JP2017525964A - Ｍａｌｄｉ用の試料調製方法およびそのための自動化システム - Google Patents

Abstract

Ｍａｌｄｉによる試験のための生物学的試料を調製する方法であって、試料パラメータに基づいて選択される方法。Ｍａｌｄｉスコアは一連の試料パラメータ（例えばマクファーランド、分注量および分注回数）について得られる。データから、Ｍａｌｄｉ試験のために調製される生物学的試料について試料調製パラメータを選択することができる。１つの試料調製ストラテジーは乾燥するステップの介在を伴う試料の複数回分注によっており、それにより特にマクファーランド値が低い範囲（例えば約２未満）にある試料についてより正確なＭａｌｄｉスコアを得ることができる。

Description

［関連出願への相互参照］
本出願は、引用することによりその全てが本明細書の一部をなすものとする２０１４年８月１８日に出願した米国仮出願第６２／０３８５０９号明細書の出願日の利益を主張する。

医学的診断や治療における日常業務として、血液や尿等の生物学的試料を患者から得、微生物の存在について分析している。微生物が存在すると判断された際には、存在する特定の微生物を同定し、治療を促進するためにその微生物の抗生剤に対する耐性／感受性を特定することが医学的にも経済的にも正当化されている。正しい治療をできるだけ早く開始することを確実にするため、このような判断は、迅速に行なわれなければならないことが多い。

例えば、敗血症は、感染に対する宿主の免疫系の極めて強い応答によって惹起される重篤な症状である。これは広範囲に亘る炎症の引き金となることがあり、それによって血流が阻害されることがある。敗血症が進行すれば、生体の臓器には酸素および栄養が枯渇し、永久的な損傷および最終的な機能障害が起こることがある。不適切に診断され、さもなければ治療されないままに放置されれば、心臓が弱くなり、敗血症ショックが起こり、多臓器不全や死に至ることもある。存在する微生物を同定し、治療の指針とするために、敗血症患者の血中の細菌または酵母の存在を検出する血液培養が必要とされている。従来、血液培養物からの微生物の分離や同定には、少なくとも２４〜４８時間を要しており、このため、敗血症患者の多くは初期に不適切な抗生剤で治療されることとなる。したがって、陽性の培養物（血液、脳脊髄液等）から迅速に微生物を分離し同定することが望ましい。

最近、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry)（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ」）（以下「Ｍａｌｄｉ」）等の、ある種のプロテオーム技術／ツールにより、陽性の血液培養物（「ＰＢＣ」）からの、或いは寒天プレート等の基材上で増殖した細菌コロニーからの、細菌および／または真菌の迅速かつ正確な同定ができることが示されている。

Ｍａｌｄｉプロセスでは、栄養培地中で通常の方法によって培養されたコロニーからの少量の微生物を、Ｍａｌｄｉプレートとして知られる質量分析用の試料支持プレートに移し、一般的には飛行時間型（ＴＯＦ）による質量分析に直接供している。様々なタンパク質が微生物中に十分な濃度で存在することを前提として、これらのタンパク質が質量分析によって示される。次いで、数千種類の参照スペクトルを含むスペクトルライブラリをコンピュータ検索することにより、微生物のタンパク質プロファイルから微生物を同定する。検査している微生物の正確な種に関する参照質量スペクトルがライブラリ中に存在していない場合には、関連する微生物が同一種類のタンパク質をいくつか含むことが多いので、類似性の要求を比較的低くしたコンピュータ化ライブラリ検索を行なうことによって、微生物の目、科または属の少なくともいくつかを示すことができる。ＭａｌｄｉプロセスはＵｌｒｉｃｈ Ｗｅｌｌｅｒに与えられた「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ Ｂｏｄｉｌｙ Ｆｌｕｉｄｓ」と題する国際公開第２００９／０６５５８０Ａ１号により詳細に述べられており、その内容は引用することによりその全てが本明細書の一部をなすものとする。同定には種々の質量分析装置が用いられる。

ＰＢＣ試料中の微生物は、Ｍａｌｄｉ同定の前に、例えば寒天プレート上で継代培養することができる。または、継代培養を必要とせずに、種々の試料調製法を用いてＰＢＣ試料から微生物を分離することができる。微生物の分離株は、一般にＭａｌｄｉプレートに直接塗布して、約７０〜８０％の同定精度を得ることができる。いかなる同定もできなかった分離株については、典型的には追加の液体抽出法を用いて微生物からタンパク質を抽出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって同定を改善する。これらの液体タンパク質抽出法によって一般的には同定精度が向上するが、これらの方法は数回の遠心分離ステップを必要とするだけでなく、時間もかかる。

Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｖ．ら「Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．３１巻（３）、３１１〜３１７頁（２０１２年３月）（２０１１年６月２３日電子版）には、分離した細菌の液体試料をＭａｌｄｉプレートにスポットし、スポットした液体試料に２５％のギ酸を直接重層することによって、陽性の血液培養物から細菌を同定する方法が開示されている。したがって、細菌試料中のギ酸の最終濃度は２５％未満である。Ｓｃｈｍｉｄｔ法により、グラム陰性細菌については８６．６％の同定精度、グラム陽性細菌については６０％の同定精度が得られる。Ｓｃｈｍｉｄｔは酵母にてこの方法の試験を報告している。

Ｈｙｍａｎ，Ｊ．ら（２０１０年５月１３日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０１２００８５号明細書）は、Ｓｃｈｍｉｄｔと同様の方法を開示しており、ここでは、溶液中の未処理の分離した微生物をＭａｌｄｉプレートに直接塗布する。次いで、この液体試料にほぼ等量の５０％のギ酸を重層する。したがって、試料に加えたギ酸の最終濃度は約２５％である。この方法は１４種の異なった細菌および酵母について試験された。この方法によって９１．１％の同定が得られたが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、または酵母に関して、この方法がどの程度効果的であったかのデータは示されていない。

Ｈａｉｇｈら「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ Ｙｅａｓｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ａ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４９巻（９）３４４１頁（２０１１年９月）は、Ｍａｌｄｉプレートに直接塗布した微生物タンパク質をニートのギ酸を用いて抽出する方法を記述している。しかしながら、この方法では、酵母およびグラム陽性細菌の全ての株を同定することには成功していない。

Ｈｅｒｅｎｄａｅｌら「Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ３１巻（５）、８４１〜８４８頁（２０１２年５月）（２０１１年８月２３日電子版）は、酵母の同定のための２つの方法を記述している。Ｈｅｒｅｎｄａｅｌらが記述した標準的抽出法は、従来の液体抽出法である。Ｈｅｒｅｎｄａｅｌらが記述した短い抽出法では、寒天プレートから１つのコロニーを採取し、ターゲットのＭａｌｄｉプレートに直接添加した。試料にギ酸（濃度７０％、１μＬ）を加え、試料を乾燥させた。乾燥させた試料にＭａｌｄｉマトリックスを重層し、さらに乾燥して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析した。短い抽出法によって標準的抽出法と同様の結果が得られたが、Ｍａｌｄｉスコアは短い抽出法の方が低かった。ほとんど全て（９７．６％）の分離株が短い抽出法によって同定できたが、これらの同定の１７．１％が信頼閾値レベル１．７未満であった。

抽出法によって正確な結果が得られる一方、検出までの時間（ＴＴＤ）は、直接塗布による検出よりもずっと短い。したがって、直接塗布Ｍａｌｄｉを用いて同定精度を改善する方法が求められている。

