JP2017529072A - 圧電検知とループ媒介等温増幅を組み合わせた核酸検出板及び検出システム - Google Patents

圧電検知とループ媒介等温増幅を組み合わせた核酸検出板及び検出システム Download PDF

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Abstract

圧電検知とループ媒介等温増幅を組み合わせた核酸検出板（１）及び検出システムであって、圧電センサ（２）と、当該圧電センサ（２）の表面を通過する少なくとも１本のダクト（３）を含み、ダクト（３）における圧電センサ（２）よりも上流側には２つの弁（４，５）が間隔を置いて設けられており、検出対象の核酸は、圧電センサ（２）を通過する前に２つの弁（４，５）の間のダクト（３）内に密封されて等温増幅する。核酸検出システムは、前記核酸検出板（１）と、当該核酸検出板（１）を収容可能なインキュベータ（９）と、圧電センサ（２）とデータ接続可能な信号プロセッサ（１０）とを含む。等温増幅と圧電検知を組み合わせて連動検出することから、装置の構造が簡略化されるとともに、検出効率が向上する。また、全工程が密閉構造であるため、核酸検出中に発生し得るエアロゾル汚染等の問題を回避可能となるほか、大量生産の実現も容易となる。本検出システムは、血液病原体に起因する、特に血小板の細菌汚染による検出時間の長時間化、ロースループット、高コスト、手順の煩雑さといった従来の課題解決に適用される。【選択図】図１

Description

本発明は核酸検出装置に関し、特に、血液検査に用いられるとともに、圧電検知とループ媒介等温増幅を組み合わせた核酸検出板及び検出システムに関する。
輸血関連感染症の予防と制御は社会全体が関心を寄せるところとなっており、新技術の導入は血液の更なる安全性向上のために重要である。輸血の分野では、提供された血液や血液成分中に何らかの病原体が存在し、輸血による伝搬で被提供者に深刻な臨床結果をもたらす恐れがある。つまり、輸血にはある程度のリスクが不可避である。また、関連する病原体は非常に広範囲にわたり、ウィルス、細菌、寄生虫及び何らかのタンパク質が含まれる。中でも、輸血により伝搬される細菌のリスクはたいへん高く、例えば、血小板製品の細菌汚染リスクはウィルスによる汚染リスクの２５０倍にも達する。そこで、欧州の一部国家では１９９０年から全ての血小板製品について細菌検出を実施しており、２００４年には米国でも血小板製品の細菌検出が必須項目となった。
細菌培養法は、現在公認されているものの中で最も正確な血液細菌検出法であり、欧州、米国、カナダ等の血液サービス機関で広く利用されている。例えば、バクテアラートシステムでは、培養瓶中のＣＯ2濃度を継続的に検出することで細菌濃度を判定するが、検出前に製品を２４ｈ保存して細菌を一定数にしておく必要がある。また、培養が陽性結果となるまでにも一定の時間を要し、通常は７２ｈ以上かかる。一方、Ｐａｌｌ ｅＢＤＳでは、サンプリングバッグ内のＯ2消費量を連続測定することで細菌の汚染状況を検出するが、やはり細菌の培養に２４ｈを要する。つまり、細菌培養法は長時間を要し、対応するシステムの配置やメンテナンスのコストが非常に嵩む。また、細菌の成長には遅滞性があることから、こうした方法では偽陰性が発生しやすい。
高速検出法の場合には、細菌培養法における長時間を要するとの欠点を解消可能となる。例えば、Ｓｃａｎｓｙｓｔｅｍでは、モノクローナル抗体により血小板を凝集させて濾過した後、試料内に残留した細菌ＤＮＡに対して浸透剤と蛍光標識を用い、レーザースキャニングすることで汚染状況を特定する。これによれば、陽性の検出報告時間を９０ｍｉｎまで短縮可能である。しかし、感度はわずか１０3ＣＦＵ／ｍＬにとどまり、システムでの蛍光信号区分も必要なことから、操作者に対する要求が高く、普及が難しい。そこで、高感度で低コスト、ハイスループットな血小板細菌検出機器を開発することで、血液のスクリーニング検査や臨床診断時の輸血の安全性に対するニーズに応えるとともに、血液の細菌汚染率を低下させ、輸血の安全性を保証することが現在求められている。
