JP2017524933A - 川崎病の診断及び治療 - Google Patents

Abstract

被験体において川崎病を診断、治療、又は治療をモニタリングする方法が記載される。該方法は、被験体から得られた試料中のバイオマーカーのレベルを検出することを含み、該バイオマーカーはＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３である。そのレベルをカットオフレベルと比較する。また、上記方法を実施するためのキットが記載される。【選択図】図１

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年７月２４日付で出願された米国仮特許出願第６２／０２８，６３３号に対する優先権を主張し、その内容の全体が本明細書に引用することにより本明細書の一部をなす。

川崎病（ＫＤ）は、低年齢児において見られる多系統炎症状態であり、冠動脈を最も著しく冒す、急性血管炎を引き起こす場合がある。治療をしなければ、ＫＤを有する子供のおよそ２０％〜２５％は冠動脈異常（ＣＡＡ）を発症する。免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩＧ：intravenous immunoglobulin）の処置は、ＣＡＡの発生率をおよそ５％まで減少することができるが、早期発見が必要である。

ＫＤ診断は、特に初期段階では困難である。現在、ＫＤ診断は、５日以上の発熱、滲出物を伴わない両側の結膜充血、様々な形の発疹、口唇の変化（唇の紅斑及びひび割れ、イチゴ舌、並びに口腔及び咽頭粘膜のびまん性の充血）、四肢の変化（手足の紅斑及び浮腫）、及び頸部リンパ節腫脹（直径１．５ｃｍ以上）を含む臨床症状に基づく。しかしながら、ＫＤと他の状態との間の重複する臨床的特徴及び実験室でのパラメーターが確定診断を困難にし、特異的な臨床検査を行うことができない。

したがって、実験室分析によってＫＤ診断を促進する特異的なバイオマーカーの同定は、深刻なＫＤの後遺症、特にＣＡＡを予防するのに役立つであろう。

本明細書には、被験体において川崎病を診断する方法が記載される。該方法は、川崎病を有すると疑われる被験体から得られた試料中のバイオマーカーのレベルを検出することであって、該バイオマーカーはＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３であることと、そのレベルとカットオフレベルとを比較することとを含み、ここで該レベルがカットオフレベルよりも高い又は低い場合に、該被験体を、川崎病を有すると判定する。一つの実施の形態では、バイオマーカーはＩＰ−１０であり、そのレベルがカットオフレベルよりも高い場合に、その被験体を、川崎病を有すると判定する。上記試料は、被験体における発熱の開始から０日〜１０日以内（例えば、５日目）に被験体から得られてもよい。

さらに、本明細書には被験体において川崎病を治療する方法が記載される。該方法は、川崎病を有すると疑われる被験体に由来する第１の試料中のバイオマーカーの第１のレベルを検出することであって、該バイオマーカーはＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３であり、ここで、第１のレベルがカットオフレベルのそれよりも高い又は低いことと、被験体に川崎病に対する治療を施すこととを含む。一つの実施の形態では、バイオマーカーはＩＰ−１０であり、第１のレベルはカットオフレベルよりも高い。治療は、免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩＧ）又はＩＶＩＧ及びステロイドであってもよい。第１の試料は、被験体における発熱の開始から０日〜１０日以内（例えば、５日目）に被験体から得られてもよい。上記方法は、治療が投与された後に被験体から第２の試料を得ることと、第２の試料においてバイオマーカーのレベルを検出することと、第２の試料におけるレベルがカットオフレベルよりも高い場合に治療を継続するか、又は異なる治療を施すこととを更に含んでもよい。

また、本明細書には、被験体において川崎病の治療をモニタリングする方法が記載される。該方法は、治療前又は治療中の第１の時間点で被験体から得られた第１の試料中のバイオマーカーの第１のレベルを検出することであって、該バイオマーカーはＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３であることと、第２の時間点に被験体から得られた第２の試料中のバイオマーカーの第２のレベルを検出することと、第１のレベルと第２のレベルとを比較することと、その比較に基づいて治療決定を行うこととを含む。バイオマーカーはＩＰ−１０であってもよく、治療は免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩＧ）であってもよい。

上のいずれかの方法において、試料は体液試料（例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、又は唾液の試料）であってもよい。免疫アッセイを使用して試料中のバイオマーカーのレベルを検出することができる。例えば、免疫アッセイは、ＥＬＩＳＡ、タンパク質アッセイ、フローサイトメトリー、磁気ビーズに基づく多重免疫アッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット又はＥＬＩＳＰＯＴであってもよい。ＩＰ−１０に対する１３１８ｐｇ／ｍＬのカットオフ血漿レベルを上のいずれかの方法において使用することができる。一つの実施の形態では、患者集団は漢民族である。