開示した方法の種々の実施形態によって、陽性の血液培養物（「ＰＢＣ」）または基材上で培養した細菌コロニーの純粋な分離株からの微生物のＭａｌｄｉを用いる質量分析による直接的な同定が可能となる。本発明に係る一実施形態では、溶液分注／積層法(a solution dispense/layering method)を用いてＭａｌｄｉ用の試料を調製する。本明細書に記載の溶液分注／積層法では、分注する細菌懸濁液(bacterial suspension)を最初に評価し、懸濁液中の細菌の濃度の指標として、その濁度を測定する。濁度測定のためのこのような標準法の１つとして、マクファーランド濁度標準がある。マクファーランド濁度標準(The McFarland turbidity standard)は当業者には公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない。

細菌懸濁液は「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｌｄｉ」と題するＢｏｔｍａらのＷＯ２０１３１４７６１０および「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ」と題するＡｒｍｓｔｒｏｎｇらの米国特許出願公開第２０１２／０００９５５８号明細書に記載された方法等の方法によって作製することができ、これらの開示は引用することによりその全てが本明細書の一部をなすものとする。

溶液分注積層法(solution dispense layering method)は、その名称の通り、Ｍａｌｄｉのために２層以上の溶液の層形成を必要とするものである。選択した量の試料をＭａｌｄｉプレートに添加し、乾燥する。次いで、（好ましくは第１の層と同じ量の）、試料の少なくとも第２の層を添加する。第２の層を乾燥する。任意選択的に、さらなる層を堆積し、乾燥してもよい。２層以上の層のうちの最後の層を乾燥した後、（例えばギ酸を加え、次いで本明細書に記載するように試料の上にマトリックスを添加することによって）Ｍａｌｄｉ用に試料を処理する。次いで、Ｍａｌｄｉによって試料を評価する。溶液分注／積層法により、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方について、有意に２．０未満のマクファーランド濁度を有する液体試料にて許容できるＭａｌｄｉの結果が得られることが分かった。

例えば、一実施形態では、（上記のように寒天プレートから採取した細菌コロニーから調製し、水（質量分析グレード）に懸濁した）液体の細菌懸濁液(liquid bacterial suspension)がマクファーランド値０．５を有する場合、その値はマクファーランド値２．０よりも有意に小さく、これは溶液分注／積層試料調製を用いてこの試料をＭａｌｄｉ用に調製するべきであるとの指標となる。

Ｍａｌｄｉ用の試料を調製するために溶液分注／積層を用いることを決定した後、層あたりの試料の量を選択する。０．５マクファーランド値を有する試料を用いる上記例では、少なくとも約３μｌで約４μｌを超えない層あたりの量を選択する。層の数は濁度値および試料量による。層の量を選択し、Ｍａｌｄｉプレート上に堆積したら、試料を乾燥する。正確な乾燥条件は設計選択の問題であり、Ｍａｌｄｉ試験用の試料の一体性を維持しながら迅速な乾燥が得られるように選択する。好適な乾燥条件は当業者によって容易に決定される。例えば、乾燥するステップは周囲温度で、または（例示的に、約４０℃〜約４５℃の）ホットプレートを用いて完了することができる。乾燥の後、第１の層の上に試料の第２の層を堆積させる。第２の層は第１の層と同じ量を有する。必要であれば、追加の層を加えて乾燥する。積層法は追加の時間および資源を必要とするので、層の数はＭａｌｄｉから正確な結果を得るために必要な数に限定される。

溶液分注／積層試料の堆積に続いて、典型的なＭａｌｄｉ手順（７０％のギ酸およびマトリックスの添加）によって試料ターゲットウェルを処理する。

Ｍａｌｄｉ用の試料調製プロセスは種々の要因によるが、最も顕著にはｉ）試料中の微生物の濃度、ｉｉ）試料の量、および適用可能な場合にはｉｉｉ）分注回数によることが分かった。微生物濃度は試料の濁度に反映される。大まかには、濁度が高ければ微生物濃度が高い。本明細書に記載した方法は、試料の濁度の測定から始まる。濁度は、当業者にとって公知な手法と装置を用いる標準的な比濁分析によって測定される。比濁分析は、本明細書にて詳細には記載しない。濁度を評価したら、どのようにＭａｌｄｉ用の試料調製をするかの決定を行なう。この決定は、濁度情報および試料量を評価することによって行なう。自動化された評価および決定を意図した本発明に係るこれらの実施形態では、試料情報をデータベースに入力する。（特定の試料に最適化された試料調製に関する情報によって予めプログラムされた）データベースは、Ｍａｌｄｉ試料調製のための推奨される方法を出力する。

別の実施形態では、試料を評価し、適切なＭａｌｄｉ調製プロトコルを決定するためのシステムが意図される。好ましくは、システムは完全に自動化されている。システムの自動化された実施形態では、試料に関してプロセッサが受信する情報に基づいて、プロセッサはＭａｌｄｉ調製プロトコルを制御する。試料はＰＢＣから直接得られるか、平板培養から採取される。自動化システムでは、試料はロボティクスを用いて得られる。試験のための生物学的試料を得るロボティック機構(robotic mechanisms that obtain biological samples for testing)は当業者には公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない。他の実施形態では、システムは半自動化されている。半自動化された実施形態では、試料は手動で得られる。

試料が得られた後、これを希釈する。自動化システムでは、希釈はプロセッサからの指示によって制御される。システムは、上記したように、無菌水を用いて試料を所定量（例えば４．５ｍｌ）に希釈する。半自動化された実施形態では、希釈は手動で行なうこともできる。

試料が希釈されたら、システムは試料の濁度を測定する。好ましくは、システムには、濁度を測定するために自動化装置が配置されている。試料の濁度を測定するための自動化装置(automated equipment for measuring sample turbidity)は、当業者には公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない。半自動化された実施形態では、濁度は手動で測定される。

システムプロセッサは、測定された濁度と所定の濁度閾値とを比較する。試料の濁度が所定の濁度値の範囲内にあるとプロセッサが判断した場合、プロセッサは所定量の希釈された試料をＭａｌｄｉプレートに移送する指示を与える。自動化システムは、プロセッサからの指示に基づいてＭａｌｄｉ用の試料を調製する（すなわち、微生物の細胞壁を破壊して細胞中のタンパク質を放出させるためのギ酸の添加およびそれに続く本明細書の他の場所に述べたＭａｌｄｉに先立つ試料上へのＭａｌｄｉマトリックス溶液の添加）。半自動化システムでは、Ｍａｌｄｉプレート上に堆積すべき試料の量についての指示を受信したら、Ｍａｌｄｉプレートは手動で調製される。濁度が所定の範囲を超えるとプロセッサが判断した場合、プロセッサは典型的な量より少ない量を用いてＭａｌｄｉ試料を調製する指示を与える（すなわち、Ｍａｌｄｉプレート上に通常０．５μｌが堆積される場合には、高濁度試料の代わりに０．２５μｌのみがＭａｌｄｉプレート上に堆積される）。濁度が所定の範囲未満であるとプロセッサが判断した場合、堆積と堆積の間に試料を乾燥しながらＭａｌｄｉプレート上に試料が複数の層に堆積される。Ｍａｌｄｉプレート上の試料の複層の堆積については上に述べている。上記のように、完全に自動化された実施形態では、システムはプロセッサからの指示に基づいて試料をＭａｌｄｉプレート上に堆積するオートメーションを有している。半自動化された実施形態では、プロセッサからの指示に基づいてオペレーターが試料をＭａｌｄｉプレート上に堆積する。