また、核酸増幅については、現在のところ大多数が従来のＰＣＲ法を用いている。しかし、当該方法には、特異性の低さ、低感度、検出速度の遅さといった課題がある。また、当該技術は操作が複雑であり、計器や機器に対する要求が高いため、現場で求められる迅速診断のニーズに応えることは難しい。
従来技術の瑕疵に対し、本発明は、圧電検知とループ媒介等温増幅（以下、等温増幅と略称）の利点を有機的に組み合わせ、核酸検出の感度と速度を向上させるとともに、核酸検出における操作の難度と検出コストを低下させることが可能な核酸検出板及び検出システムを提供することを目的とする。
一方で、核酸は非常に汚染されやすいため、全工程を密閉環境下に置いて検出を実施するのが最適である。しかし、この場合には検出時間が長くなり、コストの高騰が招来される。また、操作手順も煩雑となり、操作者に対する要求が高くなるため、利用の普及が難しい。そこで、本発明では、完全な密閉環境下での核酸検出において、途中で中断されることなく、且つ核酸が外部と接触することのないワンストップ型の高速検出を実現可能な核酸検出のための全く新しいハード構造を提供することを他の目的とする。
上記の目的を実現するために、本発明では以下の技術方案を用いる。
核酸検出板であって、圧電センサと、当該圧電センサの表面を通過する少なくとも１本のダクトを含み、検出対象の核酸が液状で当該ダクトに導かれ、前記圧電センサの表面を通過する。
前記ダクトには、圧電センサよりも上流側に２つの弁が間隔を置いて設けられており、検出対象の核酸は、圧電センサを通過する前に２つの弁の間のダクト内に密封されて等温増幅されることで、増幅された検出対象の核酸が圧電センによって検知可能となる。
前記核酸検出板において、好ましくは、前記２つの弁は、それぞれ前記圧電センサに近い第１の弁と、前記圧電センサから離れた第２の弁であり、第２の弁の上流側には更に三方弁が設けられており、三方弁のうち一方の分岐口には試料セルが接続されており、当該試料セルは、検出対象の核酸と、核酸増幅のための助剤、及び増幅した検出対象の核酸が圧電センサにより検知されるのを助ける助剤を載置するために用いられ、三方弁の他方の分岐口は前記核酸検出板の外部に接続されており、ダクト内に洗浄液又は緩衝液を導入するために用いられる。
前記核酸検出板において、好ましくは、前記ダクトには、圧電センサよりも下流側に廃液プールが接続されており、当該廃液プールは、圧電センサにより検知された検出対象の核酸を回収し、汚染を防止するために用いられる。
核酸検出システムであって、上述した核酸検出板と、当該核酸検出板を収容可能なインキュベータ、及び前記圧電センサのデータに接続可能な信号プロセッサを含む。
前記核酸検出システムにおいて、好ましくは、前記核酸検出システムは、液体がダクト内で流動するよう駆動するための注入ポンプを更に含む。
前記核酸検出システムにおいて、好ましくは、前記第１の弁、第２の弁及び三方弁はいずれも電気制御弁であり、前記核酸検出板の上方には昇降台が設けられており、当該昇降台における前記第１の弁、第２の弁及び三方弁と対向する位置には伸縮可能な第１のプローブがそれぞれ設けられており、選択的に電気制御弁の開閉を誘発する。
前記核酸検出システムにおいて、好ましくは、前記昇降台における前記圧電センサと対向する位置に伸縮可能な第２のプローブが設けられており、圧電センサと信号プロセッサのデータ接続を選択的に制御する。
前記核酸検出システムにおいて、好ましくは、前記インキュベータにおける前記試料セルの上方と正対する部分には、試料投入口が開設されている。
前記核酸検出システムにおいて、好ましくは、前記試料投入口には密封材が充填されている。
