KR20140136805A - 신규한 인간 엑소좀 단백질 및 그 용도 - Google Patents
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- G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy
Abstract
본 발명은 신규한 인간 엑소좀 단백질 및 그 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 인간 엑소좀 단백질 및 그 용도에 관한 것이다.
일반적으로 엑소좀은 엔도좀에서 기원한 microvesicle로서, 지름이 30-100nm에 이르는 둥근 모양의 vesicle이다. 엑소좀은 대부분의 세포에서 multivesicular bodies가 세포막과 fusion 되면서 세포외로 분비되게 된다(도 1). 엑소좀은 사람의 다양한 체액-혈액, 소변, 타액, 양수, 복수, 흉수, 관절강액, 모유-에서 발견되었으며, 엑소좀 안에는 막단백질, 세포내단백질, RNA, DNA 및 microRNA가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 진단 및 치료에의 응용 가치가 큰 것으로 인정받고 있다. 알려젼 엑소좀의 기능에는, 세포사, 혈관생성, 염증, 혈액응고, 세포와 환경간의 상호작용 등이 있다.
[선행특허 문헌]
대한민국특허공개번호 제10-2009-0047289
대한민국특허공개번호 제10-2010-0058421
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 엑소좀 단백질을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 표에 기재된 유전자 정보번호 및 이에 상응하는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 엑소좀 단백질 조성물을 제공한다.
번호. | 유전자 정보번호 | 단백질 이름 |
1 | 207028673 | 알도-케토 리덕테이즈 계 1 멤버 C2 isoform 2 [Homo sapiens] |
2 | 4502261 | 안티트롬빈-III 전구체 [Homo sapiens] |
3 | 206597441 | 알데히드 탈수소효소, 다이머 NADP-preferring [Homo sapiens] |
4 | 4502491 | 보체 콤포넌트 1 Q subcomponent-결합 단백질, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
5 | 5031777 | isocitrate 탈수소효소 [NAD] 서브유닛 알파, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
6 | 24234747 | 인터루킨 인헨서-결합 인자 2 [Homo sapiens] |
7 | 46094076 | tsukushin 전구체 [Homo sapiens] |
8 | 4501989 | 알파-피토프로틴전구체 [Homo sapiens] |
9 | 260064050 | 알파-2-안티프라즈민 isoform b 전구체 [Homo sapiens] |
10 | 4503519 | 진핵 번역 시작 인자 3 서브유닛 F [Homo sapiens] |
11 | 217272892 | 116 kDa U5 스몰 핵 리보뉴크레오프로틴 콤포넌트 isoform a [Homo sapiens] |
12 | 14149738 | neurolysin, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
13 | 15451921 | 혈소판-유래 성장인자 D isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
14 | 4885649 | SUMO-액티베이팅 효소 서브유닛 2 [Homo sapiens] |
15 | 290560750 | A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 전구체 [Homo sapiens] |
16 | 32483374 | 인 단백질 56 [Homo sapiens] |
17 | 7305503 | 스토마틴-유사 단백질 2 [Homo sapiens] |
18 | 71773106 | AP-2 복합체 서브유닛 베타 isoform a [Homo sapiens] |
19 | 169218225 | PREDICTED: u5 스몰 핵 리보뉴크레오프로틴 200 kDa 헬리케이즈-유사, partial [Homo sapiens] |
20 | 45446745 | 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 C2 isoform 1 [Homo sapiens] |
21 | 24497583 | 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 C3 [Homo sapiens] |
22 | 14141161 | 헤테로지너스 핵 리보뉴크레오프로틴 U isoform b [Homo sapiens] |
23 | 4885377 | 히스톤 H1.3 [Homo sapiens] |
24 | 291291012 | putative 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 B15 [Homo sapiens] |
25 | 205277471 | cochlin 전구체 [Homo sapiens] |
26 | 258613957 | 아스파틸/아스파라기닐 베타-하이드록시레이즈 isoform l [Homo sapiens] |
27 | 4505047 | 루미칸 전구체 [Homo sapiens] |
28 | 4503635 | 프로트롬빈 프리프로프로틴 [Homo sapiens] |