図１は、本明細書に記載した方法の一実施形態にて用いた統計モデルを公式化するために用いたデータを示す表であり、用いたパラメータおよび用いたパラメータの値を含む。 図２は、本明細書に記載した統計モデルを開発するために用いた追加的条件を示す表である。 図３Ａおよび図３Ｂは、本明細書に記載した方法を試験するために用いた微生物のリストである。 図４Ａ−図４Ｃは、どのＭａｌｄｉ試料調製パラメータから許容できるＭａｌｄｉ結果が得られるかを示す統計モデルから得られる表面応答プロットである。 図５は、種々の試料調製パラメータについての（図３に列挙した細菌の）Ｍａｌｄｉからの正しい同定（種の同定）の数を記載した表である。 図６Ａおよび図６Ｂは、種々の異なった微生物について、乾燥ありおよび乾燥なしの複数回分注によって調製した０．２５のマクファーランド濁度の試料のＭａｌｄｉスコアを比較した表である。 図７Ａ−図７Ｃは、種々の異なった微生物について、異なった試料量／分注回数で調製した０．２５のマクファーランド濁度の試料のＭａｌｄｉスコアを比較した表である。 図８は、測定した試料の濁度に基づいて試料を調製した本発明に係る実施形態についてのフローチャートである。 図９は、本明細書に記載した方法を実施するために用いたシステムの概略図である。

本発明は、Ｍａｌｄｉプレート上に複層の試料を分注する溶液分注／積層手法を用いるＭａｌｄｉ用試料調製法を意図している。分注された試料は分注の間に乾燥される。広範囲の微生物についてＭａｌｄｉスコアを改善するための方法をここで説明する。

Ｍａｌｄｉ同定の結果がＭａｌｄｉプレート上に堆積した細胞の量によって影響されることは、当業者にはよく知られている。標準化された微生物懸濁液によって細胞の均一な分散が得られ、より正確で再現性のある結果が得られる。一実施形態では、Ｍａｌｄｉ質量分析法によって微生物のアイデンティティを決定するために構成された装置に載置するように適合された固体表面上に堆積される前に、微生物懸濁液が標準化される。微生物懸濁液は任意選択的に、ある種のマクファーランド標準に調節することができる。標準化された微生物懸濁液の作製は当業者には公知の種々の方法、例えば接種ループ、ミクロドロッパー、または他の物理的な方法を用いて実施することができる。好ましい実施形態では、微生物懸濁液はＭａｌｄｉプレートに接種する前に少なくとも０．２５のマクファーランド標準に調節される。接種の条件（すなわち、分注量および分注回数）は、許容できる程度に高いＭａｌｄｉスコア（好ましくは少なくとも約２以上）が得られそうな試料を提供するように選択される。

記載した実施形態にて、図３に列挙した微生物の試料をＭａｌｄｉ用に調製した。Ｍａｌｄｉ用に試料を調製するために用いたいくつかの異なった方法を以下に記載する。

＜方法１＞
先ず、図３Ａに列挙した各微生物について、無菌希釈剤（例えばＢＢＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社））中で２．０のマクファーランド濁度で調製した。Ｍａｌｄｉターゲットプレート上に３個のスポットを形成した。それぞれのスポットの量は、１μｌであった。次いで、ホットプレートを用いて約４０℃〜約４５℃で試料を乾燥した。Ｍａｌｄｉターゲットプレートは、Ｂｒｕｋｅｒ社から入手した。試料が乾燥した後、７０％のギ酸１μｌを、スポットの上に添加した。試料を再び乾燥した。次いで、α−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）マトリックス１μｌをスポット上に載置し、試料を乾燥し、装置の標準設定を用いてＢｒｕｋｅｒ社のＭａｌｄｉで分析した。Ｍａｌｄｉにより、図３Ａに列挙した微生物２９種のうち２８種について属と種を同定することに成功した。

＜方法２＞
先ず、試料を希釈するために無菌希釈剤を用いて、図３Ａに列挙した各微生物について１．０のマクファーランド濁度で調製した。Ｍａｌｄｉターゲットプレート上に、３個のスポットを形成した。それぞれのスポットの量は、２μｌであった。次いで、ホットプレートを用いて約４０℃〜約４５℃で試料を乾燥した。Ｍａｌｄｉターゲットプレートは、Ｂｒｕｋｅｒ社から入手した。試料が乾燥した後、７０％のギ酸１μｌを、スポットの上に添加した。試料を再び乾燥した。次いで、ＨＣＣＡマトリックス１μｌをスポット上に載置し、試料を乾燥し、装置の標準設定を用いてＢｒｕｋｅｒ社のＭａｌｄｉで分析した。Ｍａｌｄｉにより、図３Ａに列挙した微生物２９種のうち２６種について属と種を同定することに成功した。

＜方法３＞
先ず、無菌希釈剤を用いて、図３Ａに列挙した各微生物について１．０のマクファーランド濁度で調製した。Ｍａｌｄｉターゲットプレート上に、３個のスポットを形成した。それぞれのスポットの量は、１μｌであった。次いで、ホットプレートを用いて約４０℃〜約４５℃で試料を乾燥した。乾燥したスポットのそれぞれの上にさらに１μｌを作製した。次いで、これらのスポットを乾燥した。Ｍａｌｄｉターゲットプレートは、Ｂｒｕｋｅｒ社から入手した。試料が乾燥した後、７０％のギ酸１μｌを、スポットの上に添加した。試料を再び乾燥した。次いで、ＨＣＣＡマトリックス１μｌをスポット上に載置し、試料を乾燥し、標準設定を用いてＢｒｕｋｅｒ社のＭａｌｄｉで分析した。Ｍａｌｄｉにより、図３Ａに列挙した微生物２９種のうち２９種について属と種を同定することに成功した。

［実施例１］
０．５マクファーランド値の試料を調製し、Ｍａｌｄｉによって正しく同定された微生物の数について評価した。最初に、無菌希釈剤を用いて、図３Ａに列挙した各微生物について０．５マクファーランド値の試料を調製した。試料は、下記表１に従ってＭａｌｄｉプレート上に作製した。

統計モデルを作成するために、３つのパラメータのそれぞれについて４つの値を選択した。これら４つの値およびこれらの値に付随するパラメータを、図１の表２００に示す。次いで、これらの値を、実験デザイン（ＤＯＥ）タグチデザイン(design of Experiment (DOE) Taguchi Design)（これは購入可能であり、当業者には公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない）を用いてミニタブ１６に入力した。この初期デザインによって、図１の表１００で説明した通りパラメータマトリックスを用いて１６個の実験操作のシリーズを作成した。表１００は表２００のパラメータに付随する整数を列挙したものである。表３００は、それぞれの実験操作の実際のパラメータを列挙したものである。実験操作は、図３Ｂのチャレンジセット（図３Ａに列挙したものよりも検出が難しい微生物のアレイ）のＭａｌｄｉ同定を用いて、最も検出が難しい１５種の細菌について行なった。データを蓄積し、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａバージョン１２（当業者には公知の購入可能なソフトウェア）を用いて解析した。３つのパラメータ、すなわちマクファーランド、分注量および分注回数の全ては、試料が正しいＭａｌｄｉスコアを得るために許容できる機会を有したか否かの判断について有意であった。

