CN102803483A - 用于微流体装置中taq 聚合酶的干燥储存的可再水合基质 - Google Patents
用于微流体装置中taq 聚合酶的干燥储存的可再水合基质 Download PDFInfo
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Abstract
记载了用于PCR反应剂的干燥储存的剂型。这些剂型可用于制造用于PCR临床测试的独立微流体卡盒装置,在测试时重构反应剂。在这些卡片中,TAQ聚合酶以玻璃化的干燥形式“车载”存储,而不需要冻干或冷冻,并且在测定法中通过样品或样品稀释液进行重构。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月12日提交的美国临时专利申请号61/186,441的根据35U.S.C.§119(e)的权益,该申请以其全文并入本文作为参考。
发明背景
发明领域
本发明一般涉及具有用于PCR的车载(on-board)TAQ聚合酶的微流体卡盒(microfluidic cartridge)中的分子诊断性测定法领域,其中TAQ聚合酶通过不经冻干的脱水得以稳定化,本发明还涉及制造具有该车载反应剂的微流体卡盒的方法。
相关技术描述
已知脱水保持冰点(freezing)之上存储期间的酶功能,但是此项技术是高度不可预测,并且所述方法和组合物必须针对所研究的每种反应剂而变动——没有具体的成功预期。在PCR中所使用的嗜热生物体的DNA聚合酶——由于其首次发现于水生栖热菌(Thermusaquaticus)中而通常称为“TAQ聚合酶”——在这方面尤其有难度。尽管如此,开发在微流体装置中在室温下具有商业有效保质期的PCR产品依赖于该问题的解决。
TAQ具有5’-3’的聚合酶以及外切核酸酶活性,却没有其他聚合酶的3’-5’的校对(proofreading)能力。然而,该酶结构是与其他DNA聚合酶共有的,并且包含对生拇指内收(opposable thumb-palm)结构域,其被与DNA模板结合相关的深裂口所分开。与热稳定性相关的特征包括Arg对Lys、Glu对Asp、Ala对Gly、Thr对Ser的比例升高以及不合半胱氨酸。在升高的温度下的折叠通过疏水作用、氢键、静电及范德华相互作用而维持。
酶是复杂折叠的纳米机器,具有与其催化功能及折叠相关的协作运动和灵活性。特定的结构性亚结构域在结构中相对固定,而其他亚结构域更具高流动性和动态性。理想的是,这种天然状态在通过脱水的储存期间得到保持,但是脱水最经常地导致一定水平的折叠去稳定。酶的去折叠会导致变性和活性丧失;脱水(或冷冻)之后产生的结构变化可严重到在再水合之后不会发生重新折叠成为活性“天然状态”形式。
已经牢牢确立了水在酶结构中的作用。蛋白质的水合程度可由“Dh”表示,其中Dh≌0.4(g H2O/g蛋白质)表示蛋白质周围有完全水合外壳或单层水。水合的中间水平也是已知的。在Dh≌0.15-0.2时,水仅仅足以与更高极性和离子化的表面结合,而酶活性丧失。最极端的冻干过程导致Dh≌0.02。在没有水的电介质屏蔽(dielectricshielding)时,静电相互作用可导致变性。水通过水合外壳中氢键连续的断裂和重建(导致疏水和亲水相互作用),以及通过由肽间和侧链相互作用引导二级和四级结构如α-螺旋和β-折叠基序而控制了蛋白质结构。作为溶剂,水的液晶态、氢键合能力润滑或“弹性化”了酶的结构性结构域的运动。
无定形固体优选地用于反应剂的“干燥”储存,因为再水合过程比用于相对应晶体状态更迅速。理想的是,蛋白质稳定化于固体的、非吸湿性的玻璃样(glassy)基质中,当以过量的水再水合时,其发生受控的失透作用(devitrification)。此优选状态与通过过冷液体而形成的玻璃样状态有很多共同点。类似地,可在温度Td(动态转化温度(dynamical transition temperature))或以下将蛋白质结构域以无定形“玻璃样”或凝胶样状态进行冷冻,此温度类似于形成小分子和聚合物中玻璃样状态的Tg(玻璃转化温度)。在Td以下,蛋白质去折叠受到有效的抑制。类似地,脱水到临界水平可与蛋白质去折叠的抑制相关:尽管室温下可用的热能足以使蛋白质变性,但是在Dh<0.2时水合外壳碎片化,并且没有足够的水分子以执行与蛋白质结构域的去折叠相关的氢键的重排。
尤其感兴趣的是蛋白质在由冻干保护剂(lyoprotectant)(其为在干燥储存过程中保护蛋白质不发生变性的分子)组成的玻璃(glass)内的脱水。冻干保护剂的活性最好地可由“水置换模型”解释,其中认为冻干保护剂通过氢键和疏水键与蛋白质直接相互作用,这以某种方式抵消了移除水造成的变性效应。例如,认为甘油在蛋白质水合外壳中置换了水并有效地弹性化了以可再水合形式的脱水蛋白质,尽管其中没有产生水的构象不稳定性。
因此,可使用普通的框架来考虑通过用玻璃形成分子(glass-forming molecule)冷却紧密混合物中的蛋白质而形成的无定形玻璃样状态以及通过脱水所述混合物而形成的无定形玻璃样状态。在所述两种情况下的固体产物都由具有不同程度的天然状态的蛋白质构象异构体组成,所述蛋白质构象异构体经“溶剂化”并分子上地分散于无定形玻璃如糖中。例如,已经发现蛋白质和糖混合物在热测量学上具有糖的Tg和蛋白质的Td之间的总Tg中间值,该值与混合物的组成成比例。类似地,蛋白质的Td可通过蛋白质与合适的冻干保护剂的紧密结合而进行调节,尽管机制并未完全理解。因此,人们相信去水的蛋白质的构象会以某种方式缀合于玻璃的分子结构。