また、本明細書には、被験体において川崎病を診断するため、又は川崎病の治療をモニタリングするためのキットが記載される。該キットは、バイオマーカーのレベルを検出するための試剤（例えば抗体）又はデバイス（試験片、固体支持体、チップ、又はプレート）を備えてもよい。バイオマーカーは、ＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３であってもよい。

１又は複数の実施形態の詳細は、以下の詳細な説明に述べられる。

川崎病（ＫＤ）の急性期の間のタンパク質レベルを示す一組のグラフである。血漿サイトカインレベルを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムを使用して非ＫＤ発熱対照（ｎ＝２０）及びＫＤ患者（ｎ＝３７）において測定した。タンパク質アレイにより同定された血漿Ｅ−セレクチン、ＭＰＩＦ−１、及びＩＰ−１０のレベルを発熱対照（ｎ＝２０）及びＫＤ症例（ｎ＝３７）における酵素結合免疫吸着測定法によって特定した。ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−３３、ｓＣＤ４０Ｌ、Ｅ−セレクチン、ＭＰＩＦ−１及びＩＰ−１０のｐ値は、それぞれ、１．５×１０^−２、４．７×１０^−３、２．８×１０^−２、８．６×１０^−３、２．３×１０^−８、及び４．１×１０^−１１であった。各ドットは、単一個体による標準偏差５％未満の偏差を伴う３つの分析の平均を表す。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、対応のないステューデントｔ検定。 発見試験及び再現試験による発熱対照及びＫＤ患者の複合データ、並びにＩＰ−１０の血漿レベルによる川崎病の予測モデルに対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す一組のグラフである。血漿ＩＰ−１０レベルを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して発熱対照（ｎ＝５７）及びＫＤ患者（ｎ＝４０）において特定した。発熱対照（ｎ＝７７）及びＫＤ症例（ｎ＝７７）における血漿ＩＰ−１０レベルもまたＥＬＩＳＡを使用して測定する。^＊＊＊、ｐ＜０．００１、対応のないステューデントｔ検定。各ドットは、単一の個体に由来する５％未満の偏差を含む３回の測定の平均（標準偏差／平均）を表す。組み合わせデータに基づいて、ＫＤ患者における血漿ＩＰ−１０レベルのＲＯＣ曲線を発熱対照に対してプロットする。バイオマーカーの最適なカットオフ値をその最大の感度及び特異度の合計として決定した。 盲検の確認試験におけるＩＰ−１０の血漿レベルを示すグラフである。発熱対照（Ｃ−Ｆ、ｎ＝３７）、不全型ＫＤ患者（Ｋ−Ｉ、ｎ＝３）、及びＫＤ患者（Ｋ、ｎ＝２０）を含む確認試験（患者は６歳未満であった）における血漿ＩＰ−１０レベルは、酵素結合免疫吸着測定法によって特定した。エラーバーは三連（triplicate）の値の標準偏差を示す。 発熱の開始から４日未満（平均３．４±０．９０日；範囲１日〜４日）、又は発熱の開始から５日超（平均６．０±１．０５日；範囲５日〜８日）に得られた血液を用いるＫＤ患者におけるＩＰ−１０血漿レベルを示すドットプロットである。各ドットは単一の個体による５％未満の偏差を含む３回の分析の平均（標準偏差／平均）を表す。 ＫＤを有する４５名の患者におけるＩＶＩＧ治療の前及びその１週間後の血漿ＩＰ−１０レベルを示すグラフである。 急性ＫＤを有する患者のＴ細胞中の細胞表面ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３を示す一組のグラフである。左パネル：開曲線（Open curves）は抗ＣＸＣＲ３抗体で染色されたＣＤ３＋Ｔ細胞の蛍光活性化セルソーターヒストグラムのプロットを示す。患者ＫＤ−１〜ＫＤ−６はＫＤの急性期にあった。ＨＤは健康なドナーを示す。右パネル：３名の健康なドナー及び６名の急性ＫＤを有する患者によるＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ３の平均蛍光強度を要約する棒グラフを示す。^＊＊、ｐ＜０．０１、対応のないステューデントｔ検定。

