JP2017522263A - 生体分子の回収、安定化及び溶出のための基材及び方法 - Google Patents

Abstract

タンパク質の抽出、安定化及び貯蔵のための固体基材を提供する。この基材は、実質的乾燥状態下でメレジトースなどの多糖類を含む。基材は、試料からタンパク質を抽出し、抽出されたタンパク質を乾燥フォーマットで周囲条件下において長期保存の間安定化するように構成される。乾燥固体基材中で貯蔵されたタンパク質を回収及び回復させる方法についても記載する。【選択図】図１

Description

本発明は、生体試料から生体分子を回収、安定化及び溶出するための乾燥固体基材に関する。本発明はさらに、乾燥固体基材から生体試料由来の生体分子を回収、安定化及び溶出する方法にも関する。

生体試料からの単離又は精製の間に生体分子の構造的及び機能的完全性を保存することは、分析物の検出、センシング、法定的、診断的又は治療的用途などを含む、様々な下流用途にとって必須である。生体試料由来のタンパク質、ペプチド又はアミノ酸の抽出及び安定化は、溶液ｐＨ、温度及び様々なプロテアーゼの偏在的存在を始めとする多数の環境要因に敏感である。結果として、溶液状態のタンパク質又はペプチドは通常冷蔵貯蔵され（例えば、−４℃、−２０℃又は−８０℃）、加水分解及び酵素的分解が防止され、タンパク質の構造又は機能の完全性が保存される。

乾燥フォーマットでタンパク質又はペプチドの回収及び保存の成功を獲得する乾燥状態技術は、通常、タンパク質が貯蔵前に試料から「予備精製」又は「濃縮」されていることが必要である。乾燥フォーマットのタンパク質保存のための他の乾燥状態技術は、さらなる乾燥施設（例えば、強制気流、凍結乾燥）を必要とする。したがってこれらの方法は、さらなる重要な処理ステップをせずに、試料（例えば、生体試料）からタンパク質又はペプチドを直接回収及び安定化する助けとはならない。

タンパク質又はペプチドは変性しやすく、その結果として貯蔵の間に生物活性又はエピトープ認識を失う傾向がある。バイオマーカー又は生物学的治療薬などの様々な分析試験の標的であるタンパク質は、未精製状態では低量で存在すると思われる。したがって、目的のタンパク質分析物の回収率を最大にする方法が、非常に望ましい。タンパク質又はペプチドの分解は、例えば、プロテアーゼ活性を阻害する化学的添加剤を使用して遅延又は防止され得る。しかし、化学的添加剤の存在は、質量分析法及び免疫アッセイを含む下流の分析技術に影響を与え得る。

未処理のセルロース紙基材、例えば、９０３もしくは３１ＥＴＦ紙（Ｗｈａｔｍａｎ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＧｒａｄｅ２２６紙（Ａｈｌｓｔｒｏｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）は、新生児試験などの分析目的の乾燥血液スポット中の酵素、抗体、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸の保存に広範囲に使用される。しかし、未処理セルロース基材からの分析物の回収率及び分析物、特に分解しやすいタンパク質のその後の生物活性は多くの場合十分ではない。乾燥標本、例えば、新生児試験に使用される乾燥血液スポットは、一般に冷蔵下で貯蔵され、分析物の安定性が維持される。乾燥血液スポットから非効率的に溶出され得る分析物は、その機能回復の乏しさにより不安定な標的であると当分野において解釈されることがある。タンパク質の安定化のために様々な化学的フィラーの添加が当分野において報告されてきているが、フィラーは敏感なタンパク質の回収及び安定化の能力が限られている。

したがって、生体試料から、タンパク質、ペプチド又はアミノ酸を含む生体分子の予備精製をしない回収及び抽出並びに乾燥状態下及び周囲条件下における、その後の生体分子の安定化並びに後段でのさらなる分析のために生体分子を実質的にインタクトな形態で溶出することのできる組成物及び方法が非常に望ましい。

国際公開第２０１２／１１３９１１号

生体分子の抽出、安定化及び溶出のための固体基材の一実施形態は、実質的乾燥状態下のメレジトースを含む。

別の実施形態では、生体分子の回収、安定化及び溶出のための固体基材は、実質的乾燥状態下の三糖類を含む。

固体基材上に配置された生体試料から生体分子を抽出、安定化及び溶出する方法の一例は、生体試料と基材とを接触させるステップと、生体試料を実質的乾燥状態に乾燥させるステップと、基材を溶出緩衝液中で再水和させることによって、基材上で乾燥生体試料から生体分子を溶出するステップとを含み、固体基材は実質的乾燥状態下でメレジトース、及び場合により実質的乾燥状態下で基材に含浸された１種以上の溶解剤、核酸変性剤又はこれらの組合せを含む。

