JP2017526931A - がん患者由来のヒト血清のエクソソーム画分からのアスパルチル（アスパラギニル）ベータヒドロキシラーゼ（ｈａａｈ）の回収 - Google Patents

Abstract

本発明は、アスパルチル−［アスパラギニル］−β−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）を含むエクソソームを検出する方法を包含する。本発明は、ＨＡＡＨを含むエクソソームを特定することにより、がんを診断する方法をさらに対象としている。本発明は、例えば、生物試料からエクソソームを単離するステップと； ＨＡＡＨの存在について前記エクソソームを解析するステップと； ＨＡＡＨを含むエクソソームの存在に基づき、がんを診断するステップとを含む、がんを診断するための方法を提供する。

Description

（発明の背景）
がんは、ヒトの人生の機会損失を生み、医療費がかかるという両方の点で最も重篤な疾患の１つであり、図らずも診断上のニーズもほとんど満たされていない。診断被験物として、がん患者由来の血清をよりよく理解することを求めて、エクソソームについての研究が著しく台頭してきた。エクソソームは３０〜１２０ｎｍの範囲のサイズの微小胞であり、開口分泌経路を介して能動的に分泌される。エクソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、リンパ球、肥満細胞、上皮細胞などの様々な種類の細胞、ならびに肺、肝臓、乳房、前立腺および結腸由来の組織から、特定の生理的条件下で分泌されうる。エクソソームは、最終的に血液中に現れ、理想的な解析標的を与える。さらにエクソソームは、当技術分野で公知の多段階超遠心分離および／またはポリマー誘導性沈殿プロセス後に、ｄ細胞培養物上清、および大部分の体液から回収されうる。さらに、エクソソームは固有の性質として数多くのがん関連バイオマーカーを保持し、それにより、有益な非侵襲性診断の可能性をもたらす。

アスパルチル−（アスパラギニル）−β−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）は、肝細胞癌および肺癌を含む様々な悪性新生物において過剰発現される。ＨＡＡＨは腫瘍特異的な抗原であり、特定の悪性細胞表面に特異的に発現される。ＨＡＡＨは鉄およびαケトグルタル酸（ｋｅｔｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）依存性ヒドロキシラーゼ酵素であり、ノッチなどの細胞タンパク質を改変し、このことが、細胞の増殖、運動性および侵入性を引き起こすことによりがんの病因に寄与する。この酵素を中和するか、またはその発現を減少させることにより、がん細胞における正常表現型（複数可）がもたらされる。抗ＨＡＡＨ抗体（およびｓｉＲＮＡ）は、細胞増殖抑制性であることが示されている。全ヒト配列の抗ＨＡＡＨ（ＰＡＮ−６２２）が、動物研究において、受動免疫療法により腫瘍増殖を９０％超阻害することが示されている。しかし、ＨＡＡＨはよく保存され、胎盤でも過剰発現され、したがって動物においては十分に免疫原性ではなく、ヒトにおいては確実に自己抗原となる。

がんの進行における腫瘍エクソソームの役割は、台頭しつつある研究領域である。がんの進行におけるエクソソームの役割についての理解が増し、診断方法を改善する必要性が高まっていることを考えれば、それに応じて腫瘍特異的な抗原を含むエクソソームを検出する方法が必要となる。

（発明の概要）
本発明は、アスパルチル−［アスパラギニル］−β−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）を含むエクソソームを検出する方法を包含する。

本発明は、生物試料からエクソソームを単離するステップと、ＨＡＡＨの存在についてエクソソームを解析するステップと、ＨＡＡＨを含むエクソソームの存在に基づき、がんを診断するステップとを含む、がんを診断するための方法をさらに企図する。

本発明によるエクソソームは、超遠心分離を含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の手段により、またはＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）などの市販のキットの使用により、単離可能である。

本発明によれば、エクソソームは、ＨＡＡＨ選択的解析用サンドイッチＥＬＩＳＡを含むがこれに限定されないＥＬＩＳＡにより、解析可能である。

本発明のある特定の実施形態では、エクソソームは、診断されたがんの種類を決定するため、原発組織特異的なマーカーの存在についてさらに解析される。このようなマーカーには、αフェトプロテイン、ＣＡ１２５、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡおよびＰＳＡなどのマーカーが含まれるがこれらに限定されない。