通常地,候选的冻干保护剂包括多羟化合物(PHC),具体而言为多种糖类(包括单糖、双糖、三糖和寡糖)、糖醇,以及多种多羟小分子和聚合物。乳糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、肌醇、苏糖醇、山梨醇(葡糖醇)以及甘油为糖醇的实例。非还原性糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、水苏糖、龙胆三糖、松三糖和蜜三糖。是冻干保护剂的糖衍生物包括甲基葡萄糖苷和2’-脱氧葡萄糖,等等。糖酸包括L-葡糖酸盐及其金属盐。对大多数应用不那么优选的包括还原性糖如果糖、芹菜糖、甘露糖、麦芽糖、异麦芽酮糖、乳糖、乳酮糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、洋地黄毒素糖、岩藻糖(fucose)、槲皮醇、阿洛糖、阿卓糖、樱草糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、甘油醛、阿洛糖、芹菜糖、阿卓糖、塔格糖、松二糖、槐糖、麦芽三糖、甘露三糖、芸香糖、海葱二糖、纤维二糖、龙胆二糖以及葡萄糖。还可用的为聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、果胶、纤维素、衍生的纤维素(如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素以及羟丙甲基纤维素)、羟乙基淀粉、可溶性淀粉、葡聚糖、高分支高质量亲水的多糖如也已经发现玻璃形成白蛋白、明胶和氨基酸挥是可用的。经过试错法,也已经发现可用的上述物质的混合物,这通常对于各个靶标蛋白有所不同。
也已知成功形成玻璃对冷却速度、浓度、压力和其他加工过程参数如晶种的存在与否是敏感的。要记住的是玻璃为亚稳定状态。这些复杂系统的难点通过出自WO 1996/033744的以下实施例得到举例说明,其中报道在其Tg为40℃以上生产出一种无定形固体冻干组合物,其是95%的乳糖中含降钙素2%并具有2%的残留水,导致乳糖的爆发性结晶以及由60%水和40%蛋白质组成的结晶水的形成,并被排除出晶体相。溶液相的玻璃化温度低于冰点,并且因此在室温下蛋白质非常迅速丧失生物学活性。类似的酶失活在使用结晶的蔗糖时注意到(Schebor C等人,2008,Glassy state and thermal inactivation ofinvertase and lactase in dried amorphous matrices.Biotech Progress13:857-863)。
如已过期美国专利号4891319中所公开的,Rosen发现了具有比乳糖或蔗糖更高的Tg的海藻糖在蛋白质室温干燥时具有冻干保护性,避免使用冷冻干燥和喷雾干燥的激烈条件,且据报道荧光标记物也可以此方式脱水。Rosen提出糖∶淀粉比例为1.4∶1至10∶1。海藻糖被认为起干燥骨架的作用,在将水移除时维持高分子的结构完整性。这些发现在其他地方也有进一步扩展(Colaco C等人,1992,Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose:simplifiedmolecular biology,Bio/Technology 10:1007-11),并且在美国专利号5955448中报道只要剂型还包括美拉德反应(Maillard browningreaction)的抑制剂便可采用多种碳水化合物,包括乳糖或蔗糖。相关的观察已经由Franks(美国专利号5098893)以及Wettlaufer(美国专利号5200399)所报道,其还评论了在玻璃化的生物学物质活性丧失中氧气、光以及化学反应的重要性。
有人提出将蔗糖、山梨醇、松三糖和蜜三糖作为优选的冻干保护剂。然而,据我们所知,未报道有使用海藻糖或任何其他糖在不经冻干而稳定化干燥TAQ用于延长的储存稳定期的成功案例。相反的,在Madejón(图1-来源:美国专利申请号10/292848文档夹)的声明中显示海藻糖以干燥反应剂形式在4℃下储存一周的至多有部分保护性,并且在37℃下一周后不如不加冻干保护剂的标准PCR混合物具有保护性。Madejón进一步显示松三糖本身根本不具保护性。参考凝胶,在4℃下反应物储存后跑1-9泳道;在37℃下储存后跑10-18泳道(“M”-松三糖,“L”-赖氨酸,“G”-糖原,“T”-海藻糖,“S”-不含冻干保护剂的标准混合物)。
已经有报道认为海藻糖是不寻常的,因为添加少量的水不会像在其他糖中那样压低Tg值(Crowe JH等人,1998,The role ofvitrification in anhydrobiosis.Ann Rev Physiol 60:73-103)。相反,形成海藻糖的二水晶体,由此保护剩余的玻璃样海藻糖不受所添加水的影响。然而Franks在美国专利号6071428中显示此效应并不显著,且五水蜜二糖对于储存干燥状态的酶也可用。据报道此五水晶体与周围无水材料的玻璃样状态共存。这些碳水化合物通常不与会有助于变性的结晶或爆发结晶(irruptive crystallization)的水的形式结合。