１５％メレジトースを含む基材から回収された場合、未修飾３１−ＥＴＦセルロースと比較して、活性な非変性β−ｇａｌの溶出効率が増大することを示すグラフである。

生体分子、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素及び抗体の抽出、安定化及び溶出に適切なマトリックス及び方法の実施形態を提供する。変性しやすい生体分子は、したがってインタクトな形態で保存することが困難である。本発明の１以上の実施形態は、実質的乾燥状態下でメレジトースなどの三糖類を含む、生体分子の抽出、安定化及び溶出のための固体基材に関する。この固体基材は、単一処理ステップで、生体試料を回収し、その後試料からタンパク質、ペプチド又はアミノ酸を抽出及び安定化し、その後溶出するように構成される。溶出されたタンパク質又はペプチドは、様々な下流用途に使用される。基材は、タンパク質又はペプチドを実質的乾燥状態で周囲温度で安定化し、タンパク質の完全な構造及び／又は機能を実質的に保持するように構成される。

特許請求する発明の主題をより明確かつ簡潔に記載するために、下記の説明及び添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語に対して、下記の定義が提供される。本明細書を通して、特定の用語の例示は、限定されない例とみなすべきである。

単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「（ｔｈｅ）」は、文脈が特に他のことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲を通してここで使用される、近似的表現は、関連する基本的機能に変化をもたらすことなく、差し支えない程度に変動できる任意の量的表現を修飾するために適用することができる。したがって、「約」などの用語により修飾された値は、指定された正確な値に限定されるものではない。いくつかの場合において、近似的表現は、値を測定する機器の精度に対応する。必要に応じて、範囲が供給され、それらの範囲はその間のすべての部分範囲を包括する。

本明細書において称される「生体試料」という用語は、特に限定されないが、ヒトを始めとする生物から得られた血液、血清、組織及び唾液を含む。生体試料は、自己診断テスト（例えば血糖のモニタリング）を受ける個体によって、又は例えば針を使用する血液吸引もしくは患者の皮膚の病巣などの特定領域の削り取りもしくは綿棒による拭き取りを含む、様々な技術により熟練した医療専門家によって得られる。様々な生体試料の回収方法は当分野において周知である。「試料」という用語は上で定義された生体試料を含むが、例えば組織培養された細胞及び精製されたタンパク質も含む。

本明細書において称される「還元剤」という用語は、電子を別の化学種に提供する任意の化学種を含む。様々な還元剤が当分野において公知である。例示的な還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。さらに、上記その他の還元剤の任意の組合せも使用し得る。特定の実施形態では、還元剤はＴＣＥＰである。

本明細書で用いる「緩衝液」という用語は、例えば、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及びリン酸緩衝液を含む。緩衝液候補のこのリストは単なる例示目的のためである。本明細書に開示の組成物及び方法に使用するために選択される緩衝液のｐＨは、通常３〜１０である。ある実施形態では、本明細書で用いる緩衝液のｐＨは、６〜９であり、他の実施形態では、緩衝液のｐＨは７〜８である。

生体分子の回収、安定化及び溶出のための固体基材の一実施形態は、実質的乾燥状態下で三糖類を含む。この三糖類は、メレジトース、ラフィノース、マルトトリウロース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、ケトース又はこれらの組合せから選択され得る。

固体基材の１以上の実施形態は、実質的乾燥状態下でメレジトースを含む。メレジトースは非還元三糖であり、分子量５０４４４ｇ／ｍｏｌを有する。１以上の実施形態では、固体基材はメレジトースを含み、メレジトースの濃度は約１０〜３０％である。一実施形態では、メレジトースの濃度は１５％である。メレジトースは、基材に含浸されていてよい。ある実施形態では、基材中に含浸されたメレジトースの濃度は、１０〜３０％の間である。いくつかの他の実施形態では、１５％のメレジトースが基材に含浸される。基材は、メレジトースにより受動的にコーティング又は共有結合により修飾され得る。いくつかの他の実施形態では、基材は、メレジトースの１５％溶液でコーティングされる。メレジトースを含む基材は、実施例２に記載するように、タンパク質の高い安定性を示し、高い収率をもたらす。

１以上の実施形態では、基材は、溶解剤、緩衝剤又は還元剤などの１種以上の試薬がさらに含浸される。ある実施形態では、含浸された試薬は、実質的乾燥状態下で基材に含浸された細胞溶解剤、タンパク質安定化試薬などの生体分子安定化試薬、タンパク質貯蔵用化学物質及びこれらの組合せを含む。

基材はまた、生体試料からタンパク質又はペプチドを抽出し、実質的乾燥状態で周囲温度で保存するように構成される。本明細書において使用する場合、「実質的乾燥状態」という用語は、抽出された生体分子がおよそ２％未満の含水量を有するように乾燥することを指す。同様に、試薬は実質的乾燥状態で基材に含浸される。