予想外にもＫＤを有する被験体における或る特定のバイオマーカーのレベルが非ＫＤ発熱状態の被験体におけるレベルと異なることが発見された。

バイオマーカーとしてＩＬ−１７Ｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４４３１０４）、ＩＬ−３３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１８６５７０）、ｓＣＤ４０Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２８９６８２）、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６６５９０５）、Ｅ−セレクチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００４４１）、及びＣＸＣＬｌ０／ＩＰ−１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１５５６）が挙げられる。ＫＤ患者におけるＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、及びＩＰ−１０のレベルは、非ＫＤ発熱被験体におけるレベルよりも高いことがわかった。ＫＤ患者におけるＩＬ−３３のレベルは、非ＫＤ発熱被験体におけるレベルよりも低いことがわかった。

したがって、ＫＤを有すると疑われる被験体（例えば、ＫＤの症状を示す被験体）に由来する試料中の１又は複数のバイオマーカーのレベルを検出し、それらの対応する予め定められたカットオフ値と比較して、その被験体がＫＤを有するかどうかを判定することができる。例えば、上記被験体におけるＩＰ−１０のレベルが対応するカットオフレベルよりも高い場合、その被験体がＫＤを有することを示す。本明細書に記載されるいずれのバイオマーカーも、ＫＤを診断するため、ＫＤに対する他の診断検査、バイオマーカー、又はリスクファクターと組み合わせて使用され得る。

試料は体液試料、例えば血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、又は唾液の試料であってもよい。上記試料中のバイオマーカーのレベルを様々な方法、例えばＥＬＩＳＡ、タンパク質アレイ、フローサイトメトリー、磁気ビーズに基づく多重免疫アッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット又はＥＬＩＳＰＯＴを使用して特定することができる。一つの例示的な方法では、被験体に由来する血漿又は血液の試料を濾紙に滴下し、乾燥して保存することができる。乾燥した血液又は血漿のスポットを、その後ＥＬＩＳＡで使用して試料中の上記バイオマーカーのレベルの検出及び定量を行うことができる。例えばAabye et al., PLoS ONE, 7(6): e39228, June 2012を参照されたい。上述のバイオマーカーを特異的に認識する抗体は、商業的に入手可能であるか、又は当該技術分野で既知の方法を使用して作製することができる。

ＫＤを有しない被験体における同じバイオマーカーのレベルを表すバイオマーカーの予め定められたカットオフレベルは、ＫＤ患者群及びＫＤを有しない被験体群におけるバイオマーカーの代表的なレベルに基づいて決定され得る。ＫＤを有しない被験体として、ＫＤと重複する臨床的特徴及び／又は実験室パラメーターを有する疾患又は状態（例えば、長引く発熱、皮膚の発疹、若年性関節リウマチ、猩紅熱等の或る特定のウイルス及び細菌の感染症、及び毒素性ショック症候群、並びに以下の表２に示される状態）を伴う被験体が挙げられ得る。好適な統計学的分析を得られたバイオマーカーレベルに適用し、ＫＤを有しない被験体、特に臨床上ＫＤに類似する状態を伴うＫＤを有しない被験体とＫＤ患者とを区別するカットオフレベルを決定する。

本明細書に記載されるバイオマーカー（例えばＩＰ−１０）は、ＫＤの早期診断に使用され得る。例えば、ＫＤを有すると疑われる被験体におけるバイオマーカーのレベルを、被験体における発熱の開始から０日〜１０日以内（例えば、３日未満、４日未満、５日未満、又は１０日未満）に検出することができる。その後、検出されたバイオマーカーのレベルを対応するカットオフレベルと比較して、その被験体がＫＤを有するかどうかを判定する。上に述べられるように、早期診断ひいては早期の介入は、ＫＤの深刻な合併症を予防することができる。

一部のＫＤ患者は典型的なＫＤの症状を全く示さない。上述の方法を、ＫＤのかかる症例、すなわち不全型又は不定型のＫＤの診断に使用することができる。

１又は複数の上述のバイオマーカーを使用してＫＤを有すると被験体を判定した後、ＫＤに対する治療を該被験体に施すことができる。早期の治療は被験体の冠動脈合併症のリスクを軽減する。ＩＶＩＧは熱を下げ、患者における冠動脈異常の発生リスクを減少することが示されている。さらに、発熱を制御するためアスピリンを与えてもよい。一部の患者は熱を下げるため２度目のＩＶＩＧ投薬を必要とする場合がある。一部の患者はＩＶＩＧに対して非反応性である。それらの場合、他の治療を被験体に施してもよい。かかる代替治療として、抗ＴＮＦ−α抗体（例えば、インフリキシマブ）及びステロイドとＩＶＩＧとの併用が挙げられる。

