CD20+）およびT細胞（CD3+）上のIi p10検出を、7B8ネオエピトープ抗体を用いてフローサイトメトリーにより決定した。応答曲線およびIC50値を、GraphPad Prismソフトウェアで算出した。 Ii p10ネオエピトープアッセイの長期変動。2つの時点で11人の健常ドナー（R198；R209；R154；R213；R214）の献血から単離したPBMCを、増大する濃度のカテプシンS阻害剤1またはビヒクルと20時間インキュベートした。B細胞（CD20+）およびT細胞（CD3+）上のIi p10検出を、7B8ネオエピトープ抗体を用いてフローサイトメトリーにより決定した。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。 図6A：B細胞中のIi p10蓄積は、ネオエピトープアッセイにより検出される。B細胞（CD20+）上のIi p10検出を、7B8ネオエピトープ抗体クローンを用いてフローサイトメトリーにより決定した。3匹のカニクイザル（カニクイザル（Macaca fascicularis））の献血から単離したPBMCを、増大する濃度のカテプシンS阻害剤1またはビヒクルと20時間インキュベートした。カニクイザル試料のp10染色指数を、B細胞の平均蛍光強度（MFI）を、Forward Scatter Low CD20陰性の（FSCloCD20-）細胞のMFIで割ることによって決定した。図６B：B細胞中のIi p10蓄積は、単一経口用量のカテプシンS阻害剤後にネオエピトープアッセイにより検出される。B細胞（CD20+）上のIi p10検出を、7B8ネオエピトープ抗体クローンを用いてフローサイトメトリーにより決定した。血液を、50mg/kgの単一用量の2時間および7時間後に、動物から収集した。Ii p10ネオエピトープアッセイを、全血において行った。カニクイザル試料のp10染色指数を、B細胞の平均蛍光強度（MFI）を、Forward Scatter Low CD20陰性の（FSCloCD20-）細胞のMFIで割ることによって決定した。 健常な男性および女性ボランティアにおいて単一用量のカテプシン阻害剤1の安全性、耐容性、薬物動態、および薬力学効果を評定するための、単一施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照の単一漸増用量研究に参加している対象から取得した試料についてのp10の定量。前臨床実験において観察されたような予期される対象間変動の影響を説明および限定するために、インターリーブコホート（「リープフロッグ」）設計を使用した。対象を、各々8人の対象の2つのコホート（コホートAおよびB）に動員した。コホート内の各個体について、研究は、無作為化、プラセボ対照、4種の処置、4つの期間、4様式の交差であった。0時間の時点の直後に適用した単一用量を、各図7A〜図7D（コホートA）上に示す。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。 健常な男性および女性ボランティアにおいて単一用量のカテプシン阻害剤1の安全性、耐容性、薬物動態、および薬力学効果を評定するための、単一施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照の単一漸増用量研究に参加している対象から取得した試料についてのp10の定量。前臨床実験において観察されたような予期される対象間変動の影響を説明および限定するために、インターリーブコホート（「リープフロッグ」）設計を使用した。対象を、各々8人の対象の2つのコホート（コホートAおよびB）に動員した。コホート内の各個体について、研究は、無作為化、プラセボ対照、4種の処置、4つの期間、4様式の交差であった。0時間の時点の直後に適用した単一用量を、各図8A〜図8D（コホートB）上に示す。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。 詳細は上記の通り。
実験部分
カテプシンS阻害剤でのインビトロアッセイ
・滅菌ポリスチレン24ウェルプレートを使用する。
・500μlの完全RPMI＋濃度を増大させて（0〜10μM）のカテプシンS阻害剤を添加する。
・500μlのPBMC懸濁液（2×106個）を各ウェルに添加する。
・ウェルの内容物を混合し、プレートを、加湿インキュベーターにおいて＋37℃、5％ CO2で20時間インキュベートする。
FACS染色：
・1×溶解／固定溶液を調製する。
・2×106個のPBMCまたは200μlの血液あたり4 mLのあらかじめ温めた1×溶解／固定溶液を添加する。
・37Cで10分間インキュベートし、細胞を1回、PBSで洗浄して（250×g、5分、RT）、上清を除去する。
・チューブあたり2 mLの1×透過処理溶液を添加する。
・RTで20分間インキュベートする。
・細胞を2回、2 mlのCell Stain Bufferで洗浄して（250×g、5分、RT）、上清を除去する。
・Cell Staining Buffer中の10μg/mLの非標識抗p10抗体を、RTで1時間、添加する。
・細胞を1回、2 mlのCell Stain Bufferで洗浄して（250×g、5分、RT）、上清を除去する。
・Cell Staining中の1:125のPEコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG抗体を、RTで30分間、暗所で添加する。