組成物の基材内への「組み込み」は、限定されるものではないが、下記の「浸漬」手順を含む。ある実施形態では、このような方法は、組成物の乾燥固体基材内への組み込みを達成する。乾燥固体基材内への組成物の組み込み後、固体基材は任意の適切な方法を使用して乾燥される。

１以上の実施形態では、基材は溶解剤を含む。これらの溶解剤は、洗浄剤、カオトロープ、変性剤又はこれらの組合せを含んでいてもよい。特定の変性剤に限定することを意図するものではないが、変性剤は、それらの生物物理学的特性及び生物学的酵素活性（例えば、プロテアーゼ）を完全に阻害する能力に依存して、弱い溶解剤又は強い溶解剤のいずれかに分類することができる。ある実施形態では、弱いタンパク質変性剤（例えば、洗浄剤）は、細胞を溶解して、タンパク質を変性することなくタンパク質−タンパク質相互作用を崩壊するために使用し得る。数多くの溶解剤が当分野において公知であり、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するために選択することができる。特定の溶解剤に限定することを意図するものではないが、例示的な溶解剤としては、チオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアジニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アルギニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素又はこれらの組合せが挙げられる。

上述の通り、溶解剤は洗浄剤を含んでいてもよく、例示的な洗浄剤は、イオン性洗浄剤、非イオン性洗浄剤又は双性イオン性洗浄剤に分類され得る。イオン性洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン洗浄剤又はエチルトリメチルアンモニウムブロミドなどの陽イオン洗浄剤を含んでいてもよい。細胞溶解のための非イオン性洗浄剤の限定されない例としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ２０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド又はジギトニンが挙げられる。いくつかの双性イオン性洗浄剤は、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）及び３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）を含んでいてもよい。

１以上の実施形態では、溶解剤はチオシアン酸塩を含む。基材の１以上の実施形態は、乾燥状態で含浸されたチオシアン酸塩を含む。例示的なチオシアン酸塩としては、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム又はこれらの組合せが挙げられる。いくつかの他の実施形態では、溶解剤は、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はこれらの組合せから選択される。

１以上の実施形態では、基材は、タンパク質の安定性及び完全性を、生体試料から抽出後所望のレベルで維持する。一実施形態では、基材は１種以上のタンパク質安定化剤により含浸される。これらの安定化剤としては、プロテアーゼ阻害剤、緩衝材又はキレート剤（例えばＥＤＴＡ）が挙げられる。

プロテアーゼの存在下で回収されたタンパク質の消化は、１種以上のプロテアーゼ阻害剤を基材に添加することによって回避することができ、プロテアーゼ阻害剤は外部から添加してもよいし、基材に含浸してもよい。一実施形態では、含浸されたプロテアーゼ阻害剤は、乾燥基材の湿潤により活性化され得る。ある実施形態では、基材はプロテアーゼ阻害剤をさらに含み、プロテアーゼ阻害剤は合成もしくは天然に存在（例えば天然に存在するペプチド又はタンパク質）ものであり、アプロチニン、ベスタチン、キモスタチン、ロイペプチン、アルファ−２−マクログロブリン、ペプスタチン、フッ化フェニルメタンスルホニル、Ｎ−エチルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸、アンチトロンビン又はこれらの組合せを含む。一実施例において、このようなプロテアーゼ阻害剤の添加は、プロテアーゼ又はペプチダーゼを阻害することによって、「液体状態及び乾燥フォーマットの両方においてタンパク質の安定性を増大する。

基材の特定の実施形態は、乾燥状態で緩衝剤を含み、緩衝剤は抽出の間に再水和され得る。これらの緩衝剤の例としては、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸緩衝剤、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸緩衝剤又はこれらの組合せが挙げられる。上述の通り、基材は水和によりｐＨが６〜８となり、これにより、生体試料からの生体分子の抽出及び抽出された生体分子の安定化が可能になる。水和は、試料、水又は任意の他の溶液（例えば、緩衝液）を添加することによって達成され得る。基材の１以上の実施形態は、水和により２〜７のｐＨを与える。ある実施形態では、基材は、水和により７〜１０のｐＨを与える。一実施形態では、基材は水和により６〜８のｐＨを与える。

ある実施形態では、基材は１種以上の還元剤をさらに含み、還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及びこれらの組合せからなる群から選択される。

ある実施形態では、基材は１種以上のキレート剤を含む。これらのキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）又はこれらの組合せから選択され得る。

ある実施形態では、基材は多糖類をさらに含む。これらの多糖類は、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、キトサン、アミロペクチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース又はこれらの組合せから選択され得る。一実施形態では、多糖類はＦｉｃｏｌｌ（登録商標）である。一実施形態では、基材は、Ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（ＲＴＧ）成分、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の１５％溶液をさらに含む。