29 | 15890086 | 콜라겐 알파-5(IV) 체인 isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
30 | 47578117 | 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-의존 Rac exchanger 2 단백질 isoform b [Homo sapiens] |
31 | 290656011 | neogenin isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
32 | 5454158 | valyl-tRNA 신쎄테이즈e [Homo sapiens] |
33 | 20544168 | 히스톤 H1t [Homo sapiens] |
34 | 22035638 | 마이크로좀 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 1 [Homo sapiens] |
35 | 55770836 | probable saccharopine 탈수소효소 [Homo sapiens] |
36 | 153945728 | 마이크로튜블-관련 단백질 1B [Homo sapiens] |
37 | 83376130 | 연장 인자 1-베타 [Homo sapiens] |
38 | 296317339 | 전압-의존적 anion-선택 채널 단백질 2 isoform 2 [Homo sapiens] |
39 | 133925811 | 트랜스포틴-1 isoform 1 [Homo sapiens] |
40 | 208431836 | 폴리아데닐레이트-결합 단백질 4 isoform 3 [Homo sapiens] |
41 | 28373105 | 사르코프라즈믹/엔도프라즈믹 레티컬럼 칼슘 ATPase 3 isoform e [Homo sapiens] |
42 | 15431301 | 60S 리보본 단백질 L7 [Homo sapiens] |
43 | 46593007 | 사이토크롬 b-c1 복합체 서브유닛 1, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
44 | 38327552 | ras GTPase-액티베이팅 프로틴-결합 단백질 1 [Homo sapiens] |
45 | 21396489 | 이온 프로테이즈 호모로그, 미토콘드리아 전구체[Homo sapiens] |
46 | 148277071 | 싸이오리독신 리덕테이즈 1, 원형질 isoform 3 [Homo sapiens] |
47 | 148596949 | 인 및 코일된 바디 포스포프로틴 1 [Homo sapiens] |
48 | 4504425 | 하이 모빌리티 그룹 단백질 B1 [Homo sapiens] |
49 | 148491070 | CTP 신쎄테이즈 1 [Homo sapiens] |
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 단백질은 인간 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 하기 표에 기재된 유전자 정보번호 및 이에 상응하는 단백질 또는 이들에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 노년황반변성 진단용 조성물을 제공한다.
번호. | 유전자 정보번호 | 단백질 이름 |
1 | 207028673 | 알도-케토 리덕테이즈 계 1 멤버 C2 isoform 2 [Homo sapiens] |
2 | 4502261 | 안티트롬빈-III 전구체 [Homo sapiens] |
3 | 206597441 | 알데히드 탈수소효소, 다이머 NADP-preferring [Homo sapiens] |
4 | 4502491 | 보체 콤포넌트 1 Q subcomponent-결합 단백질, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
5 | 5031777 | isocitrate 탈수소효소 [NAD] 서브유닛 알파, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
6 | 24234747 | 인터루킨 인헨서-결합 인자 2 [Homo sapiens] |
7 | 46094076 | tsukushin 전구체 [Homo sapiens] |
8 | 4501989 | 알파-피토프로틴전구체 [Homo sapiens] |
9 | 260064050 | 알파-2-안티프라즈민 isoform b 전구체 [Homo sapiens] |
10 | 4503519 | 진핵 번역 시작 인자 3 서브유닛 F [Homo sapiens] |
11 | 217272892 | 116 kDa U5 스몰 핵 리보뉴크레오프로틴 콤포넌트 isoform a [Homo sapiens] |
12 | 14149738 | neurolysin, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
13 | 15451921 | 혈소판-유래 성장인자 D isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
14 | 4885649 | SUMO-액티베이팅 효소 서브유닛 2 [Homo sapiens] |
15 | 290560750 | A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 전구체 [Homo sapiens] |
16 | 32483374 | 인 단백질 56 [Homo sapiens] |
17 | 7305503 | 스토마틴-유사 단백질 2 [Homo sapiens] |
18 | 71773106 | AP-2 복합체 서브유닛 베타 isoform a [Homo sapiens] |
19 | 169218225 | PREDICTED: u5 스몰 핵 리보뉴크레오프로틴 200 kDa 헬리케이즈-유사, partial [Homo sapiens] |