また、上に記載されるバイオマーカーのいずれかを使用してＫＤの治療をモニタリングすることができる。ＫＤ治療（例えばＩＶＩＧ）を受けている患者におけるＫＤバイオマーカーのレベルを様々な時間点、例えば治療前及び治療開始１週間以内の１又は複数の時間点で特定することができる。一連の治療の間、その対応するカットオフレベルの方に傾くバイオマーカーレベルの変化は、その治療が有効であることを示す。例えば、先の時間点におけるレベルと比較して或る時間点での患者におけるより低いレベルのＩＰ−１０は、その治療が有効であることを示す。後の時間点におけるバイオマーカーのレベルが先の時間点（治療前又は治療開始直後）におけるレベルと同等、又は著しく異ならない場合、その治療を継続するべき（例えば、先のものと同等又はそれよりも高いＩＶＩＧの更なる投薬量）、又は代替治療を施すべきであることを示す。言い換えれば、一連の治療の間の被験体におけるＫＤバイオマーカーのレベルを使用して、治療決定を行う（例えば、治療を継続する若しくは中断する、又は異なる治療を施す）ことができる。

さらに、上述のバイオマーカーのいずれかをＫＤに対する候補化合物又は治療の有効性の評価に使用することができる。ＫＤバイオマーカーのレベルを、被験体への化合物の投与又は治療の実施前、その間、及び／又はその後に特定することができる。

ＫＤを診断するため又はＫＤの治療をモニタリングするためのキットは、ＫＤバイオマーカー（例えば、ＩＰ−１０）のレベルを検出するための試剤又はデバイス（例えば、試験片、固体支持体、又はプレート）を備えてもよい。上記試剤は、ＫＤバイオマーカーに特異的な抗体であってもよい。また、デバイスは、ＫＤバイオマーカーに特異的な抗体を含んでもよい（又はそれで被覆されてもよい）。

以下の具体的な実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなることがあっても開示の残りの部分を限定するものではない。更なる労作によらず、当業者であれば本明細書の記載に基づいて最大限に本開示を利用することができると考えられる。本明細書において引用される全ての出版物は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。さらに、以下に提案されるいかなる機構も特許請求の範囲を何ら限定するものではない。

発熱及びＫＤを示唆する臨床的特徴を伴う２１４名の小児を登録した。そのうち、１００名のみがＫＤと診断された。彼らの血漿試料を、不偏（unbiased）大規模定量的タンパク質アレイを使用してサイトカイン、ケモカイン、及び細胞接着分子について包括的に分析した。この試験を３段階、すなわち、発見、再現、及び盲検による確認で行った。発見フェーズ［ｎ（ＫＤ）＝３７、ｎ（対照）＝２０］の間、対照における発現と比較してＫＤ患者において急性期の間、インターロイキン−１７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、Ｅ−セレクチン、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、及びＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）の発現が上方制御された。ＩＰ−１０レベルにおける著しい増加が観察された（ＫＤ、３０３７±２２６．７ｐｇ／ｍＬ、対照、６７２±１３０．４ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝４．１×１０^−１１）。複合された発見及び再現のデータ［ｎ（ＫＤ）＝７７、ｎ（対照）＝７７］の受信者動作特性分析は、ＩＰ−１０レベルが高い曲線下面積値を有することを示した（０．９４［９５％信頼区間、０．９０５５〜０．９７７８］、感度、１００％、及び特異度、７７％）。最適カットオフとして１３１８ｐｇ／ｍＬを用いて、盲検による確認試験はＩＰ−１０レベルがＫＤの良好な予測因子であることを確認した。免疫グロブリン静注療法の処置により、ＩＰ−１０レベルは正常まで戻った。ＩＰ−１０の下流受容体であるＣＸＣＲ３を急性ＫＤ患者のＴ細胞において活性化した。

上記試験は、中医大附医院、高雄長庚記念醫院、及び台湾の中央研究院の治験審査委員会及び治験審査委員会の倫理委員会によって承認された。被験体又はその両親から同意書を得た。

患者
発熱及びＫＤを示唆する臨床的特徴を有する２１４名の漢民族の小児を登録した。そのうち１００名のみが最終的にＫＤと診断された。これらのＫＤの小児の人工統計学的及び臨床的な特徴を表１に示す。非ＫＤを有する１１４名の小児の最終診断を表２に示す。

