CN102181428A - 一种利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应扩增效果的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用异亮氨酸(L-isoleucine)提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法，涉及生物技术领域，该方法是在原有的PCR扩增方法基础上，通过向体系中添加一定量的异亮氨酸来实现的。本发明优化扩增的效果明显，操作简便，易于掌握。

Description

一种利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应扩增效果的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域的聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，尤其是异亮氨酸(L-isoleucine)提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)，又称体外酶促基因扩增，是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，该技术由K.Mullis于1985年发明，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间里就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现的基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。

在过去的20多年的时间里，PCR技术在不断进步和发展中逐渐成熟，形成了一整套完整的技术体系。常规PCR技术操作简便，成功率很高，因而其在遗传学、微生物学、乃至整个生命科学领域的研究中都得到了广泛应用。但是PCR技术仍存在着不可避免的缺点，如扩增的副反应多，扩增产物的产量少，保真度不高等。但对PCR反应影响最大的是扩增过程中的副反应的发生，这种情况轻则带来在PCR产物中出现少量非目的产物，电泳图上表现为明显的非目的带和少量拖尾现象的出现，重则带来大量的非目的产物出现，在电泳图上表现为干扰很严重的拖尾和大量的弥散，导致主带模糊或根本无主带，整个扩增失效。虽然近年来一个又一个功能强大的引物设计软件被开发出来，但高特异性引物只是提高PCR反应效率的一个方面，对反应体系及反应条件进行优化组合则是解决这一问题的主要方面。根据多年来各国科学家的研究成果我们发现，通过向PCR反应体系中添加一定量的添加剂可以在不同程度上减少或消除副反应的发生。这些添加剂包括DMSO，Betain，BSA，甘油，Tween-20，NP-40，甲酰胺等。但这些添加剂都有各自的局限性，在各种不同的情况下效果差异很大，给应用带来不便。因此开发更多更新的PCR反应优化剂是发展PCR技术过程中一项很重要的工作。

鉴于PCR反应本身是一种模拟体内DNA复制的体外扩增方法，因此在本发明的摸索过程中，试图从模拟细胞核内环境出发，寻找参与酿酒酵母细胞代谢的核内，并设计将这些核内以接近核内浓度的条件下添加入PCR反应体系中，以期获得更为有效的PCR添加剂。异亮氨酸L-isoleucine就是通过这个思路被我们发现有明显增进PCR反应特异性的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了利用异亮氨酸(L-isoleucine)提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法。该方法通过在PCR反应体系中添加异亮氨酸达到对DNA片段的有效扩增。此方法明显提高了反应特异性，应用成本低，使用简便，易于掌握。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的优化方法是：

(1).异亮氨酸溶液的配制：10-20mg/mL的异亮氨酸水溶液；

(2).异亮氨酸溶液的灭菌；

(3).PCR体系的配置；

(4).PCR体系的优化：在PCR反应体系中添加异亮氨酸溶液，异亮氨酸终浓度为5-15mg/mL；

(5).PCR条件的设定与运行；

(6).PCR产物检测。

而且，所述的PCR体系的优化是：异亮氨酸终浓度的优选浓度为6.0-6.5mg/mL。

而且，所述的异亮氨酸溶液是指：异亮氨酸完全溶解于纯水、10×PCR缓冲液或者其它一切适用于PCR反应的液相中。

本发明的优点和有益效果是：

1.本发明作为PCR增效剂的新成果，与已有方法相比，异亮氨酸优化扩增的效果明显，确实提高了PCR扩增的特异性，且异亮氨酸较为低廉的价格使得其应用没有增加很多成本。

2.本发明中使用的PCR优化试剂异亮氨酸，添加到体系中基本不影响PCR反应后的一般后续操作如电泳分离DNA产物。

3.该异亮氨酸提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的优化方法易于掌握，使用简便。

附图说明

图1为本发明中利用异亮氨酸优化扩增片段长度为900bp左右的非高GC-DNA片段的结果电泳图与不添加异亮氨酸的反应结果电泳图的对比图；

图2为本发明中利用异亮氨酸优化扩增片段长度为750bp左右的高GC-DNA片段的结果电泳图与不添加异亮氨酸的反应结果电泳图的对比图；

具体实施方式

本发明结合附图通过以下实施例进一步详述，但不局限于下述实施例。

本发明所涉及的PCR技术的优化方法是通过向PCR体系中添加异亮氨酸来实现的，其具体操作方法如下：

1.异亮氨酸(L-isoleucine)溶液的制备：

所述的异亮氨酸分子是指2-氨基-3-甲基戊酸，疏水性氨基酸，L-异亮氨酸是组成蛋白质的常见20种氨基酸之一。化学式：CH3CH2CH(CH3)CH(NH2)COOH。分子量：131.17。异亮氨酸固体粉末可以用市售产品，属于现有技术，不再详细叙述。所述的异亮氨酸溶液的浓度为：可以根据需要配置不同浓度大小的溶液，浓度的单位为质量体积比(W/V)，范围在10-20mg/mL。一般推荐浓度为10mg/mL。以配置浓度为(W/V)10mg/mL的异亮氨酸溶液为例，先精确称取10mg异亮氨酸粉末，置于已灭菌的1.5mL的小离心管中，用移液器缓慢加入灭菌水，使其溶解，最后定容至1mL。