Arieli在WO 2007/137291中提出通过在冰点以上进行干燥,一般在55℃干燥1-3hr,用稳定化试剂如蔗糖、海藻糖、松二糖、糖醇和还原性糖与BSA组合而稳定化TAQ。本申请的附图显示了TAQ在过夜或短期储存后的活性。然而,并没有提到在干燥过程中达到的水合度(Dh),并且如已知的,TAQ在水溶液中在室温下过夜后保留完全的活性(图2-来源:Marenco A等人,2004,Fluorescent-basedgenetic analysis for a microfluidics device,Defence R&D CanadaContract W7702-00-R849/001/EDM Final Report),对于更长时间推测也是一样。因此,并不清楚所达到的水合和玻璃样状态是否足以用于在数月数年的长期储存。Rosado已经提出TAQ在完全水合的“凝胶化”形式中得到最好的稳定化,然而属于Rosado的美国专利申请2003/0119042中的数据说明只能达到有限持续时间的稳定性,可能为数天或数周。
例如,在美国专利号6127155中已经报道了对TAQ的冷冻商业化剂型的开发。然而,冷冻储存要求专门的设备,这些设备一般在微流体卡片使用的照护点(point-of-care)设施处是不可使用的。还要注意的是,多个的研究者已经报道了成功的冻干TAQ制备物。这些包括Walker(美国专利号5565318),Treml(美国专利号5763157)以及Park等人(美国专利号5861251和6153412)。Park描述了在葡萄糖、山梨醇、蔗糖或存在下对TAQ的冻干。Klatser PR等人描述了一种冻干的PCR混合物,其使用海藻糖作为低温保护剂,并使用了Triton X-100。Klatser发现在制备后多至一年时再水合,TAQ的冻干混合物仍具TAQ活性。包含TAQ和赋形剂的商业可用的冻干珠子或冷冻基质也已经可得(Ready-to-Go PCR珠,AmershamBiosciences;SprintTM Clontech,Mt View CA)。一旦冻干,这些产品就具有吸湿性并对湿度敏感,必须立即密封。显然,这些产品还必须在用超纯水进行再水合加工过程期间置于冰上以及随后的在使用之前处于冷冻状态,这样使得其在下一代有车载反应剂的微流体装置中的使用如果不是不可能也是困难的。
相反,下一代微流体装置经配置使得不可能在反应剂的再水合期间使用冰或纯净水。装置反应剂一般是通过样品或从样品制备的稀释液进行再水合的,例如通过Boom的方法(美国专利号5234809)。因此,本领域仍然需要这样的方法,使得实现PCR反应剂混合物组成中的DNA聚合酶的环境稳定化(ambient stabilization),其中不涉及冻干并随时间保持足够的可靠性足以在微流体卡片中进行敏感性诊断测定法的商业化。
因此,迄今为止的公开都没有明显地提出适合于不经冻干或冷冻的TAQ聚合酶的稳定干燥储存的剂型。用于诊断性应用的微流体装置的商业化越来越接近完成,更迫切地需要对此问题有可行的解决方案。
发明简述
已经证明在微流体卡片上的TAQ聚合酶的室温干燥储存是十分困难的。通常将反应剂印记在卡片的微流体通道中,并随后不经过会破坏卡片装置的制造的冷冻或冻干而在位置进行干燥。我们推理对于在高温环境下的活性而言合适的酶很可能具有高的Td值,如许多TAQ聚合酶的Vmax为75℃左右就是证明,并且为了最好地保持其天然状态,应当将其以玻璃化状态与具有相对高Tg的玻璃相缀合。我们还认识到可能需要其他赋形剂如表面活性剂以在干燥储存期间稳定化TAQ的高度折叠的结构,尤其在微流体装置中,因为反应剂材料优选地印记在低表面活性的表面上,如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET),并且在干燥和再水合期间进行界面吸附和变性。一旦反应剂印记在位置上,就通过层压或超声焊接进一步加工微流体装置,使得冻干变得困难或者不可能进行。
在受控室温下干燥一段时间之后,所述方法依赖于在密封的防潮袋中使用凝胶干燥剂以完成酶的玻璃化。因此在脱水过程中酶会经历几周时间的部分脱水状态。尽管不受理论的制约,我们认为延长的连续时间-脱水曲线对酶在糖或多醇逐渐置换水作为氢键供体的过程中以天然状态进行稳定化是至关重要的。惊奇的是,我们发现TAQ活性实际上在此干燥加工过程中急速增加,比较在此期间湿储备TAQ混合物的起始活性。尽管不受任何具体理论的制约,我们将此解释为通过以部分水合状态进行重折叠的过程,在冷冻储备物中构象异构体的潜在活性得到回复,这更接近地类似于以摩尔渗透压浓度(osmolarity)的细胞内溶胶。在此过程中,该材料由凝胶发展为复合的凝胶样玻璃,发展出由于松三糖(一种优选的冻干保护性糖)的高Tg值性质而超过室温的Tg。据发现高分子量聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白(BSA)或可选地,选定的含氟表面活性剂有助于此过程。
用于印记和稳定化TAQ聚合物的方法,所述TAQ聚合酶作为凝胶样玻璃在水的冰点温度之上存储在微流体装置上,所述方法不使用冻干,并包括以下步骤:
a)组合TAQ聚合酶与水性溶液,所述水性溶液包含如下组分:约1.0%-10%w/v的三糖或三糖水合物;任选地约0.001%-0.1%w/v的高分子量聚乙二醇;任选地约0.001%-0.3%的含氟表面活性剂;约0.1%-10%的载体蛋白质;以及兼容的缓冲液,从而形成可印记的TAQ溶液;
b)将可印记TAQ溶液的液滴置于所述微流体卡片的塑料表面上,所述可印记TAQ溶液的液滴包含有效聚合核酸的一定量的TAQ聚合酶;
c)在受控的室温或大约20℃下简单干燥液滴以形成在表面上的凝胶点;并且
