CN103993005B - 巯基化单链dna在聚合酶链式反应中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了巯基化单链DNA在增强聚合酶链式反应特异性扩增中的应用，即：利用巯基化单链DNA增强聚合酶链式反应特异性扩增的方法：将适量巯基化单链DNA加入PCR反应体系中进行PCR扩增；所述适量指在20μL反应体系中巯基化单链DNA的终浓度不小于15μM。所述巯基化单链DNA，满足以下条件：（1）为一段与靶序列不互补、非同源的任意序列；（2）Tm值≥37.7℃；（3）至少一端含巯烷基基团SH‑C6H12‑。本发明具有优化扩增的效果显著、制备简便、适用性广、成本低、易操作等优点；对基因的检测与克隆、遗传分析、医学诊断、基因芯片等领域有着巨大的潜在应用价值。

Description

巯基化单链DNA在聚合酶链式反应中的应用
技术领域
本发明涉及巯基化单链DNA在增强聚合酶链式反应特异性扩增中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
聚合酶链式反应（PloymeraseChainReaction,PCR），又称体外酶促基因扩增，是一种在体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术，机制非常复杂，在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在短时间内可以将目的基因扩增至百万倍。该技术由K.Mul1is于1983～1984年发明，在核酸序列分析中得到广泛应用。经过30年的发展，PCR反应已经发展成一项成熟技术，常规实验中失误率较小，然而在实际应用时总会出现一定程度的干扰副反应，如碱基错配、引物间形成二聚体等引起的扩增等。这些副反应轻则引起非特异性扩增，导致扩增效率不高，重则可能造成扩增失败。
PCR反应组分和程序的优化是提高PCR扩增特异性的重要途径。多年以来，众多研究人员对PCR反应组分的优化做了大量工作，如向反应体系中加入DMSO、甘油、甜菜碱、纳米金属等可以在一定程度上改善非特异性扩增问题。但在实际应用中，有些效果并不是很理想，比如过多的纳米金属等会抑制聚合酶的活性，造成扩增效率降低。
经过对现有专利与文献的检索，发现中国专利申请CN101983241A中提到以下内容：将修饰（包括巯基修饰、羟基修饰）的至少部分互补的寡核苷酸与靶核酸的链杂交，可用于靶核酸的PCR扩增，由于已证实的在羟基核碱基或巯基核碱基与靶核酸的核碱基之间可以发生更稳定的氢键结合，因此可达到增强修饰序列与靶序列结合效率的目的。在该专利申请提到的该项应用中，其所述的“修饰的至少部分互补的寡核苷酸”实际上用作PCR反应中的引物，对引物进行羟基或巯基或其他基团修饰的目的是增加引物与靶序列的结合效率，并不具备增强PCR特异性的功能。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种可有效增强核酸聚合酶链式反应特异性扩增的方法，该方法是通过向反应体系中加入巯基化单链DNA实现的，其优化扩增的效果显著，制备简便，适用性广，成本低，易操作。
本发明是通过以下技术方案实现的：
巯基化单链DNA在聚合酶链式反应中的应用：本发明的申请人通过实验研究证明，向PCR反应体系中添加巯基化寡核苷酸，即巯基化单链DNA，可实现对PCR体系的优化：将适量巯基化单链DNA加入PCR反应体系中进行PCR扩增，对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并与未添加巯基化单链DNA的PCR反应体系的扩增产物进行对比，结果发现，未添加巯基化单链DNA的PCR反应体系的扩增产物中，出现了非常严重的非特异性扩增，而添加巯基化单链DNA的PCR反应体系的扩增产物中，非特异性扩增完全消失，特异性得到明显改善。
所述巯基化单链DNA，是指5’或3’端的核苷酸用巯烷基（SH-C6H12-）修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸的Tm值需≥37.7℃（Tm值使用生物学软件Oligo7.4计算）。
所述巯基化单链DNA，其碱基的序列无特定要求，是一段与靶序列不互补的随机序列，在PCR反应中不做为引物，也不产生PCR产物链。
进一步地，所述巯基化单链DNA，满足以下条件：（1）为一段与靶序列不互补（非同源）的任意序列；（2）Tm值≥37.7℃；（3）至少一端含巯烷基基团（SH-C6H12-）。
所述巯基化单链DNA，可由生物公司依据引物合成方法合成并进行巯基修饰，为常规方法。
所述聚合酶链式反应，是指分子生物学中常用PCR扩增，包括常规PCR、复杂模板PCR等。
所述PCR体系参见各商业ExTaq聚合酶说明书。
一种利用巯基化单链DNA增强聚合酶链式反应特异性扩增的方法，如下：将适量巯基化单链DNA加入PCR反应体系中进行PCR扩增；所述适量指在20μL反应体系中巯基化单链DNA的终浓度不小于15μM。
比如，常用PCR扩增程序按照现有技术设定如下：95℃预热5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；其中循环数、退火温度、退火时间、延伸时间可根据不同PCR仪器和不同引物需要而做适当改变，最后72℃延伸7min。
所述琼脂糖凝胶电泳参照现有技术，一般包含以下步骤：
（1）制备2%的琼脂糖凝胶(含染色剂溴乙锭)；
（2）PCR产物点样，同时点分子量标记作为对照；
（3）加以4～5V/cm的电压，电泳，30min；
（4）凝胶成像观察并分析结果。
本发明利用巯基化单链DNA增强聚合酶链式反应特异性扩增的方法，与现有方法相比，具有优化效果显著、制备简便、适用性广、成本低、易操作等优点。巯基化单链DNA稳定性好，可在4℃长期保存不会降解或失活，使用极为方便，只需适量加入到PCR体系中即可。本发明中使用的巯基化单链DNA不依赖碱基序列，因此适用广泛，可直接用于各种基因的PCR扩增而不需要针对性设计。本发明发展的PCR扩增方法对多种PCR体系均具有优化作用，适用于各种PCR扩增，对基因的检测与克隆、遗传分析、医学诊断、基因芯片等领域有着巨大的潜在应用价值。