表面応答プロットを作成し、相互作用を検討した。これらの表面応答プロットにより、許容できるＭａｌｄｉの結果がマクファーランドの値、分注回数および分注量によって変動することが示される。プロットにより、高いマクファーランドが必ずしも望ましいＭａｌｄｉスコアを与えるのに重要であるとは限らないことが示される（属および種の確認のため２．０以上）。例えば、２．０マクファーランドおよびより低いマクファーランド（例えば０．５）は、分注量が多い場合（図４Ｂ）および／またはターゲットプレートへの分注／乾燥サイクルが多い場合（図４Ｃ）には、同じ正しいＭａｌｄｉの結果を生じることがある。表５００には、モデルを補完するために用いたＭａｌｄｉ試料調製のための追加の試料パラメータを示す。これらの試料は有意に高いマクファーランド値（約５．０）を有し、上限の相互作用を決定する。

試料のＭａｌｄｉ値は、Ｂｒｕｋｅｒ社のＭＡＬＤＩ Ｂｉｏｔｙｐｅｒ ＬＴを用いて得た。全ての試料は上記のプロトコルを用いて調製した。マクファーランド値、分注量および分注回数は図１および図２に説明した通りである。図５に示す実験１〜２２を、図３Ｂに列挙した各微生物について実施した。試料の堆積が完了したら、試料を乾燥して７０％のギ酸水溶液１μｌで固定した。試料を再び乾燥し、Ｂｒｕｋｅｒ社のＨＣＣＡマトリックス１μｌとともにシールした。

所望のマクファーランド値を得るための試料を調製するために、試料を無菌試料希釈剤(sterile sample diluent)５ｍｌで希釈した。所望のマクファーランド値は、ＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ｓｐｅｃ比濁計およびＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ｓｐｅｃ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ法を用いて得た。

図１、表２００にて説明した通り、試料は以下の値を用いて調製した。
ｉ）マクファーランド値：０．２５、０．５、１．０、２．０；
ｉｉ）試料量：０．５μｌ、１．０μｌ、２．０μｌ、４．０μｌ；および
ｉｉｉ）分注回数：１、２、３、および４。

試料の堆積が完了したら、試料を乾燥して７０％のギ酸水溶液１μｌで固定した。試料を再び乾燥し、Ｂｒｕｋｅｒ社のＨＣＣＡマトリックス１μｌとともにシールした。マトリックス溶液は５０％アセトニトリル、４７．５％水および２．５％ＴＦＡを用いて調製した。溶媒はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。

各微生物についてそれぞれのプレートの上に３つのスポットを調製したので、各微生物について３つのＭａｌｄｉスコアが得られた。したがって表３００および表５００（図１および図２）に列挙した２２回の実験にて、各微生物について６６個のＭａｌｄｉスコアが得られた。

図５に示すように、種々の異なったパラメータについて最大の割合で正しいＭａｌｄｉスコアが得られた（正しい結果は２．０以上のＭａｌｄｉスコアであった）。一般に、マクファーランド値が低い試料については、正しいＭａｌｄｉスコアを高い率で得るためには、分注量を大きく、分注回数を多くする必要がある。例えば、０．２５のマクファーランド値の試料については、８４％の正しいＭａｌｄｉスコアを得るために、分注量４μｌおよび分注の間の乾燥を含む４回の分注が必要であった。

［実施例２］
試料（０．２５のマクファーランド値）を調製し、図３Ｂに列挙した微生物を添加した。試料は概して上に述べた手順を用いて調製した。Ｍａｌｄｉターゲットプレート上に３つのスポットを形成した。それぞれのスポットの量は１μｌであった。次いで試料をホットプレート上、４０℃〜４５℃で乾燥した。それぞれの試料について２枚のターゲットプレートを調製した。ＭａｌｄｉターゲットプレートはＢｒｕｋｅｒ社から入手した。第１のプレートでは、堆積した試料を乾燥し、その後、乾燥した第１のスポットの上にさらに１μｌの試料スポットを載置した。第２のプレートでは、第２のスポットをその上に堆積させる前に第１のスポットを乾燥しなかった。スポットを完全に堆積させた後、両方のプレート上のスポットを乾燥した。次いで両方のプレートの乾燥したスポットの上に７０％のギ酸１μｌを添加した。試料を再び乾燥した。次いでＨＣＣＡマトリックス１μｌをスポット上に載置し、試料を乾燥して、Ｂｒｕｋｅｒ社のＭａｌｄｉで分析した。Ｍａｌｄｉプレート上にスポットを堆積するステップの間に乾燥するステップを用いて調製したそれらの試料について、Ｍａｌｄｉにより、添加した試料４５スポットのうち３９の同定に（属レベルで）成功した。Ｍａｌｄｉプレート上にスポットを堆積するステップの間に乾燥するステップを用いて調製したそれらの試料について、Ｍａｌｄｉにより、添加した試料４５スポットのうち２９の同定に（種レベルで）成功した。試料には１５種の微生物の１つを添加しており、それぞれの添加した試料について３つのスポットがあったので、全部で４５個の試料スポットがＭａｌｄｉによって評価された。

Ｍａｌｄｉプレート上にスポットを堆積するステップの間に乾燥するステップなしに調製したそれらの試料については、Ｍａｌｄｉにより、添加した試料４５スポットのうち（属レベルで）同定に成功したのは３９スポットであった。しかし、Ｍａｌｄｉプレート上にスポットを堆積するステップの間に乾燥するステップなしに調製したそれらの試料については、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦにより、添加した試料４５スポットのうち（種レベルで）同定に成功したのは２４スポットのみであった。これらの結果のまとめを以下の表２に示す。結果は陽性の集合というよりも３回のうち最良のものとして報告している。これより、堆積ステップの間に乾燥するステップがある場合に、乾燥するステップがない場合よりも１種多い微生物が検出されたことが分かる。

評価した各微生物についてのＭａｌｄｉスコアを図６に列挙する。Ｍａｌｄｉスコア１．７未満の場合は「同定なし」とみなすことに注意されたい。１．７〜２未満のＭａｌｄｉスコアは、属レベルでは陽性の同定とみなしたが、種レベルではそうでないとみなした。２以上のＭａｌｄｉスコアは属レベルおよび種レベルの両方で陽性の同定とみなした。１回目の分注と２回目の分注の間に乾燥した試料については、属レベルおよび種レベルでの陽性の同定の割合は６４％であり、分注の間に試料を乾燥しなかった場合の同定の５３％と比較される。このことは、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦによる「低マクファーランド」試料の試験について、乾燥するステップなしに複数回分注した場合に比べて、本明細書に記載した（乾燥するステップを含む）溶液分注／積層法が顕著な利点を有することを示している。