上記研究に参加している小児を、台湾の種々の地域の医療センター、すなわち台湾の南部及び北部の４病院を含む長庚記念醫院システム、並びに台湾中心部の３つの地域病院を含む中医大附医院から募集した。既知の臨床診断基準を使用してＫＤを診断した。Newburger et al., Pediatrics. 2004;114: 1708-1733、及びKim and Dedeoglu, Curr Opin Pediatr. 2005;17:695-702を参照されたい。１００名のＫＤ患者のうち、３７名を試験の発見フェーズに含め、４０名を再現フェーズに含め、２３名を盲検による確認フェーズに含め、その中にはＫＤを完全には提示しない３名の患者が含まれていた（ｉＫＤは日本の診断基準のうち４以下の主要症状の存在によって定義される）。Newburger et al., Circulation. 2004;110:2747-2771を参照されたい。

サイトカイン、ケモカイン、及び細胞接着分子の多重分析及び定量
試験の被験体から得られた新鮮なヘパリン化血液試料を２０００ｇで１０分間遠心分離した。その後、血漿試料を等分し、更なる分析のため−８０℃で保存した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ（商標）ヒトＴｈ−１７サイトカインパネル１５−Ｐｌｅｘ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのBio-Rad）を使用して試料を二連で分析にかけた。サイトカインの完全な一覧（ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−γ、ｓＣＤ４０Ｌ、及び腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］−α）をこれらのコホートにおいて定量し、検出限界及び再現性は製品マニュアルにおいて提供された。各サイトカインに特異的な捕捉モノクローナル抗体が充填された蛍光染色ビーズの１５の別個のセットを使用した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘタンパク質アレイシステム（Bio-Rad）を使用してシグナルを測定し、定量した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘマネージャーソフトウェア、バージョン３．０（Bio-Rad）と統合されたＢｉｏ−Ｐｌｅｘタンパク質アレイシステムを使用してアッセイを行った。レポーター結合発光波長をＢｉｏ−Ｐｌｅｘキャリブレーションキット（Bio-Rad）を使用して調整した。個々のビーズシグネチャの流動性能、一貫性のある光学アラインメント、ダブレット識別、及び同定をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ確認キット、バージョン３．０（Bio-Rad）を使用して確認した。最初のスクリーニングのため、６名のＫＤ患者に由来する血漿を、ＫＤにおいて上方制御された発現を示すタンパク質を同定するために５４個のケモカイン及びＣＡＭを評価する、ヒトタンパク質アレイ（ＡＡＨ−ＣＹＴ−Ｇ８−８、米国ジョージア州ノークロスのRaybiotech Inc.）を使用して検査した。完全なケモカイン／ＣＡＭの名称はraybiotech.comのウェブサイトで入手可能である。同定された上方制御される遺伝子、すなわちＩＬ−９、ＩＰ−１０、Ｅ−セレクチン及びＭＰＩＦ−１を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して残りのＫＤ患者において更に定量した。Ｅ−セレクチン、ＭＰＩＦ−１、及びＩＰ−１０のＥＬＩＳＡの検出限界は、それぞれ３０ｐｇ／ｍＬ、７ｐｇ／ｍＬ、及び８ｐｇ／ｍＬであった。ＩＰ−１０の再現性（アッセイ内：ＣＶ＜１０％、アッセイ間：ＣＶ＜１２％）及び特異度が確認され、このＥＬＩＳＡキットは試験したどのサイトカインとも交差反応性を示さない。希釈範囲は、製造業者の指示書（RayBiotech Inc.）に従い１：２〜１：２０とした。

フローサイトメトリー
フィコール−イソペーク（Ficoll-Isopaque）密度勾配分離（スウェーデン国ウプサラのPharmacia Fine Chemicals）によってヘパリン化した血液から末梢血単核細胞を単離した。ヒトＣＤ３を認識する別個の蛍光色素結合モノクローナル抗体（ＵＣＨＴ１、米国カリフォルニア州サンノゼのBD Biosciences）又はＣＸＣＲ３（１Ｃ６／ＣＸＣＲ３、BD Biosciences）を使用して免疫表現性分析を行った。ＰＢＭＣの後、細胞を希釈抗体（１：２００）と共に室温で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒデバイス（BD Biosciences）を使用してマルチカラーフローサイトメトリーによって検査した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ取得ソフトウェア（BD Biosciences）を使用してデータを得て、各実験の分析に対して０．５×１０^６〜２．０×１０^６の事象を記録した。