附图说明
图1：实施例1中巯基化单链DNA对CaMV35S基因片段PCR扩增反应优化扩增效果图。
图2：实施例2中巯基化单链DNA对复杂植物基因组转基因玉米MON810PCR扩增反应优化扩增效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1巯基化单链DNA优化扩增CaMV35S基因片段
（1）PCR反应体系的配置：
反应体系含2×PremixExTaq10μL，上、下游引物(10μmolL-1)各1μL（序列为：F1：GCTCCTACAAATGCCATCATTGC，R1：GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC，如SEQIDNO.1、2所示），含CaMV35S基因的DNA（为来源于转CaMV35S基因玉米的基因组总DNA）2μL，其中，PremixExTaq购自大连TaKaRa公司。
各样品的配置如下：
常规PCR体系配置2管，编号为1、2，用双蒸水补足至总体积20μL；
添加未巯基化单链DNA的体系配置2管，编号为5、6，每管分别添加未巯基化单链DNA至终浓度20μM，再用双蒸水补足至总体积20μL；所述未巯基化单链DNA的序列为GTATGTGCCCATGTG，如SEQIDNO.3所示；
添加巯基化单链DNA的体系配置7管，编号为3、4、7、8、9、10、11，每管分别添加不同序列的巯基化单链DNA至终浓度20μM，再用双蒸水补足至总体积20μL；每管所添加的巯基化单链DNA的序列如下：
编号3：HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
编号4：HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，同上；
编号7：HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
编号8：HS-ssDNA2：HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
编号9：HS-ssDNA3：HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
编号10：HS-ssDNA4：HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；
编号11：HS-ssDNA5：HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；
添加巯基化单链DNA的优化体系配置6管，编号12、13、14、15、16、17，Tm值分别为12.9℃，30.3℃，37.7℃，47.4℃，53℃，59.1℃；具体Tm值及所添加的巯基化单链DNA序列如下：
编号12：12.9℃；HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；
编号13：30.3℃；HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；
编号14：37.7℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；
编号15：47.4℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
编号16：53℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
编号17：59.1℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。
（2）利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
（3）对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：
扩增结果如图1所示，其中，各泳道所对应的样品如下：
M：分子量标记（北京天根公司MarkerI，自下至上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp）；
1-2：常规PCR体系；
3-4：添加巯基化单链DNA的优化改进体系；
5-6：添加未巯基化单链DNA的对照体系；
7-11：分别添加HS-ssDNA1、HS-ssDNA2、HS-ssDNA3、HS-ssDNA4、HS-ssDNA5的巯基化单链DNA优化改进体系；
12-17：分别添加巯基化单链DNATm值为12.9℃，30.3℃，37.7℃，47.4℃，53℃，59.1℃的优化改进体系。
该扩增的目的基因片段为195bp，由图1可见，在常规PCR中出现了严重的非特异性扩增，表现为2条非特异性条带（大小约为450bp和550bp，泳道1-2），加入Tm≥37.7℃的随机巯基化单链DNA的PCR体系非特异性扩增完全消失（泳道3-4，7-11，14-17），而加入未巯基化单链DNA和Tm值＜37.7℃的巯基化单链DNA的对照体系非特异性扩增依然存在（泳道5-6，12-13）。
实施例2巯基化单链DNA优化扩增复杂植物基因组转基因玉米MON810
（1）PCR反应体系的配置：
反应体系含2×PremixExTaq10μL，上、下游引物(10μmolL-1)各1μL（F1：CAAGTGTGCCCACCACAGC，R1：GCAAGCAAATTCGGAAATGAA，如SEQIDNO.14、15所示），转基因玉米MON810基因组DNA2μL，其中，PremixExTaq购自大连TaKaRa公司。
各样品的配置如下：
常规PCR体系配置3管，编号为1、2、3，用双蒸水补足至总体积20μL；
添加巯基化单链DNA的体系配置3管，编号为4、5、6，每管分别添加序列不同的巯基化单链DNA至终浓度为20μM，再用双蒸水补足至总体积20μL；所述巯基化单链DNA的序列如下：
