CN115144512A - 用于生物分子的收集、稳定和洗脱的基材和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于蛋白的提取、稳定和储存的固体基材。所述基材包括：在基本干态下的多糖，例如松三糖。所述基材被构造为从样品中提取蛋白并在环境条件下以干品形式长期稳定提取的蛋白。还描述了收集和回收储存在干固体基材中的蛋白的方法。

Description

用于生物分子的收集、稳定和洗脱的基材和方法
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2015年4月20日；申请号：201580021334.X；发明名称：“用于生物分子的收集、稳定和洗脱的基材和方法”。
技术领域
本发明涉及用于从生物样品中收集、稳定和洗脱生物分子的干固体基材。本发明还涉及由所述干固体基材从生物样品中收集、稳定和洗脱生物分子的方法。
背景技术
在从生物样品中分离或纯化期间保持生物分子的结构和功能完整性对于各种下游应用是必需的，这些下游应用包括分析物检测、传感应用、法医应用、诊断或治疗应用等。衍生自生物样品的蛋白、肽或氨基酸的提取和稳定对许多环境因素敏感，这些环境因素包括但不限于溶液pH、温度和各种蛋白酶的普遍存在。因此，通常将蛋白或肽以溶液状态冷藏(例如4℃、-20℃或-80℃)储存，以防止水解和酶促降解并保持蛋白结构或功能的完整性。
宣称以干形式成功收集和保存蛋白或肽的干态技术通常需要在储存之前从样品中“预纯化”和“浓缩”蛋白。用于以干品形式保存蛋白的其他干态技术需要额外的干燥设备(例如强制空气流动、冻干)。因此，这些方法不利于在没有额外且重要的加工步骤的情况下从样品(例如，生物样品)中直接收集和稳定蛋白或肽。
蛋白或肽易于变性，因此在储存期间会丧失生物活性或表位识别。为不同分析测试的靶标的蛋白(例如生物标记或生物治疗药物)可能以未纯化状态低含量存在。因此，非常需要使目标蛋白分析物的回收最大化的方法。可以使用例如抑制蛋白酶活性的化学添加剂来减缓或防止蛋白或肽的降解。然而，化学添加剂的存在可能影响下游分析技术，包括质谱和免疫测定。
未处理的纤维素纸基材，例如903或31ETF纸(WhatmanTM，GE Healthcare)或Grade226纸(Ahlstrom，PerkinElmer)广泛用于在干血斑中保存酶、抗体、蛋白、肽和氨基酸以用于分析目的如新生儿测试。然而，分析物从未处理的纤维素基材的回收和随后所述分析物(特别是易于降解的蛋白)的生物活性通常是不够的。干样品，例如用于新生儿测试的干血斑样品，通常冷藏储存以保持分析物稳定性。可以从干血斑中低效洗脱的分析物在本领域中可以解释为不稳定的靶标，原因是差的功能恢复性。在本领域中已经报道了补充不同的化学填料以稳定蛋白，然而填料具有有限的回收和稳定敏感蛋白的能力。
因此，非常需要能够从生物样品中收集和提取生物分子(包括蛋白、肽或氨基酸)、且随后在干态和环境条件下稳定生物分子而无需预纯化、且此后以基本完整的形式洗脱生物分子以进一步分析的组合物和方法。
发明内容
用于生物分子的提取、稳定和洗脱的固体基材的一个实施方案包含在基本干态下的松三糖。
在另一个实施方案中，用于收集、稳定和洗脱生物分子的固体基材包含在基本干态下的三糖。
用于从置于固体基材上的生物样品中提取、稳定和洗脱生物分子的方法的一个实例包括使所述生物样品与所述基材接触；将所述生物样品干燥至基本干态；和通过在洗脱缓冲液中使所述基材再水合从在所述基材上干燥的生物样品中洗脱所述生物分子，其中所述固体基材包含在基本干态下的松三糖，和任选的一种或多种在基本干态下浸渍于基材中的裂解试剂、核酸变性试剂或其组合。
附图说明
图1图示了，与未改性的31-ETF纤维素相比，当从具有15%松三糖的基材中回收时活性、非变性β-gal的提高的洗脱效率。
具体实施方式