d)然后在干燥气氛下用干燥剂将表面上的凝胶点封闭并密封在气密性袋子中,所述干燥剂在储存期间进一步玻璃化凝胶点。
有利地,冻干和冷冻储存条件不是必需的。尽管不受其限制,所述方法用于制造用于诊断性核酸测定法的微流体装置和试剂盒。
附图简述
本发明的所教导的内容可通过参考下文详述的说明书结合所附的图和权利要求更好地理解,其中:
图1是展示了多种脱水反应混合物中的PCR扩增产物的凝胶的复制。该图复制于A Madejón(图1,上部图组)的声明,来源于美国专利申请号10/292848的文档夹中的记录。
图2是展示了TAQ反应剂溶液储存过夜后的PCR扩增产物的凝胶的复制。
图3为柱状图,比较干燥储存两个月后的TAQ剂型。
图4为rtPCR曲线,显示了再水合后的干燥混合物相比湿反应混合物(未干燥)中的TAQ活性。
图5为柱状图,显示在室温下TAQ活力在商业化供应的储备物中在松三糖玻璃中的连续玻璃化期间的增加。
图6为柱状图,显示在含有选定赋形剂的松三糖相比海藻糖中进行玻璃化储存后的TAQ活力。
图7显示在含有赋形剂含氟表面活性剂FC-4430(3M Corp)的玻璃化储存后的TAQ活力。
发明详述
发明者意欲在本文中为特定意义进行限定,即,其为固有的意义。本文使用的其他词语和短语的意义与相关领域技术人员所清楚的用法相一致。当引用的文献通过参考并入时,若参考文献中任何词语的意义或定义抵触或约束本文所使用的意义,则认为其为所述参考文献的特有风格而不会取代本文公开中所使用的词语意义。
定义
冻干保护剂:保护蛋白质、引物或探针,例如TAQ聚合酶在干燥储存期间不发生变性或丧失生物学活性的分子。许多冻干保护剂为多醇,但这类物质还可包括氨基酸、肽、蛋白质以及PHC、糖、聚乙烯基吡咯烷酮、PEG,等等。应当理解的是此定义还包括联合冻干保护剂(co-lyoprotectant),其中在混合物中使用了第一种物质以及第二种与第一种具有协同保护效应的物质。
“Tg”为玻璃转化温度,高于此温度时无定形玻璃样材料的粘稠度迅速下降,从凝胶发展为可变形的塑料(plastic)再变为液体,相反地,低于此温度则变为无定形非晶体固体形式。人们认为40℃或更高的Tg会确保室温下反应剂的稳定性,但是这对于TAQ聚合酶还是未知的。一般地Tg是使用差示扫描量热法(DSC)确定的,并且可定义为作为转化的起始、中点或末点。技术细节在Jan P.Wolanczyk,1989,Cryo-Letters,10,73-76(1989)的“Differential ScanningCalorimetry Analysis of Glass Transitions”以及Gibbs JH和EADiMarzio,1958,Nature of the Glass Transition and the Glassy State,J.Chemical Physics 28:373-393中提供。用于此方法的玻璃通常并非形成于纯的玻璃前体,而相反地形成于冻干保护剂和联合冻干保护剂、联合溶剂、联合表面活性剂或所添加的赋形剂形成的混合物,因此称为“复合玻璃”。这些复合玻璃可具有中间玻璃和“凝胶样”特性,其水合值范围为约0.01≤Dh≤-0.4,更优选的为0.022≤Dh≤0.2。复合材料的Tg一般取决于单个组分的Tg值(Franks,F,1994,Long termstabilization of biologicals,Bio/Technology 12:253-56)。优选的Tg超过预期储存温度20度以上。
“储存稳定期”指的是一段时间,例如“保质期”,其中干燥反应剂混合物在受控条件下储存于微流体卡片中同时保留生物学活性。如果生物学活性材料的生物学活性在进行PCR扩增时任何给定的时间都有效,则TAQ聚合酶在反应剂复合物中“保留其生物学活性”。优选的组合物具有超过6个月的保质期。
探针:“探针”为能够在室温下以足够的互补性通过互补碱基配对结合至靶标核酸以形成稳定的双螺旋的核酸。探针可以加标签。可连接至探针的合适标签包括但不限于,放射性同位素、荧光素、发色团、质量标签(mass label)、电子致密颗粒(electron dense particle)、磁性颗粒、自旋标签、发射化学光的分子、电化学活性分子、酶、辅助因子以及酶底物。荧光探针包括插入型探针,如Cyber(Molecular Probes)、溴化乙锭或噻唑橙、FRET探针、探针(Roche Molecular Systems)、分子信标探针、Black HoleQuencherTM(Biosearch Technologies)、探针(Nanogen)、ScorpionsTM(DxS Ltd)探针、LUXTM引物-探针(Invitrogen)、SunriseTM探针(Oncor)、MGB-Pleiades(Nanogen),等等。探针技术由例如Lukhtanov EA等人在2007,Novel DNAProbes with low background and high hybridization-triggeredfluorescence,Nucl Acids Res 35:e30中综述。
“引物”:是单链多聚核苷酸或缀合的多聚核苷酸,其能够在存在合适的聚合酶和辅助因子的情况下作为用于模板指导的DNA合成的起始点。引物通常是至少7个核苷酸长,并且通常的长度范围是10-30个核苷酸。术语“引物对”是指包括与DNA模板的5’末端的互补序列杂交的5’“正向”或“上游”引物和与DNA模板的3’末端杂交的3’“反向”或“下游”引物的引物组.