20 | 45446745 | 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 C2 isoform 1 [Homo sapiens] |
21 | 24497583 | 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 C3 [Homo sapiens] |
22 | 14141161 | 헤테로지너스 핵 리보뉴크레오프로틴 U isoform b [Homo sapiens] |
23 | 4885377 | 히스톤 H1.3 [Homo sapiens] |
24 | 291291012 | putative 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 B15 [Homo sapiens] |
25 | 205277471 | cochlin 전구체 [Homo sapiens] |
26 | 258613957 | 아스파틸/아스파라기닐 베타-하이드록시레이즈 isoform l [Homo sapiens] |
27 | 4505047 | 루미칸 전구체 [Homo sapiens] |
28 | 4503635 | 프로트롬빈 프리프로프로틴 [Homo sapiens] |
29 | 15890086 | 콜라겐 알파-5(IV) 체인 isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
30 | 47578117 | 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-의존 Rac exchanger 2 단백질 isoform b [Homo sapiens] |
31 | 290656011 | neogenin isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
32 | 5454158 | valyl-tRNA 신쎄테이즈e [Homo sapiens] |
33 | 20544168 | 히스톤 H1t [Homo sapiens] |
34 | 22035638 | 마이크로좀 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 1 [Homo sapiens] |
35 | 55770836 | probable saccharopine 탈수소효소 [Homo sapiens] |
36 | 153945728 | 마이크로튜블-관련 단백질 1B [Homo sapiens] |
37 | 83376130 | 연장 인자 1-베타 [Homo sapiens] |
38 | 296317339 | 전압-의존적 anion-선택 채널 단백질 2 isoform 2 [Homo sapiens] |
39 | 133925811 | 트랜스포틴-1 isoform 1 [Homo sapiens] |
40 | 208431836 | 폴리아데닐레이트-결합 단백질 4 isoform 3 [Homo sapiens] |
41 | 28373105 | 사르코프라즈믹/엔도프라즈믹 레티컬럼 칼슘 ATPase 3 isoform e [Homo sapiens] |
42 | 15431301 | 60S 리보본 단백질 L7 [Homo sapiens] |
43 | 46593007 | 사이토크롬 b-c1 복합체 서브유닛 1, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
44 | 38327552 | ras GTPase-액티베이팅 프로틴-결합 단백질 1 [Homo sapiens] |
45 | 21396489 | 이온 프로테이즈 호모로그, 미토콘드리아 전구체[Homo sapiens] |
46 | 148277071 | 싸이오리독신 리덕테이즈 1, 원형질 isoform 3 [Homo sapiens] |
47 | 148596949 | 인 및 코일된 바디 포스포프로틴 1 [Homo sapiens] |
48 | 4504425 | 하이 모빌리티 그룹 단백질 B1 [Homo sapiens] |
49 | 148491070 | CTP 신쎄테이즈 1 [Homo sapiens] |
또한 본 발명은 하기 표에 기재된 유전자 정보번호 및 이에 상응하는 단백질 또는 이들의 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 노년황반변성 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
번호. | 유전자 정보번호 | 단백질 이름 |
1 | 207028673 | 알도-케토 리덕테이즈 계 1 멤버 C2 isoform 2 [Homo sapiens] |
2 | 4502261 | 안티트롬빈-III 전구체 [Homo sapiens] |
3 | 206597441 | 알데히드 탈수소효소, 다이머 NADP-preferring [Homo sapiens] |
4 | 4502491 | 보체 콤포넌트 1 Q subcomponent-결합 단백질, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
5 | 5031777 | isocitrate 탈수소효소 [NAD] 서브유닛 알파, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
6 | 24234747 | 인터루킨 인헨서-결합 인자 2 [Homo sapiens] |
7 | 46094076 | tsukushin 전구체 [Homo sapiens] |
8 | 4501989 | 알파-피토프로틴전구체 [Homo sapiens] |
9 | 260064050 | 알파-2-안티프라즈민 isoform b 전구체 [Homo sapiens] |
10 | 4503519 | 진핵 번역 시작 인자 3 서브유닛 F [Homo sapiens] |
11 | 217272892 | 116 kDa U5 스몰 핵 리보뉴크레오프로틴 콤포넌트 isoform a [Homo sapiens] |