所述实施方案提供了用于提取、稳定和洗脱生物分子例如蛋白、肽、氨基酸、酶和抗体的合适的基材(matrice)和方法。易于变性的生物分子因此难以以完整形式保存。本发明的一个或多个实施方案涉及用于生物分子的提取、稳定和洗脱的固体基材，其中所述基材包含在基本干态下的三糖，例如松三糖。所述固体基材被构造为收集生物样品，然后从样品中提取并长时间稳定蛋白、肽或氨基酸，随后在单个处理步骤中洗脱。洗脱的蛋白或肽用于各种下游应用。所述基材被构造为在环境温度下以基本干态稳定蛋白或肽，并基本保持蛋白的完整结构和/或功能。
为了更清楚简明地描述要求保护的本发明的主题，为用于以下描述和所附权利要求中的具体术语提供以下定义。在整个说明书中，具体术语的示例应被认为是非限制性实例。
除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。如在整个说明书和权利要求书所使用的近似语言可以用于修饰任何定量表示，该定量表示在不导致与其相关的基本功能改变的情况下可允许改变。因此，由术语例如“约”修饰的值不限于所指定的精确值。在一些情况下，近似语言可以对应于用于测量该值的仪器的精度。在必要时，已经提供了范围，并且那些范围包括其间的所有子范围。
本文所提到的术语“生物样品”包括但不限于从任何生物体(包括人)获得的血液、血清、组织和唾液。生物样品可以由进行自我诊断测试(例如，血糖监测)的个体或由受过训练的医疗专业人员通过各种技术获得，所述技术包括例如使用针抽吸血液或刮擦或擦拭特定区域，例如患者皮肤上的损伤。用于收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。术语“样品”包括如上定义的生物样品，但也包括例如组织培养的细胞和纯化的蛋白。
本文所提到的术语“还原剂”包括向另一化学物类提供电子的任何化学物类。各种还原剂是本领域已知的。示例性还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。此外，可以使用这些或其他还原剂的任何组合。在具体实施方案中，所述还原剂是TCEP。
本文所用的术语“缓冲液”包括例如2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(Tris)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、柠檬酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和磷酸盐缓冲液。该有效缓冲液的列表仅用于说明目的。选择用于本文公开的组合物和方法的缓冲液的pH通常在3-10的范围内。在一些实施方案中，本文使用的缓冲液的pH在6-9的范围内，或在一些其他实施方案中，缓冲液的pH在7-8的范围内。
用于收集、稳定和洗脱生物分子的固体基材的一个实施方案包含在基本干态下的三糖。所述三糖可以选自松三糖、棉子糖、麦芽三酮糖(maltotriulose)、异麦芽三糖、黑曲霉三糖、麦芽三糖、酮糖或其组合。
固体基材的一个或多个实施方案包含在基本干态下的松三糖。松三糖是非还原性三糖，具有504,44g/mol的分子量。在一个或多个实施方案中，所述固体基材包含松三糖，其中松三糖的浓度在约10-30%的范围内。在一个实施方案中，松三糖的浓度为15%。松三糖可以浸渍在基材中。在一些实施方案中，浸渍的松三糖在基材中的浓度为10-30%。在一些其他实施方案中，15%的松三糖浸渍在基材中。所述基材可以钝态地涂有松三糖或用松三糖共价改性。在一些其他实施方案中，用15%的松三糖溶液涂覆基材。具有松三糖的基材表现出高蛋白稳定性，并提供更高的产率，如实施例2中所述。
在一个或多个实例中，所述基材还用一种或多种试剂浸渍，所述试剂例如裂解试剂、缓冲剂或还原剂。在一些实施方案中，浸渍的试剂包括浸渍在基材中的在基本干态下的细胞裂解试剂、生物分子稳定试剂(例如蛋白稳定试剂)、蛋白存储化学品及其组合。