本発明は、生物試料からＨＡＡＨを回収する方法も包含する。

本発明のさらなる実施形態は、生物試料中のＨＡＡＨ濃度を増加させる方法を包含する。

図１は、ＨＡＡＨを含有するエクソソームの形成を示す。 図２は、ビオチン化ＨＡＡＨ特異的抗体ＦＢ５０により捕捉および検出されたエクソソームを示す。 図３は、組換えＨＡＡＨを使用した、典型的なＥＬＩＳＡ較正標準曲線を示す。 図４は、エクソソーム試料の希釈の範囲において、ＨＡＡＨシグナルがほぼ直線となることを示す。 図５は、ナノ粒子軌跡解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）を使用した、典型的なエクソソームの粒径分布を示す。 図６は、５つの様々ながん患者プール、およびこれらのプールの対応するエクソソーム調製物についてのＨＡＡＨ濃度を示す。 図７は、乳、肺および結腸がん患者血清、ならびに正常血清で再構成した対応するエクソソーム調製物のＨＡＡＨ濃度を示す。緑色の点線はカットオフを表し、それを上回る試料がＨＡＡＨについて陽性であるとみなされる。 図８は、最初の血清試験で偽陰性であった７人のがん患者由来の試料を示す。示された順番で、これらは以下のがん由来であった：前立腺、乳、肺、結腸、肺、膀胱および乳。これらの試料は、正常血清でエクソソームを再構成すると陽性となった。自己血清で再構成すると、ＨＡＡＨの検出は回復しなかった。 図９は、本発明に適合するＥＬＩＳＡ法の例を示す。

（発明の詳細な説明）
簡潔性および例示目的のため、本発明の原理を、その様々な例示的な実施形態に言及することで記載する。本発明の好ましい実施形態が本明細書で特に開示されるが、同じ原理がその他の系に等しく適用可能であり、その他の系において実施可能であること、および任意のこのような変形形態が、本発明の範囲から逸脱しないこのような改変の範囲内にあることを、当業者は容易に認識するものである。開示される本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその他の実施形態が可能であるため、本発明が、その適用にあたって、示される任意の特定の構成の詳細に限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用される用語は説明する目的のためのものであり、限定する目的のためのものではない。さらに、特定の方法が、特定の順番で本明細書に提示される特定のステップを参照して記載されるが、多くの例で、これらのステップは、当業者により理解される任意の順番で行われてよく、これらの方法は、本明細書で開示されるステップの特定の構成に限定されない。

がん細胞における、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）の蓄積は、細胞の分化、運動性および侵入性などの重要なイベントと密接に並行して起こる。ＨＡＡＨは、がん細胞表面上と、腫瘍微小環境に関連して特徴付けられていない経路による血液中との両方に広く発現される癌胎児性抗原として、免疫化学的に検出可能である。血液バイオマーカーとしてのこのＨＡＡＨの異所性出現については、ＨＡＡＨが大抵エクソソームを伴うという最近の観察により、現在非常によく理解されている。本発明は、ＨＡＡＨが血清マトリックスのエクソソーム画分と物理的に会合している状況における、ＨＡＡＨの免疫化学的検出に関する。ＨＡＡＨ選択的解析用サンドイッチＥＬＩＳＡにより、我々は、血清ＨＡＡＨがエクソソーム画分を実質的に伴うことを観察した。

エクソソームを単離する方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，９０１，２８４号、米国特許第９，００５，８８８号、およびＴｈｅｒｙら、Ｃｕｒｎ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３章、ユニット３：２２頁（２００６年）で教示されている。本発明の開発における一部の実験は、エクソソームを生成する手段としての血清の超遠心分離によるものであった。我々は、微量ハイスループット様式でエクソソームの低速沈殿を可能にする市販の試薬（ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標））も利用した（表１を参照のこと）。この方法により、一部の場合において、がん患者の血清から調製されるエクソソーム中のＨＡＡＨ抗原の回収率が１００％に近付く。この回収率は、場合により完全に定量的であるが、平均するとより少なく、５０％まで低くなりうる。この試料対試料の相違の性質は理解されていないが、この結果は、エクソソームマトリックス全体の状況において、ＨＡＡＨ解析物の試料収集、保存および安定性の標準化を最適化することに我々が注目する必要があることを示唆している。