12 | 14149738 | neurolysin, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
13 | 15451921 | 혈소판-유래 성장인자 D isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
14 | 4885649 | SUMO-액티베이팅 효소 서브유닛 2 [Homo sapiens] |
15 | 290560750 | A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 전구체 [Homo sapiens] |
16 | 32483374 | 인 단백질 56 [Homo sapiens] |
17 | 7305503 | 스토마틴-유사 단백질 2 [Homo sapiens] |
18 | 71773106 | AP-2 복합체 서브유닛 베타 isoform a [Homo sapiens] |
19 | 169218225 | PREDICTED: u5 스몰 핵 리보뉴크레오프로틴 200 kDa 헬리케이즈-유사, partial [Homo sapiens] |
20 | 45446745 | 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 C2 isoform 1 [Homo sapiens] |
21 | 24497583 | 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 C3 [Homo sapiens] |
22 | 14141161 | 헤테로지너스 핵 리보뉴크레오프로틴 U isoform b [Homo sapiens] |
23 | 4885377 | 히스톤 H1.3 [Homo sapiens] |
24 | 291291012 | putative 알도-케토 리덕테이즈 계열 1 멤버 B15 [Homo sapiens] |
25 | 205277471 | cochlin 전구체 [Homo sapiens] |
26 | 258613957 | 아스파틸/아스파라기닐 베타-하이드록시레이즈 isoform l [Homo sapiens] |
27 | 4505047 | 루미칸 전구체 [Homo sapiens] |
28 | 4503635 | 프로트롬빈 프리프로프로틴 [Homo sapiens] |
29 | 15890086 | 콜라겐 알파-5(IV) 체인 isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
30 | 47578117 | 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-의존 Rac exchanger 2 단백질 isoform b [Homo sapiens] |
31 | 290656011 | neogenin isoform 2 전구체 [Homo sapiens] |
32 | 5454158 | valyl-tRNA 신쎄테이즈e [Homo sapiens] |
33 | 20544168 | 히스톤 H1t [Homo sapiens] |
34 | 22035638 | 마이크로좀 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 1 [Homo sapiens] |
35 | 55770836 | probable saccharopine 탈수소효소 [Homo sapiens] |
36 | 153945728 | 마이크로튜블-관련 단백질 1B [Homo sapiens] |
37 | 83376130 | 연장 인자 1-베타 [Homo sapiens] |
38 | 296317339 | 전압-의존적 anion-선택 채널 단백질 2 isoform 2 [Homo sapiens] |
39 | 133925811 | 트랜스포틴-1 isoform 1 [Homo sapiens] |
40 | 208431836 | 폴리아데닐레이트-결합 단백질 4 isoform 3 [Homo sapiens] |
41 | 28373105 | 사르코프라즈믹/엔도프라즈믹 레티컬럼 칼슘 ATPase 3 isoform e [Homo sapiens] |
42 | 15431301 | 60S 리보본 단백질 L7 [Homo sapiens] |
43 | 46593007 | 사이토크롬 b-c1 복합체 서브유닛 1, 미토콘드리아 전구체 [Homo sapiens] |
44 | 38327552 | ras GTPase-액티베이팅 프로틴-결합 단백질 1 [Homo sapiens] |
45 | 21396489 | 이온 프로테이즈 호모로그, 미토콘드리아 전구체[Homo sapiens] |
46 | 148277071 | 싸이오리독신 리덕테이즈 1, 원형질 isoform 3 [Homo sapiens] |
47 | 148596949 | 인 및 코일된 바디 포스포프로틴 1 [Homo sapiens] |
48 | 4504425 | 하이 모빌리티 그룹 단백질 B1 [Homo sapiens] |
49 | 148491070 | CTP 신쎄테이즈 1 [Homo sapiens] |
또한 본 발명은 대상(subject)에서 노년황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법으로서,(a) 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 측정하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 바이오마커는 본 발명의 청구항 제1항 또는 제3항에 기재된 조성물 중에서 선택되는 단계; 및 (b) 측정치 또는 측정치들을 정상인과 비교하여 그 측정치가 정상인보다 높은 경우에 노년황반변성과 상호관련시키는 단계를 포함하는 노년황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 방수내, 근내, 복강내 또는 피하주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리 정제한다.