所述基材还被构造为从生物样品中提取蛋白或肽并在环境温度下保持在基本干态下的蛋白或肽。本文所用的术语“基本干态”是指将提取的生物分子干燥到水含量约小于2%。类似地，所述试剂以基本干态浸渍在基材中。
将组合物“结合”到基材中包括但不限于下面描述的“浸渍”程序。在一些实施方案中，这种方法实现将组合物结合到干固体基材中。在将组合物结合到干固体基材中之后，使用任何合适的方法干燥固体基材。
在一个或多个实施方案中，所述基材包含裂解试剂。所述裂解试剂可以包括洗涤剂、离液剂、变性剂或其组合。不旨在受限于特定的变性剂，根据其生物物理性质和完全抑制生物酶(例如蛋白酶)活性的能力，裂解试剂可以分为弱裂解试剂或强裂解试剂。在一些实施方案中，弱蛋白变性剂(例如洗涤剂)可用于裂解细胞和破坏蛋白-蛋白相互作用而不使蛋白变性。许多裂解试剂是本领域已知的，并且可以经选择用于本文所述的组合物和方法中。不旨在受限于特定的裂解试剂，示例性的裂解试剂包括硫氰酸
Figure 503582DEST_PATH_IMAGE001
、盐酸
Figure 420723DEST_PATH_IMAGE001
、硫氰酸钠、硫氰酸钾、精氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、脲或其组合。
如上所述，所述裂解试剂可以包括洗涤剂，其中示例性洗涤剂可以分为离子型洗涤剂、非离子型洗涤剂或两性离子型洗涤剂。所述离子型洗涤剂可以包括阴离子洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))或阳离子洗涤剂(例如乙基三甲基溴化铵)。用于细胞裂解的非离子型洗涤剂的非限制性实例包括TritonX-100、NP-40、Brij 35、Tween 20、辛基葡糖苷、辛基硫葡糖苷或毛地黄皂苷。一些两性离子洗涤剂可以包括3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)。
在一个或多个实施方案中，所述裂解试剂包括硫氰酸盐。所述基材的一个或多个实施方案包括在干态下浸渍的硫氰酸盐。示例性的硫氰酸盐包括但不限于硫氰酸
Figure 403722DEST_PATH_IMAGE001
、硫氰酸钠、硫氰酸钾或其组合。在一些其他实施方案中，所述裂解试剂选自硫氰酸
Figure 798931DEST_PATH_IMAGE001
、硫氰酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)或其组合。
在一个或多个实施方案中，在从生物样品提取后所述基材保持蛋白的所需水平的稳定性和完整性。在一个实施方案中，用一种或多种蛋白稳定剂浸渍基材。这些稳定剂可以包括蛋白酶抑制剂、缓冲剂或螯合剂(例如EDTA)。
在蛋白酶存在下回收的蛋白的消化可以通过向基材中加入一种或多种蛋白酶抑制剂来避免，其中蛋白酶抑制剂可以外部加入或可以浸渍在基材中。在一个实施方案中，浸渍的蛋白酶抑制剂可以在润湿干基材时被活化。在一些实施方案中，所述基材还包含蛋白酶抑制剂，其中所述蛋白酶抑制剂是合成的或天然存在的(例如天然存在的肽或蛋白)，并且包括抑肽酶、抑制素、抑糜蛋白酶素、亮抑酶肽、α-2-巨球蛋白、胃蛋白酶抑制剂、苯甲磺酰氟、N-乙基马来酰亚胺、乙二胺四乙酸、抗凝血酶或其组合。在一个实例中，添加这种蛋白酶抑制剂通过抑制蛋白酶或肽酶来增强液态和干态蛋白两者的稳定性。
基材的某些实施方案包含干态的缓冲剂试剂，所述缓冲剂试剂可在提取期间再水合。这些缓冲剂的实例包括但不限于2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(Tris)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代))丙磺酸(MOPS)、柠檬酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸盐缓冲液或其组合。如所指出，所述基材在水合时提供6-8的pH，这确保从生物样品中提取生物分子和提取的生物分子的稳定化。水合可以通过加入样品、水或任何其他溶液(例如缓冲溶液)来实现。基材的一个或多个实施方案在水合时提供在2-7的范围内的pH。在一些实施方案中，所述基材在水合时提供7-10的pH。在一个实施方案中，所述基材在水合时提供6-8的pH范围。