［実施例３］
試料（０．２５のマクファーランド値）を調製し、図３Ｂに列挙した微生物を添加した。試料は概して上に述べた手順を用いて調製した。それぞれのＭａｌｄｉターゲットプレート上に３つのスポットを形成した。それぞれの試料について３枚のターゲットプレートを調製した。ＭａｌｄｉターゲットプレートはＢｒｕｋｅｒ社から入手した。第１のプレートの上にそれぞれ１μｌの試料の３つのスポットを分注した。第２のプレートの上にそれぞれ２μｌの試料の３つのスポットを分注した。第３のプレートの上にそれぞれ１μｌの試料の３つのスポットを分注し、乾燥して、それぞれの乾燥したスポットの上に、さらに１μｌの試料スポットを形成した。スポットを完全に堆積させた後、プレート上のスポットを乾燥した。次いで両方のプレートの乾燥したスポットの上に７０％のギ酸１μｌを添加した。試料を再び乾燥した。次いでＨＣＣＡマトリックス１μｌをスポット上に載置し、試料を乾燥して、Ｂｒｕｋｅｒ社のＭａｌｄｉで分析した。０．２５のマクファーランド値の試料を１μｌ単回分注して調製したそれらの試料について、Ｍａｌｄｉにより、添加した試料４２スポットのうち３１の同定に（属レベルで）成功した。０．２５のマクファーランド値の試料を２μｌ単回分注して調製したそれらの試料について、Ｍａｌｄｉにより、添加した試料４２スポットのうち３３の同定に（属レベルで）成功した。０．２５のマクファーランド値の試料を１μｌ分注し、次いで、乾燥して、２回目の１μｌの分注によって調製したそれらの試料について、Ｍａｌｄｉにより、添加した試料４２スポットのうち３６の同定に（属レベルで）成功した。これらの結果を以下の表３および図７に報告する。結果を「３つのうちの最良のもの」として報告すれば、０．２５マクファーランドを１μｌ／１μｌで積層することによって最良の結果（異なった微生物の最大の数についての正しいＩＤ）が得られたことが明らかである。

種レベルでは、１μｌを２回分注し、乾燥するステップの介在を伴う溶液分注／積層法によって、種レベルで２４種の正しい同定が得られた（２μｌの単回分注における１８種および１μｌの単回分注における１０種と比較される）。このデータも、マクファーランド値が低い試料について、溶液分注／積層法により、単回分注よりも顕著に正確なＭａｌｄｉスコアが得られることを示している。

一実施形態にて、純粋な分離株またはＰＢＣ試料からの微生物は、ｉ）少なくとも１種の微生物を含む疑いがある試料を増殖培地から（すなわち、ＰＢＣから、または寒天プレート上の継代培養から）得るステップ、ｉｉ）試料の接種パラメータを決定するステップであって、該パラメータが接種液の決定されたマクファーランド値、分注量および分注回数を含むステップ、ｉｉｉ）決定した分注量および分注回数を用いて、Ｍａｌｄｉ質量分析によって微生物を同定するために構成された装置に載置するように適合された固体表面上に試料の少なくとも一部を堆積させるステップ、ｉｖ）少なくとも１つの試薬で試料を処理するステップであって、該試薬が揮発性の酸、有機溶媒、および／または有機溶媒と揮発性の酸の組合せを含むステップ、ｖ）処理した試料の上にＭａｌｄｉマトリックス溶液を載置するステップ、およびｖｉ）質量分析によって微生物を同定するステップによって同定される。一実施形態では、揮発性の酸は少なくとも７０％のギ酸である。別の実施形態では、揮発性の酸は少なくとも８０％のギ酸である。別の実施形態では、揮発性の酸は少なくとも９０％のギ酸である。本明細書にて他に特定しない限り、ギ酸溶液は水溶液である。別の実施形態では、揮発性の酸は少なくとも１００％のギ酸（例えばニート）である。別の実施形態では、試料の上にＭａｌｄｉマトリックス溶液を載置する前に、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、または酢酸エチル等の有機溶媒中の少なくとも７０％のギ酸で試料を処理する。別の実施形態では、試料の上にＭａｌｄｉマトリックス溶液を載置する前に、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、または酢酸エチル等の有機溶媒中の少なくとも８０％のギ酸で試料を処理する。別の実施形態では、試料の上にＭａｌｄｉマトリックス溶液を載置する前に、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、または酢酸エチル等の有機溶媒中の少なくとも９０％のギ酸で試料を処理する。一実施形態では、試料が揮発性の酸を希釈することを防止するために、揮発性の酸を加える前に、固体表面上に堆積された試料を乾燥させる。別の実施形態では、試料の上にＭａｌｄｉマトリックス溶液を載置する前に揮発性の酸を乾燥する。本発明に係る種々の実施形態にて用いられる揮発性の酸の例は、これらに限定されないが、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸および塩酸を含む。

Ｍａｌｄｉプレート上で試料を乾燥し、単独でまたは有機溶媒と組み合わせて揮発性の酸と混合した後、試料と試薬の混合物を乾燥する。乾燥は、その後に加えるいかなる液体も希釈されないように液体を十分に蒸発させることと定義される。試料は周囲空気中で乾燥してよいが、混合された試料および試薬の液体部分の蒸発を加速するために、加熱ブロック、ホットプレート、加熱オーブンまたは赤外加熱ランプ等の熱源を用いてもよい。これらの乾燥法はＭａｌｄｉによる同定に際して試料のスペクトルを変化させない。

乾燥後、試薬で処理した試料の上にＭａｌｄｉマトリックスを添加する。開示した方法では、当業者には公知の任意のＭａｌｄｉマトリックス溶液を用いてよい。これらのマトリックス溶液は、これらに限定されないが、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＳＰＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）、３，４−ジヒドロキシ桂皮酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）−安息香酸、２−アミノ−４−メチル−５−ニトロピリジン、および２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）を含む。

代替の実施形態では、微生物は、ｉ）少なくとも１種の微生物を含む疑いがある試料の微生物懸濁液を調製するステップ、ｉｉ）微生物懸濁液の濁度を決定するステップ、ｉｉｉ）Ｍａｌｄｉ質量分析によって微生物を同定するために構成された装置に載置するように適合された固体表面上に試料の少なくとも一部を微生物懸濁液から堆積させるために用いる分注の量および回数を選択するステップ、ｉｖ）選択したパラメータを用いてＭａｌｄｉプレート上に試料を堆積させるステップ、ｖ）任意選択的に、有機溶媒、例えばエタノール、固定剤、例えばホルムアルデヒドを用いて、または一般に最大で約３７℃（すなわち、ほぼ体温）に加熱することによって、微生物を固定するステップ、ｖｉ）試料を少なくとも７０％のギ酸によって覆うステップ、ｖ）試料を乾燥するステップ、ｖｉ）処理した試料の上にＭａｌｄｉマトリックス溶液を載置するステップ、ｖｉｉ）試料を乾燥させるステップ、およびｖｉｉｉ）質量分析によって微生物を同定するステップによって同定される。ホルムアルデヒド等の固定剤(fixatives)は当業者には公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない。

図８を参照して、本発明に係る１つの例は生物学的試料を得ることを意図している。試料を、これをＭａｌｄｉプレートに送達することに適した希釈剤と混合する。試料／希釈剤混合物の濁度を測定する。測定された濁度が所定の範囲内である場合、所定量のアリコート(aliquot)を、Ｍａｌｄｉプレート上に堆積させる。測定された濁度が所定の範囲より高い場合、より少ない量の試料をＭａｌｄｉプレート上に堆積させる。測定された濁度が所定の範囲未満である場合、分注の間の乾燥を含む複数回分注を用いる上述した試料調製プロトコルを用いる。

例示的な一実施形態では、試料を得て懸濁液を調製する。濁度を測定する。濁度が（マクファーランドで）約２〜約６であれば、約３μｌをＭａｌｄｉプレート上に堆積する。試料の濁度が約６より高ければ、Ｍａｌｄｉプレート上に堆積する試料の量を約１μｌに減らす。試料の濁度が約２未満であるが約１〜約２の範囲にあれば、約３μｌの試料をＭａｌｄｉプレート上に堆積し、乾燥して、第２の３μｌの試料を堆積し、乾燥する。試料の濁度が約０．５〜約１であれば、それぞれ約３μｌの３「層(layers)」の試料を堆積し、乾燥する。試料の濁度が約０．２５〜約０．５であれば、（それぞれ３μｌの）４「層」の試料を堆積し、乾燥する。