모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술[Koeher and Milstein 1975,Nature,256:495)]에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 ㎍을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 개체의 체액에서 본 발명의 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 노년황반변성에 대한 정보를 얻는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 인간 혈액 또는 방수인 것을 특징으로 하며, 상기 검출 단계는 개체의 간의 방수 또는 혈액 용액으로부터 2차원(2-D) 전기영동으로 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 직접 검출하거나, 방수 또는 혈액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다.
항원항체반응으로서 현재 널리 알려진 immunoassay 법은 효소면역측정법(ELISA, Coated tube), 항체결합 magnetic particle을 tube에 결합시킨 다음 antigen-tracer와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량하는 magnetic particle법, 항체결합 latex particle을 이용한 latex particle법 등이 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 노년황반변성의 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종, 형광원, 효소 등에 의해 표지화될 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test,potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 노년황반변성 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에도 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 노년황반변성 환자의 방수 (Aqueous humor)에 증감하는 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 노년황반변성 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 주사제 등의 제형으로 제조되어 정맥주사 등으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질환의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준으로 1일 0.001~100 ㎎의 단백질을 투여할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 살아있는 사람의 방수에서 최초로 엑소좀의 존재를 확인하였으며, 엑소좀에 있는 단백질을 프로테오믹 단백 기법으로 분석하여, 총 145개 단백질의 엑소좀 내 존재를 확인하였다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 총 49개의 신규 엑소좀 단백질을 발굴하였으며, 방수내에서 발견된 엑소좀은 안구내 다양한 세포에서 기원하였을 것으로 추정되는데, 망막색소상피세포 배양액에서 추출한 엑소좀과 비교하였을때, 망막색소상피가 엑소좀을 분비하는 안구내 주된 세포일 가능성이 크고, 따라서 망막색소상피가 분비하는 엑소좀은 노년황반변성 발병 및 진행의 위험인자인 드루젠 (세포외침착물)의 생성 메커니즘과 관련이 있으므로, 노년황반변성의 새로운 병인으로 대두될 수 있는 전망이 밝다.
도 1은 엑소좀 생성의 모식도
도 2는 ARPE-19 cell과 습성황반변성 환자의 방수 (AH)에서 ExoQuick을 이용하여 엑소좀 (exosome)을 얻는 방법의 모식도
도 3은 ARPE-19 cell과 방수 (AH)에서 얻은 엑소좀의 확인. (A) 전자현미경으로 100 nm 이하의 비교적 균일한 엑소좀을 확인함 (scale bar, 100 nm). (B) 엑소좀 마커인 CD63의 존재를 Western blot으로 확인함. 좌측열부터 차례로 엑소좀을 얻는데 사용한 cell lysate와 conditioned medium (CM)에서 얻은 엑소좀 (con: control culture, para: culture exposed to 400 μM paraquat, 24 h)과 환자 방수에서 얻은 엑소좀을 나타냄. cathepsin D의 엑소좀 내 존재도 확인함.
도 2는 ARPE-19 cell과 습성황반변성 환자의 방수 (AH)에서 ExoQuick을 이용하여 엑소좀 (exosome)을 얻는 방법의 모식도
도 3은 ARPE-19 cell과 방수 (AH)에서 얻은 엑소좀의 확인. (A) 전자현미경으로 100 nm 이하의 비교적 균일한 엑소좀을 확인함 (scale bar, 100 nm). (B) 엑소좀 마커인 CD63의 존재를 Western blot으로 확인함. 좌측열부터 차례로 엑소좀을 얻는데 사용한 cell lysate와 conditioned medium (CM)에서 얻은 엑소좀 (con: control culture, para: culture exposed to 400 μM paraquat, 24 h)과 환자 방수에서 얻은 엑소좀을 나타냄. cathepsin D의 엑소좀 내 존재도 확인함.