在一些实施方案中，所述基材还包含至少一种还原剂，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)及其组合。
在一些实施方案中，所述基材包含一种或多种螯合剂。所述螯合剂可以选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、乙二醇四乙酸(EGTA)或其组合。
在一些实施方案中，所述基材还包含多糖。所述多糖可以选自葡聚糖、Ficoll®、壳聚糖、支链淀粉、藻酸盐、羧甲基纤维素或其组合。在一个实施方案中，所述多糖是Ficoll®。在一个实施方案中，所述基材还包含来自GE Healthcare的Illustra TM Ready-To-Go(RTG)组分的15%溶液。
所述基材能够收集、提取和储存蛋白或肽，而不溶解基材材料。所述固体基材可以选自硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜、玻璃纤维和两种或更多种上述膜的任何组合。
所述固体基材可以是多孔的。在一个实施方案中，所述固体基材是多孔纤维素纸，例如来自Whatman TM的纤维素基材。在一个实例中，来自Whatman TM的纤维素基材包含903-纤维素、FTA TM或FTA TM Elute。
如所述，所述固体基材包含干态的组合物并且还在干品条件下保存提取的蛋白。使用干固体基材进行提取和储存比基于液体的提取更有利，因为干基材确保施加到基材上的样品的最小体积稀释。基于液体的提取会在过量体积的稳定剂中稀释样品的浓度。相比之下，用于提取和稳定生物分子的干固体基材维持样品以及提取的生物分子的浓度，并且消除了与样品在不足体积的液体保存剂(liquid preservative)中的不当稀释相关的问题，例如样品降解。此外，所述固体基材包含干试剂的固定组合物(fixed composition)，其使得能够在水合时有效提取生物分子，例如蛋白、肽或氨基酸，随后在环境温度下稳定提取的生物分子。
术语“环境条件”或“环境温度”在下文中可互换使用。本文所用的术语“环境温度”是指在0℃-60℃之间的范围内的温度。在一个或多个实施方案中，环境温度是室温。在一些实施方案中，所述基材被构造为在环境温度下以干态储存或保存蛋白。
如所述，所述固体基材被构造为在干态下长时间储存或保存蛋白。在本文中术语“被构造成”或“被构造为”是指基材的结构或组成使得基材能够在环境温度下提取并储存蛋白一段时间。关于将提取的蛋白保持在适于进一步分析的形式，术语“储存”或“保存”在本文中可以互换使用。更具体地，所述蛋白可以储存或保存在固体基材中，其中所述基材确保维持分子的完整性。
在一些实施方案中，所述基材是固相提取基材。使用固相提取法的基材在本文中称为固相提取基材。已经利用固相提取(SPE)技术来减少测序和其他应用的高纯度蛋白的提取时间。固相提取是使用固相和液相从材料中分离一种或多种相同类型或不同类型的分子的提取方法。所述基材例如用于在色谱分离或其他分析方法的上游纯化样品。
在一些实例中，所述基材允许在环境温度下以干形式(例如，在固体基材上)储存易于降解的蛋白。在一个或多个实施方案中，所述基材被构造成在环境温度下为生物分子提供改进的稳定性和洗脱。在一些实施方案中，所述基材被构造成在20-22℃的环境温度下储存至少一个月至三个月期间为生物分子提供改进的稳定性。
所述基材被构造为在环境温度下以干形式在基本完整的形式下储存蛋白。术语蛋白的“形式”是指蛋白的整体结构或功能。