用于PCR的微流体装置的设计及操作
在微流体装置中的PCR由于对于装置典型的高的表面积对体积比而具有挑战性。几微升样品的反应体积是典型的,且通道和腔室的维度一般在宽度上小于500微米,在深度上可能为该数值的10-20%。本发明的微流体装置为小型化学反应器,优选地大量生产自具有包含预印记的测定法反应剂的微型通道和腔室的塑料。
在一个优选的实施方式中,进行诊断性测定法所要求的所有反应剂预先置于装置之内,这样装置就是用于进行核酸诊断性测定法的独立可丢弃设备。可选地,所述装置还包含车载稀释剂、洗涤溶液以及体积足以包含所有测定法中产生的液体废物的废物收集器。
适合于本发明的实践的微流体卡片的设计和特征的详述公开于例如美国专利申请12/207627,“Integrated Nucleic Acid Assays”;11/562611“Microfluidic Mixing and Analytical Apparatus”;12/203715“System and Method for Diagnosis of Infectious Diseases”以及10/862826“System and Method for Heating,Cooling and Heat Cyclingon Microfluidic Device”,所有这些申请都共转让给本申请人。这些技术是Zhang的近期的综述的主题(2007,Miniaturized PCR chips fornucleic acid amplification and analysis:latest advances and futuretrends.Nucl Acids Res 35:4223-37)。
如本领域已知的,微流体PCR可在四种构造的PCR热循环反应器中进行:a)蛇形,b)环形,c)往复型,d)具有定位加热冷却的单腔室型。蛇形反应器包括加长的通道,这些通道来回循环于两或三个温度区域之间,环形反应器为穿过两或三个温度区域的单回路,往复型反应器包含两或三个不同温度的腔室,每个腔室相互连接以交换反应混合物,基于单室的反应器则含有反应混合物并有定位加热和冷却的供应,如通过帕尔贴热电子设备。蛇形、环形和往复型反应器都需要一个泵或数个泵使得反应混合物穿过或在温度区域之间进行循环。微流体装置的结构也是不同,以反映出这些不同构造。
测定法可包括末点或动态(也称为“实时”)检测。当使用了指示型反应剂如探针时,可在扩增期间或扩增后将其加入。优选的为荧光、荧光淬灭以及“升频转换(up-converting)”荧光探针,这些都在本领域已知。
在一个优选的实施方式中,将含有核酸的生物学样品吸取到微流体卡片的入口,该入口随后在测定法的余下操作中被密封。使用气动控制器按需要引导样品和液体反应剂而完成测定法。在第一个步骤中,样品的核酸可选地在固相基质中提取并在与含有引物的干燥的PCR反应剂接触前在PCR缓冲液中再水合。含有TAQ聚合酶的干燥反应剂是分开提供的。然后在卡片上进行热循环,并且通过多种方法进行扩增子的阳性检测,包括使用在微流体装置上提供的荧光探针。
由于水和塑料之间的表面张力,有时候会将表面活性剂和联合表面活性剂如PEG或白蛋白用于减少微流体装置的塑料表面对生物学品的吸附。已知的用于减少吸附性损失的表面活性试剂包括Tween-20、Triton X-100、Nonidet P40、PEG-8000和牛血清白蛋白。还认为这些物质减少TAQ聚合酶的聚集,并频繁用于增加聚合酶活性。通常地,dNTP、镁盐、氯化钾、氯化钠、缓冲液、探针类、可选的引物、以及非特异性湿润试剂或表面活性剂可选地组合在“主要混合物(master-mix)”中,所述主要混合物等量分配于并干燥于独立的微流体装置上。
在制造有车载反应剂的微流体装置的过程中,含有玻璃、赋形剂和生物学反应剂的溶液一般使用多种自动化液滴分配器设备印记在微流体装置的通道或腔室中。然后将覆盖层或盖子置于装置上并将装置密封。在装配和检查后,将完成的微流体装置插入箔衬袋(foil bag)。每个装置的袋子中都放有干燥剂。可用的干燥剂的实例包括硅胶、皂土、硼砂、高氯酸镁、氧化钡、活性氧化铝、无水氯化钙、无水硫酸钙、硅酸钛、无水氧化钙以及无水氧化镁、硫酸镁,和等等,可以加入或不加指示剂。然后用热压封口机将这些袋子密封,并储存以所标示的保质期。
详述
为了在制造具有车载反应剂的微流体装置后数月扩增靶标核酸序列,必须在储存期间保持有效水平的TAQ活性。可通过将装置包装在有干燥剂的密封箔衬袋中改变室温储存的条件,从而防止了湿度的波动。在将具有玻璃冻干保护剂前体和赋形剂的缓冲混合物中的TAQ反应剂点样于装置上之后,在达到完全干燥之前将装置密封在袋中。在此阶段,这些点在稠度上是凝胶样的。在密封于袋中之后,通过结合水从反应剂点到干燥剂的转移,玻璃化继续进行。通过选择兼容性的玻璃/赋形剂组合物,此方法产生出装配在独立微流体装置中的储存稳定性TAQ,该装置只需要加入样品就可以运行测定法。