前記核酸検出システムにおいて、好ましくは、前記インキュベータの表面には、管配線のための配線孔が更に設けられ、当該配線孔内に密封材が充填されている。
本発明によれば、以下の有益な効果が得られる。
１）等温増幅と圧電検知を組み合わせて連動検出するため、装置の構造が簡略化されるとともに、検出効率が向上する。また、圧電センサの高特異性によって、核酸検出の感度がいっそう高まり、検出限界が０．１ｐｇ／ｍＬにまで達する。
２）全工程が密閉構造であるため、核酸検出中に発生し得るエアロゾル汚染等の問題を回避可能となるほか、大量生産の実現も容易となる。本検出システムは、血液病原体に起因する、特に血小板の細菌汚染による検出時間の長時間化、ロースループット、高コスト、手順の煩雑さといった従来の課題解決に適用される。
図１は、核酸検出板の構造を示す図である。 図２は、核酸検出システムの構造を示す図である。 図３は、核酸検出システムにおける昇降台の構造を示す図である。 図４は、核酸検出システムにおけるインキュベータの構造を示す図である。
以下に、当業者が明細書の記載を参照して実施可能なように、図面を組み合わせて本発明につき更に詳細に説明する。
図１〜４を参照して、本発明では一実施例の核酸検出板１を提供する。当該核酸検出板１は、圧電センサ２と、当該圧電センサの表面を通過する少なくとも１本のダクト３を含む。ダクト３は複数本としてもよいが、複数の試料を同時に検出可能とするために、各ダクト３は互いに独立させる。検出対象の核酸は液状で当該ダクト３に導かれ、圧電センサ２の表面を通過する。検出対象の核酸が圧電センサ２の表面を通過する具体的形式については特に限定されず、検出対象の核酸と圧電センサ２の検知面との接触が保証されればよい。ダクト３が複数本ある場合には、これに応じて、同数の互いに独立した検知面を圧電センサ２の表面に設けることで、複数経路での検出ニーズに対応する。好ましくは、圧電センサ２は圧電音響波センサとし、より好ましくはＬａｍｂ波センサとする。
ダクト３には、圧電センサ２よりも上流側に２つの弁が間隔を置いて設けられている。検出対象の核酸は、圧電センサ２を通過する前に２つの弁の間のダクト内に密封され、等温増幅される。これにより、増幅された検出対象の核酸を圧電センサ２によって検知可能となる。等温増幅は、圧電センサ２でより吸着検知しやすいように、核酸分子の大きさを拡大することが目的である。２つの弁間の距離が一定であれば、この間のダクト体積を算出可能となり、検出対象の核酸濃度に換算しやすくなる。
上記実施例において、２つの弁はそれぞれ圧電センサ２に近い第１の弁４と、圧電センサ２から離れた第２の弁５である。第２の弁５の上流側には更に三方弁６が設けられており、三方弁６うち一方の分岐口には試料セル７が接続されている。当該試料セル７は、検出対象の核酸と、核酸増幅のための助剤、及び増幅した検出対象の核酸が圧電センサにより検知されるのを助ける助剤を載置するために用いられる。増幅した検出対象の核酸が圧電センサにより検知されるのを助けるための助剤は、一般的には圧電センサの表面を修飾する抗体分子とされる。圧電センサの表面は、修飾されると検出対象の核酸分子を吸着可能となる。なお、いうまでもなく、具体的にどのような修飾分子を用いるかは検出対象の核酸の具体的種類によって決まる。核酸増幅のための助剤と、増幅した検出対象の核酸が圧電センサにより検知されるのを助けるための助剤とは、双方が併存する場合に反応することがない。これらは、検出対象の核酸よりも先に試料セル内に載置される。そして、検出対象の核酸が試料セルに投入されると、三者が第１の弁４と第２の弁５の間のダクト内へと駆動され、増幅を開始する。増幅はそれほど急速に進むわけではないため、三者が一時的に併存しても増幅結果に影響することはない。三方弁６の他方の分岐口は核酸検出板１の外部に接続されており、ダクト内に洗浄液又は緩衝液を導入するために用いられる。三方弁６は、検出の自動化レベルと検出効率を高めるべく、試料セル７内の液体及び緩衝液又は洗浄液の流入をそれぞれ制御するとの作用を奏する。