在一些实施方案中，浸渍在基材中的干试剂通过加入缓冲液、水或样品而水合。在一个实施方案中，浸渍的干试剂被样品(更具体地，生物样品)水合，样品置于基材上用于提取或储存蛋白。在一些其他实施方案中，除了样品之外，还加入水或缓冲液以水合基材并重构或活化包埋在基材中的试剂。在一些实施方案中，基材的水合产生用于提取基材上的蛋白的适当pH。在一些实施方案中，水合进一步导致重构在基材中以干形式存在的试剂，例如细胞裂解试剂、蛋白稳定试剂、还原剂、缓冲剂试剂。
本文提供了从置于固体基材上的生物样品中提取、稳定和洗脱生物分子的方法。方法的实例包括将生物样品与基材接触，其中所述基材包含在基本干态下的松三糖和在基本干态下的浸渍在基材中的一种或多种裂解试剂、核酸变性试剂或其组合。术语“接触生物样品”的非限制性实例包括使用移液管、导管(catheter)、注射器或导管(conduit)施用样品或将样品置于基材上。在一些实施方案中，样品可以倒在基材上。所述方法还包括将生物样品干燥至基本干态。为了洗脱，通过在洗脱缓冲液中使基材再水合，从在基材上干燥的生物样品中洗脱生物分子。
术语“提取”是指从样品(更特别是从生物样品)中分开或分离蛋白的任何方法。术语“提取”和“收集”在本文中可互换使用。生物分子例如蛋白和肽可以通过细胞裂解从细胞释放。在一个实施方案中，所述蛋白可以在蒸发性细胞裂解期间释放。在另一个实施方案中，细胞在与包含细胞裂解试剂的基材接触时裂解。例如通过使用FTATM或FTA TM洗脱纤维素纸使包含细胞的生物样品与基材接触导致细胞裂解，细胞裂解释放蛋白。
如所述，所述方法还包括将生物样品干燥至基本干态，其中干样品可以在基材上储存更长的时间。使用任何合适的方法干燥固体基材，例如风干或真空干燥。样品干基材可以储存数周或数个月，并且根据需要，可以从基材上的干样品中洗脱蛋白或肽。
在一个实施方案中，所述方法还包括在环境温度下以基本干态将提取的蛋白储存在固体基材上。在一些实施方案中，蛋白可以储存超过一个月的时间。在一些实施方案中，蛋白可以储存多于六个月的时间。由于一些蛋白或肽易于降解，因此使用基材的提取和保存是有用的，并且回收的蛋白或肽可进一步用于各种下游应用。
如所述，所述方法还包括通过在洗脱缓冲液中使基材再水合，从在基材上干燥的生物样品中洗脱生物分子。术语“洗脱”是指通过各种手段从基材回收生物分子，例如蛋白或肽。所述方法的一个或多个实施方案包括通过固相提取技术从基材回收生物分子。在一个或多个实施方案中，通过在水溶液、缓冲液或有机溶液中使基材再水合，从固体基材洗脱蛋白，并且其中对蛋白进行进一步分析。可以使用能够从样品(例如，未纯化的生物样品)洗脱生物分子的任何方法。可以通过在水溶液、如上所述的缓冲溶液或有机溶液中使固体基材(例如纤维素纸)再水合来洗脱蛋白。在一些实施方案中，通过电洗脱、电泳或用洗脱缓冲液洗涤从固体基材中回收蛋白。
上述方法可任选地包括在从固体基材洗脱蛋白用于进一步分析之前洗涤基材的步骤。例如，可以在洗脱蛋白之前用合适的缓冲液或水洗涤基材一次或多次。
在一些实施方案中，所述基材被构造为在从基材洗脱生物分子时提供70%至90%的回收率。进行洗脱使得生物分子以完整形式洗脱。在该方法的实施方案中，生物分子的洗脱不需要蛋白或肽的预纯化来有效稳定和保存。可以提取蛋白或肽，然后在单个步骤中稳定化和洗脱。
如所述，在长期储存中易于降解的蛋白或肽可以根据生物活性状态的蛋白的回收百分比来定义。易于降解的蛋白定义为在室温下在基材中储存一周后具有小于约60%的回收率或在生物活性状态下具有小于约40%的回收率的蛋白，其中所述基材没有任何试剂。
在一些实施方案中，可以在无菌条件下进行使用基材的整个方法，例如施用生物样品、将样品在基材上干燥、储存、从基材提取和洗脱蛋白或肽。
在该方法中使用的样品包括但不限于从任何生物体(包括人)获得的生物样品，例如血液、血清、组织和唾液。