基材は、基材材料を可溶化することなくタンパク質又はペプチドの回収、抽出及び貯蔵を可能にする。固体基材は、ニトロセルロース膜、セルロース膜、酢酸セルロース膜、再生セルロース膜、ニトロセルロース混合エステル膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ポリオレフィン膜、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜、ポリプロピレン膜、ポリフッ化ビニリデン膜、ポリエチレン膜、ポリスチレン膜、ポリウレタン膜、ポリフェニレンオキシド膜、ポリ（テトラフルオロエチレン−ｃｏ−ヘキサフルオロプロピレン膜）、ガラス繊維及び上記の膜の２以上の任意の組合せからなる群から選択され得る。

固体基材は多孔質であってよい。一実施形態では、固体基材は多孔質セルロース紙、例えばＷｈａｔｍａｎ（商標）のセルロース基材である。一実施例において、Ｗｈａｔｍａｎ（商標）のセルロース基材としては、９０３−セルロース、ＦＴＡ（商標）又はＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅが挙げられる。

上述の通り、固体基材は乾燥状態で組成物を含み、さらに抽出されたタンパク質を乾燥条件下で保存する。乾燥基材は、基材に適用する試料の最小容積希釈を確保するので、抽出及び貯蔵のための乾燥固体基材の使用は、液体ベースの抽出より有利である。液体ベースの抽出は、過剰容積の安定化剤で試料の濃度を希釈し得る。対照的に、生体分子の抽出及び安定化のための乾燥固体基材は、試料及び抽出された生体分子の濃度を維持し、不十分な容積の液体防腐剤中での不適切な希釈に関連する、試料の分解などの課題を取り除く。加えて、固体基材は、乾燥試薬の固定された組成物を含み、これにより、タンパク質、ペプチド又はアミノ酸などの生体分子の水和による効率的な抽出、その後の抽出された生体分子の周囲温度における安定化が可能になる。

「周囲条件」又は「周囲温度」という用語は、これ以降ほとんど同じ意味で使用される。本明細書において使用する場合、「周囲温度」という用語は、０℃〜６０℃の温度を指す。１以上の実施形態では、周囲温度は室温である。ある実施形態では、基材は、周囲温度下において乾燥状態でタンパク質を貯蔵又は保存するように構成される。

上述の通り、固体基材は、乾燥状態下で長期間タンパク質を貯蔵又は保存するように構成される。「〜するように構成される」又は「〜するために構成される」という用語は、基材を、周囲温度でタンパク質を抽出及び長期間貯蔵可能にする、基材の構造又は組成を指す。「貯蔵」又は「保存」という用語は、抽出されたタンパク質をさらなる分析に適切なフォーマットで維持することに関して、本明細書においてほとんど同じ意味で使用することができる。より詳細には、タンパク質は固体基材中に貯蔵又は保存することができ、基材は、分子の完全性の維持を確保する。

ある実施形態では、基材は固相抽出基材である。固相抽出法が使用される場合、本明細書において基材は固相抽出基材と称される。固相抽出（ＳＰＥ）技術は、シークエンシング又は他の用途のための高純度タンパク質の抽出時間を短縮するために活用されてきた。固相抽出は、固相及び液相を使用して、同じタイプ又は異なるタイプの１種以上の分子を材料から単離する抽出方法である。例えば、基材は、クロマトグラフィー分離又は他の分析方法の上流の試料を精製するために使用される。

いくつかの実施例において、基材は乾燥フォーマット（例えば、固体基材上で）で周囲温度で、分解しやすいタンパク質の貯蔵を可能にする。１以上の実施形態では、基材は、周囲温度で生体分子の安定性及び溶出率を向上させるように構成される。ある実施形態では、基材は、２０〜２２℃の周囲温度で、少なくとも１乃至３ヶ月の貯蔵の際の生体分子の安定性を向上させるように構成される。

基材は、乾燥フォーマットで、周囲温度でタンパク質を実質的にインタクトな形態で貯蔵するように構成される。タンパク質の「形態」という用語は、タンパク質の完全な構造又は機能を指す。

ある実施形態では、基材中に含浸された乾燥試薬は、緩衝液、水又は試料を添加することによって水和される。一実施形態では、含浸された乾燥試薬は、タンパク質の抽出又は貯蔵のための基材上に配置された試料、より詳細には生体試料により水和される。いくつかの他の実施形態では、試料に加えて水又は緩衝液が添加され、基材を水和及び基材に包埋された試薬を再構成又は活性化する。ある実施形態では、基材の水和により、基材上でタンパク質の抽出のための適切なｐＨを生じる。ある実施形態では、水和は、試薬、例えば、基材の乾燥形態中に存在する細胞溶解剤、タンパク質安定化剤、還元剤、緩衝剤の再構成をさらにもたらす。