上記の実施例において、ダクト３には、圧電センサ２よりも下流側に廃液プール８が接続されている。当該廃液プール８は、圧電センサ２により検知された検出対象の核酸を回収し、汚染を防止するために用いられる。
本発明では、一実施例の核酸検出システムを提供する。当該システムは、上述した核酸検出板１と、当該核酸検出板１を収容可能なインキュベータ９と、圧電センサ２のデータに接続可能な信号プロセッサ１０を含む。
本実施例において、核酸検出システムは、液体がダクト内で移動するよう駆動するための注入ポンプ１１を更に含む。注入ポンプ１１は、廃液プール８の上部に接続可能である。
本実施例において、第１の弁４、第２の弁５及び三方弁６はいずれも電気制御弁である。
核酸検出板１の上方には昇降台１２が設けられている。当該昇降台１２における第１の弁４、第２の弁５及び三方弁６と対向する位置には、伸縮可能な第１のプローブ１３がそれぞれ設けられており、選択的に電気制御弁の開閉を誘発する。このような制御は、集積された制御チップにより遂行される。プローブの制御方式は自由に設定可能であり、選択的に、プローブが下降してプローブヘッドに接触した場合に弁を開放し、逆の場合に閉止するとしてもよいし、プローブが下降してプローブヘッドに接触した場合に弁を閉止し、逆の場合に開放するとしてもよい。このほか、昇降台の制御に関しても、実際の必要性に応じて、チップ電動制御、機械式半自動制御、又は完全手動制御を選択してもよい。
本実施例では、昇降台１２における圧電センサ２と対向する位置に伸縮可能な第２のプローブ１４が設けられており、圧電センサ２と信号プロセッサ１０のデータ接続を選択的に制御する。プローブが圧電センサ両端の電極に接触すると、圧電性結晶には逆圧電効果があることから、圧電センサ２の薄膜部分に振動が発生する。また、圧電効果によって、機械的エネルギーが電気エネルギーに変換されることで、電気信号が出力される。当該センサは、センサ表面の質量の変化に応じて振動数が変化するため、これによって検出対象の液体内における検出対象核酸の含有量が算出される。
本実施例において、インキュベータ９における試料セル７の上方と正対する部分には、試料投入口１５が開設されている。試料投入口１５は、試料を投入しやすくするとの作用を奏する。
本実施例において、試料投入口１５には密封材が充填されている。密封材の具体的形式や種類は限定されないが、主として、増幅効率が所期の効果を実現するよう、インキュベータの等温効果を保証するために用いられる。
本実施例において、インキュベータ９の表面には、管配線のための配線孔１６が更に設けられ、当該配線孔１６内に密封材が充填されている。なお、密封材の具体的形式や種類もまた限定されない。
核酸検出システムの動作フローは以下の通りである。
１）インキュベータ９の側板を開放し、核酸検出板１をインキュベータ９内に投入して側板を閉じる。続いて、インキュベータ９を起動して昇温し、増幅に必要な温度まで上昇させる。
２）全ての弁を開放する一方、三方弁のうち試料セル７に接続される分岐口は閉止する。また、注入ポンプ１１によって、緩衝液がダクト３内に導入されるよう駆動して洗浄する。
３）三方弁のうち緩衝液に接続される分岐口を閉止する一方、試料セル７に接続される分岐口を開放する。また、第１の弁４と第２の弁５は連通状態を維持する。続いて、試料投入口１５から試料セル７内に検出対象の核酸液を投入する（助剤は事前に試料セル７内に投入しておいてもよい）。
４）注入ポンプ１１が検出対象の試料を第１の弁４と第２の弁５の間のダクト内に導き、全ての弁を閉止して、検出対象の核酸の等温増幅を開始する。