統計学的分析
対応のないステューデントｔ検定及びＰｒｉｓｍ４ソフトウェア（米国カリフォルニア州サンディエゴのGraphPad）を使用して統計学的有意性を評価した。ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．３（米国ノースカロライナ州ケーリーのSAS Institute Inc.）を使用して受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を行った。ＲＯＣ曲線は感度及び１−特異度をプロットし、持続的予測因子に対するカットオフポイントの範囲に亘る感度及び特異度の要約を提供する。群間の差異を分散分析及びロジスティクス回帰分析を使用して決定した。各候補バイオマーカーの最適なカットオフ値をその最大感度及び特異度の合計として決定した。

血漿プロファイル：発見試験
サイトカイン多重システム及びタンパク質アレイを使用して、合計６９個の炎症性サイトカインを分析した。初期スクリーニングにおいて、２０名の非ＫＤ発熱対照及び３７名のＫＤ患者における１５個のサイトカインの血漿レベルを特定した。ＩＬ−１７Ｆ及びｓＣＤ４０Ｌのレベルは、発熱対照よりもＫＤ患者において有意に高かった。図１を参照されたい。唯一、ＩＬ−３３のサイトカインのみが下方制御されたことがわかった。図１を参照されたい。ＩＬ−１βはＫＤのマウスモデルにおける冠動脈病変の発症に重要であったが、ＩＬ−１βの血漿レベルは本試験において急性ＫＤ患者での評価では有意ではなかった（データは示されていない）。

残りの５４個の炎症性ケモカイン及びＣＡＭに対し、プロテオミクスアプローチを使用して、発見フェーズから無作為に選択された６名のＫＤ患者の急性期の間に得られた一組の血漿試料中の候補バイオマーカーを同定した。これらのデータを非ＫＤ発熱及び皮膚発疹を伴う対照のデータと比較した。１０個のサイトカイン又はＣＡＭの平均発現レベルは、ＫＤ患者において対照よりも少なくとも１．３倍高かった。表３を参照されたい。これら１０個のタンパク質のうち、ＩＬ−９、ＩＰ−１０、Ｅ−セレクチン、及びＭＰＩＦ−１は、ＫＤ患者において少なくとも２倍の平均発現の増加を示し、この結果は試験した６名全ての患者で見られた。さらに、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＬ−２Ｒ−α、ＣＤ１４、ＩＧＦ−ＩＩ、及びＳｉｇｌｅｃ−５の遺伝子は、急性期ＫＤ患者において下方制御され、対照と比較して少なくとも１．８倍の減少を示した（６０％未満、データは示されていない）。その後、候補バイオマーカー（ＩＬ−９、ＩＰ−１０、Ｅ−セレクチン、及びＭＰＩＦ−１）を定量するため、より大きな試料サイズ（２０名の非ＫＤ発熱対照及び３７名のＫＤ患者）を用いてＥＬＩＳＡを行った。急性期ＫＤ患者に対するタンパク質アレイデータと一致して、ＩＰ−１０、ＭＰＩＦ−１、及びＥ−セレクチンのレベルに有意な増加があった。図１を参照されたい。しかしながら、ＩＬ−９レベルの増加は試料サイズが増すと有意ではなくなった（データは示されていない）。６個の候補ＫＤバイオマーカー（ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−３３、ｓＣＤ４０Ｌ、Ｅ−セレクチン、ＭＰＩＦ−１、及びＩＰ−１０）のうち、ＩＰ−１０は対照（６７２±１３０．４ｐｇ／ｍＬ）と比較してＫＤ患者において最も有意に増加した（３０３７±２２６．７ｐｇ／ｍＬ）（ＫＤ患者における値対非ＫＤ発熱対照における値、ｐ値＝４．１×１０^−１１）。図１を参照されたい。

ＩＰ−１０レベル：再現試験及び複合試験
ＩＰ−１０の役割を更に確認するため、更に４０名のＫＤ患者及び５７名の非ＫＤ発熱対照を含む再現試験を行った。図２（左上パネル）に示されるように、本試験もまた、発熱対照におけるレベルと比較してＫＤ患者におけるＩＰ−１０レベルの有意な増加を示した。再現試験によるデータを発見試験によるデータと合わせた場合（複合試験）、ＩＰ−１０レベルは、７７名の非ＫＤ発熱対照（９２１±１０６．２ｐｇ／ｍＬ）と比較して７７名のＫＤ患者（３５８７±２１０．２ｐｇ／ｍＬ）において有意に上昇した（ＫＤ患者における値対非ＫＤ発熱対照における値、ｐ値＝２．８×１０^−２０）。図２（右上パネル）を参照されたい。