固体基材上に配置された生体試料から生体分子を抽出、安定化及び溶出する方法を、本明細書において提供する。方法の一例は、生体試料と基材とを接触させ、基材が、実質的乾燥状態下でメレジトース及び実質的乾燥状態下で基材に含浸された１種以上の溶解剤、核酸変性剤又はこれらの組合せを含むステップを含む。「生体試料と接触させるステップ」という用語の限定されない例としては、ピペット、カテーテル、注射器又は導管を使用して、基材上に試料を適用又は試料を配置するステップが挙げられる。ある実施形態では、試料は基材上に注がれてもよい。この方法は、生体試料を実質的乾燥状態に乾燥させるステップをさらに含む。溶出に関しては、基材を溶出緩衝液で再水和することによって、基材上で乾燥生体試料から生体分子が溶出される。

「抽出」という用語は、試料、より詳細には生体試料からタンパク質を分離又は単離するための任意の方法を指す。「抽出」及び「回収」という用語は、本明細書においてほとんど同じ意味で使用される。タンパク質及びペプチドなどの生体分子は、細胞溶解によって細胞から放出され得る。一実施形態では、タンパク質は、蒸発性細胞溶解の間に放出され得る。別の実施形態では、細胞は、細胞溶解剤を含む基材と接触することにより溶解される。例えばＦＴＡ（商標）又はＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅセルロース紙を使用することによって、細胞を含む生体試料を基材と接触させることで、タンパク質を放出する細胞溶解がもたらされる。

上述の通り、本方法は、生体試料を実質的乾燥状態に乾燥するステップをさらに含み、乾燥された試料は、基材上で長期間貯蔵することができる。固体基材は、風乾又は真空乾燥などの任意の適切な方法を使用して乾燥される。基材で乾燥された試料は、数週間又は数ヶ月間貯蔵することができ、必要に応じて、タンパク質又はペプチドが基材上の乾燥試料から溶出され得る。

一実施形態では、この方法は、抽出されたタンパク質を固体基材上で、実質的乾燥状態で周囲温度で貯蔵するステップをさらに含む。ある実施形態では、タンパク質は１ヶ月超の期間貯蔵することができる。ある実施形態では、タンパク質は６ヶ月超の期間貯蔵することができる。タンパク質又はペプチドのいくつかは分解されやすいので、基材を使用する抽出及び保存は有用であり、回収されたタンパク質又はペプチドは、様々な下流用途にさらに使用し得る。

上述の通り、本方法は、基材を溶出緩衝液で再水和することによって、基材上で乾燥生体試料から生体分子を溶出するステップをさらに含む。「溶出」という用語は、タンパク質又はペプチドなどの生体分子を、様々な手段によって基材から回収することを指す。本方法の１以上の実施形態は、固相抽出技術により基材から生体分子を回収するステップを含む。１以上の実施形態では、基材を水溶液、緩衝液又は有機溶液で再水和することによってタンパク質が固体基材から溶出され、タンパク質はさらなる分析に供される。試料（例えば、未精製生体試料）から生体分子の溶出を可能にする任意の方法を採用することができる。タンパク質は、固体基材（例えば、セルロース紙）を水溶液、上で定義された緩衝液又は有機溶液で再水和することによって溶出され得る。ある実施形態では、タンパク質は、電気泳動溶出、電気泳動又は溶出緩衝液による洗浄によって固体基材から回収される。

上記の方法は場合により、さらなる分析のために固体基材からタンパク質を溶出するステップの前に、基材を洗浄するステップを含んでもよい。例えば、基材は、タンパク質の溶出前に、適切な緩衝液又は水で１回以上洗浄してもよい。

ある実施形態では、基材は、基材からの生体分子の溶出において７０〜９０％の回収率をもたらすように構成される。溶出は、生体分子がインタクトな形態で溶出されるように実行される。本方法の実施形態では、生体分子の溶出は、有効な安定化及び保存のために、タンパク質又はペプチドの予備精製を必要としない。タンパク質又はペプチドは、単一ステップで抽出後安定化及び溶出され得る。

上述の通り、長期保存において分解されやすいタンパク質又はペプチドは、生物学的活性状態のタンパク質の回収率に関して定義することができる。分解されやすいタンパク質は、いずれの試薬も含まない基材において１週間、室温で基材中で貯蔵後、約６０％未満の回収率を有する、又は生物学的活性状態で約４０％未満の回収率を有するタンパク質として定義される。

ある実施形態では、基材を使用する全方法、例えば、生体試料の適用ステップと、基材上での試料の乾燥ステップと、タンパク質又はペプチドの保存、基材からの抽出及び溶出ステップは、無菌条件下で実行され得る。