５）増幅が完了すると、第１の弁４、第２の弁５及び三方弁のうち緩衝液に接続される分岐口を開放し、緩衝液を導入する。このとき、検出対象の核酸が圧電センサ２を通過し、助剤のうちの修飾分子が、検出対象である核酸をセンサ表面に吸着させて質量を変動させることで、センサの振動数が変化する。信号プロセッサ１０は、圧電センサ２の信号位相と振幅の変化を取得し、記録保存する。
６）全ての試料が廃液プール８に吸引されると、緩衝液はセンサ表面を洗浄する。測定完了後に核酸検出板１を廃棄し、新たな核酸検出板１に交換して、次の検出を開始する。図中では検出量が１０経路であるもの、即ち、１つの検出板で同時に１０試料を検出可能なものを示した。
以上、本発明の実施形態について開示したが、これらは本明細書及び実施形態においてのみ運用されるものではなく、本発明に適合する各種分野への適用が可能である。また、当業者であれば、その他の変更も可能である。即ち、特許請求の範囲及び同等の範囲において限定される一般概念から逸脱しないことを前提に、本発明は特定の詳細や、ここで提示及び記載した図示に限定されない。

Claims (10)

  1. 圧電センサと、当該圧電センサの表面を通過する少なくとも１本のダクトを含み、検出対象の核酸が液状で当該ダクトに導かれ、前記圧電センサの表面を通過し、
    前記ダクトには、圧電センサよりも上流側に２つの弁が間隔を置いて設けられており、検出対象の核酸は、圧電センサを通過する前に２つの弁の間のダクト内に密封されて等温増幅されることで、増幅された検出対象の核酸が圧電センサによって検知可能となる核酸検出板。
  2. 前記２つの弁は、それぞれ前記圧電センサに近い第１の弁と、前記圧電センサから離れた第２の弁であり、第２の弁の上流側には更に三方弁が設けられており、三方弁のうち一方の分岐口には試料セルが接続されており、当該試料セルは、検出対象の核酸と、核酸増幅のための助剤、及び増幅した検出対象の核酸が圧電センサにより検知されるのを助ける助剤を載置するために用いられ、三方弁の他方の分岐口は前記核酸検出板の外部に接続されており、ダクト内に洗浄液又は緩衝液を導入するために用いられることを特徴とする請求項１記載の核酸検出板。
  3. 前記ダクトには、圧電センサよりも下流側に廃液プールが接続されており、当該廃液プールは、圧電センサにより検知された検出対象の核酸を回収し、汚染を防止するために用いられることを特徴とする請求項２記載の核酸検出板。
  4. 請求項３記載の核酸検出板と、
    当該核酸検出板を収容可能なインキュベータ、及び
    前記圧電センサのデータに接続可能な信号プロセッサを含む核酸検出システム。
  5. 前記核酸検出システムは、液体がダクト内で流動するよう駆動するための注入ポンプを更に含むことを特徴とする請求項４記載の核酸検出システム。
  6. 前記第１の弁、第２の弁及び三方弁はいずれも電気制御弁であり、
    前記核酸検出板の上方には昇降台が設けられており、当該昇降台における前記第１の弁、第２の弁及び三方弁と対向する位置には伸縮可能な第１のプローブがそれぞれ設けられており、選択的に電気制御弁の開閉を誘発することを特徴とする請求項４記載の核酸検出システム。
  7. 前記昇降台における前記圧電センサと対向する位置に伸縮可能な第２のプローブが設けられており、圧電センサと信号プロセッサのデータ接続を選択的に制御することを特徴とする請求項６記載の核酸検出システム。
  8. 前記インキュベータにおける前記試料セルの上方と正対する部分には、試料投入口が開設されていることを特徴とする請求項４記載の核酸検出システム。
  9. 前記試料投入口には密封材が充填されていることを特徴とする請求項８記載の核酸検出システム。
  10. 前記インキュベータの表面には、管配線のための配線孔が更に設けられ、当該配線孔内に密封材が充填されていることを特徴とする請求項４記載の核酸検出システム。
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