表１：超遠心分離を使用して、および市販のエクソソーム沈殿試薬ＥｘｏＱｕｉｃｋ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、結腸がん血清試料から調製されたエクソソームにおける、ＨＡＡＨの回収。両方法により調製されたエクソソームを、ＨＡＡＨ選択的ＥＬＩＳＡでのアッセイ前に、ＨＡＡＨ陰性の正常血清中に再懸濁させた。

本研究では、エクソソームの形態で回収されるＨＡＡＨの解析的特性に焦点を当てている。ＨＡＡＨの定量的回収は、一部の試料で達成可能であった。概して、より多数の試料セットにおいては、平均回収率は約５０％であった。偽陰性の決定を有した一部の試料においては、正常血清で再構成したエクソソーム画分を再試験すると、陽性の値が得られた。完全に理解されておらず、進行中の研究の対象であるが、これらの特定の試料血清中に、未だ特徴付けられていない阻害物質が存在すると思われる。

（実施例１）
被験物として、天然の血清または血清で再構成したエクソソームを使用した、ＨＡＡＨ ＥＬＩＳＡ法
ＨＡＡＨ ＥＬＩＳＡ用試料
超遠心分離またはＥｘｏｑｕｉｃｋ試薬のいずれかにより、がん患者血清または正常なボランティア由来のエクソソームを調製し、ＨＡＡＨアッセイで使用する前に、正常なＨＡＡＨ陰性血清で適切に再構成した。

ＨＡＡＨ ＥＬＩＳＡ較正物質
アフィニティー精製されたバキュロウイルス発現タンパク質として組換えＨＡＡＨを試験前に生成し、それによりＥＬＩＳＡ較正物質とした。

ＨＡＡＨ ＥＬＩＳＡ法（図９を参照のこと）
捕捉および検出ステップの両方に同じ抗体が使用される相同な形式で、モノクローナル抗ＨＡＡＨ ＦＢ５０を用いて、９６ウェルポリスチレンマイクロプレートにおいてＨＡＡＨ ＥＬＩＳＡを実施した。ＦＢ５０抗体は最初、肝細胞癌細胞株ＦＯＣＵＳに対して産生され、以前にＬａｖａｉｓｓｉｅｒｅ、Ｌ． Ｊｉａ、Ｓ． Ｎｉｓｈｉｙａｍａ、Ｍ． ｄｅ ｌａ Ｍｏｎｔｅ、Ｓ． Ｓｔｅｒｎ、Ａ． Ｍ． Ｗａｎｄｓ、Ｊ Ｊ． Ｒ． Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｐ． Ａ．（１９９６年）Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．９８巻：１３１３頁に記載されている。
１）血清試料、標準物質および対照をまずアッセイ緩衝剤により１／１０ｖ／ｖに希釈し、その後、密封したポリプロピレン９６ウェルディープウェルプレート（ＮＵＮＣ）において５０℃で３０分間加熱した。
２）次いで、処理した試料を、ＦＢ５０ Ｍａｂコーティング／ブロッキング高結合マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、インキュベートした。
３）逐次、洗浄ステップを介在させつつ、次いでプレートをビオチン化ＦＢ５０抗体、その後ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートした。
４）最終洗浄ステップ後、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートし、希酸により反応を終結させた。
５）プレートを４５０ｎｍで読み取り、標準曲線による補間を使用して未知の試料の値を算出した。

（実施例２）
エクソソームの調製
基本的にはＥｘｏＱｕｉｃｋ試薬の製造業者により記載される方法によって、血清からエクソソームを調製した。血清試料および対照（４０μＬ）をＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）１０μＬと混合した。４℃で一晩インキュベートした後、試料を１５００Ｘｇで３０分間遠心分離した。上清吸引後、プールした正常血清４０μＬでペレットを再構成した。この方式で調製したエクソソームを、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）装置を使用したナノ粒子軌跡解析により評価した。