在研究了糖、联合冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂和载体蛋白质的数百种组合后,选择海藻糖和松三糖进行进一步研究。我们推论就活性而言适用于高温环境的酶可能具有高的Td,如许多TAQ聚合酶的Vmax在75℃左右就是证明,并且为了最好地保持天然状态,其应当以玻璃态化的状态与具有相对高的Tg的玻璃相缀合。我们还认识到可能需要其他赋形剂如表面活性剂以在干燥储存过程中稳定化TAQ的高度折叠结构并防止界面变性所造成的活性丧失。
海藻糖为由两个葡萄糖分子组成的二糖,这两个分子通过α,α-1,1键相连。由于葡萄糖残基的还原性末端相互连接,海藻糖没有还原能力。海藻糖广泛分布于自然界中并保护生物体应对多种压力,如干燥、冷冻以及渗透压。脱水生活(anhydrobiotic)生物体如卤虫(brineshrimp)和特定的线虫,其抗干燥,由于其高的海藻糖含量能够耐受水缺乏;海藻糖在极端环境条件下稳定化膜和其他高分子装配物中起到关键作用。海藻糖相对于其他二糖还具有更高的玻璃转化温度,并且有在干燥产品中作为稳定剂的很长的历史(见例如Crowe JH等人,1984,Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms therole of trehalose,Science 223:701-703;美国专利号4457916、4206200和4762857,以及英国专利GB 2009198),因此认为其优于蔗糖。广泛认为海藻糖比所有其他冻干保护剂优越(Colaco C等人,1992,Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose:simplifiedmolecular biology,Bio/Technology 10:1007-11)。
松三糖(α-D-吡喃葡萄糖基-[1→3]-β-D-呋喃果糖基-[2→1]-α-D-吡喃葡萄糖苷)水合物为由2个葡萄糖分子和1个果糖分子组成的三糖,干燥状态下的分子量为504.44Da。其由许多食用植物液汁的昆虫包括蚜虫和粉虱产生。松三糖对这些昆虫有益,是因为其作为储备碳水化合物通过减少细胞内水势能而减少渗透应力。还广为人知的是其起到冷冻保护剂的功能并由于其低的摩尔渗透压浓度而用于广泛多种哺乳动物细胞的冷冻储存。水解作用释放葡萄糖和松二糖,但是这种三糖本身是非还原性的并相对耐受美拉德反应。松三糖的玻璃转化温度比二糖要高。
下文表I中显示了Tg的比较值:
表I
松三糖的Tg值获自“Mollmann,SH等人,2006,The stability ofinsulin in solid formulations containing melezitose and starch。DrugDev Indust Pharmacy 32:765-778。其他值获自Green JL和CA Angell,1989,Phase relations and vitrification in saccharide-water solutionsand the trehalose anomaly,J Phys Chem 93:2880-82;Kajiwara K和FFranks,1997,Crystalline and amorphous phases in the binary systemwater-raffinose,J Chem Soc Faraday Trans 93:1779-1783;Slade L和H Levine.1988.Non-equilibrium behavior of smallcarbohydrate-water systems,Pure&Appl Chem 60:1841-64;以及Heldman DR和DB Lund,2006,Handbook of Food Engineering(2nded)CRC Press,Boca Raton FL。并非所有来源的数据都完全一致;然而,通常认为Tg随着分子量而增加并随着水合水而减少。
以水合糖开始确保了Tg一开始较低且剂型为液体,但是在干燥时,Tg会增加并达到一个值使得室温储存为无定形玻璃的形式。在这个过程中,要求无水糖的结晶过程不发生。共溶剂赋形剂用于防止不想要的结晶并更具选择性地与TAQ聚合酶结合,这一点是通过试错法的过程而确定的。
剂型1由(以水中终浓度计)1.5%的松三糖水合物、0.005%的PolyoxTM WSR-301(Amerchol Corp,Piscataway NY)、0.1mg/mL的BSA以及10单位TAQ聚合酶的水性溶液组成。在制备具有稳定剂的TAQ溶液储备物之后,清澈的凝胶前体溶液以3uL点加到塑料微流体装置或卡片的内部表面。引物和探针是分开储存的。让这些点在受控的室温下干燥大约10分钟或更短,然后将塑料装置密封于有干燥剂小袋的气密性袋子中并储存于受控室温下。Polyox WSR-301是一种长链聚氧乙二醇(4MDa分子量,也叫做“PEG-90M”)。所有剂型都使用分子生物学级的水。牛血清白蛋白是一种优选的蛋白质载体,而鱼明胶也可用于此方法。还可使用甜菜碱或赖氨酸。
