CN102102125A - Pcr显色检测dna序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域，公开了一种PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分；通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物；将待检测物，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTP和经单链DNA引物修饰的贵重金属混合，进行PCR反应；PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量。本发明利用DNA纳米技术和PCR技术，通过对目标DNA序列的特异性识别，改变读出光信号的峰位置，实现对样品的有效、方便、大范围监测。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及了一种PCR显色检测DNA序列的方法。
背景技术
人类所患的病症有25％～30％与基因有关。如人类第二大致死病因肿瘤，与基因有密切关系。生物体的一切生命活动，从出生成长、到出现疾病、衰老直至死亡都与基因基因调控着细胞的各种功能，包括生长、分化、衰老和死亡等。人类与疾病相关约有5000多个，迄今已有三分之一被分离和确认。对于基因突变的检测，对于疾病的早期诊断具有极大的意义。
聚合酶链式反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。但传统的PCR反应体系始终是无色透明的，要想检测其中有无目的DNA以及目的DNA含量，必须进行染色。染色方法有两种，一种是将反应产物在琼脂糖凝胶中电泳后将凝胶泡在含0.5ug/ml溴化乙锭(EB)溶液中进行染色，EB可以嵌入DNA碱基中，用302nm紫外光透射仪激发可放射出橙红色信号，由此可判断出所检测DNA片段的有无及浓度。另一种方法是用核酸电泳染料SYBR Green，它与双链DNA有亲和力，可以用作电泳前染色。电泳后，在紫外光透射仪激发下，与SYBRGreen结合的双链DNA呈现绿色。
EB可以嵌入碱基分子中，导致错配，是强诱变剂，具有高致癌性。EB具有一定毒性，对含EB的溶液及凝胶进行净化处理增加了实验的时间和成本。这两种染色方法均需在PCR反应后进行电泳方可以判断实验结果，不够直观。
发明内容
本发明针对现有技术中检测DNA序列必须进行染色，实验过程耗时长且成本高，需用电泳判断实验结果，不够直观的缺点，提供了一种利用DNA技术和PCR技术对目标DNA序列的特异性识别，通过溶液紫外可见吸光光谱的显著改变，实现对样品的有效、方便、大范围实时监测的PCR显色检测DNA序列的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：
步骤a：先设计巯基修饰的单链DNA引物，DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，DNA引物序列无重叠部分；
步骤b：通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰到贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物；
步骤c：将待检测物，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTP和步骤b中的经单链DNA引物修饰的贵重金属混合，进行PCR反应；
步骤d：PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量；
当被监测目标中没有目标DNA序列时，贵重金属偶联的单链DNA不会通过PCR反应扩增，这些单链DNA引物由于没有互补序列，贵重金属是分散的，溶液的颜色为红色；
当被监测目标中含有能与单链DNA引物结合的DNA序列时，单链引物通过PCR反应扩增，引入了互补序列，贵重金属通过DNA杂交交联在一起，导致贵重金属的紫外可见吸收光谱发生位移，溶液的颜色变成紫色。
作为优选，所述的步骤b中的贵重金属为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
作为优选，所述的PCR反应条件为：①94℃变性2min；②94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环25-30次；③72℃延伸3min。
作为优选，所述的DNA聚合酶为rTaq酶。
作为优选，所述的PCR缓冲液的组分及用量分别为：Tris-HCl：50-300mmol/L、KCl：50-1000mmol/L、MgCl2：5-50mmol/L。
作为优选，所述的PCR缓冲液的组分及用量分别为：Tris-HCl：100mmol/L、KCl：500mmol/L、MgCl2：15mmol/L。
本发明通过DNA技术和PCR技术改变贵重金属的聚集状态，引起溶液紫外可见吸光光谱的显著改变，从而达到对DNA序列的显色检测。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
本发明利用DNA纳米技术和PCR技术，通过对目标DNA序列的特异性识别，改变读出光信号的峰位置，实现对样品的有效、方便、大范围监测，通过微机电系统的集成，可以实现该技术方案应用的芯片化，进而为用户提供一种网络化、高通量、高灵敏的实时DNA监测技术。
附图说明
图1是本发明经过30个循环的PCR后的反应产物的紫外可见光谱检测结果图。
图2是本发明未发生聚集的AuNPs透射电子显微镜图。
图3是本发明用DNA引物修饰的AuNPs通过DNA之间的杂交反应发生聚集后的透射电子显微镜图。
具体实施方式
下面结合附图1至图3与具体实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1
PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：
先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物，取8μL修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8μL修饰有下游引物的20pmol金纳米颗粒在200μL PCR管中混合，分5次加入2.5ul的10xPCR缓冲液(Tris-HCl：100mmol/L、KCl：500mmol/L、MgCl2：15mmol/L)，然后依次加入5ng待测样品，2ul 2mmol/L的dNTP和0.5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应：94℃变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec循环30次，72℃延伸3min，溶液颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示：由519nm红移至525nm。
实施例2
PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：
先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物，取16μL修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和16μL修饰有下游引物的20pmol金纳米颗粒在200μL PCR管中混合，分5次加入2.5ul的10xPCR缓冲液(Tris-HCl：100mmol/L、KCl：500mmol/L、MgCl2：15mmol/L)，然后依次加入5ng待测样品，2ul 2mmol/L的dNTP和0.5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应：94℃变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec循环30次，72℃延伸3min，溶液颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示：由519nm红移至528nm。
实施例3
PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：
先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物，取8μL修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8μL修饰有下游引物的20pmol金纳米颗粒在200μLPCR管中混合，分5次加入2.5ul的10xPCR缓冲液(Tris-HCl：100mmol/L、KCl：500mmol/L、MgCl2：15mmol/L)，然后依次加入5ng待测样品，2ul 2mmol/L的dNTP和0.5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应：94℃变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环25次；72℃延伸3min，溶液颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示：由519nm红移至526nm。
实施例4
PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：