엑소좀 분리 및 특성규명 방법은 다음과 같다. 죽은 세포와 세포 부스러기 (cell debris)를 제거하기 위하여 3000 × g에서 15 분간 원심분리후, ExoQuickTMreagent (ExoQuickTM Exosome Precipitation Solution (System Bioscience, SBI))와 섞어서, 4℃에서 overnight하였다. ExoQuick/sample mixture를 1500 × g에서 30분간 원심분리하면, 백색의 엑소좀 펠렛이 얻어졌다. 이렇게 얻어진 펠렛이 엑소좀 펠렛인 것을 확인하기 위하여, 다음의 과정을 거졌다. 첫째, 전자현미경으로 비교적 균질한, 지름 50-100 nm인 둥근 vesicle을 확인함. 둘째, Western blot analysis로, 잘 알려진 엑소좀 마커 단백질 (CD63)의 존재를 확인하였다(도 2, 및 3).
145개 단백질을 엑소좀 단백질의 리스트를 보유하고 있는, ExoCarta (exocarta.org)의 최신 리스트와 비교하여, 총 49개의 신규 엑소좀 단백질을 발굴하였다. 방수내에서 발견된 엑소좀은 안구내 다양한 세포에서 기원하였을 것으로 추정되는데, 망막색소상피세포 배양액에서 추출한 엑소좀과 비교하였을때, 망막색소상피가 엑소좀을 분비하는 안구내 주된 세포일 가능성이 크다. 망막색소상피가 분비하는 엑소좀은, 노년황반변성 발병 및 진행의 위험인자인 드루젠 (세포외침착물)의 생성 메커니즘과 관련이 있으므로, 노년황반변성의 새로운 병인으로 대두될 수 있는 전망이 밝다.
No. | Accession # | entrez ID | Protein Name | MW |
1 | 207028673 | 1646 | aldo-keto reductase family 1 member C2 isoform 2 [Homo sapiens] | 15738.19 |
2 | 4502261 | 462 | antithrombin-III precursor [Homo sapiens] | 52568.98 |
3 | 206597441 | 218 | aldehyde dehydrogenase, dimeric NADP-preferring [Homo sapiens] | 50362.9 |
4 | 4502491 | 708 | complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial precursor [Homo sapiens] | 31342.61 |
5 | 5031777 | 3419 | isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial precursor [Homo sapiens] | 39566.1 |
6 | 24234747 | 3608 | interleukin enhancer-binding factor 2 [Homo sapiens] | 43035.2 |
7 | 46094076 | 25987 | tsukushin precursor [Homo sapiens] | 37783.8 |
8 | 4501989 | 174 | alpha-fetoprotein precursor [Homo sapiens] | 68633.09 |
9 | 260064050 | 5345 | alpha-2-antiplasmin isoform b precursor [Homo sapiens] | 47876.72 |
10 | 4503519 | 8665 | eukaryotic translation initiation factor 3 subunit F [Homo sapiens] | 37540.17 |
11 | 217272892 | 9343 | 116 kDa U5 small nuclear ribonucleoprotein component isoform a [Homo sapiens] | 109366.4 |
12 | 14149738 | 57486 | neurolysin, mitochondrial precursor [Homo sapiens] | 80599.83 |
13 | 15451921 | 80310 | platelet-derived growth factor D isoform 2 precursor [Homo sapiens] | 42139.92 |
14 | 4885649 | 10054 | SUMO-activating enzyme subunit 2 [Homo sapiens] | 71179.34 |
15 | 290560750 | 26762 | hepatitis A virus cellular receptor 1 precursor [Homo sapiens] | 39224.98 |
16 | 32483374 | 10528 | nucleolar protein 56 [Homo sapiens] | 66008.77 |
17 | 7305503 | 30968 | stomatin-like protein 2 [Homo sapiens] | 38510.22 |
18 | 71773106 | 163 | AP-2 complex subunit beta isoform a [Homo sapiens] | 105624.8 |
19 | 169218225 | 652147 | PREDICTED: u5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase-like, partial [Homo sapiens] | 194198.9 |
20 | 45446745 | 1646 | aldo-keto reductase family 1 member C2 isoform 1 [Homo sapiens] | 36711.99 |
21 | 24497583 | 8644 | aldo-keto reductase family 1 member C3 [Homo sapiens] | 36829.86 |
22 | 14141161 | 3192 | heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U isoform b [Homo sapiens] | 88924.16 |
23 | 4885377 | 3007 | histone H1.3 [Homo sapiens] | 22336.33 |