制备下文的剂型用于两个月稳定性研究中的并排比较:剂型2的复合成分为1.5%海藻糖、0.005%Polyox WSR-301、0.1mg/mL BSA以及10单位TAQ聚合酶。剂型3含有1.5%松三糖水合物、0.1%400、0.1mg/mL BSA。剂型4含有1.5%海藻糖、0.1%含氟表面活性剂FC4430(3M Corp)以及0.1mg/mL BSA。剂型5含有1.5%海藻糖、0.1%PEG8000以及0.1mg/mL BSA。剂型6含有1.5%海藻糖、0.1%纤维素树胶7LF以及0.1mg/mL BSA。剂型7含有1.5%乳糖醇、0.005%Polyox WSR-301以及0.1mg/mL BSA。这些实验中使用的TAQ为Plus(Lucigen Corp,Middleton WI),配制成10U/uL。
所有的剂型都与标准量的TAQ聚合酶混合并点样于塑料表面用于测试。在点样后,让凝胶复合物前体点简单放置大约10分钟,然后封闭并将其和过量的干燥剂一同密封于防潮的气密性袋子中。一般地,使用带有指示剂的硅胶或皂土。这些袋子在干燥、惰性气氛中进行热密封。
剂型还包括其选自甜菜碱、n-甲酰吗啉、δ-戊内酰胺(2-哌啶酮)、ε-己内酰胺、1,2-环戊二醇、PVP-10、PVP-40或其混合物的玻璃兼容性PCR增强剂;选自菊粉、纤维素、衍生的纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、赖氨酸、精氨酸或美拉德反应抑制剂的赋形剂。增强剂有多重功能,包括提高富含GC的DNA底物作为模板时的效果并增加特异性和产量。已知多种酰胺、亚砜、砜及二醇提高PCR产量及特异性,常常比甜菜碱明显更好。DMSO、四亚甲基亚砜、甲酰胺、2-吡咯烷酮都是实例。一些增强剂,如n,n-二甲基甲酰胺和DMSO已经用于降低热循环所需的温度,而在盐溶液中可能需要将溶液加热到近沸腾,还有附随的压力及除气问题。然而,本文需要可以以干燥形式如以凝胶或玻璃复合物形式储存的增强剂。
增强剂包括可用作联合冻干保护剂的玻璃形成体。这些增强剂包括n-甲酰吗啉(熔点23℃)、δ-戊内酰胺(2-哌啶酮,熔点38-40℃)、ε-己内酰胺(熔点69-70℃)以及1,2-环戊二醇(熔点为54-56℃)。据报道PVP-10的玻璃转化温度为66℃而PVP-40的Tg为99℃。其他有提高PCR的功能的玻璃形成体包括氨基酸如赖氨酸、低分子量酰胺、碳水合合物如糖原和菊粉、白蛋白(HSA和BSA),以及一系列如前文讨论的糖。
图3报道了2个月稳定性储存测试的数据。这些结果显示为相对于未干燥而进行的新鲜混合的“湿”扩增的活性而标准化得到的荧光比率。如可见的,大多数剂型无法保持完全的活力。然而,可见剂型1,基于松三糖/Polyox WSR-301/BSA凝胶的剂型,在室温储存2个月后以1.3倍的系数超过了标准的湿扩增混合物的效果。相反,用Ficoll 400制备的松三糖水合物在两个月后并未令人信服地具有稳定性,以Polyox WSR-301或多种备选赋形剂配制的海藻糖类似地也无法提供合适的储存稳定期。
在这些研究中,使用具有5000拷贝/反应的副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi)引物对用于扩增。再水合的完全扩增混合物进行热循环,并使用分子信标或FRET探针完成检测。对每个反应测量Ct及荧光输出比率。图4中显示了样品的实时PCR扩增曲线,对比了延长干燥储存后的松三糖剂型1与新鲜湿反应。实心曲线(41)为干燥的TAQ反应剂的活性,虚线曲线(42)为标准湿TAQ反应混合物的活性。
在图5中,将剂型1松三糖的表现作为储存稳定期的函数进行进一步检查。可见,在加工的起始期,TAQ聚合酶活性在4周的时期内稳步增加。再次地,荧光比率是实时PCR中达到的荧光的比率。我们认为此结果不是人为造成的;其可能表示从在含有制造和储存过程中损坏的TAQ酶分子的储备物中募集到天然状态构象异构体。尽管不受理论约束,认为商业可用的冷冻制备物包含一定百分比的冷冻变性的TAQ分子、构象异构体混合物,其中有一些是天然态构象而有一些不是,一些变体比其他活性更弱,并且稳定化步骤具有修复至少一些受损分子的构象状态的效应。
图6比较了在具有不同的引物系统的扩增中的三种剂型。比较了剂型6A、6B和6C,其中剂型6A等价于上文的剂型3,6B等价于上文的剂型1,6C等价于上文的剂型5。如可见的,在使用将凝胶点密封于有干燥剂的气密性袋子以实现酶的逐步、连续脱水的方法进行干燥储存后,含有松三糖1.5%/0.005%Polyox WSR301/0.1%BSA的剂型再次显示出优越性。
图7比较了含有海藻糖和0.1%PEG8000的剂型7A与含有海藻糖及0.1%含氟表面活性剂FC4430的剂型7B。惊奇的是,含氟表面活性剂对2周干燥储存数据中的荧光输出有显著的效应。