比較目的のため、同じ血清試料をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で適切に希釈し、Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）ベンチトップ超遠心機における１００，０００Ｘｇでの最大８時間超遠心分離に供した。上清吸引後、プールした正常血清でエクソソームのペレットを再懸濁させた。

ＨＡＡＨ ＥＬＩＳＡ
相同なマイクロプレート形式でともに適用される、同じ捕捉および検出抗体ＦＢ５０を使用して、ＨＡＡＨ ＥＬＩＳＡを実施した。ビオチン化ＦＢ５０検出がさらに増幅され、ペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン／ＴＭＢ化学反応により読取り値が得られた。この方式で実施されたアッセイは、組換えＨＡＡＨを使用して、常に直線の較正標準を生じ、特有の広範なダイナミックレンジを有する（図３）。陽性および陰性対照はそれぞれ、プールしたがん患者血清および健康なドナー血清であった。エクソソームの連続滴定により、実用的な吸光度範囲で、シグナルがほぼ直線となることが確立された。

代替的な（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）エクソソームの再構成
一部の実験においては、エクソソームを再構成するのに、正常血清を使用する代わりに患者の自己血清を使用した。図８に示す通り、偽陰性試料におけるＨＡＡＨ検出の潜在的な阻害物質について試験するためにこれを行った。

本発明は、その特定の例示的な実施形態を参照して記載されるが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、記載される本発明の実施形態に対し様々な改変を加えることができる。本明細書で使用される用語および説明は、例示としてのみ示され、限定するものとして意図されない。具体的には、本発明は例示の目的で記載されるが、様々な組成物およびプロセスにより、本明細書に記載される発明の概念が実施される。本発明は様々な用語およびある特定の実施形態で記載および開示されるが、本発明の範囲はそれにより限定されることを意図されず、また限定されるとみなされるべきではない。また、本明細書での教示により示唆されうる、このようなその他の改変または実施形態に関する権利は、特にこれらが本明細書に添付の特許請求の範囲の広さおよび範囲に入るとき、特に出願人が有する。これらのおよびその他の変形形態が、以下の特許請求の範囲およびそれらの同等物で規定される本発明の範囲内に入る可能性があることを、当業者は認識するものである。

Claims (9)

1. 生物試料からエクソソームを単離するステップと；
   ＨＡＡＨの存在について前記エクソソームを解析するステップと；
   ＨＡＡＨを含むエクソソームの存在に基づき、がんを診断するステップと
   を含む、がんを診断するための方法。
2. 前記エクソソームがＥＬＩＳＡの手段により解析される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＥＬＩＳＡが、ＨＡＡＨ選択的解析用サンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項２に記載の方法。
4. 前記エクソソームが、これらに限定されないが、αフェトプロテイン、ＣＡ１２５、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡおよびＰＳＡなどのマーカーの群から選択される原発組織特異的なマーカーの存在についてさらに解析される、請求項１に記載の方法。
5. 試料からエクソソームを単離するステップと；
   ＨＡＡＨ特異的抗体でコーティングされた磁気ビーズとともに、前記試料から単離されたエクソソームを再懸濁させるステップと；
   ＨＡＡＨを含むエクソソームの存在について、前記磁気ビーズを解析するステップと
   を含む、がんを診断するための方法。
6. ＨＡＡＨを含む前記エクソソームが、ＨＡＡＨ特異的抗体により捕捉される、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＨＡＡＨ特異的抗体がＦＢ５０である、請求項６に記載の方法。
8. 生物試料からエクソソームを単離するステップと；
   ＨＡＡＨ特異的抗体でコーティングされた磁気ビーズとともに、前記試料から単離された前記エクソソームを再懸濁させるステップと；
   ＨＡＡＨを含むエクソソームの存在について、前記磁気ビーズを解析するステップと
   を含む、生物試料中のＨＡＡＨの存在を検出するための方法。
9. 前記ＨＡＡＨ特異的抗体がＦＢ５０である、請求項８に記載の方法。

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