この方法に利用される試料としては、限定するものではないが、ヒトを含む任意の生物から得られた、血液、血清、組織及び唾液などの生体試料が挙げられる。

抽出された生体分子は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、抗体又はこれらの組合せを含んでいてもよい。生体分子は、天然に存在するタンパク質、合成タンパク質、突然変異タンパク質、融合タンパク質又はキメラタンパク質を含んでいてもよい。タンパク質又はペプチドは化学的に合成され得る。ある実施形態では、タンパク質又はペプチドは細胞中で天然に合成され得る。ある実施形態では、生体分子は、細胞又は組織切片から単離することができる組換えタンパク質又はペプチドである。生体分子は、翻訳後修飾されたタンパク質又はペプチドを含んでもよい。タンパク質は、酵素又は触媒を含んでもよい。タンパク質、ペプチド又はアミノ酸は、細菌供給源、動物供給源又はヒト供給源などの様々な供給源から単離されてよい。

実施例１：紙基材の調製
試薬：３１−ＥＴＦはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。セルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ ３１ＥＴＦ）を、適切な配合物の暖めた溶液に浸漬し、その後ラインオーブンコンベヤを使用してこの基材を乾燥させることによって、紙基材にメレジトース及び他の試薬を含浸させた。乾燥基材をその後、防湿剤と共に後の試験までＭｙｌａｒバッグ中に密閉した。４種の浸漬用配合物を調製した：（１）１５％（重量／体積基準）メレジトース溶液、（２）１５％メレジトースも含有する標準ＦＴＡ溶液。標準ＦＴＡ成分は、下記（重量／体積基準）：０．２４％ＥＤＴＡ、１．６３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１．６１％Ｔｒｉｓ緩衝液塩及び０．５６％尿酸、（３）５％（重量／体積基準）Ｆｉｃｏｌｌ ＰＭ４００及び（４）下記のパーセントの小成分を含有した溶液：６．５％メレジトース、４．２％Ｆｉｃｏｌｌ ＰＭ７０及び４．２％Ｆｉｃｏｌｌ ＰＭ４００を含み、これ以降メレジトース−Ｆｉｃｏｌｌ配合物と称される。

実施例２：タンパク質安定性アッセイ
３種のタンパク質を、セルロース系基材上の初期安定性評価のために選択した：サイトカインＩＬ−８、コレステロールタンパク質アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）及び酵素β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）。ＩＬ−８は、呼吸器感染症の代表的バイオマーカーであるため選択した。ＡｐｏＢは、易動性タンパク質モデル（すなわち、乾燥血液スポットにおいて半減期が短いことが公知である）として選択した。β−ｇａｌは、酵素活性の直接定量を提供するその能力のため、第３のモデルタンパク質として選択した。

各基材配合物の評価のために、基材の３ｍｍのパンチに３μＬの緩衝液又は目的のタンパク質をスパイクされたクエン酸−リン酸−ブドウ糖（ＣＰＤ）−安定化ヒト血液を個別にスポットした。使用したスパイク濃度は、ＡｐｏＢが０．１ｍｇ／ｍＬ、ＩＬ−８が３．３ｎｇ／ｍＬ及びβ−ｇａｌが１０μｇ／ｍＬであった。スポットされた試料をその後乾燥させ、低湿度の環境で貯蔵した。ＡｐｏＢ及びＩＬ−８に関して、溶出緩衝液を添加して、基材を連続振とう下でインキュベートすることによってタンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質をその後、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。β−ｇａｌに関しては、タンパク質の安定性を、２つの異なる方法を使用して決定した。第１の方法において、タンパク質を各基材から溶出緩衝液内に溶出し、溶出されたタンパク質の活性を測定した。第２の方法において、各基材のパンチを直接分析緩衝液中に置き、酵素活性の「理論値」を分析した。緩衝化された試料を用いて、β−ｇａｌ活性を、無色の基質ｏ−ニトロフェニルガラクトシドが黄色の生成物ｏ−ニトロフェノールへ転換することによって評価した。血液試料を用いて、β−ｇａｌ活性を、クロロフェノールレッドガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）からクロロフェノールレッドへの基質の転換により評価した。後続の研究において、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αを含む他のタンパク質を処理し、上記のＩＬ−８と同様の様式で分析した。