图6和7涉及疟疾引物系统的不对称扩增,其中正向和反向引物是10∶1比例,使用5000拷贝/反应的正向引物。在所有情况下,使用新鲜的冷冻反应剂平行进行反应。
实施例
实施例1.PCR标准反应
作为湿标准反应,根据表II,将储备的冷冻TAQ聚合酶加入新鲜制备的PCR反应剂储备物混合物中。
表II
使用Rotor Q(Qiagen Carlsbad CA)热循环仪对反应混合物进行热循环,并进行rtPCR监视。监视实时PCR以获得交叉阈值(crossing threshold,Ct);即,荧光(也就是DNA)增长为指数时的循环数及荧光输出(FSTD)的测量值。对所有成功的扩增运行熔解曲线以验证靶标扩增子的正确扩增。还可使用末点监测。可选地,可包括FRET熔解曲线以验证扩增子的性质。
实施例2.干燥反应剂测定法
将含有TAQ聚合酶、冻干保护剂、联合冻干保护剂以及蛋白质载体或赋形剂并有KCl、Mg2+、dNTP的反应混合物制备成约5x的储备物并以3uL的点点样于微流体卡片中或塑料表面上。让这些点在室温下凝胶化大约10min或更少,然后置于Vaporflex PreservationPackaging(LPS Industries,Moonachie,NJ)提供的箔衬袋中。重构时,使用体积15uL的含有靶标DNA和引物的样品。
松三糖、海藻糖、乳果糖和其他糖获自Sigma Chemicals(St LouisMO)。Polyol WRS301(也叫做“PEG 90M”,1%粘稠度1650-550cps,4MDa MW)由Amerchol Corp,Piscataway NY提供。含氟表面活性剂FC-4430获自3M Corp。如果可能,反应剂近可能为分子生物学级。
实施例3.剂型1
用于微流体装置中TAQ聚合酶的环境干燥储存的剂型根据表III进行制备。糖以松三糖水合物的25%水溶液加入。在此实施例中使用含有0.01%Polyol WRS301的储备物作为赋形剂。
表III
将所得的清澈的凝胶复合物前体溶液用移液管点样到微流体装置已钝化的塑料表面(PET)上。让这些点放置约10min然后密封于含干燥剂的箔衬袋中。使用发色指示剂验证密封袋在储存期间的完整性。这些袋子在储存前在干燥气体气氛下进行热密封。
尽管上文是本发明目前优选的实施方式的完全描述,然而有可能使用多种备选方案、改动以及等价方案。本说明书参考的、声明为优先权文件的和/或在任何信息数据页面列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、国外专利、国外专利申请及非专利出版物都以其全文并入本文作为参考。一般地,在下文的权利要求中,所使用的术语不应当解释为将权利要求限制到本说明书和权利要求中公开的具体实施方式,而应当解释为这些权利要求所赋予的所有可能的实施方式和等价方案的全范围。因此,这些权利要求并不受本公开的限制。
Claims (9)
1.用于不经冻干而稳定化TAQ聚合物的方法,所述TAQ聚合酶作为凝胶样玻璃在水的冰点温度之上印记和存储在微流体装置上,所述方法包括以下步骤:
a)组合所述TAQ聚合酶与水性溶液,所述水性溶液包含:
i)约1.0%-10%w/v的三糖;
ii)任选地约0.001%-0.1%w/v的高分子量聚乙二醇;
iii)任选地约0.001%-0.3%的含氟表面活性剂;
iv)约0.1%-10%的载体蛋白质;以及
v)兼容的缓冲液,从而形成可印记的TAQ溶液;
b)将所述可印记TAQ溶液的液滴置于表面上,所述可印记TAQ溶液的液滴包含有效聚合核酸的一定量的所述TAQ聚合酶;
c)在受控的室温或大约20℃下简单干燥所述液滴以形成在所述表面上的凝胶点;并且
d)然后在干燥气氛下用干燥剂将所述表面上的所述凝胶点封闭并密封在气密性袋子中,所述干燥剂在储存期间进一步玻璃化凝胶点。
2.权利要求1的方法,其中所述三糖是松三糖或蜜三糖。
3.权利要求1的方法,其中所述高分子量聚乙二醇是PEG90M。
4.权利要求1的方法,其中所述高分子量聚乙二醇的分子量是1-5MDa。
5.权利要求1的方法,其中所述载体蛋白质为牛血清白蛋白或鱼明胶。
6.权利要求1的方法,其中所述含氟表面活性剂为非离子氟烷表面活性剂。
7.权利要求6的方法,其中所述含氟表面活性剂为含氟表面活性剂FC-4430。
8.权利要求1的方法,其中所述水性溶液还包含PCR增强剂,其选自甜菜碱、n-甲酰吗啉、δ-戊内酰胺(2-哌啶酮)、ε-己内酰胺、1,2-环戊二醇、PVP-10、PVP-40或其混合物。
9.权利要求1的方法,其中所述水性溶液还包含菊粉、纤维素、衍生的纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、赖氨酸、精氨酸或美拉德反应抑制剂。
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