24 | 291291012 | 441282 | putative aldo-keto reductase family 1 member B15 [Homo sapiens] | 39435.3 |
25 | 205277471 | 1690 | cochlin precursor [Homo sapiens] | 59445.33 |
26 | 258613957 | 444 | aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase isoform l [Homo sapiens] | 21949.51 |
27 | 4505047 | 4060 | lumican precursor [Homo sapiens] | 38404.8 |
28 | 4503635 | 2147 | prothrombin preproprotein [Homo sapiens] | 69992.2 |
29 | 15890086 | 1287 | collagen alpha-5(IV) chain isoform 2 precursor [Homo sapiens] | 161530.3 |
30 | 47578117 | 80243 | phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 2 protein isoform b [Homo sapiens] | 112019 |
31 | 290656011 | 4756 | neogenin isoform 2 precursor [Homo sapiens] | 154206.7 |
32 | 5454158 | 7407 | valyl-tRNA synthetase [Homo sapiens] | 140387.4 |
33 | 20544168 | 3010 | histone H1t [Homo sapiens] | 22005.67 |
34 | 22035638 | 4257 | microsomal glutathione S-transferase 1 [Homo sapiens] | 17587.22 |
35 | 55770836 | 51097 | probable saccharopine dehydrogenase [Homo sapiens] | 47121.48 |
36 | 153945728 | 4131 | microtubule-associated protein 1B [Homo sapiens] | 270465.9 |
37 | 83376130 | 1933 | elongation factor 1-beta [Homo sapiens] | 24748.28 |
38 | 296317339 | 7417 | voltage-dependent anion-selective channel protein 2 isoform 2 [Homo sapiens] | 31546.54 |
39 | 133925811 | 3842 | transportin-1 isoform 1 [Homo sapiens] | 102288.9 |
40 | 208431836 | 8761 | polyadenylate-binding protein 4 isoform 3 [Homo sapiens] | 69534.97 |
41 | 28373105 | 489 | sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3 isoform e [Homo sapiens] | 114857.2 |
42 | 15431301 | 6129 | 60S ribosomal protein L7 [Homo sapiens] | 29207.21 |
43 | 46593007 | 7384 | cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial precursor [Homo sapiens] | 52612.5 |
44 | 38327552 | 10146 | ras GTPase-activating protein-binding protein 1 [Homo sapiens] | 52132.14 |
45 | 21396489 | 9361 | lon protease homolog, mitochondrial precursor [Homo sapiens] | 106422.5 |
46 | 148277071 | 7296 | thioredoxin reductase 1, cytoplasmic isoform 3 [Homo sapiens] | 70711.41 |
47 | 148596949 | 9221 | nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1 [Homo sapiens] | 73559.65 |
48 | 4504425 | 3146 | high mobility group protein B1 [Homo sapiens] | 24878.18 |
49 | 148491070 | 1503 | CTP synthase 1 [Homo sapiens] | 66648.09 |
표 4는 본 발명에서 동정된 환자의 방수로부터 유래한 신규한 엑소좀 단백질 리스트
Claims (9)
- 제 1항에 있어서 상기 단백질은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 엑소좀 단백질 조성물.
- 제 3항에 있어서 상기 단백질은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 엑소좀 단백질 조성물.
- 대상(subject)에서 노년황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법으로서,
(a) 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 측정하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 바이오마커는 상기 제1항 또는 제3항에 기재된 조성물 중에서 선택되는 단계; 및
(b) 측정치 또는 측정치들을 정상인과 비교하여 그 측정치가 정상인보다 높은 경우에 노년황반변성과 상호관련시키는 단계를 포함하는 노년황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법.
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