乾燥血液スポット中のタンパク質の安定性を、ＦＴＡ（商標）溶液又はＦＴＡ（商標）＋１５％メレジトースの溶液で浸漬コーティングされた３１−ＥＴＦセルロースを使用して、室温における長期保存後に決定し、両方の基材からの相対的安定性データを表１に示す。データは、未修飾３１−ＥＴＦ（商標）セルロース上又はこれから溶出された各タンパク質分析物のシグナルに対して正規化した。表１は、いずれの浸漬配合物へのメレジトースの含有が、３１−ＥＴＦ（商標）セルロース又はＦＴＡ（商標）基材のいずれかにと比べて、分析物シグナルの改善を予期せずにもたらしたことを明確に示している。シグナル改善の大きさはいくぶんタンパク質依存性であるが、最も高いシグナルは、この実施例中の各分析物に関して、ＦＴＡ（商標）＋１５％メレジトースを含む基材に関して達成された。メレジトース含有基材は、約２０〜２２℃の周囲温度で試料を少なくとも１ヶ月貯蔵後、未修飾３１−ＥＴＦ（商標）から溶出されたタンパク質と比較した場合、溶出されたタンパク質に対するシグナルが最低限２０〜６０％の改善を示した（表１）。貯蔵日数は丸括弧内に表し、改善％は（試験紙に関するシグナル−３１ＥＴＦに関するシグナル）／（３１ＥＴＦに関するシグナル）×１００として計算した。

ＦＴＡ（商標）基材はＳＤＳなどの変性剤を含有し、これらの変性剤は、図１に示すようにいくつかの分析物に対して３１−ＥＴＦ（商標）と比べてタンパク質シグナルの変化％に負値をもたらす。予想外に、メレジトースなどの三糖類を基材に含浸することにより、室温の試料貯蔵の間にＳＤＳの存在下でシグナル検出の改善（正味の正値）がもたらされ、それによって、メレジトースを含まないＦＴＡ（商標）と比べてタンパク質の安定性の増大が示された。

実施例３：３０℃でのタンパク質の安定性
配合物のリストは、長期（９０日）試料貯蔵後のタンパク質の安定性を決定するために選択した。本実施例では、目的の分析物を含有するヒト血液試料を各基材に適用し、低湿度条件下で３０℃において９０日間貯蔵し、その後実施例２に記載のようにタンパク質の安定性を決定した。全基材を実施例１に上記のように調製した。基材配合物のパンチに、血液中のＩＬ−１β（６ｐｇ／μＬ）、ＩＬ−８（７．５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＮＦ−α（８ｐｇ／μＬ）又はβ−ｇａｌ（１０μｇ／ｍＬ）を個別に添加し、上記のように室温で乾燥させた。選択された基材由来の乾燥血液スポットを、３０℃における長期貯蔵（丸括弧内は貯蔵日数）後、未修飾３１−ＥＴＦセルロースと比較した。

ＥＬＩＳＡ又は酵素活性データに基づき、メレジトース含有基材の安定化効果は、被験タンパク質分析物のタイプにより変動するが、すべての分析物が、３１−ＥＴＦセルロースと比べてメレジトースを含有する基材においてシグナルの改善を示した（表２）。例えば、貯蔵９０日後、溶出されたＩＬ−１βシグナルは、未修飾３１−ＥＴＦからの対応するシグナルより、１５％メレジトースを含有する基材に関して２４％大きく、メレジトース−Ｆｉｃｏｌｌ配合物を含有する基材に関して５２％大きい。３０℃における長期保存後、３１−ＥＴＦセルロースと比べたメレジトース含有基材に関するシグナルの正味の改善を表２に示す。５％Ｆｉｃｏｌｌ ＰＭ４００単独は、本明細書において調査したＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及びβ−ｇａｌなどのいくつかのタンパク質に対する安定化効果を提供したが、メレジトースをＦｉｃｏｌｌ（又はＦｉｃｏｌｌと同様の組成物）と組合せて含むメレジトース−Ｆｉｃｏｌｌ配合物を含む基材は、表２に示すようにより優れた安定化効果を示した。表２において、すべての乾燥血液スポット試料の貯蔵日数を丸括弧内に示し、改善％は（試験紙−３１ＥＴＦ）／（３１ＥＴＦ）×１００として計算した。

実施例４：乾燥試料からのβ−ｇａｌの溶出効率
サイトカイン標的（ＩＬ−１β、ＩＬ−８及びＴＮＦ−α）及びＡｐｏＢに関するＥＬＩＳＡシグナルは、様々なセルロース基材の相対的安定化効果の有用な測定を提供した。分析物のシグナルが抑制される場合、実質的なタンパク質の変性と相まった完全な溶出からもたらされるのか、又は実質的に活性な非変性タンパク質の不完全な溶出からもたらされるのかどうかを決定することは困難である。β−ｇａｌシグナルは必然的に活性タンパク質に依存するので、この特定の分析物は、シグナルの「理論値」とシグナルの溶出による実測値とを比較することによって、活性な非変性タンパク質の実際の溶出効率を測定する機会を提供した。