提取的生物分子可以包括蛋白、肽、氨基酸、酶、抗体或其组合。所述生物分子可以包括天然存在的蛋白、合成蛋白、突变蛋白、融合蛋白或嵌合蛋白。所述蛋白或肽可为化学合成的。在一些实施方案中，所述蛋白或肽可以在细胞中天然合成。在一些实施方案中，所述生物分子是可以从细胞或组织切片中分离的重组蛋白或肽。所述生物分子可以包括后翻译修饰的蛋白或肽。所述蛋白可以包括酶或催化剂。所述蛋白、肽或氨基酸可以从多种来源分离，例如细菌来源、动物来源或人来源。
实施例1. 纸基材的制备
试剂：31-ETF来自GE Healthcare。用松三糖和其他试剂浸渍纸基材，做法是，通过将纤维素纸(Whatman 31ETF)浸渍在适当制剂的温热溶液中，然后使用在线烘箱输送机干燥基材。然后将干燥的基材密封在带有干燥剂的Mylar袋中，直到进一步测试。制备四种浸渍制剂：(1) 15%(基于重量/体积)的松三糖溶液，(2) 还含有15%松三糖的标准FTA溶液。该标准FTA组分包含以下(基于重量/体积)：0.24% EDTA、1.63% 十二烷基硫酸钠(SDS)、1.61%Tris缓冲盐和0.56%尿酸，(3) 5% (基于重量/体积) Ficoll PM400，和(4) 含有以下百分比的子组分的溶液：6.5%的松三糖，4.2% Ficoll PM 70和4.2% Ficoll PM400，下文称为松三糖-Ficoll制剂。
实施例2：蛋白稳定性测定
选择三种蛋白用于对基于纤维素的基材进行初始稳定性评价：细胞因子IL-8、胆固醇蛋白载脂蛋白B(ApoB)和酶β-半乳糖苷酶(β-gal)。选择IL-8，原因是它是呼吸道感染的代表性生物标志物。选择ApoB作为不稳定蛋白模型(即，在干血斑上已知的短半衰期)。选择β-gal作为第三模型蛋白，因为其提供直接定量酶活性的能力。
为了评价每种基材制剂，用3μL掺有目标蛋白的缓冲液或柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖(CPD)稳定的人血分别对3mm基材冲孔点样。所用掺加浓度为：Apo B为0.1 mg/mL、IL-8为3.3ng/mL、β-gal为10 μg/mL。然后将点样的样品干燥并储存在低湿度环境中。对于ApoB和IL-8，通过加入洗脱缓冲液洗脱蛋白，并将基材在连续振荡下温育。然后使用商品ELISA试剂盒检测洗脱的蛋白。对于β-gal，使用两种不同的方法确定蛋白稳定性。在第一种方法中，将蛋白从各基材洗脱到洗脱缓冲液中并测定洗脱的蛋白的活性。在第二种方法中，将各基材的冲孔直接放置在分析缓冲液中，并“纸上”分析酶活性。对于缓冲样品，通过将无色基材邻硝基苯基半乳糖苷转化为黄色产物邻硝基苯酚来评估β-gal活性。对于血液样品，通过将具有氯酚红半乳吡喃糖酐(CPRG)的基材转化为氯苯酚来评估β-gal活性
使用在FTATM溶液中或在FTATM + 15%松三糖溶液中浸涂的31-ETF纤维素来测定在室温长期储存后干血斑中的蛋白的稳定性，并且来自两种基材的相对稳定性数据示于表1中。将数据相对于来自未改性的31-ETFTM纤维素上的或从其洗脱的每种蛋白分析物的信号归一化。表1清楚地证明，相对于31-ETFTM纤维素或FTATM基材，在浸渍制剂中包含松三糖意想不到地导致改进的分析物信号。尽管信号改进的幅度在某种程度上是依赖于蛋白的，但是在该实施例中对于每种分析物包含FTATM + 15%松三糖的基材实现最高的信号。当在约20-22℃的环境温度下储存样品至少一个月后，与从未改性的31-ETFTM洗脱的蛋白相比，含有松三糖的基材表现出洗脱的蛋白的信号的最低20-60%的改进(表1)。存储天数在括号中表示，%改进如下计算：(试验纸的信号-31ETF的信号)/(31ETF的信号) * 100。
表1：在室温长期储存后与未改性的31-ETFTM纤维素相比蛋白信号的变化
Figure 613304DEST_PATH_IMAGE002
FTATM基材含有变性剂，例如SDS，对于某些分析物SDS导致相对于31-ETFTM的蛋白信号变化%的负值，如表1所示。出乎意料地，将三糖例如松三糖浸渍到基材中导致在室温样品储存期间在SDS存在下改进的检测信号(净正值)，从而证明相对于没有松三糖的FTATM增强的蛋白稳定性。