编号4：HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
编号5：HS-ssDNA2：HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
编号6：HS-ssDNA3：HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
添加未巯基化单链DNA的体系配置1管，编号为7，添加未巯基化单链DNA至终浓度为20μM，再用双蒸水补足至总体积20μL；所述未巯基化单链DNA的序列为：CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
添加巯基化单链DNA的优化体系配置6管，编号8-13，分别添加巯基化单链DNATm值为12.9℃，30.3℃，37.7℃，47.4℃，53℃，59.1℃；具体Tm值及所添加的巯基化单链DNA序列如下：
编号8：12.9℃；HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；
编号9：30.3℃；HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；
编号10：37.7℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；
编号11：47.4℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
编号12：53℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
编号13：59.1℃；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。
（2）利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
（3）对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：
扩增结果如图2所示，其中，各泳道所对应的样品如下：
M：分子量标记(北京天根公司MarkerI，自下至上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp)；
1-3：常规PCR体系；
2：加入Tm=0℃的随机非同源巯基化单链DNA的优化改进体系(GTATGT)；
4-6：分别为添加HS-ssDNA1、HS-ssDNA2、HS-ssDNA3的巯基化单链DNA优化改进体系；
7：添加序列为CATACGCTCCAGACC的未巯基化单链DNA的对照体系；
8-13：分别添加巯基化单链DNATm值为12.9℃，30.3℃，37.7℃，47.4℃，53℃，59.1℃的优化改进体系。
该扩增的目的基因片段为106bp，由图2可见，在常规PCR中出现了严重的非特异性扩增，表现为2条非特异性条带（200bp上下，泳道1-3），加入Tm≥37.7℃的随机巯基化单链DNA的PCR体系非特异性扩增完全消失（泳道4-6，10-13），而加入未巯基化单链DNA和Tm值＜37.7℃的巯基化单链DNA的对照体系非特异性扩增依然存在（泳道7-9）。

Claims (4)

1.巯基化单链DNA在增强聚合酶链式反应特异性扩增中的应用，其特征在于：所述巯基化单链DNA，满足以下条件：(1)为一段与靶序列不互补、非同源的序列；(2)Tm值≥37.7℃；(3)5’端含巯烷基基团SH-C6H12-，具体应用方法为：将适量巯基化单链DNA加入PCR反应体系中进行PCR扩增；所述适量指在20μL反应体系中巯基化单链DNA的终浓度不小于15μM。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述巯基化单链DNA选自以下序列：
HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
HS-ssDNA2：HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
HS-ssDNA3：HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
HS-ssDNA4：HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
HS-ssDNA5：HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
3.一种利用巯基化单链DNA增强聚合酶链式反应特异性扩增的方法，其特征在于：将适量巯基化单链DNA加入PCR反应体系中进行PCR扩增；所述适量指在20μL反应体系中巯基化单链DNA的终浓度不小于15μM；其中，所述巯基化单链DNA，满足以下条件：(1)为一段与靶序列不互补、非同源的序列；(2)Tm值≥37.7℃；(3)5’端含巯烷基基团SH-C6H12-。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述巯基化单链DNA选自以下序列：
HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
HS-ssDNA2：HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
HS-ssDNA3：HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
HS-ssDNA4：HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
HS-ssDNA5：HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
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