試料を堆積して乾燥した後、本明細書に記載したように、試料をＭａｌｄｉのために処理する。

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法による評価のための生物学的試料を調製するための自動化システムも意図されている。このようなシステムは、試料調製デバイスと通信するプログラム可能なコントローラ（例えばプロセッサ）を有している。プログラム可能なコントローラは、平板培養物からコロニーを採取する指示を試料調製デバイスに送信する。このようなデバイスとしては、例えば、ＢＤ Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）から購入できるＩｎｏｑｕｌＡ（商標）である。プロセッサは、必要に応じてある量の希釈剤または試料処理試薬を試料に加えて所定量を有する試料溶液を調製する指示を与える。試料を所定量に希釈する自動化システム(automated systems that dilute samples to a predetermined volume)は当業者には公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない。試料を希釈した後、試料の濁度を測定する。濁度は、吸光度、透過率およびマニュアル法等の種々の手法によって測定される。システムの実施形態は、濁度を測定するために比濁計の使用を意図している。

本明細書にて「比濁計(nephelometer)」は、懸濁液中の固体粒子の量を測定することができる装置である。本明細書にて「比濁分析(nephelometry)」は、懸濁液中の懸濁固体の量を測定できる方法を意味する。比濁計は当業者には公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない。

プロセッサは、試料の濁度を測定する装置と通信する。プロセッサは、許容できる濁度の値または値の範囲を記憶するメモリを有している。プロセッサは、記憶された値と測定値とを比較する。試料濃度が所定の範囲内にある場合、プロセッサは、上述のように質量分析を実施するために構成されたデバイスに試料を送達するように適合された基板に第１の所定量の試料を添加することを指示する。

測定された試料濃度が所定の範囲より高いとプロセッサが判断した場合、プロセッサは、質量分析を実施するために構成されたデバイスに試料を送達するように適合された基板に、第２の所定量の試料を添加する指示を与える。第２の所定量は、第１の所定量より少ない。

測定された試料濃度が所定の範囲より低いとプロセッサが判断した場合、プロセッサは、ｉ）質量分析を実施するために構成されたデバイスに試料を送達するように適合された基板に第３の所定量の試料を添加すること、ｉｉ）試料を乾燥すること、ｉｉｉ）基板上の乾燥された試料の上に第３の所定量の試料の第２の添加を行なうこと、およびｉｖ）本明細書に記載した方法で試料を乾燥する指示を与える。

この後、プロセッサは、堆積した試料の上に質量分析における使用に適合されているマトリックスを添加することをシステムに指示する。また、システムは、調製された試料を試験のために質量分析デバイスに載置するための輸送機構を有している。

図９に、微生物試料の懸濁液の自動調製のためのシステム１の実施形態を概略的に示す。システム１は培養皿３のためのステージ２を備え、この培養皿３は寒天ゲル層等の栄養層５の上に微生物４を備える。

システム１は、第１の採取ツール６および更なる採取ツール７を有している。位置決めデバイス８は、図示した実施形態では採取ツールを解放可能に保持するための採取ツールホルダ９を含み、図１に示す実施形態では、採取ツールホルダ９は、第１の採取ツール６を保持している。位置決めデバイス８は、開始位置（図９にて実線で示す）にて第１の採取ツール６を培養皿３の上に位置決めするように配置され、第１の採取ツール６を培養皿３に近づけ、またそれから離れるように自動的に上下させるように配置される。これにより、第１の採取ツール６を、微生物４に接触して微生物の試料を採取する位置（破線６’で示す）に位置決めすることができる。第１の採取ツール６が試料を採取した後、位置決めデバイス８は上昇し、第１の採取ツール６を移送位置に位置決めする。図９に示す実施形態では、移送位置は開始位置と同一である。他の実施形態では、開始位置と移送位置は異なっていてもよい。

システム１は、懸濁液チューブ１１を保持するための懸濁液チューブホルダ１０をさらに備え、この懸濁液チューブ１１は、懸濁媒体(suspension medium)を収容することができる。懸濁媒体は、自動懸濁媒体分注器１２から分注され、図示の実施形態では、この分注器は、懸濁液チューブホルダ１０に保持された懸濁液チューブ１１に、懸濁媒体１４を自動分注するための分注ノズル１３を有している。本実施形態では、懸濁液チューブホルダ１０は、懸濁液チューブ１１を、鉛直軸Ａを中心にして回転させるための回転可能な懸濁液チューブホルダである。

システム１には、移送デバイス１５が組み込まれており、この移送デバイス１５は、採取ツールを、位置決めデバイス８の移送位置から、懸濁液チューブホルダ１０に保持された懸濁液チューブ１１の上の位置に自動的に移送するためのものである。図示した実施形態では、移送デバイス１５は、採取ツールを解放可能に保持するための把持ツール１７を有する移送ホルダ１６を備える。移送デバイス１５は、図に示すようなレール等の移送軌道１８が敷設され、それによって矢印で示すような直線運動をする。しかしながら、その他に、架台に取り付けられた（deck mounted）移送機構なども企図されている。このように、移送デバイス１５は、位置決めデバイス８のところに移動することができ、それによって、把持ツール１７は、採取ツールを位置決めデバイス８から受け取ることができる。把持手段１７が採取ツールを把持した後、採取ツールホルダ９が採取ツールを解放する。図９に示す実施形態では、このように微生物４の試料１９を採取した第２の又は更なる採取ツール７は、移送デバイス１５によって、実線で示す開始位置にて懸濁液チューブ１１の上に位置決めされる。移送デバイス１５は、懸濁液チューブ１１に収容された懸濁媒体１４の中へと第２の採取ツール７を下降させるように動く。そして、図９の破線で示すように、試料１９を有する第２の採取ツール７’は、懸濁媒体１４の中に浸漬される。その後、移送デバイス１５は、第２の採取ツール７を懸濁液チューブ１１の上の待機位置へと位置する。この待機位置は、図９に示す実施形態では開始位置と同一である。なお、他の実施形態では、待機位置と開始位置は異なっていてもよい。

このシステムには、懸濁液チューブホルダ１０に保持された懸濁液チューブ１１に収容されている懸濁媒体１４の濁度の測定を実施するための濁度計２０がさらに設けられている。当技術分野にて一般的に知られるように、濁度計は、物質の濃度、本例では懸濁媒体中に懸濁している微生物の濃度について指標となる測定値を提供できる。図９に示す実施形態では、濁度計２０は、懸濁媒体に向かって且つ通過するレーザー光を発射するレーザー装置２１と、懸濁媒体を通過したレーザー光の量を検出するセンサ２２を備える。さらに、懸濁液によって散乱されたレーザー光の量を検出するために、例えばレーザー光路に対して垂直の位置に配置された更なるセンサ（図示せず）がある。

本発明に係るデバイスの操作は、例えばマイクロプロセッサを含むコントローラ２３によって制御される。これは、位置決めデバイス８の動作、移送デバイス１５の動作、自動懸濁媒体分注器１２の操作、および濁度計２０の操作を自動制御するために、それぞれ位置決めデバイス８、移送デバイス１５、自動懸濁媒体分注器１２、および濁度計２０と通信可能に接続されている（信号線によって示す）。さらに、コントローラ２３は、システム１の他のパーツ、例えば採取ツールホルダ９、移送ホルダ１６、レーザー装置２１およびセンサ２２等とそれぞれ直接的に通信可能に接続されていてもよい。