实施例3：在30℃下的蛋白稳定性
选择一系列制剂来确定在长期(90天)样品储存后的蛋白稳定性。在该实施例中，将含有目标分析物的人血液样品施加到各基材，并在低湿度条件下在30℃下储存90天，然后如实施例2所述确定蛋白稳定性。所有基材如上面的实施例1中所述制备。基材制剂的冲孔单独地配剂有在血中的IL-1β (6pg/μL)、IL-8 (7.5ng/mL)、TNF-α (8pg/μL)或β-gal(10μg/mL)并如上所述在室温下干燥。在30℃下长期储存(在括号中为存储天数)后，将所选基材的干血斑相对于未改性的31-ETF纤维素进行比较。
基于ELISA或酶活性数据，含有松三糖的基材的稳定作用随着测试的蛋白分析物的类型而变化，然而，相对于31-ETF纤维素，所有分析物在含有松三糖的基材上显示改进的信号(表2)。例如，在储存90天后，与来自未改性的31-ETF的相应信号相比，含有15%松三糖的基材的洗脱的IL-1β信号大24%，含有松三糖-Ficoll制剂的基材的洗脱的IL-1β信号大52%。在30℃下长期储存后，含有松三糖的基材相对于31-ETF纤维素的信号的净改进显示在表2中。尽管根据本文的研究5% Ficoll PM400单独对一些蛋白如IL-1β、IL-8、TNF-α和β-gal提供了稳定作用，但是具有包含与Ficoll(或与Ficoll类似的组分)组合的松三糖的松三糖-Ficoll制剂的基材显示出优异的稳定作用，如表2所示。在表2中，所有干血斑样品的储存天数显示在括号中，%改进如下计算：(测试纸-31ETF)/(31ETF)*100。
表2：在30℃下长期储存后与31-ETF纤维素相比含有松三糖的基材的信号改进
Figure 435766DEST_PATH_IMAGE003
实施例4：β-gal从干样品的洗脱效率
细胞因子靶标(IL-1β、IL-8和TNF-α)和ApoB的ELISA信号提供了不同纤维素基材的相对稳定作用的有用量度。当分析物信号被抑制时，难以确定该抑制的信号是由与显著的蛋白变性相关的完全洗脱引起的，还是由基本上活性的、非变性蛋白的不完全洗脱引起的。由于β-gal信号必需依赖于活性蛋白，所以该特定的分析物通过比较“纸上”信号和“洗脱”信号提供了测量活性、非变性蛋白的实际洗脱效率的机会。
如上制备掺有β-gal的血样品，并以与实施例3相同的方式确定长期储存的蛋白稳定性。然后将样品点样到3mm基材冲孔上，干燥并在30℃下储存在低湿度条件下。将样品储存14-90天，并且在该储存间隔中始终观察到约50%的洗脱改进，如图1所示。图1的每个数据点表示通过比色酶活性测定法测定的活性蛋白的洗脱与总量(eluted-to-total)(“纸上”)信号的比率。通过将3mm干血斑样品置于具有100mL缓冲液(PBS/0.05% Tween-20)的微量离心管中并充分混合(800rpm，1小时)来实现洗脱条件，然后确定洗脱效率。图1显示当以这种方式测量时，相对于未改性的31-ETF纤维素，当从具有15%松三糖的基材回收时，活性、非变性β-gal的洗脱效率增强。
虽然本文仅示出和描述了本发明的某些特征，但是本领域技术人员将想到许多修改和改变。因此，应当理解，所附权利要求旨在覆盖落入本发明的范围内的所有这样的修改和改变。

Claims (51)

1.一种用于生物分子的收集、稳定和储存的纸基材，所述纸基材基本上由以下组成：
a. 选自纤维素、乙酸纤维素及其组合的不可溶解材料；和
b. 三糖，所述三糖浸渍在所述不可溶解基材中。
2.权利要求1的基材，其中所述材料为纤维素。
3.权利要求2的基材，其中所述纤维素为纤维素纸。
4.权利要求3的基材，其中所述纤维素纸为多孔纤维素纸。
5.权利要求2的基材，其中所述纤维素为纤维素膜。
6.权利要求1的基材，其中所述材料为乙酸纤维素。
7.权利要求6的基材，其中所述乙酸纤维素为乙酸纤维素膜。