先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物，取16μL修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和16μL修饰有下游引物的20pmol金纳米颗粒在200μL PCR管中混合，分5次加入2.5ul的10xPCR缓冲液(Tris-HCl：100mmol/L、KCl：500mmol/L、MgCl2：15mmol/L)，然后依次加入5ng待测样品，2ul 2mmol/L的dNTP和0.5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应：94℃变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，分别循环30次；72℃延伸3min，溶液颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示：由519nm红移至530nm。
实施例5
PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：
先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物，取8μL修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8μL修饰有下游引物的20pmol金纳米颗粒在200μL PCR管中混合，分5次加入2.5ul的10xPCR缓冲液(Tris-HCl：50mmol/L、KCl：50mmol/L、MgCl2：5mmol/L)，然后依次加入5ng待测样品，2ul 2mmol/L的dNTP和0.5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应：94℃变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec循环30次，72℃延伸3min，溶液颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示：由519nm红移至524nm。
实施例6
PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤：
先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物，取8μL修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8μL修饰有下游引物的20pmol金纳米颗粒在200μL PCR管中混合，分5次加入2.5ul的10xPCR缓冲液(Tris-HCl：150mmol/L、KCl：750mmol/L、MgCl2：50mmol/L)，然后依次加入5ng待测样品，2ul 2mmol/L的dNTP和0.5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应：94℃变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec循环30次，72℃延伸3min，溶液颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示：由519nm红移至527nm。
上述各实施例中所采用的反应设备为Bio-Rad PCR仪。
当被监测目标中没有目标DNA序列时，贵重金属偶联的单链DNA不会通过PCR反应扩增，这些单链DNA引物由于没有互补序列，贵重金属是分散的，溶液的颜色为红色；
当被监测目标中含有能与单链DNA引物结合的DNA序列时，单链引物通过PCR反应扩增，引入了互补序列，贵重金属通过DNA杂交交联在一起，导致贵重金属的紫外可见吸收光谱发生位移，溶液的颜色变成紫色，从而实现对DNA序列的高灵敏显色监测。
本发明利用DNA纳米技术和PCR技术，通过对目标DNA序列的特异性识别，改变读出光信号的峰位置，实现对样品的有效、方便、大范围监测。通过微机电系统的集成，可以实现该技术方案应用的芯片化，进而为用户提供一种网络化、高通量、高灵敏的实时DNA监测技术。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (7)
1.PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤a：先设计巯基修饰的单链DNA引物，DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，DNA引物序列无重叠部分；
步骤b：通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物；
步骤c：将待检测物，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTP和步骤b中的经单链DNA引物修饰的贵重金属混合，进行PCR反应；
步骤d：PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量。
2.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于：所述的步骤b中的贵重金属为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于：所述的步骤c中的PCR反应条件为：
①94℃变性2min；②94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环25-30次；③72℃延伸3min。
4.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于：所述的步骤d的对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量过程中，当被监测目标中没有目标DNA序列时，贵重金属偶联的单链DNA不会通过PCR反应扩增，这些单链DNA引物由于没有互补序列，贵金属是分散的，溶液的颜色为红色；当被监测目标中含有能与单链DNA引物结合的DNA序列时，单链引物通过PCR反应扩增，引入了互补序列，贵重金属通过DNA杂交交联在一起，导致贵重金属的紫外可见吸收光谱发生位移，溶液的颜色变成紫色。
5.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶为rTaq酶。
6.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于：所述的PCR缓冲液的组分及用量分别为：Tris-HCl：50-300mmol/L、KCl：50-1000mmol/L、MgCl2：5-50mmol/L。
7.根据权利要求6所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于：所述的PCR缓冲液的组分及用量分别为：Tris-HCl：100mmol/L、KCl：500mmol/L、MgCl2：15mmol/L。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015158088A1 (zh) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 巯基化单链dna在聚合酶链式反应中的应用 |
| CN106367515A (zh) * | 2016-09-27 | 2017-02-01 | 周宏灏 | 基于金纳米颗粒探针检测dna甲基化程度的试剂盒及其检测方法与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009128960A2 (en) * | 2008-01-14 | 2009-10-22 | Ultrapid Nanodiagnostics, Inc. | Rapid test including genetic sequence probe |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009128960A2 (en) * | 2008-01-14 | 2009-10-22 | Ultrapid Nanodiagnostics, Inc. | Rapid test including genetic sequence probe |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《科学通报》 20050630 沈鹤柏 基于金纳米粒子的聚合酶链反应 第1190-1194页 1-5 第50卷, 第12期 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015158088A1 (zh) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 巯基化单链dna在聚合酶链式反应中的应用 |
| US10131941B2 (en) | 2014-04-18 | 2018-11-20 | Institute Of Plant Protection, Shandong Academy Of Agricultural Sciences | Application of thiolated single-stranded DNA in polymerase chain reaction |
| CN106367515A (zh) * | 2016-09-27 | 2017-02-01 | 周宏灏 | 基于金纳米颗粒探针检测dna甲基化程度的试剂盒及其检测方法与应用 |
| CN106367515B (zh) * | 2016-09-27 | 2019-12-17 | 周宏灏 | 基于金纳米颗粒探针检测dna甲基化程度的试剂盒及其检测方法与应用 |
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