CN102286470A - L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(pcr)扩增效果的方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法及用途，利用L-甲硫氨酸(L-Methionine)提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的优化方法，属于生物技术领域。该方法是在原有的PCR扩增方法基础上，通过向体系中添加一定量的L-甲硫氨酸来实现的。本发明提出了PCR增效剂的新成果，与已有方法相比，L-甲硫氨酸优化扩增的效果明显(见图1)，提高了PCR扩增的特异性，且L-甲硫氨酸较为低廉的价格使得其应用没有增加很多成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，尤其是一种L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法及用途。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)，又称体外酶促基因扩增，是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，该技术由K.Mullis于1985年发明，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间里就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现的基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。
在过去的20多年的时间里，PCR技术在不断进步和发展中逐渐成熟，形成了一整套完整的技术体系。常规PCR技术操作简便，成功率很高，因而其在遗传学、微生物学、乃至整个生命科学领域的研究中都得到了广泛应用。但是PCR技术仍存在着不可避免的缺点，如扩增的副反应多，扩增产物的产量少，保真度不高等。但对PCR反应影响最大的是扩增过程中的副反应的发生，这种情况轻则带来在PCR产物中出现少量非目的产物，电泳图上表现为明显的非目的带和少量拖尾现象的出现，重则带来大量的非目的产物出现，在电泳图上表现为干扰很严重的拖尾和大量的弥散，导致主带模糊或根本无主带，整个扩增失效。虽然近年来一个又一个功能强大的引物设计软件被开发出来，但高特异性引物只是提高PCR反应效率的一个方面，对反应体系及反应条件进行优化组合则是解决这一问题的主要方面。根据多年来各国科学家的研究成果我们发现，通过向PCR反应体系中添加一定量的添加剂可以在不同程度上减少或消除副反应的发生。这些添加剂包括DMSO，Betain，BSA，甘油，Tween-20，NP-40，甲酰胺等。但这些添加剂都有各自的局限性，在各种不同的情况下效果差异很大，给应用带来不便，因此开发更多更新的PCR反应优化剂是发展PCR技术过程中一项很重要的工作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法及用途，本方法通过在PCR反应体系中添加L-甲硫氨酸达到对DNA片段的有效扩增。本方法明显提高了反应特异性，应用成本低，使用简便，易于掌握。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法，在PCR反应体系中添加L-甲硫氨酸溶液，L-甲硫氨酸在PCR反应体系中的终浓度为 5-15mg/mL。
而且，PCR扩增产物大小为100-4000bp。
而且，PCR扩增产物GC含量小于70％。
而且，PCR的步骤如下：
(1)L-甲硫氨酸溶液的配制：10-50mg/mL的L-甲硫氨酸水溶液；
(2)L-甲硫氨酸溶液的灭菌；
(3)PCR体系的配置；
(4)PCR体系的优化：在PCR反应体系中添加L-甲硫氨酸溶液，L-甲硫氨酸终浓度为5-15mg/mL；
(5)PCR条件的设定与运行；
(6)PCR产物检测。
而且，所述L-甲硫氨酸溶液包括：L-甲硫氨酸完全溶解于纯水、10×PCR缓冲液或者适用于PCR反应的液相。
L-甲硫氨酸作为提高聚合酶链式反应效率试剂的应用。
本发明的优点和有益效果是：
1、本发明提出了PCR增效剂的新成果，与已有方法相比，L-甲硫氨酸优化扩增的效果明显(见图1)，提高了PCR扩增的特异性，且L-甲硫氨酸较为低廉的价格使得其应用没有增加很多成本。
2、本发明中使用的PCR优化试剂L-甲硫氨酸，添加到体系中基本不影响PCR反应后的一般后续操作，如电泳分离DNA产物。
3、本发明提供的L-甲硫氨酸提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的优化方法易于掌握，使用简便。
附图说明
图1为本发明中利用L-甲硫氨酸优化扩增片段长度为1000bp左右的非高GC-DNA片段的结果电泳图，与不添加L-甲硫氨酸的反应相对比，20对引物扩增结果。上半为没有添加L-甲硫氨酸的扩增效果图，下半为对应的添加L-甲硫氨酸的扩增效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，以助于理解本发明的内容，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
鉴于PCR反应本身是一种模拟体内DNA复制的体外扩增方法，因此在本发明的摸索过程中，试图从模拟细胞核内环境出发，寻找参与酿酒酵母细胞代谢的核内小分子，并设计将这些核内小分子以接近核内浓度的条件下添加入PCR反应体系中，以期获得更为有效的PCR添加剂。L-甲硫氨酸就是通过这个思路被我们发现有明显增进PCR反应特异性的作用。
一、本发明所涉及的PCR技术的优化方法是通过同PCR体系中添加L-甲硫氨酸来实现的，其具体操作方法如下：
1、L-甲硫氨酸(L-Methionine)溶液的制备：
L-甲硫氨酸又名蛋氨酸，化学名为2-氨基-4-甲巯基丁酸，L-甲硫氨酸是生成蛋白质的20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸和生酮氨基酸，其侧链易氧化成甲硫氨(亚)砜。