β−ｇａｌをスパイクされた血液試料を上記のように調製し、タンパク質の安定性を、実施例３と同じ様式で長期保存に関して決定した。したがって、試料を３ｍｍの基材のパンチ上にスポットし、乾燥させ、低湿度条件下で３０℃において貯蔵した。試料を１４〜９０日間貯蔵し、およそ５０％の溶出改善が、図１に示すようにこの貯蔵間隔の間中一貫して観察された。図１の各データポイントは、比色酵素活性アッセイにより決定された活性タンパク質のシグナルの溶出による実測値対合計（「理論値」）の比を表す。溶出条件は、３ｍｍの乾燥血液スポット試料を１００ｍＬの緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を含む微小遠心管に入れ、完全に混合し（８００ｒｐｍ、１ｈ）、その後溶出効率を決定することによって得た。図１は、この様式で測定して、１５％メレジトースを含む基材から回収した場合、未修飾３１−ＥＴＦセルロースと比べて、活性な非変性β−ｇａｌの溶出効率が増大することを示す。

本発明のわずかな特定の特色を、本明細書に例示及び記載してきたが、多くの改良及び変形が当業者には思い浮かぶことと思われる。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の範囲内にあるすべてのこのような改良及び変形を含むことが意図されることを理解すべきである。

Claims (20)

1. 生体分子の抽出、安定化及び溶出のための固体基材であって、実質的乾燥状態下でメレジトースを含む基材。
2. メレジトースの濃度が１０〜３０％である、請求項１に記載の基材。
3. メレジトースの濃度が１５％である、請求項１又は２に記載の基材。
4. 実質的乾燥状態下で基材に含浸された、１種以上の溶解剤、生体分子安定化試薬又はこれらの組合せをさらに含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の基材。
5. 溶解剤が洗浄剤、カオトロープ、変性剤又はこれらの組合せを含み、チオシアン酸塩、陰イオン性洗浄剤、非イオン性洗浄剤、陽イオン性洗浄剤、尿素又はこれらの組合せ、好ましくは、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はこれらの組合せから選択される、請求項４に記載の基材。
6. 還元剤、緩衝剤、抗酸化剤、キレート剤又はこれらの組合せをさらに含み、還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はこれらの組合せから選択され、緩衝剤が２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸緩衝剤、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸緩衝剤又はこれらの組合せから選択され、キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）又はこれらの組合せから選択される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の基材。
7. デキストラン、フィコール、キトサン、アミロペクチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース又はこれらの組合せから選択される多糖類をさらに含む請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の基材。
8. ニトロセルロース膜、セルロース膜、酢酸セルロース膜、再生セルロース膜、ニトロセルロース混合エステル膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ポリオレフィン膜、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜、ポリプロピレン膜、ポリフッ化ビニリデン膜、ポリエチレン膜、ポリスチレン膜、ポリウレタン膜、ポリフェニレンオキシド膜、ポリ（テトラフルオロエチレン−ｃｏ−ヘキサフルオロプロピレン膜、ガラス繊維又はこれらの組合せから選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の基材。
9. 周囲温度で生体分子の安定性及び溶出率を向上さるように構成される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の基材。
10. ２０〜２２℃の周囲温度で、少なくとも１乃至３ヶ月の貯蔵期間における生体分子の安定性を向上させるように構成される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の基材。
11. 生体分子が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、触媒又はこれらの組合せを含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の基材。
12. 実質的乾燥状態下で、メレジトース、ラフィノース、マルトトリウロース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、ケトース又はこれらの組合せから選択される三糖類を含む、生体分子の回収、安定化及び溶出のための固体基材。
13. 生体試料と、実質的乾燥状態下で基材に含浸されたメレジトースを含む基材とを接触させるステップと、生体試料を実質的乾燥状態に乾燥させるステップと、基材を溶出緩衝液中で再水和させることによって、基材上で乾燥生体試料から生体分子を溶出するステップとを含む、固体基材上に配置された生体試料から生体分子を抽出、安定化及び溶出する方法。
14. 基材が、基材からの生体分子の回収率が７０〜９０％となるように構成される、請求項１３に記載の方法。
15. 基材が生体分子をインタクトな形態で溶出するように構成される、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
16. 基材がセルロースを含む、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
17. メレジトースが、１０〜３０％の濃度、好ましくは１５％の濃度で存在する、請求項１３乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
18. 基材が１種以上の溶解剤、核酸変性剤及びこれらの組合せをさらに含み、溶解剤がチオシアン酸塩、洗浄剤、尿素又はこれらの組合せから選択され、好ましくは溶解剤がチオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アルギニン、尿素又はこれらの組合せから選択される、請求項１３乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
19. 基材が、デキストラン、フィコール、キトサン、アミロペクチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース又はこれらの、好ましくは１〜１０％のフィコールから選択される多糖類をさらに含む、請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
20. 基材が、基材に含浸された還元剤、緩衝剤、抗酸化剤、キレート剤又はこれらの組合せをさらに含み、還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はこれらの組合せから選択され、緩衝剤が２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸緩衝剤、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸緩衝剤又はこれらの組合せから選択され、キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）又はこれらの組合せから選択される、請求項１３乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。