・細胞を2回、2 mlのCell Stain Bufferで洗浄して（250×g、5分、RT）、上清を除去する。
・抗体（比較対照）または抗体混合物（100μl／試料、Cell Stain Bufferに希釈）を各チューブに添加する。
・+4℃で20分間、暗所でインキュベートする。
・細胞を1回、2 mlのCell Stain Bufferで洗浄して（250×g、5分、RT）、上清を除去する。
・沈殿を200μlのCell Stain Bufferに再懸濁して、FACS上での解析まで細胞を暗所で保存する。
抗体：
Figure 2017529531
材料および緩衝液：
24ウェルプレート、BD、オーダーID：351147。保存：室温、滅菌、ポリスチレン非組織培養処理。
10×BD Phosphoflow Lyse/Fix緩衝液の溶解緩衝液（BD、オーダーID：558049）。保存：+4℃。5×BD Phosphoflow Lyse/Fix緩衝液をH2O bidest.で1×に希釈し、使用する前に、必要とされる温度まであらかじめ温める。10×Phosflow Perm Buffer IVの透過処理緩衝液（BD、オーダーID：560746）。RTで保存。10×BD Phosphoflow Perm Buffer IVをPBSで1×に希釈する。
1×Cell Satining Buffer（BioLegend、オーダーID：420201）。保存：+4C。1×Cell Satining Bufferはそのまま使用できる。CaCl2およびMgCl2を含まない1×PBS（Gibco、オーダーID：14190-094）。保存：室温。PBSはそのまま使用できる。5 mlポリスチレン丸底チューブ（FACSチューブ、BD、オーダーID：352052）。保存：室温。
アミノ酸配列
Figure 2017529531

Claims (12)

  1. （a）カテプシンS阻害剤が投与されている動物の組織試料を準備するか、または、インビトロでカテプシンS阻害剤と接触させた動物の組織試料を準備する工程であって、該組織試料が白血球を含む、工程、
    （b）工程（a）の組織試料の白血球におけるli p10ペプチドレベルを、フローサイトメトリーにより測定する工程、および
    （c）白血球におけるli p10ペプチドレベルをカテプシンS阻害剤用量に関連づける工程であって、カテプシンS阻害剤が白血球におけるli p10ペプチドのレベルの増大をもたらす、工程
    を含む、動物の組織試料においてカテプシンS阻害剤活性をモニタリングするための方法。
  2. （a）非ヒト動物を試験化合物と接触させる工程、
    （b）白血球を含む工程（a）の動物の組織試料を準備する工程、
    （c）工程（b）の組織試料の白血球におけるli p10ペプチドレベルを、フローサイトメトリーにより測定する工程
    を含み、
    無処置の動物の組織試料中の白血球におけるli p10ペプチドのレベルと比較した、工程（a）の試料中の白血球におけるli p10ペプチドのレベルの増大が、カテプシンS阻害剤を示す、
    カテプシンS阻害剤の特定のための方法。
  3. 前記組織試料が血液である、請求項1または2記載の方法。
  4. 白血球が、抗原提示細胞（APC）、好ましくはB細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. APCが、B細胞および単球から選択される、請求項4記載の方法。
  6. 動物がヒトである、請求項1および3〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. 非ヒト動物が、げっ歯類、好ましくはラットまたはマウスである、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. 白血球が、フローサイトメトリーによりli p10ペプチドを測定するために透過処理される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. li p10に対する抗体が、白血球におけるli p10を測定するためにフローサイトメトリーにおいて使用される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. 請求項11または12記載の抗体を使用する、請求項9記載の方法。
  11. SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含むCDR2、SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むCDR3配列を含む、VHドメイン、および、
    SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含むCDR2、SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含むCDR3配列を含む、VLドメイン
    を含む、抗li p10抗体。
  12. VHドメインがSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含み、VLドメインがSEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含む、請求項9記載の抗li p10抗体。
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