ＫＤ診断におけるバイオマーカーとしてのＩＰ−１０の役割を更に確認するため、複合試験によるＩＰ−１０の値を使用してＲＯＣ曲線分析を行った。ＩＰ−１０は、非ＫＤ発熱患者を対照として使用した場合、０．９４という非常に高い曲線下面積（ＡＵＣ）値を示した（９５％信頼区間、０．９０５５〜０．９７７８）。図２（下部パネル）を参照されたい。最大感度及び特異度の合計によって定義される最適カットオフ値として１３１８ｐｇ／ｍＬの血漿ＩＰ−１０レベルにより、ＩＰ−１０は非ＫＤ発熱対照と比較して高い感度（１００％）及び特異度（７７％）を示した。図２（下部パネル）を参照されたい。

盲検による確認試験
ＫＤを有すると疑われた６０名の小児に由来する血漿試料を使用して、最終研究フェーズを行った。血漿ＩＰ−１０レベルを、盲検方式で標識された試料において測定し、結果を非盲検化して分析した。１３１８ｐｇ／ｍＬのカットオフ値を使用することにより、２９個の試料はＩＰ−１０陽性であり、３１個はＩＰ−１０陰性であった。２９個のＩＰ−１０陽性試料（２症例のｉＫＤを含む）のうち２２個をＫＤと診断することに成功し、残りの７個の試料を非ＫＤ発熱と診断した。図３を参照されたい。３１個のＩＰ−１０陰性試料のうち、３０個が非ＫＤ発熱対照に由来し、１個がｉＫＤ患者に由来した。全体的に、１３１８ｐｇ／ｍＬのＩＰ−１０カットオフ値は、２３名のＫＤ患者と３７名の非ＫＤ発熱対照とを区別する良好な能力を示した（感度、９６％［２２／２３］、特異度、８１％［３０／３７］）。

血漿ＩＰ−１０レベルと発熱期間との関連及び免疫グロブリン静注療法の処置
初期のＫＤの間にＩＰ−１０レベルの増加を検出することができるかどうかを判定するため、発熱の開始から４日以内（平均、３．４±０．９０日、範囲１日〜４日）に得られた３７個のＫＤ試料を検査し、結果を該疾患の後期（発熱の開始から平均、６．０±１．０５日、範囲５日〜８日）に得られた４６個の試料のレベルと比較した。ＩＰ−１０レベルは疾患の初期段階で著しく増加した（３０５４±３３１．０ｐｇ／ｍＬ）。図４Ａを参照されたい。１３１８ｐｇ／ｍＬを最適なカットオフ値として使用すると、３７名のＫＤ患者の８１％（３０名）が非常に初期段階（４日未満）にあると同定されたのに対し、４６名のＫＤ患者の９６％（４４名）が急性期（５日超）にあると同定された。

また、４５名の患者においてＩＶＩＧ治療の前及び開始後１週間のＩＰ−１０レベルを検査した。１回目のＩＶＩＧ治療に対して抵抗性であり、２回目の治療を必要とした１名のＫＤ患者を除いて、治療前の高いＩＰ−１０レベルはＩＶＩＧ治療によって正常まで戻った（治療前、３３２３±２２４．９ｐｇ／ｍＬ、治療後、３４８±６４．８ｐｇ／ｍＬ）。図４Ｂを参照されたい。

Ｔ細胞における細胞表面ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３
ＩＰ−１０は、Ｔ細胞において細胞表面ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３を下方制御する。ＫＤ患者におけるＩＰ−１０レベルの増加の下流効果を判定するため、６名のＫＤ患者のＴ細胞におけるＣＸＣＲ３の細胞表面発現を分析した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定すると、３名の健康なドナーのＭＦＩと比較して急性期ＫＤ患者におけるＭＦＩは３．３倍減少した。図５を参照されたい。回復期では、ＣＸＣＲ３の発現レベルは正常まで戻った（データは示されていない）。

他の実施形態
本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組み合せで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価の、又は類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別段の明らかな記載がない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の等価な又は類似の特徴の例に過ぎない。