分子式：C5H11O2NS，结构式：CH3-S-CH2-CH2-CH(NH2)COOH，分子量：149.21，白色薄片状结晶或结晶性粉末，有特殊气味，味微甜，熔点280～281℃(分解)，10％水溶液的PH值5.6～6.1，无旋光性，对热及空气稳定。对强酸不稳定，可导致脱甲基作用，溶于水(3.3g/100ml，25℃)、稀酸和稀碱，极难溶于乙醇，几乎不溶于乙醚，L-甲硫氨酸固体粉末可以用市售产品，属于现有技术，不再详细叙述。
所述的L-甲硫氨酸溶液的浓度为：可以根据需要配置不同浓度大小的溶液，浓度的单位为质量体积比(W/V)，范围在10-50mg/mL，一般推荐浓度为10mg/mL。以配置浓度为(W/V)10mg/mL的L-甲硫氨酸溶液为例，先精确称取10mg L-甲硫氨酸粉末，置于已灭菌的1.5mL的小离心管中，用移液器缓慢加入灭菌水，使其溶解，最后定容至1mL。
2、L-甲硫氨酸溶液的灭菌：溶液均需用高温灭菌，灭菌条件：121℃，30min。
3、PCR体系的配置：
PCR体系根据现有的技术，由待扩增DNA片断的不同而各不相同。具体表现在dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量应根据不同的模板和不同的扩增片段长度来选择；PCR反应体系中的H2O为双蒸水及以上级别水，体系中水的添加量应根据L-甲硫氨酸溶液添加的体积进行调整，即应扣除相应添加的L-甲硫氨酸溶液的体积。
4、PCR体系的优化：
在上述PCR反应体系中加入一定体积的L-甲硫氨酸溶液。
5、PCR条件的设定与运行
PCR反应条件中的预变性，变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板和引物融解温度来选择；其中的延伸温度根据所用聚合酶的合适温度来选择；其中的延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；其中的循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。
6、PCR产物的检测：
一般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，琼脂糖凝胶的浓度及PCR产物的上样体积需根据具体情况而定。所述的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如 下：
(1)制备所需要浓度的琼脂糖凝胶，具体浓度大小应根据扩增DNA片段的大小来确定。
(2)吸取一定体积的PCR产物上电泳槽点样，同时点上合适分子量标记作为参照。
(3)加上3～4V/cm的电压进行电泳。
(4)待指示剂到合适位置时，取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。
二、具体PCR扩增实例：L-甲硫氨酸对一组PCR的增效作用
1、L-甲硫氨酸溶液配制：10mg/ml
2、L-甲硫氨酸溶液灭菌：高温灭菌(121℃，30min)
3、PCR反应体系的配置：
按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。
其中，模板为人类Genome DNA，由本实验室自行提取。Taq酶及PCR缓冲液购自北京三博远志生物工程公司。共配置PCR体系40管，使用20对引物，编号分别为A81-82与A99-100依次配对，B1-2与B19-20依次配对。其扩增的目的产物大小为1000bp左右。
4、PCR体系优化：在上述12微升PCR反应体系中包含加入7.6微升L-甲硫氨酸(10mg/ml)溶液，这样L-甲硫氨酸的终浓度为6.33mg/ml。
5、PCR条件的设定与运行。按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。
6、对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。
具体扩增结果如图1所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为DL2000(分别为：100，250，500，750，1000，2000bp，其中750bp条带浓度加亮)。从图1中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，加入L-甲硫氨酸后，PCR的总体特异性有明显提高，可见L-甲硫氨酸对扩增有增效作用。
Claims (6)
1.一种L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法，其特征在于：在PCR反应体系中添加L-甲硫氨酸溶液，L-甲硫氨酸在PCR反应体系中的终浓度为5-15mg/mL。
2.根据权利要求1所述的L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法，其特征在于：PCR扩增产物大小为100-4000bp。
3.根据权利要求1所述的L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法，其特征在于：PCR扩增产物GC含量小于70％。
4.根据权利要求1所述的L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法，其特征在于：PCR的步骤如下：
(1)L-甲硫氨酸溶液的配制：10-50mg/mL的L-甲硫氨酸水溶液；
(2)L-甲硫氨酸溶液的灭菌；
(3)PCR体系的配置；
(4)PCR体系的优化：在PCR反应体系中添加L-甲硫氨酸溶液，L-甲硫氨酸终浓度为5-15mg/mL；
(5)PCR条件的设定与运行；
(6)PCR产物检测。
5.根据权利要求1所述的L-甲硫氨酸增进聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法，其特征在于：所述L-甲硫氨酸溶液包括：L-甲硫氨酸完全溶解于纯水、10×PCR缓冲液或者适用于PCR反应的液相。
6.L-甲硫氨酸作为提高聚合酶链式反应效率试剂的应用。
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