図９に示す実施形態では、コントローラ２３は、濁度計２０を制御するように構成されており、それによって第２の採取ツール７が懸濁媒体１４の中に浸漬される前に、懸濁媒体１４の濁度の測定が開始される。さらに、コントローラ２３は、回転可能な懸濁液チューブホルダ１０を制御し、これによって、第２の採取ツール７が懸濁媒体１４の中に浸漬される前に、ホルダ１０に保持された懸濁液チューブ１１の回転を開始させることができ、また、懸濁媒体１４の濁度の測定の間、懸濁液チューブ１１の回転を維持することができる。このようにして、濁度計２０は、オンラインで測定値をコントローラ２３に提供する。この値は、測定された濁度を示し、すなわち微生物の濃度を示す。

コントローラ２３はメモリを備えており、この中に第１の閾値と第２の閾値が記憶される。第１の閾値は第２の閾値に等しいかこれより大きい。濁度計によって得られた濁度測定値が第１の閾値および第２の閾値に等しいかこれらの間にある場合、懸濁媒体中の微生物の濃度／量は、懸濁液を収容する懸濁液チューブを次の処理へ進むために十分である。この場合、コントローラ２３は、懸濁液チューブを次の処理をしてよいという信号を発する。さらに、このような場合、例えば位置Ｃに移送デバイスを移動させ、この位置で把持手段１７が作動して第２の採取ツール７を解放することで、第２の採取ツール７を廃棄できる。

濁度計の最終測定値がコントローラ２３のメモリに予め記憶されている第１の閾値を超える場合には、微生物の濃度が高すぎて懸濁液チューブを次の処理に進めることはできない。この場合、コントローラ２３は自動懸濁媒体分注器１２を制御して、追加量の懸濁媒体を懸濁液チューブ１１に供給する。この追加量の懸濁媒体は、懸濁媒体の初期の量、最終測定値ならびに第１の閾値および／または第２の閾値の値に基づいており、それにより懸濁液チューブ１１の中に既に存在していた懸濁媒体に、追加量の懸濁媒体を添加することによって、次の処理に進むための要件を満たす懸濁媒体中の微生物の濃度が得られる。これは、濁度計２０を用いて追加の又は更なる濁度を測定することにより確認できる。

濁度計２０の最終測定値が第２の閾値未満である場合は、懸濁媒体中の微生物の濃度が低すぎることを意味し、コントローラ２３はシステム１を制御して、微生物の追加試料が第１の採取ツール６によって採取されるようにする（または、追加試料を採取するために第２の又は別の採取ツールを用いてもよい）。更なる他の実施形態（後述する）では、懸濁液の濁度が規格未満である場合には、懸濁液（suspension）を複数回分注して同一スポットに堆積させてもよい。これについて具体的に説明すると、コントローラ２３は移送デバイス１５の位置を制御して、第２の採取ツール７を上述のように廃棄されるようにする。次いで（または同時に）位置決めデバイス８の採取ツールホルダ９の中の第１の採取ツール６が、培養皿３の上の開始位置から培養皿の方向に下降し、微生物４と接触して、微生物の追加試料を採取する。その後、微生物の追加試料を有する第１の採取ツール６は、培養皿から離れて移送位置へと自動的に上昇する。次いで移送デバイスは、微生物の追加試料を有する第１の採取ツールを、位置決めデバイス８の移送位置から、懸濁液チューブ１１の上の位置まで自動的に移送する。微生物の追加試料を有する第１の採取ツール６は、懸濁媒体１４の中に下降し、微生物の追加試料を懸濁媒体中に放出する。再び濁度を測定し、この測定値を、コントローラ２３のメモリに記憶されている第１の閾値および第２の閾値と比較する。そして、濁度計２０によって実施された濁度のオンライン測定値が第１の閾値以下で第２の閾値以上であれば、コントローラ２３は、移送デバイス１５の動作を制御して、第１の採取ツール６を待機位置へと上昇するように設定することができる。

本発明に係るシステムに特に有用な懸濁液チューブ、またはバイアルもしくはキュベットは、ターゲット最大寸法（target maximum dimension）が約２ｍｍから約１２ｍｍ、好ましくは約３ｍｍの断面を有するものである。このような比較的に小さな懸濁液チューブにおいては、供給される懸濁媒体の初期の量が約０．１〜５ｍｌ、好ましくは約１ｍｌ未満となるように、コントローラ２３が自動懸濁媒体分注器１２を制御することができる。

懸濁液を調製した後、懸濁液の複数のアリコートを、懸濁液チューブ１１から自動的にピペットで取り出し、Ｍａｌｄｉプレート１００の上に堆積する。Ｍａｌｄｉプレート１００は、図に示すように、支持体１０５の上に配置されている。このステップは、Ｍａｌｄｉプレート調製ステーションで行なわれ、このステーションは、懸濁液が調製される位置から離れた位置Ｃのような位置にある。ある実施形態では、懸濁液チューブ１１は、上述したＭａｌｄｉプレートでの調製のために、Ｍａｌｄｉプレートに近い位置に移動させられる。他の実施形態では、懸濁液のアリコートが懸濁液チューブ１１から取り出され、そのアリコートがＭａｌｄｉプレートでの調製のために用いられる。図９に、ロボットピペッタ(robotic pipettor)を符号１１０として概略的に示す。ロボットピペッタは公知であるため、本明細書にて詳細には記載しない。また、Ｍａｌｄｉプレート１００は、ヒータ１２０として例示されている乾燥装置に接続されている。

以上のように、本明細書にて特定の実施形態を参照して本発明を説明した。これらの実施形態は、本発明に係る原理および応用を説明するのみであることを理解されたい。したがって、実例とした実施形態に数多くの改変が行なえることや、添付した特許請求の範囲により定義される本発明に係る範囲から逸脱することなく他の配置も考えられることを理解されたい。

Claims (36)

1. マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法による評価のための生物学的試料を調製する方法であって、
   生物学的試料を得るステップと、
   前記試料を希釈するステップと、
   質量分析を実施するデバイスに試料を送達するための表面に、前記希釈された試料の第１のアリコートを供給するステップと、
   前記試料を乾燥するステップと、
   前記第１の乾燥されたアリコートの上に前記試料の第２のアリコートを供給するステップと、
   前記試料を乾燥するステップと、
   前記乾燥された試料の上に、前記質量分析法用のマトリックスを供給するステップと、
   前記試料について質量分析を実施するステップと
   を含む方法。
2. 前記試料を無菌希釈剤と混合することにより、前記試料を希釈する、請求項１に記載の方法。
3. 前記生物学的試料が、培養プレートから採取された微生物のコロニーの一部である、請求項１に記載の方法。
4. 前記生物学的試料が、陽性の血液培養物から採取される、請求項１に記載の方法。
5. 前記表面が、質量分析用のプレートである、請求項１に記載の方法。
6. 前記希釈された試料の濁度を測定するステップをさらに含む方法であって、前記希釈された試料が約１〜約２のマクファーランド濁度を有し、前記方法が、約３μｌの第１のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップと、約３μｌの第２のアリコートを前記表面に供給するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記マトリックス溶液が、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＳＰＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）、３，４−ジヒドロキシ桂皮酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）−安息香酸、２−アミノ−４−メチル−５−ニトロピリジン、および２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記乾燥するステップが、ほぼ室温〜約４５℃の温度で行なわれる、請求項１に記載の方法。
9. 前記試料の供給の後、前記試料が、揮発性の酸、有機溶媒およびそれらの組合せの少なくとも１つを含む試薬で処理される、請求項１に記載の方法。
10. 前記揮発性の酸が、少なくとも７０％のギ酸である、請求項９に記載の方法。
11. 前記ギ酸が有機溶媒と混合され、前記有機溶媒がアセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、および酢酸エチルからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記希釈された試料の濁度を測定するステップをさらに含む方法であって、前記希釈された試料が約０．５〜約１未満のマクファーランド濁度を有し、前記方法が、約３μｌの第１のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップと、約３μｌの第２のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップ、約３μｌの第３のアリコートを前記試料に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記希釈された試料の濁度を測定するステップをさらに含む方法であって、前記希釈された試料が約０．２５〜約０．５未満のマクファーランド濁度を有し、前記方法が、約３μｌの第１のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップと、約３μｌの第２のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップ、約３μｌの第３のアリコートを前記試料に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップ、約３μｌの第４のアリコートを前記試料に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法による評価のための生物学的試料を調製する方法であって、
    生物学的試料を得るステップと、
    前記試料を希釈するステップと、
    前記試料濃度を測定するステップと、
    測定された試料濃度が所定の範囲内にある場合は、質量分析を実施するデバイスに試料を送達するための表面に、試料の第１の所定のアリコートを供給するステップと、
    測定された試料濃度が前記所定の範囲より高い場合は、質量分析を実施するデバイスに試料を送達するための表面に試料の第２の所定のアリコートを供給するステップであって、前記第２の所定のアリコートが前記第１の所定のアリコートより少ないステップと、
    測定された試料濃度が前記所定の範囲より低い場合は、
    ｉ）質量分析を実施するデバイスに試料を送達するための表面に前記試料の第１のアリコートを供給するステップと、
    ｉｉ）前記試料を乾燥するステップと、
    ｉｉｉ）前記第１の乾燥させたアリコートの上に前記試料の第２のアリコートを供給するステップと、
    ｉｖ）前記試料を乾燥するステップと、
    前記堆積した試料の上に、前記質量分析法用のマトリックスを供給するステップと、
    前記試料について質量分析を実施するステップと
    を含む方法。
15. 濁度を、吸光度、透過率、手動法または比濁分析により測定する、請求項１４に記載の方法。
16. 濁度を、比濁分析により測定する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記生物学的試料が、培養プレートから採取された微生物のコロニーの一部である、請求項１４に記載の方法。
18. 前記生物学的試料を、陽性の血液培養物から採取する、請求項１４に記載の方法。
19. 前記表面が、質量分析用のプレートである、請求項１４に記載の方法。
20. 前記所定の範囲が約２〜約６のマクファーランド濁度であり、前記希釈された試料が約１〜約２未満のマクファーランド濁度を有し、前記第１および第２のアリコートがいずれも約３μｌである、請求項１６に記載の方法。
21. 前記マトリックス溶液が、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＳＰＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）、３，４−ジヒドロキシ桂皮酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）−安息香酸、２−アミノ−４−メチル−５−ニトロピリジン、および２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
22. 前記乾燥するステップが、ほぼ室温〜約４５℃の温度で行なわれる、請求項１４に記載の方法。
23. 前記試料の前記表面への供給の後、前記試料が、揮発性の酸、有機溶媒およびそれらの組合せの少なくとも１つを含む試薬で処理される、請求項１４に記載の方法。
24. 前記揮発性の酸が、少なくとも７０％のギ酸である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ギ酸が有機溶媒と混合され、前記有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、および酢酸エチルからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記所定の範囲が約２〜約６のマクファーランド濁度であり、前記希釈された試料が約０．５〜約１未満のマクファーランド濁度を有し、約３μｌの第１のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップと、約３μｌの第２のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップと、約３μｌの第３のアリコートを前記試料に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
27. 前記所定の範囲が約２〜約６のマクファーランドであり、前記希釈された試料が約０．２５〜約０．５未満のマクファーランド濁度を有し、約３μｌの第１のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップと、約３μｌの第２のアリコートを前記表面に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップ、約３μｌの第３のアリコートを前記試料に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップと、約３μｌの第４のアリコートを前記試料に供給するステップと、前記試料を乾燥するステップとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
28. マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法による評価のための生物学的試料を調製するための自動化システムであって、
    マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法による評価のための生物学的試料を調製する自動化装置と通信するプロセッサを含み、
    前記プロセッサが、
    ｉ）培養培地から生物学的試料を得るための前記自動化装置に指示を与え、
    ｉｉ）前記プロセッサによって決定される量の希釈剤を前記生物学的試料と混合する前記自動化装置に希釈された試料を調製する指示を与え、
    前記自動化装置が前記希釈された試料の濃度を測定する比濁計を含み、前記比濁計が前記プロセッサと通信し、
    前記プロセッサが前記測定された濃度を受信して、前記測定された試料濃度が所定の範囲内にあるかを判断し、
    前記試料が前記所定の範囲内にあると前記プロセッサが判断した場合、前記プロセッサは、質量分析を実施するデバイスに試料を送達するための基板に第１の所定量の希釈された試料を供給することを前記自動化装置に指示を与え、
    測定された試料濃度が前記所定の範囲より高いと前記プロセッサが判断した場合、前記プロセッサは、質量分析を実施するデバイスに前記試料を送達するための前記基板に第２の所定量の試料を供給することを前記自動化装置に指示を与え、前記第２の所定量は前記第１の所定量より少なく、
    測定された試料濃度が前記所定の範囲より低いと前記プロセッサが判断した場合、前記プロセッサは、
    ｉ）質量分析を実施するデバイスに前記試料を送達するための基板に第３の所定量の前記試料を供給すること、
    ｉｉ）前記試料を乾燥すること、
    ｉｉｉ）前記基板上の前記乾燥された試料の上に第３の所定量の前記試料の第２の供給を行なうこと、および
    ｉｖ）前記試料を乾燥すること、という指示を前記自動化装置に与え、
    次いで前記プロセッサは前記堆積した試料の上に、前記質量分析法用のマトリックスを供給することを前記自動化システムに指示し、
    前記自動化システムは前記調製された試料を試験のために質量分析デバイスに載置するための輸送機構をさらに含む、自動化システム。
29. 前記試料を乾燥するためのヒータを含む、請求項２８に記載の自動化システム。
30. 前記希釈された試料の前記所定の濁度範囲が約２〜約６のマクファーランド濁度である、請求項２８に記載の自動化システム。
31. 前記第３の所定量が約３μｌである、請求項２８に記載の自動化システム。
32. 前記第１の所定量が約３μｌである、請求項２８に記載の自動化システム。
33. 前記第２の所定量が約１μｌである、請求項２８に記載の自動化システム。
34. 前記希釈された試料が約１〜約２未満のマクファーランド濁度を有する場合、前記希釈された試料が第１および第２の供給で前記基板に供給され、それぞれの供給の後に乾燥するステップを有する、請求項２８に記載の自動化システム。
35. 前記希釈された試料が約０．５〜約１未満のマクファーランド濁度を有する場合、前記希釈された試料が第１、第２および第３の供給で前記基板に供給され、それぞれの供給の後に乾燥するステップを有する、請求項２８に記載の自動化システム。
36. 前記希釈された試料が約０．２５〜約０．５未満のマクファーランド濁度を有する場合、前記希釈された試料が第１、第２、第３および第４の供給で前記基板に供給され、それぞれの供給の後に乾燥するステップを有する、請求項２８に記載の自動化システム。