8.权利要求1的基材，其中所述材料为玻璃纤维。
9.权利要求1的基材，其中所述基材用三糖共价改性。
10.权利要求1的基材，其中所述三糖为松三糖、棉子糖、麦芽三酮糖(maltotriulose)、异麦芽三糖、黑曲霉三糖、麦芽三糖，或其组合。
11.权利要求10的基材，其中所述三糖为松三糖。
12.权利要求1的基材，其中所述材料为纤维素且所述三糖为松三糖。
13.权利要求1的基材，其中所述材料为纤维素纸且所述三糖为松三糖。
14.权利要求1的基材，其中所述材料为多孔纤维素纸且所述三糖为松三糖。
15.一种用于从样品提取并稳定生物分子的方法，所述方法包括：
a. 使包含生物分子的样品与权利要求1-14中任一项的基材接触；和
b. 将包含所述生物分子的样品在所述固体基材上干燥至水含量低于2%。
16.权利要求15的方法，其中所述接触包括使用移液管、导管(catheter)、注射器或导管(conduit)将样品施用于基材上。
17.权利要求15的方法，其中所述接触包括将样品倒在基材上。
18.权利要求15的方法，其中所述样品包括生物样品。
19.权利要求16的方法，其中所述生物样品包括血液、血清、组织或唾液。
20.权利要求19的方法，其中所述生物样品包括血液。
21.权利要求15的方法，其中所述样品包括组织培养细胞或纯化的蛋白。
22.权利要求15的方法，其中所述生物分子包括蛋白、肽或氨基酸。
23.权利要求22的方法，其中所述生物分子包括蛋白。
24.权利要求23的方法，其中所述蛋白包括合成蛋白、突变蛋白、融合蛋白或嵌合蛋白。
25.权利要求22的方法，其中所述蛋白、肽或氨基酸来自细菌来源。
26.权利要求22的方法，其中所述蛋白、肽或氨基酸来自动物来源。
27.权利要求22的方法，其中所述蛋白、肽或氨基酸来自人来源。
28.权利要求15的方法，其中所述生物分子包括在细胞中天然合成的蛋白或肽。
29.权利要求15的方法，其中所述生物分子包括化学合成的蛋白或肽。
30.权利要求15的方法，其中所述生物分子包括从细胞或组织切片中分离的重组蛋白。
31.权利要求15的方法，其中所述生物分子包括从细胞或组织切片中分离的肽。
32.权利要求15的方法，其中所述生物分子包括后转译修饰的蛋白或肽。
33.权利要求15的方法，其中所述生物分子包括酶或抗体。
34.权利要求15的方法，其中所述干燥包括风干。
35.权利要求15的方法，其中所述干燥包括真空干燥。
36.权利要求15的方法，还包括将所述干燥的样品在所述基材上储存数周。
37.权利要求15的方法，还包括将所述干燥的样品在所述基材上储存超过6个月。
38.权利要求15的方法，其中在所述基材上的干燥的样品在室温下储存。
39.权利要求15的方法，其中在所述基材上的干燥的样品在0℃至60℃范围的温度下存储。
40.权利要求15的方法，还包括从在所述基材上的干燥的样品中洗脱生物分子。
41.权利要求40的方法，其中所述生物分子通过在洗脱缓冲液中再水合所述基材从所述基材洗脱。
42.权利要求40的方法，其中70至90%的生物分子从所述基材回收。
43.权利要求40的方法，其中所述生物分子以完整形式洗脱。
44.权利要求15的方法，还包括使包含所述生物分子的基材在水溶液、缓冲液或有机溶液中再水合。
45.权利要求15的方法，其中通过电洗脱、电泳或用洗脱缓冲液洗涤从所述基材中回收所述生物分子。
46.权利要求15的方法，还包括洗涤包含所述生物分子的基材。
47.权利要求46的方法，其中所述基材用缓冲液或水洗涤。
48.权利要求15的方法，还包括从所述样品提取所述生物分子。
49.权利要求46的方法，其中所述提取包括通过细胞裂解从细胞释放蛋白。
50.权利要求49的方法，其中所述细胞裂解为蒸发性细胞裂解。
51.权利要求15的方法，其中所述方法在无菌条件下进行。
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