幾つかの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修飾が行われ得ることが理解される。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (30)

1. 被験体において川崎病を診断する方法であって、
   川崎病を有すると疑われる被験体に由来する試料中のバイオマーカーのレベルを検出することであって、前記バイオマーカーがＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３であることと、
   前記レベルとカットオフレベルとを比較することと、
   を含み、前記レベルが前記カットオフレベルよりも高い又は低い場合に前記被験体が川崎病を有すると判定される、方法。
2. 前記バイオマーカーがＩＰ−１０であり、前記レベルが前記カットオフレベルよりも高い場合に前記被験体が川崎病を有すると判定される、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料が体液試料である、請求項２に記載の方法。
4. 前記試料が血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、又は唾液の試料である、請求項３に記載の方法。
5. 前記バイオマーカーのレベルが免疫アッセイによって検出される、請求項４に記載の方法。
6. 前記免疫アッセイが、ＥＬＩＳＡ、タンパク質アレイ、フローサイトメトリー、磁気ビーズに基づく多重免疫アッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット、又はＥＬＩＳＰＯＴである、請求項５に記載の方法。
7. 前記試料が、前記被験体における発熱の開始から０日〜１０日以内に得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記試料が、前記被験体の発熱の開始から５日以内に得られる、請求項７に記載の方法。
9. 前記川崎病が不全型川崎病である、請求項７に記載の方法。
10. 被験体において川崎病を治療する方法であって、
    川崎病を有すると疑われる被験体に由来する第１の試料中のバイオマーカーの第１のレベルを検出することであって、前記バイオマーカーがＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３であり、ここで、前記第１のレベルがカットオフレベルよりも高い又は低いことと、
    前記被験体に対して川崎病の治療を施すことと、
    を含む、方法。
11. 前記バイオマーカーがＩＰ−１０であり、前記第１のレベルが前記カットオフレベルよりも高い、請求項１０に記載の方法。
12. 前記治療が免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩＧ）である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記治療がステロイドを更に含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１の試料が体液試料である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１の試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、又は唾液の試料である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記バイオマーカーの前記第１のレベルが免疫アッセイによって検出される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記免疫アッセイが、ＥＬＩＳＡ、タンパク質アレイ、フローサイトメトリー、磁気ビーズに基づく多重免疫アッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット又はＥＬＩＳＰＯＴである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１の試料が、前記被験体における発熱の開始から０日〜１０日以内に得られる、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記第１の試料が、前記被験体における発熱の開始から５日以内に得られる、請求項１８に記載の方法。
20. 前記治療を施した後に前記被験体から第２の試料を得ることと、
    前記第２の試料中の前記バイオマーカーのレベルを検出することと、
    前記第２の試料における前記レベルが前記カットオフレベルよりも高い場合に前記治療を継続するか、又は異なる治療を施すことと、
    を更に含む、請求項１９に記載の方法。
21. 被験体における川崎病の治療をモニタリングする方法であって、
    前記治療前又は治療中の第１の時間点において前記被験体から得られた第１の試料中のバイオマーカーの第１のレベルを検出することであって、前記バイオマーカーがＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３であることと、
    第２の時間点において前記被験体から得られた第２の試料中の前記バイオマーカーの第２のレベルを検出することと、
    前記第１のレベルと前記第２のレベルとを比較することと、
    前記比較に基づいて治療決定を行うことと、
    を含む、方法。
22. 前記バイオマーカーがＩＰ−１０である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記治療が免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩＧ）である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記第１の試料及び前記第２の試料が体液試料である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記体液試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、又は唾液の試料である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記第１のレベル及び前記第２のレベルが免疫アッセイによって検出される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記免疫アッセイが、ＥＬＩＳＡ、タンパク質アレイ、フローサイトメトリー、磁気ビーズに基づく多重免疫アッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット又はＥＬＩＳＰＯＴである、請求項２６に記載の方法。
28. 被験体において川崎病を診断するため、又は川崎病の治療をモニタリングするためのキットであって、該キットはバイオマーカーのレベルを検出するための試剤又はデバイスを備え、前記バイオマーカーがＩＬ−７Ｆ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＭＰＩＦ−１、Ｅ−セレクチン、ＩＰ−１０、又はＩＬ−３３である、キット。
29. 前記バイオマーカーがＩＰ−１０である、請求項２８に記載のキット。
30. 前記試剤がＩＰ−１０に特異的な抗体である、請求項２９に記載のキット。