2.异亮氨酸溶液的灭菌：溶液均需用高温灭菌(121℃，40min)。

3.PCR体系的配置：

PCR体系根据现有的技术，由待扩增DNA片断的不同而各不相同。具体表现在dNTP、模板、Mg²⁺、引物的添加量应根据不同的模板和不同的扩增片段长度来选择；PCR反应体系中的H₂O为双蒸水及以上级别水，体系中水的添加量应根据异亮氨酸溶液添加的体积进行调整，即应扣除相应添加的异亮氨酸溶液的体积。

4.PCR体系的优化：

在上述PCR反应体系中加入一定体积的异亮氨酸溶液。

5.PCR条件的设定与运行：

PCR反应条件中的预变性，变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板和引物融解温度来选择；其中的延伸温度根据所用聚合酶的合适温度来选择；其中的延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；其中的循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。

6.PCR产物的检测：

一般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，琼脂糖凝胶的浓度及PCR产物的上样体积需根据具体情况而定。所述的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如下：

(1)制备所需要浓度的琼脂糖凝胶，具体浓度大小应根据扩增DNA片段的大小来确定。

(2)吸取一定体积的PCR产物上电泳槽点样，同时点上合适分子量标记作为参照。

(3)加上3-4V/cm的电压进行电泳。

(4)待指示剂到合适位置时，取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。

实施例1

异亮氨酸对一般PCR(非高GC)的增效作用；

1)异亮氨酸溶液配制：10mg/ml

2)肌苷溶液灭菌：高温灭菌(121℃，30min)

3)PCR反应体系的配置：

按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。

10 X PCR缓冲液           1.2μL

dNTPs(25mM)              0.1μL

模板(100ng/ul)           0.2μL

引物1(2.0μM)            0.75μL

引物2(2.0μM)            0.75μL

Mg²⁺(25mM)               1.2μL

Taq(5U/μL)              0.2μL

异亮氨酸(10mg/ml)or H₂O  7.6μL

	引物1	引物2	扩增长度(nt)
				1	AGCCAGCTGTTAACCTTGTTCAG	GCCTGATTAAAACCACAGTCACC	963
2	AACCAGCCCAGCACTAATGTTTA	ACACAAATTTAGCCGGACACAGT	941
				3	CATAGGAGGGAATCTCCTGGTCT	AGGAAAATGTCTTCAGGGTCTCC	996

4	AGGTAAAGGGGACTTTGTCTTGC	CATTCTGCATGATGCGGTTATTA	861
				5	TTTATGGTTGTTGCCCTCTCCTA	AGAAGAAAAAGCCTGAGCTTGGT	881

其中，模板为人类Genome DNA，由本实验室自行提取。Taq酶及PCR缓冲液购自北京三博远志生物工程公司。共配置PCR体系10管，使用5对引物，编号分别为1、2、3、4、5，添加异亮氨酸的编号分别为1’、2’、3’、4’、5’。其扩增的目的产物大小为900bp左右。

4)PCR体系优化：在上述12微升PCR反应体系中包含加入7.6微升异亮氨酸(10mg/ml)，这样异亮氨酸的终浓度为6.3mg/ml。

5)PCR条件的设定与运行。按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。

预变性    94℃    4min

延伸      72℃    40s

完全延伸  72℃    7min

6)对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。

具体扩增结果如图1所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为DL2000(分别为：100，250，500，750，1000，2000bp，其中750bp条带浓度加亮)。从图1中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，加入异亮氨酸后，PCR的总体特异性有明显提高。

实施例2

异亮氨酸对高GC序列PCR的增效作用；

1)异亮氨酸溶液配制：10mg/ml

2)异亮氨酸溶液灭菌：高温灭菌(121℃，30min)

3)PCR反应体系的配置：

按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。

10 X PCR缓冲液           1.2μL

dNTPs(25mM)              0.1μL

模板(100ng/ul)           0.2μL

引物1(2.0μM)            0.8μL

引物2(2.0μM)            0.8μL

Mg²⁺(25mM)               1.2μL

Taq(5U/μL)              0.2μL

异亮氨酸(10mg/ml)or H₂O  7.5μL

其中，模板为人类Genome DNA，由本实验室自行提取。Taq酶及PCR缓冲液购自北京三博远志生物工程公司。共配置PCR体系12管，使用6对引物，编号分别为1、2、3、4、5、6；添加异亮氨酸的编号分别为1’、2’、3’、4’、5’、6’。扩增的目的产物大小为750bp左右，且GC含量较高(63-71％)。

4)PCR体系优化：在上述12微升PCR反应体系中包含加入7.5微升异亮氨酸(10mg/ml)溶液，这样异亮氨酸的终浓度为6.2mg/ml。

5)PCR条件的设定与运行。按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。

预变性    94℃    4min

完全延伸  72℃    7min

6)对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。

具体扩增结果如图2所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为DL2000(分别为：100，250，500，750，1000，2000bp，其中750bp条带浓度加亮)。

从图2中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，异亮氨酸能总体上明显改善PCR扩增特异性。

Claims (1)

1.利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应扩增效果的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1).异亮氨酸溶液的配制：10-20mg/mL的异亮氨酸水溶液；

(2).异亮氨酸溶液的灭菌；

(3).PCR体系的配置；

(4).PCR体系的优化：在PCR反应体系中添加异亮氨酸溶液，异亮氨酸终浓度为5-15mg/mL；

(5).PCR条件的设定与运行；

(6).PCR产物检测。

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